Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Tối ưu hóa điều kiện trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

TÓM TATĐề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm” được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Phát triển sản phẩm, th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

HO THỊ KIM BẰNG

TOI UU HOA DIEU KIỆN TRÍCH LY CAC HỢP CHAT

CO HOAT TINH SINH HOC TU PHU PHAM NHO

BANG ENZYME CO HO TRO SIEU AM

LUAN VAN THAC SY CONG NGHE THUC PHAM

Thanh phé H6 Chi Minh, thang 3/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

HO THỊ KIM BANG

TOI UU HOA DIEU KIEN TRICH LY CAC HOP CHAT

CO HOAT TINH SINH HOC TU PHU PHAM NHO

BANG ENZYME CO HO TRO SIEU AM

Chuyên ngành: Công nghệ Hoá Học va Phuc phẩm

Mã số ngành : 8.54.01.01

LUẬN VĂN THAC SY CÔNG NGHỆ HOA HỌC VÀ THUC PHAM

Hướng dẫn khoa học

PGS TS KHA CHAN TUYEN

Thanh phé H6 Chi MinhThang 3/2024

TOI UU HÓA DIEU KIỆN TRÍCH LY CÁC HỢP CHAT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ PHU PHAM NHO

BANG ENZYME CÓ HỖ TRỢ SIEU AM

HO THI KIM BANG

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chú tịch: PGS.TS PHAN TẠI HUÂN

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

2 Thư ký: TS NGUYEN MINH XUAN HONG

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3 Ủy viên: TS NGUYÊN HUỲNH BẠCH SƠN LONG

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phầntrong nghiên cứu của NCS Nguyễn Thị Thanh Thảo, giảng viên Khoa Công nghệhóa học và thực phẩm, làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công

bô với sự đông ý của chủ nhiệm đê tài.

TP.HCM, tháng 3 năm 2024.

Học viên thực hiện đề tài

Hồ Thị Kim Bằng

1H

liệu bã nho dé phục vụ nghiên cứu tốt nhất.

Cám ơn đến tất cả quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức

chuyên môn, kiến thức thực tế sản xuất Đó chính là những công cụ hỗ trợ đắt lực để

tôi hoàn thành tốt đề tài cũng như hành trang kiến thức trong lĩnh vực chuyên môn

sau nảy.

Tôi gửi lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất đến thầy PGS.TS Kha Chấn Tuyền,ThS Nguyễn Thị Thanh Thảo đã hỗ trợ tư vấn chuyên môn, truyền đạt kiến thức và

tận tình hỗ trợ trong suốt thời gian hoàn thành luận văn này

Do chưa có nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực thực tế khi làm đề tai, nên rất

mong quý thầy cô bổ sung, đóng góp dé đề tài có thé ứng dụng trong thực tiễn vàmang lại những đóng góp trong ngành sản xuất công nghiệp cũng như những lợi íchmới cho xã hội nói chung.

Cuối cùng, tôi kính chúc Quý Thầy Cô thật nhiều sức khoẻ, hạnh phúc vàthành công.

TP.HCM, tháng 3 năm 2024.

Học viên thực hiện đề tài

Hồ Thị Kim Bằng

IV

TÓM TAT

Đề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ

phẩm nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm” được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Phát

triển sản phẩm, thuộc Khoa Công nghệ hóa học và thực phẩm Trường Đại học Nông

Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 6 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023

Trong ngành công nghiệp sản xuất rượu vang và nước ép trái cây từ nho, đa

phần lượng phụ phẩm sẽ loại bỏ đi sau quá trình chế biến Trong khi đó, bã nho chứa

hàm lượng nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học như phenolic, saponin vàproanthocyanidin Việc thu hồi các hợp chất này và ứng dụng vào công nghiệp thựcphẩm sé mang lại hiệu quả kinh tế Đối với việc thu hồi các hợp chất từ nguồn nguyênliệu thực vật, trích ly bằng enzyme được sử dụng rộng rãi vì hiệu quả và là phươngpháp xanh ít ảnh hưởng đến môi trường Tuy nhiên, quá trình trích ly bằng enzyme

có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của loạienzyme (cellulase, pectinase và kết hợp), tỷ lệ enzyme (cellulase: 14 - 56 (U/g),pectinase: 76, 152 (U/g), tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (8:1 — 14:1), nhiệt độ (40 — 60

°C) và thời gian trích ly (60 — 240 phút) đến hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinhhọc (phenolic, saponin va proanthocyanidin tông) trong dịch trích ly từ bột bã nho đãđược khảo sát So sánh hiệu quả của việc trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh họcbằng các phương pháp trích ly đơn lẻ (enzyme, siêu âm) và kết hợp cũng được thựchiện Sau đó, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa điều kiện trích ly

các hợp chất có hoạt tính sinh học trong bột bã nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

Kết quả cho thấy hỗ trợ siêu âm (mật độ năng lượng siêu âm 15 W/g trong 10

phút) trước quá trình trích ly sử dụng kết hợp hai loại enzyme (cellulase và pectinase)cho hiệu quả trích ly cao nhất Dịch trích thu được từ quá trình trích ly bằng enzymeCellulase (42 U/g) và Pectinase (76 U/g) ở điều kiện trích ly tối ưu (ty lệ dung môi:nguyên liệu là 10,5:1, nhiệt độ trích ly 56 °C, thời gian trích ly 125 phú) có hàmlượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao nhất với TPC, TSC, PAC lần lượt TPC13,22 mg GAE/g vck, TSC 40,61 mg AE /g vck và PAC 4,96 mg CE/g vek.

