Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Chủng virus KTY-PRRS-06 được phân lập tại ổ dịch ở Hải Phòng năm 2015 và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Chủng virus KTY-PRRS-06 đã được phân lập được từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc PRRS được bảo quản ở phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
* Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet.
- Tủ ấm 37 0 C/ 5% CO2, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -4 0 C, -20 0 C, -80 0 C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào
- Sử dụng buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR,
- Máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ), máy tính và các phần mềm xử lý dữ liệu như phần mềm CEQ 8000 (version 9.0), phần mềm Genetyx (version 5.0.4), MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10).
- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FCS, khỏng sinh (Penicillin (100 U/àl), Streptomycin (100 àg/ml), EDTA, Trypsin, DMSO),…
- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%.
- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…
- Bộ môn Bệnh lý Thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Khoa Thú Y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016.
N ội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Hồ sơ giống virus KTY-PRRS-06 lựa chọn nghiên cứu.
- Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển.
- Hiệu giá virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-
PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06;
- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY-PRRS-06.
3.3.1.Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
* Chuẩn bị tế bào Marc-145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế
22 bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS Đóng chặt bình nuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi dậy lên nắp bình nuôi cấy.
Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 37 0 C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, đem ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Đếm tế bào, pha loóng tế bào 100 lần (10àl tế bào trong 990àl mụi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x10 5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
* Gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Khi tế bào một lớp Marc-145 (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôi cấy, không chồng chéo lên nhau) trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gây nhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung
100àl mẫu đó chuẩn bị Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 37 0 C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 37 0 C với 5% CO2.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ sau khi gây nhiễm.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi, chụp ảnh tế bào, thu virus khi chúng phá hủy 80% - 90% tế bào gây nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50
Tế bào Marc-145 một lớp được chuẩn bị trên khay 96 giếng Mỗi giếng chứa 2,0x10 4 tế bào, dịch môi trường được hút bỏ Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm bỏ cặn, lấy phần nước trong pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp cỏc giếng theo thứ tự đỏnh dấu trước (25 àl/giếng), mỗi độ pha loóng lặp lại 3 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào cỏc giếng tế bào đó gõy nhiễm virus (100 àl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE-Cyto Pathogenic Effect) được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm TCID50 được xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Lan NT et al., 2005).
3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào với tỷ lệ Multiplicity Of Infection - MOI là 0,01 Sau 1 giờ ủ, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch với 0,5ml PBS, sau đó bổ sung môi trường DMEM có chứa 10% TPB Virus giải phóng ngoài tế bào và trong tế bào được thu riêng ở các thời điểm khác nhau sau khi gây nhiễm virus (ở 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ,
84 giờ, 96 giờ và 108 giờ) Đường cong nhân lên của virus được xây dựng có biến là Log10 của TCID50/25àl tại mỗi thời điểm thu virus.
3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả RT- PCR RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus Mục đích là thu nhận được RNA của hệ gen virus PRRS đạt hàm lượng cao, đảm bảo đủ làm khuôn cho RT- PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit.
Bước 1: Hỳt 560àl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thờm 140àl dung dịch mẫu đó xử lý là hỗn dịch (chứa virus và dung dịch PCS cho vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm) vào ống Eppendorf trên, sau đó vortex trong 15 giây.
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thờm 560 àl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Hỳt 630àl huyễn dịch trờn sang cột QIAamp spin (cột lọc) Ly tõm
8.000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống.
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 8: Thờm 500àl dung dịch AW1, ly tõm 8.000 vũng/phỳt, trong 2 phỳt rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thờm 500àl dung dịch AW2, ly tõm 14.000 vũng/phỳt, trong 3 phỳt, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới cột Sau đó ly tâm lại thêm một lần nữa 14.000vòng/phút,trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1,5ml mới sau đó thêm 60ml dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Sau đó ly tâm 8.000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C.
* Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT- PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR
Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy(àl)
Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT- PCR bao gồm có mồi xuôi và mồi ngược nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603bp của PRRSV, được trình bày dưới bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR
Trình tự nucleotid của đoạn mồi Kích thước
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
603 bp Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Người ta thường sử dụng 2 loại thạch để điện di là Agarose và
Polyacrylamid Hai loại thạch này được hòa tan trong dung dịch đệm là TBE hoặc
TAE, trong nghiên cứu này sử dụng thạch Agarose và dung dịch đệm TAE để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1 x hòa tan với 1,5 gram
Agarose đặt trong lò vi sóng ở 100 0 C trong 5 phút, đợi tới khi thạch nguội (khoảng
50 0 C-60 0 C) cho thờm 3àl Ethidium Bromide rồi đổ vào khuụn cú cỏc
26 lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng kiểm tra mẫu cần điện di Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
