(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc kty prrs 06 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM HỒNG THỊ THẢO NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌCU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌCC TÍNH SINH HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAMC VÀ SINH HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘCA CHỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘCNG VIRUS CƯỜNG ĐỘCNG ĐỘCC KTY-PRRS-06 GÂY HỘCI CHỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌCNG RỐI LOẠN HÔI LOẠN HÔN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢNP VÀ SINH SẢN Ở LỢNN Ở LỢN LỢNN Ngành : Thú y Mã số : : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học :i hướng dẫn khoa học :ng dẫn khoa học :n khoa học :c : PGS.TS Nguyễn Hữu Namn Hữu Namu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo i LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Cô giáo - người tận tình dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập Học viện Nông nghiệp Việt Nam thời gian thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Hữu Nam, người hướng dẫn khoa học, giúp đỡ nhiệt tình có trách nhiệm tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Lời cảm ơn xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, anh, chị, em phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y nơi thực đề tài tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài tốt Cuối tơi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ q trình hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình .ix Trích yếu luận văn x Thesis Abstract .xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu .3 2.1 Tình hình nghiên cứu Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.1.3 Những nghiên cứu dịch PRRS nước 2.1.4 Những nghiên cứu dịch PRRS Việt Nam .8 2.2 Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) 2.2.1 Hình thái, cấu tạo virus PRRS 2.2.2 Phân loại virus PRRS 10 2.2.3 Khả gây bệnh virus PRRS .11 2.2.4 Sức đề kháng virus PRRS 11 2.2.5 Đặc tính ni cấy virus PRRS 12 2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 12 2.3.1 Đặc điểm chung 12 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây .13 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS .15 iii 2.3.6 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18 2.3.8 Biện pháp phòng trị bệnh .19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu .21 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.2.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 3.2.2 22 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTYPRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 môi trường tế bào Marc-145 .22 3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50 24 3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy chuyển 24 3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 24 3.3.5 Phương pháp RT- PCR 25 3.3.6 Phương pháp giải trình tự Gen 27 3.3.7 Phương pháp đọc kết 28 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Kết nghiên cứu chủng virus prrs nghiên cứu 29 4.1.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu .29 4.1.2 Kết kiểm tra khả tạp nhiễm với loại virus khác 32 4.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTYPRRS-06 33 4.2.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 33 4.2.2 Kết xác định hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 36 iv 4.3 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 39 4.3.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY-PRRS-06 .40 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 41 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển 43 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 47 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử 50 Phần Kết luận kiến nghị .52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị .52 Tài liệu tham khảo 53 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ BED Blue Ear disease BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CNSH Công nghệ sinh học CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco,s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxynucleotide Acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat EAV Equine Arteritis virus EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acide ELISA Enzyme Linked Immunosortbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum GP Glycoprotein IFA Indirect Immunofluoresence Assay kDa Kilodalton LDHV Lactate Dehydlogenase – elevating virus Log Logarit (cơ số 10) MEGA5 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10 MOI Multiplicity Of Infection mRNA Acid Ribonucleic thông tin vi MSD OIE ORF Mistery Swine Disease PAM Tổ chức thú y giới PBS Open Reading Frame (khung đọc mở) PCR Pulmnary Alveolar Macrophage PEARS Phosphate Buffer Saline PRRS Polymerase Chain Reaction PRRSV Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome RNA Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RT- PCR Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus SHFV TCID50 VNT Ribonucleic Acid Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction Simian Hemorrhaghic Fever Virus Tissue Culture Infectious Dose 50 Virus Neutralization Test vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV 10 Bảng 2.2 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh .11 Bảng 3.1 Thành phần thể tích cho phản ứng RT- PCR 25 Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR 26 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR 26 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập 29 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán RT- PCR lợn nghi mắc PRRS 31 Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 32 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRS, CSF, FMD, FED, TGE 32 Bảng 4.5 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTYPRRS-06 qua đời cấy chuyển 33 Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 thời điểm thu hoạch .37 Bảng 4.7 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển .38 Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng KTY-PRRS-06 .46 Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 46 Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY-PRRS-06 49 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển 49 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới .4 Hình 2.2 Cấu trúc hạt PRRS virus Hình 2.3 Cấu trúc hệ gen virus PRRS Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 35 Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm .35 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm .35 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm .35 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây nhiễm .35 Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng virus KTY-PRRS-06 .37 Hình 4.7 Log10 hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 .39 Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số .40 Hình 4.9 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 41 Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển thứ 10 43 Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 45 Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 48 Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 51 ix