The project "Optimizing conditions for extraction of biologically active

compounds from grape by-products using ultrasound-assisted enzymes" was conducted at the Product Development Laboratory, Department of Chemical and Food Technology at Nông Lam University from June 2023 to December 2023.

In the wine and fruit juice industry from grapes, most of the by-products will

be discarded after processing Meanwhile, grape pomace contains high levels of biologically active compounds such as phenolics, saponins and proanthocyanidins Recovering these compounds and applying them to the food imdustry will bring economic efficiency For the recovery of compounds from plant raw materials,

enzymatic extraction is widely used because it is effective and is a green method with

little impact on the environment However, the enzymatic extraction process can be

affected by many factors In this study, the influence of enzyme type (cellulase,

pectinase and combination), enzyme ratio (cellulase: 14 - 56 (U/g), pectinase: 76, 152 (U/g), solvent ratio: raw materials (8:1 — 14:1), temperature (40 — 60 °C) and extraction time (60 — 240 minutes) to the content of biologically active compounds (phenolic, saponin and total proanthocyanidin ) in the extract from grape pomace

powder was investigated Comparison of the efficiency of extraction of biologically

active compounds by single extraction methods (enzyme, ultrasound) and combined extraction methods was also carried out Afterwards, response surface method was used to optimize the conditions for extraction of biologically active compounds in grape pomace powder using ultrasound-assisted enzymes.

The results show that ultrasound support (ultrasound energy density 15 W/g for 10 minutes) before the extraction process using a combination of two enzymes (cellulase and pectinase) gives the highest extraction efficiency The extract is obtained from the extraction process with enzymes Cellulase (42 U/g) and Pectinase (76 U/g) with optimal extraction conditions (solvent: material ratio is 10.5:1, temperature is 56 °C, time is 125 minutes) has the highest content of biologically active compounds with TPC, TSC, PAC respectively TPC 13.22 mg GAE/g vck, TSC 40.61 mg AE /g vck and PAC 4.96 mg CE/g vck.

VI

MỤC LỤC

Trang Trang tựa

Tang CBA cece eeeeeeceeresceess anscmaeere nese 1

LT CAT IRB ĐksaaesszeorierriiesosgSBgEbitfEoiSEEGSEG7i353G0220129i00TBEDRGH2VEEHS.700%E2iiGT-ESPBGEDM38030430E05003EEĐ 1 Poke cgi) ee ill LO1 CAM 1V

De Tổ cece rt cc Ce sees VPSUS TIA CE xi cate serene teamsnereentenuse tetÐsteoagsösgboigshuiStbxsvnillopbsBdgtgoucox.ĐOn8g/5L35uả miami naeeeeiee vi

Danh sách chữ viết tat c ccccccccccssessessessessessessessessessesseseesessessessessessessesatssesaeeseeaes xDan sach Cac Dang 0 XI Dank SẠCH: 626 With is taxi is te 010101309150 meneame erence RE XU

Se BkằiEnni-DiskdEktrengikdkbinkioisgtdniesdslindingbobjöomdSGixbindooebsitBSdidumogiddkoess 1

Chương 1 TONG QUAN 0 ccscsocsscssessessessesseeseesessessessessessessetsessessessessessessesseeseeseeed

m0 900090767 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong bã nho ©225225z25z25z25+2 41.3 Enzyme Cellulase, enzyme Petinase và các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình

trích ly bằng enzyme ¿- 2 22+2222E22EE2EE22EE22122112212711211221211221 21 2E re 71¿5.1 EmZVTii6 Cellilase Wa, PEG BE cá cá s60 ngLá kg Ha Giá E616.366.0888L35-30304031,488g08210.15688.G0348 7

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng enzyme - 91.4 Phương pháp trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bột bã nho 10

1.4.1 Trích ly bằng enZyme - 2-2 ©2222E£2E2EEEEEE2EEE21221221 21122121 crxe 10(tabs 41; NA“ 111.4.3 Trích ly enzyme có hỗ trợ siêu AM o.oo ee eeece ccs ececsecsecseseesesseeessesuesesseseseeseees 12Chương 2 NGUYEN LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14Dis IN SV CIN HIỂUHosscsassxscs2t16120501/63105065850)GEĐEGEESRSESEEGGHSSS.USQBSSSEGQ23S0230I5XIEGTBSiGU81003/2065800488 14 Doll Nguyốn† Wet WhO se enensendennEBDOSEISEESISDEEESSSTEEDSESESETSRSEESESSIESGESEHSTSA03H 50930985075 14Lat Le 14

Vil

2.1.2.1 Hóa CHAt ecccccccccccccccccscccscsesesesescsesesssssssssesssssssestecsesevevevsvevevavavsvsvsvacavscavsesees 142.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ ©22222222222222221251211211211211211211211211212121 2e 152.2 NGi dung :20 i00 011 15

2.2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu bột bã nho 2 ¿2 +S2+E£EE2E2Ez£+zEzzzzzzzzz 152.2.2 Quy trình trích ly bột bã nho bằng enzyme 2 2 2+22+Sz+S222z222+2 16

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng loại enzyme đến quá trình trích ly các hợp chất có

hoạt tính sinh học từ bột bã nho - ©2222 S2 222221 *223E22E£22EEzEEezererrsres 172.2.4 Xác định tỷ lệ enzyme bồ sung thích hợp cho quá trình trích ly 18

2.2.5 Xác định tỷ lệ dung môi: nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly 18 2.2.6 Xác định nhiệt độ trích ly thích hợp cho quá trình trích ly 19 2.2.7 Xác định thời gian trích ly thích hợp cho quá trình trích ly - lộ

2.2.8 So sánh hiệu quả của phương pháp trích ly bằng enzyme, siêu âm và sự

kết: hợp gia trổ phonon HbA s»seseeensakiiiosvdsgsoakkuESOLg140100)0200001134001800g0006 202.2.9 Tối ưu hóa điều kiện trích ly hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ pham

nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm 2: 22©222222E++EE+2E++E+z2zzzzzrxe2 21

22 Sul s QUY, CHIT TÍÍGH: NY sess: ssasnoss 01601161 tá 244 25g10 suesnns snena annsatons sana sensnsmeemamnmacinuneansi 212.2.3.2 Tối ưu hóa quá trình trích ly bằng phương pháp bề mặt đáp ứng 232:3 Phone phap phan te HecseszessssseeescoeisaEttsggiGHGGESLSIGSRQELSIXGSGSAEISESERHSIGIGEBG01gU8 232.3.1 Ham long nẽ 23

2.3.2 Hàm lượng phenolic tổng (TPC) 0.c:ccsccssessessessessessessesseseessessessessesseeseseees 23

2.3.3 Hàm lượng saponin tổng (TSC) - 2-2222 522222222222222E22E222222E2zrerxee 232.3.4 Hàm lượng proanthocyanidin tổng (20 Os eee ere eer ere eer 24

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 2 2¿22222E22E22E1221222122112112212112212212222 22x 24Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -¿22222222222222E22222222222xzze 25

3.1 Xác định loại enzyme thích hợp cho quá trình trích ly các hợp chất có hoạt

tính sinh học từ phụ phẩm nho -2- 2-22 5225S+2S2E2E£2E£2E2EzEzzzzzzez 25

3.2 Xác định hàm lượng enzyme bồ sung thích hợp cho quá trình trích ly 27

3.3 Xác định ty lệ dung môi: nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly 28 3.4 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly -=-<52 30

Vill

3.1.5 Xác định thời gian trích ly của quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính

Sinh I@e:trong Bột Bà TH sesssessseneaisnocdatindtaSiGi6N8G38/0Đ409836505i0/3h4Bi8Ng8680008010630008i25231)3.2 So sánh hàm lượng trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bã nho

giữa phương pháp trính ly bằng enzyme, phương pháp trích ly bằng siêu

âm và sự kết hợp giữa siêu âm và trích Ìy: 2¿55¿52222>x+2z+zzzxzzxz 33

3.3 Tối ưu quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết

từ bã nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm (U-EAE) - 22-52522554 35

KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ -©2-+SS2E22E£2E2EE2E23221121212121121 2121 xe 45TÀI LIEU THAM KHẢO - 2: 52252+SE2E2EE£2EE2EX27512112711211221711211 2121 Xe 46PHU LỤC ¿-©2++2E22E22E12E127512212711711211271121122121E211221211211 212 1E EEEeree 50

1X

Enzyme-ultrasound-assisted extraction (Trích ly có hỗ trợ enzyme —

siêu âm)

Enzyme-assisted extraction (Trích ly có sự hỗ trợ của enzyme)

Gallic Acid Equrvalent High-performance liquid chromatographyResponse surface methodology — Phương pháp bề mặt đáp ứng

Moisture Content (Độ ầm)

Total Proanthocyanidin Content (Hàm lượng Proanthocyanidin tông)Quercetin Equivalent

Tiéu chuan Viét Nam

Total Phenolic Content (Ham lượng phenolic tổng)Total Saponin Content (Ham lượng saponin tổng)Ultrasound-enzyme-assisted extraction (Trích ly có hỗ trợ siêu âm —

enzyme)

Ultrasound-assisted extraction (Trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm)

Ultraviolet — visible (máy đo quang phổ)

Vật chất khôWeight / volume (khối lượng/ thé tích)Weight / weight (khối lượng/ khối lượng)

DANH SÁCH CÁC BANG

BANG TRANGBang 1.1 Thanh phan của phụ phẩm nho, được tính theo g/ 100g trong lượng

EU OFT scx sternal Sts cS TRE ER i acto tiaaneS 4

Bang 2.1 Tiêu chuẩn kỹ thuật của hai loại enzyme 2- 22 52222zz22z22zz>+2 14Bang 3.1 Bảng thiết kế các khoảng biến thiên trong thí nghiệm 2 35Bang 3.2 Mã hoá và giá trị thực các yếu tố trong thí nghiệm 2 - 36Bang 3.3 Kết quả thí nghiệm tối ưu -52©525525222222zcszserseererseeserxeee 3Ÿ7

Bảng 3.4 Dự đoán hệ số phương trình bậc 2 với các hàm mục tiêu TPC, TSC và

0 38Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thí nghiệm thực tế - 44

XI

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HINH TRANG

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bj mẫu bộ phụ phẩm nho 2 2 22 22222222222 16

Hình 2.2 Quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học trong bột bã nho

bằng enZyme 2-2222 22222222122112212211211221121121121121121121121121 21121 re 17

Hình 2.3 Quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ pham nho

bang enzyme có hỗ trợ siêu AM oo eee eee essessessecsessesseeseesessessesseesesseeseeseeseeseees 21Hình 3.1 Anh hưởng của loại enzyme đến TPC, TSC, PAC trong dịch trích ly 25

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến TPC, TSC, PAC trong dịch trích

)M ,ÔỎ 27Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: nguyên liệu đến TPC, TSC, PAC trong

GGH THIÍGH LW lai xu6 S g0 2018 2y AGSGSESHEDESNGESV-HSIXRIEMGDSHESIQEIGLSGSNEAROĐSEDDRESGĐ3NB.S3i002838 03g88 29Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến TPC, TSC, PAC trong địch trích ly 31Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến TPC, TSC, PAC trong dịch trích

Ly tir 0056:) 1111115

Hình 3.6 Hàm lượng TPC, TSC, và PAC được trích ly bằng các phương pháp

KHẢO THÍ HH costo coe ep tiEE3CEDĐGNGGGLRGLSEXEBIEGIGIISRXENONNHESLSSIEHGRSERHEEEHETBIGHENEDIAGUEIRSEESS 34Hình 3.7 Đồ thị 3D và đường đồng mức thé hiện sự tương tác của các yếu tố

hàm lượng phenolic tỐng 2-22 2-©22222+2E+2E+2E++EE+2EE2EE2EE2EEEEE2EErzxrzrxeex 40

Hình 3.8 Đồ thị 3D và đường đồng mức thể hiện sự tương tác của các yêu tố

kim Ty In HN loa no eaoouiitroioigigbsiigiGig0540R0i08013000807933000805g xeagi 41Hình 3.9 Đồ thị 3D và đường đồng mức thể hiện sự tương tác của các yêu tố

đến hàm lượng proanthocyanidins -2- 2 22222z+2z22++2xz2Ez+zxrzxzzzxees 42

Hình 3.10 Mô hình tối ưu điều kiện trích ly các hợp chất có hoạt chất sinh học

tly Ot DA MO 11 43

Xil

DAT VAN DE

Ly do chon dé tai

Ba nho là một phụ phẩm của quá trình san xuất rượu vang, chiếm khoảng 25% khối lượng của nho nghiền sản xuất rượu vang Hạt nho giàu các hợp chất nhưphenolic acid, proxyanidins, resveratrol Lợi ích về sức khỏe của hợp chất sinh họcphenolic trong bã nho bị thu hút bởi nhiều nhà nghiên cứu, nhà sản xuất và kháchhàng Ngoài chất chống oxy hóa phenolic, bã nho còn chứa hàm lượng đáng ké chatbéo, protein, chất sơ không hòa tan và chất khoáng Hạt nho chứa 13-19% chất béo

20-mà rất giàu axit béo thiết yếu, protein khoảng 11%, carbohydrate không tiêu hóa vàchất chống oxi hóa không phenolic như tocopherols và beta-carotene (Yu vàAhmedna, 2013).

Bên cạnh phenolic, các hợp chất triterpenoid cũng có thê hiện diện trong bãnho Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng cao vì chúng có đặc tính chống đáitháo đường, chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan và bảo vệ

da day, với axít ursolic là một trong những chat có nguồn gốc tự nhiên đầy hứa hentrong việc phòng ngừa và điều trị ung (Yu và Ahmedna, 2013) Vì vậy, việc khaithác hiệu quả bã nho như một nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học có lợi và rẻtiền, có thể được sử dụng thành công trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹphẩm và dược phẩm là một hướng đi bền vững Ngoài các phương pháp trích ly cáchợp chất chứa hoạt tính sinh học chủ yếu từ hợp chất hữu cơ thì phương pháp xanh

được chú ý nhiều hơn do mang lại nhiều lợi ích về tiết kiệm chi phí, năng lượng, thân

thiện với môi trường cũng như giảm lượng dung môi xử dụng như: trích ly lỏng siêu

tới han (SFE), trích ly bằng enzyme ( EAE), trích ly có hỗ trợ siêu âm ( UAE), trích

ly bằng vi sóng ( MAE) Ngoài ra, việc trích ly sử dụng kết hợp giữa hai phươngpháp mang lại hiệu quả trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học được ké đến đó làphương pháp trích ly bang enzyme có hỗ trợ siêu âm ( UAEE) Một vai thí nghiệm

đã sử dụng siêu âm dé hỗ trợ enzyme cellullase và pectiness trích ly lycopene từ vỏ

cả chua; trích ly dầu từ cây thông pumila đã mang lại hiệu quả cao trong việc trích ly

so với các phương pháp đơn (Wen và ctv, 2020) Chính vì vậy, phương pháp trích lybằng enzyme được hỗ trợ siêu âm (UAEE) được chọn làm phương pháp nghiên cứu

để tìm ra điều kiện tối ưu nhất khi trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bột

bã nho.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được các thông số tối ưu cho quá trình trích ly các hợp chất có hoạt

tính sinh học từ bột bã nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm nhằm thu được hiệu quả

trích ly cao nhất

Ý nghĩa của đề tài

Y nghia khoa hoc

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hợp chat có hoạttính sinh học từ bột bã nho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

Kết quả của đề tai là tài liệu tham khảo cho trích ly các hợp chất có hoạt tinhsinh học từ các nguồn phụ phẩm thực vật

Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo

Ý nghĩa thực tiễn

Nâng cao hiệu quả sử dụng, góp phần đưa ra hướng giải quyết vấn đề về lượnglớn phụ phẩm trong công nghiệp chế biến của ngành sản xuất rượu vang, nước ép nhotại Việt Nam.

Tính mới đề tài

Tối ưu hóa quá trình trích ly các hợp chat có hoạt tinh sinh học từ bã nho Red

Cardinal bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

Ở Việt Nam, Ninh Thuận được xem là thủ phủ các loại nho đa dạng nhất nước.

Một số giống nho chính đang được trồng tại Ninh Thuận gồm: nho xanh Ninh Thuận,nho đỏ Ninh Thuận, nho đỏ ngón tay, nho đen ngón tay và nho thân gỗ Trong đógiống nho đỏ Ninh Thuận (Red Cardinal) là giỗng nho thuần Việt, cây phát triểnkhỏe, dé trồng và dé chăm sóc và năng suất cao Trái có hình cầu, bằng đầu ngón tay,

vỏ mỏng có màu hồng nhạt đến đỏ đậm, vị ngọt hài hòa và chua nhẹ Chính vì năngsuất cao, vị chua ngọt hài hòa và được trồng quanh năm, trái nho được sử dụng dạng

tươi và cũng được sử dụng nhiều trong sản xuất rượu, nước ép trái cây

Nho là loại trái cây rất phô biến trên thế giới ké cả Việt Nam khi được ứng

dụng lớn trong ngành sản xuất nước giải khát và đặc biệt là ngành sản xuất rượu vang

Chính vì thé, phụ phâm nho thải ra hàng năm từ nganh công nghiệp này vô cùng lớn,chiếm khoảng 20% trọng lượng còn lại của nho sau khi ép dịch trích ly bao gồm cả

vỏ, hạt và cuốn nho Trong khi đó, một lượng lớn các hợp chất sinh học vẫn giữ lạikhá lớn trong phụ phẩm nho này Vì thế, các nhà khoa học đã nghiên cứu các hợpchất sinh học trong phụ phẩm nho cùng với các phương pháp trích ly phù hợp vànhững ứng dụng cụ thé trong công nghiệp mỹ phẩm ,y học và thực phẩm

Bảng 1.1 Thành phan của phụ phẩm nho, được tinh theo g/ 100g trọng lượng tươi

1.2 Các hợp chất có hoạt tinh sinh học trong bã nho

Phenolic là hợp chất chuyên hóa thứ cấp của thực vật Về mặt hóa học,phenolic có thé được định nghĩa như một chất có vòng thom mang một hoặc nhiềunhóm hydroxyl, bao gồm các dẫn xuất chức năng của chúng Phenolic là những hợp

chất mà chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl phenol mang một hay nhiều vòng thơm

(Yu và Ahmedna, 2013) Trong nghiên cứu khoa học thực phẩm, hợp chất phenolic

tự nhiên được phân loại chung thành những loại chính và phụ dựa trên cấu trúc hóa

học tương tự, đó là loại khối xây dựng dẫn xuất dạng các đơn vị lặp lại Bốn nhóm

chính của phenolic được tìm thấy trong thực phẩm là acid phenolic, lignans vàstilbenes Những stilbenoid chính được tìm thay trong thực phẩm có nguồn gốc thựcvật là resveratrol và glycosids của nó Resveratrol là một phytoalexin được sản xuất

trong thực vật đề phản ứng lại sự tấn công của mầm bệnh Nó có độc tính thấp đối

voi con người và là chất diệt nắm tự nhiên Axít phenolic là phenol có một nhómchức axit carboxylic và được chia làm hai loại đó là axít hydroxycinnamic và axithydroxybenzoic Thực tế, axit hydroxycinnamic phổ biến hơn axit hydroxybenzoic

và chúng bao gồm thành phần chính như axit gallic, p-coumaric, caffeic, axit

chlorogenic, ferulic và axít sinapic (Yu và Ahmedna, 2013).

Phenolic được nghiên cứu rộng và sâu nhất chính là những flavonoids Dựavào cấu trúc phân tử của chúng được chia làm bảy lớp nhỏ: flavones, flavanones,flavonols, isoflavones, anthocyanidins/anthocyanins, flavanols (hay catechins và

procyanidins) và chalcones (Karakaya, 2004) Một nhóm khác của flavonoids màkhông bao gồm trong phân lớp này đó chính là proanthocyanidins hay còn gọi làprocyanidins, condensed tannins hay oligomeric procyanidins (Prior va Gu, 2005).Mặc dù phenolic hiện tại trong hau như trong tat cả các loại thức ăn có nguồn gốcđộng vật nhưng các loại trái cây như nho, táo, việt quốc và nam việt quốc thì cực kỳgiàu những hợp chat sinh học này Trong quả nho, thì các hợp chất phenolic chủ yêu

ở vỏ, hạt và cuốn nho Vỏ nho thì rất giàu chất chồng oxi hóa phenolic trích ly được(10-11% trọng lượng khô) Anthocyanins, catechins, proxyanidins, flavonolglycosides và stilbenes là những phenolic quan trọng được tìm thấy trong bã nho (Yu

và Ahmedna, 2013) Không những thành phần phenolic trong các giống nho khácnhau ma còn khác nhau trên các phần của quả nho Nho đỏ rất giảu anthocyaninins,

nó là một phenolic chính trong nho đỏ, khoảng 69 -151 mg/kg trong lượng nho tươi,trong khi đó flavan-3-ols là phenol phong phú nhất trong các nhóm nho trắng chiếmkhoảng 52-§1 mg/kg trọng lượng nho tươi (Yu và Ahmedna, 2013) Nghiên cứu vềhàm lượng của hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxi hóa đã cho thấy trongcatechin là hợp chất không anthocyanic phong phú nhất được xác định trong bã nho(150,16 mg/100g) cho tat cả các giống Giống nho đỏ Cabernet Sauvignon chứa hamlượng cao nhất hợp chat phenolic tổng (75 mg/g), trong khi giống Bordeaux cho thayhàm lượng tổng số anthocyanins cao nhất Vỏ nho, một phan của bã nho được chứngminh là nguồn giàu anthocyanins, axit hydroxycinnamic, flavanol và flavonolglycoside, trong khi axít gallic và flavanol chủ yêu có trong phan hạt (Kammerer vactv, 2004) Theo phân tích của Montealegre và ctv (2006) thì vỏ nho đỏ chứa nhiềuhydroxycinnamates and flavonols hơn là vỏ nho trắng Vỏ nho đỏ chứa lượnghydroxycinnamates cao hơn vỏ nho trắng (31-55 mg/kg nho tươi), nhưng lượngcatechin thấp hơn nhiều (9,0—18 mg/kg nho tươi), chat làm mờ procyanidin (8,0-18mg/kg nho tươi) và tổng số flavonols (12—19 mg/kg nho tươi)

Các proanthocyanidin tạo nên vị đắng của sôcôla, vị chát của đồ uống và tráicây do chúng có khả năng tạo phức hợp với protein nước bọt PAC có thể được sửdụng như một chat phụ gia thực phẩm dé tạo ra tính làm se, tính 6n định của vi sinh

vật, khả năng tạo bọt, én định oxy hóa và ôn định nhiệt cho các sản phẩm thực phẩm.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng PAC giúp bảo vệ cơ thê khỏi tác hại của ánh nắng mặttrời, cải thiện thị lực, cải thiện tính linh hoạt của khớp, động mach và các mô cơ thé

như tim và cải thiện lưu thông máu bằng cách tăng cường mao mạch, động mạch và

tĩnh mạch Các phức hợp proanthocyanidin oligomeric (OPC) đã được báo cáo déchứng minh các hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virút, chống ung thư,chống viêm, chống dị ứng và giãn mạch Chúng có thể ức chế peroxide hóa lipid, kết

tụ tiêu cầu và tăng tính thấm của mao mach (Fine, 2000)

Saponin là các hợp chất glycosid không bay hơi tự nhiên được tìm thấy trong

phần lớn thực vật 'Saponin' bắt nguồn từ tiếng Latinh 'Sapo' có nghĩa là 'xà phòng',

nôi tiếng với đặc tính tạo bọt (Góral và ctv, 2020) Saponin được đặc trưng bởi vô sốtính chất vật lý của chúng, bao gồm vị ngọt và vị đắng Đã có nhiều nghiên cứu liên

quan đến việc sử dụng saponin như một chất phụ gia hiệu quả đề hình thành va ổn

định nhũ tương dau trong nước và nano (Liao và ctv, 2021).Triterpenoid bao gồm cảsteroid là một nhóm rất đa dạng các sản phẩm tự nhiên phân bố rộng rãi trong thựcvật Saponin triterpenoid bao gồm một aglycone triterpene, với 30 nguyên tử carbon,với một hoặc nhiều gốc đường (bao gồm hexose, methylpentose và pentose) đượcgắn vào aglycone (Augustin & ctv, 2011) Triterpenoid saponin có thé được tìm thaytrong các loại đậu như cỏ linh lăng, đậu xanh, đậu tằm, đậu tương, đậu lăng, đậuphộng, hạt hướng dương, rễ nhân sâm và các loài chi hành khác, trong khi saponinsteroid được tìm thấy trong cây Yucca, hat ca chua, rễ nhân sâm, khoai mỡ, cả tím,hat co cà ri, mang tây, ớt chuông Saponin thé hiện một loạt các hoạt động sinh hoc

như hoạt động chống vi khuẩn hoặc chống côn trùng, được sản xuất dưới dạng các

phân tử bảo vệ thực vật dé đối phó với các mối đe dọa sinh học, mầm bệnh và độngvật ăn cỏ Trong bối cảnh sức khỏe con người, saponin thể hiện nhiều đặc tính dược

lý, bao gồm các hoạt động chống cholesterol máu, chống ung thư và tán huyết Ngoàicác ứng dung được lý, saponin được sử dụng trong công nghiệp tay rửa và mỹ phẩm

do đặc tính tạo bọt của chúng.

Hàm lượng phenolic trên mỗi phần của bã nho khác nhau tùy theo giống nho

và chịu sự ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, độ trưởng thành và thời gianlên men (Montealegre và ctv, 2006) Năng suất trích ly được trên mỗi quả của tất cả

các phenolic giảm theo độ chín và theo sau động học bậc hai Hàm lượng phenolic

trong hạt nho trắng và nho đỏ là như nhau Tuy nhiên catechin, epicatechin và

procyanidin B1 trong hạt nho đỏ thi cao hơn Nhìn chung thì hạt nho chứa ít hàm lượng phenolic hon vỏ nho nhưng lại giàu catechins và procyandins (Castillo-Muñoz

và ctv, 2010).

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rang các hợp chất phenolic phụ phẩm nhochủ yếu gồm: flavonoid, saponin triterpenoid và proanthocyanidin, cụ thể làproxyanidins mang lại nhiều lợi ich cho sức khỏe như chống lại ung thư và các hoạtđộng chống lại ung thư; chống oxi hóa và chống viêm (Yu và Ahmedna, 2013); phòngngừa và giảm thiểu các bệnh tim mạch; tăng cường tuổi thọ và làm chậm các dấu hiệuliên quan đến tuôi thọ Các hợp chất hoạt tính sinh học chính chịu trách nhiệm vềnhiều lợi ích sức khỏe được báo cáo của rượu vang và các sản phẩm phụ của rượu

nam soi Penicillium, Tricoderma va Aspergillus được xem là những nguồn nguyênliệu chủ yếu sản xuất enzyme này từ quy mô thí nghiệm quy mô ngành công nghiệp(Singh, 2021) Cellulose là hợp chất tự nhiên khá bền, không tan trong nước, chỉ bịtrương phông do hút nước, bị phân huỷ khi đun nóng với kiềm hay axít hoặc do cácenzyme được gọi chung là cellulase Trong tế bào thực vật cellulose liên kết chặt chẽvới hemixenluloza, pectin, lignin Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phân hủycellulose của enzyme Chính vi vậy, dé tối ưu hóa khả năng trích ly của enzyme,người ta thường kết họp việc sử dung cellulose với pectinase hoặc hemicellulase dé

tăng cường khả năng trích ly (Singh, 2021).

Enzyme Pectinase

Cũng tương tự enzyme cellulase thì pectinase cũng khá phổ biến, được sảnxuất công nghiệp từ nguồn góc vi sinh vật do khả năng phát triển nhanh, dòng đời

ngắn và dé thao tác di truyền Bên cạnh đó, pectinase sử dung trong nhiều lĩnh vực

quan trọng chẳng hạn như thực phẩm, dệt may, đồ uống, bột giấy và giấy, và nhiên

liệu sinh học công nghiệp chiếm khoảng 25% thị phần được sử dụng rộng rãi trongcông nghiệp và thực phâm trên toàn thế giới (Haile, 2022)

Theo Theo Bùi Xuân Đông (2019), pectin là cơ chất của enzyme pectinase.Pectin rất phô biến trong thực vat, là hợp chất polyme tự nhiên tồn tại có 3 dang:protopectin, pectin và axit pectinic Protopectin không tan có trong thực vật xanh, tạocho rau quá xanh có độ cứng nhất định, bị thuỷ phân bởi axít hay nhiệt độ, enzyme

sẽ chuyền thanh pectin hòa tan (quá trình chín của quả có thé gọi là quá trình chuyênhoá này) Pectin là este metyl của axit polygalacturonic Tinh chất quan trọng nhấtcủa pectin là dé tạo gel ở nồng độ dịch đường cao 65% trong môi trường 1% axít.Axít pectinic là một axít polygalacturonic nhưng chỉ được este hoá một phần nhỏ bởi

metanol Còn axit pectic hay polypectic là axít đã được giải phóng khỏi nhóm metoxy

(— OCH3) Muối tương ứng có tên là pectinat và pectat Liên kết chính trong pectin

là a — 1,4 - glycosit Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhómchính: hydrolase và transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt củadung dich pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành Pectinase

được định nghĩa là enzyme hỗn hợp thủy phân các chất pectic, chủ yếu là có trong visinh vật và thực vật bậc cao, là tập hợp các enzym xúc tác các chất chứa pectin dothực vật và vi sinh vật tạo ra.

Pectinase tham gia vào quá trình trao đổi chat của thành tế bào cũng như trong

sự phát triển của tế bào, lão hóa, quá trình chín của quả, cơ chế bệnh sinh và quá trình

rụng qua Enzyme này đã được điều chế thương mai từ vi sinh vật đặc biệt là từ nam

từ những năm 1970 Theo ủy ban enzyme và quốc tế hợp sinh hóa, enzyme pectinaseđược phân loại thuộc nhóm hydrolaza.

1.3.2 Các yếu tố ảnh hướng đến quá trình trích ly bằng enzyme

Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng giữa enzyme với cơ chất.Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định và khi vượt quá nhiệt

độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu Hoạt độ enzyme cũng

không phát huy tôi đa ở nhiệt độ thấp Chính vì thé, hệ số nhiệt Q10 dùng dé biểu thịảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Trong đó nhiệt độ tối ưu là nhiệt độtương ứng với tốc độ phản ứng cao nhất của enzyme Nhiệt độ tối ưu của một enzymephụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH và các chất bảo vệ Trongsản xuất, chế biến thực phẩm, nhiệt độ thường được sử dụng làm yếu tố chính dé điềukiến hoạt động và tốc độ của enzyme Nhiệt độ tới hạn là nhiệt độ mà tại đó enzyme

bị bat hoạt hoàn toàn hoạt tính (Lê Thanh Hải, 2013)

Thời gian thủy phân: Trong thời gian đầu tốc độ của quá trình thủy phân xảy

ra càng mạnh, càng về sau do nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ 12 sản phẩmtạo ra càng tăng, đồng thời do độ bền của enzyme giảm theo thời gian nên tốc độ củaphan ứng thủy phân giảm dan (Nguyễn Trọng Can, 1998)

Nong độ enzyme: trong điều kiện thừa cơ chat, tốc độ phản ứng bậc nhất phụthuộc vào nồng độ enzyme Khi cơ chất tăng thì nồng độ enzyme tăng, vận tốc tăng.Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốckhông thay đổi (Lê Thanh Hải, 2013)

pH: Tương tự như nhiệt độ, mỗi enzyme cũng hoạt động tối ưu ở một giới hạn

pH nhất định pH quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme.Nhiều enzyme thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, pH acid yếu, một số loại kháchoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức

độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vìthế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme và sử dụng pH đều điều hòaphản ứng trong quy trình chế biến khi sử dụng enzyme (Lê Thanh Hải, 2013)

Diện tích tiếp xúc: Đề tạo điều kiện tốt cho quá trình thủy phân bằng enzyme

là cần tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất bằng cách phải làm nhỏ kích

thước của cơ chất trước khi trích ly Chính vì vậy, diện tích tiếp xúc cũng là một trongcác yếu tố thúc day quá trình thủy phân (Nguyễn Trọng Cần, 1998)

1.4 Phương pháp trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bột bã nho

1.4.1 Trích ly bằng enzyme

Việc sử dụng các enzym cũng là một nguồn tài nguyên lớn bởi vì thông qua

xử lý bằng enzyme, có thể tăng cường giải phóng các phenolic bị giữ lại bên trongcau trúc tế bào của bã nho, điều này làm tăng giá trị các hợp chat phenolic từ bã nho

Hàm lượng thu hồi của các hợp chất phenolic có thể đạt được bằng một enzyme hoặc

kết hợp của các enzym khác nhau, nhằm đạt được hiệu quả lớn hon (Lima, 2017) Đó

là lý do tại sao, quá trình thủy phân bằng enzyme có thê là một lựa chọn đề thúc đâyquá trình giải phóng phenolic vì nó chọn lọc hơn so với việc sử dụng dung môi hữu

cơ Ngoài ra, điều này còn giảm thiêu sự thất thoát hợp chất phenolic do điều kiện pHkhắc nghiệt và thời gian trích ly ngắn (Dominguez-Rodriguez và ctv, 2021) Mỗi loại

enzyme có hoạt tính khác nhau và có thé tác động lên mỗi loại cơ chất nào đó dé cuối

cùng chọn được loại enzyme phù hợp hỗ trợ phá hủy thành tế bào dé ethanol dé dangtiếp xúc với các hợp chất trong cơ chất tăng hiệu suất trích ly cao nhất cho quá trìnhtrích ly các hợp chất sinh học Enzyme thâm nhập hiệu quả vào bên trong các mảnh

mô của tế bào thực vật, và giải phóng hiệu quả các hợp chất sinh học với dịch trích

ly chất lượng cao và hàm lượng hợp chất gây nhiễu thấp

10

Những thí nghiệm cho thấy Enzyme Cellulase từ chủng Aspergillus niger đã

hiệu qua trong việc trích ly Reservatrol, enzyme Cellulase từ chủng Aspergillus niger

với nồng độ 0,2% dé trích ly Resveratrol từ day gam Mặt khác, theo Kiên va ctv(2021) đã nghiên cứu quá trình xử lý thu dịch quả nho phù hợp cho lên men rượuvang đã bằng kết hợp hai loại enzyme (Pecinex SPL và Pectinex Ultra Clear) có kếtquả thu hồi và chất lượng dịch quả cao quả có chất lượng cảm quan tốt nhất về hương

vị, màu sắc và độ bền keo Dịch quả nho đỏ xử lý kết hợp bằng enzyme Pecinex SPLnồng độ 0,03% ở nhiệt độ 30 - 40°C trong thời gian 120 phút và enzyme PectinexUltra Clear nồng độ 0,25% ở nhiệt độ 40 - 60°C trong thời gian 60 phút là phù hợpnhất Và dịch quả nho trắng xử lý kết hợp bằng enzyme kết hợp hai loại trên ở nhiệt

độ 40°C và trong thời gian 120 phút là phù hợp nhất Bên cạnh đó, pectinaze vàcelluclast là hai trong năm loại enzyme được xử dụng để trích ly các hợp chất sinh

học từ phụ phẩm nho có hàm lượng trích ly các hợp chất phenolic cao hơn so với

trích ly không có enzyme (Ferri va ctv, 2023; Lima, 2017).

Trong thi nghiệm nay, enzyme được sử dung cho quá trình trích ly các hop

chat sinh học trong phụ phâm nho là sự kết hợp giữa hai loại là pectinaze và celluclast

là hai trong năm loại enzyme được xử dụng để trích ly các hợp chất sinh học từ phụphẩm nho có hàm lượng trích ly các hợp chất phenolic cao hơn so với trích ly không

có enzyme (Ferri và ctv, 2023; Lima, 2017) Bên cạnh những ưu điểm vượt bậc khi

sử dụng enzyme để trích ly các hợp chất sinh học, việc chọn loại enzyme đặc thù, sựkết hợp giữa các enzyme với nhau, nồng độ, tỉ lệ vơi cơ chất thì thời gian, nhiệt độtrích ly anh hưởng đáng kể tới năng suất thu hồi các hợp chất sinh học cần phải đượckhảo sát để tối ưu hóa cho phương pháp này

1.4.2 Trích ly bằng siêu âm

Siêu âm là quá trình xâm thực vào tế bào thực vật bằng lực cắt cao, tạo ra bong

bóng trong môi trường lỏng Kích thước của bong bóng cộng hưởng tỷ lệ thuận với

sóng siêu âm và công suất, dẫn đến tác động lớn của vụ né khi kích thước của bongbóng tăng lên Điều này gây ra sự phân mảnh, hình thành lỗ rỗng và trộn lẫn trong

mô, làm tăng khả năng khuếch tán và cải thiện hiệu suất trích ly và giải phóng các

11

hợp chat sinh học hòa tan vào trong dung môi Ngoài ra, dé tăng công suất siêu âm,nên đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ của quá trình và giảm độ ẩm trong mẫu, điềunày làm tăng bề mặt tiếp xúc với dung môi, dẫn đến hiệu quả tốt hơn và giảm thờigian siêu âm (Yusoff và ctv, 2022) Những lợi thế của UAE mang lại từ sự thâm nhập

của dung môi vao vật liệu tế bao, do đó giảm thời gian xử lý và tinh lâu dài, tăng năng

suất của sản phẩm, giảm tiêu thụ dung môi và năng lượng dé xử lý

Một số nghiên cứu đã ứng dụng UAE đã cho thấy đây là một phương pháptrích ly hiệu qua dé thu hồi các hợp chất phenolic từ bã nho (Drevelegka và ctv, 2020)

Phương pháp UAE áp dụng cho dầu hạt nho giảm thời gian trích ly với kết quả thu

hồi phenolic khả quan Da Porto và ctv (2013) đã áp dụng cho vỏ nho cho phép trích

ly anthocyanin và hợp chất phenolic Anthocyanins (TA) va phenolic (TP) được trích

ly từ bã Việt Quốc và lượng thu hồi của hai thành phần trên được cho thấy cao hơnhắn so với phương pháp trích ly dung môi hữu cơ truyền thông UAE mang lại những

ưu điểm như thời gian trích ly ngắn, vận hành tương đối dé dàng, tiêu thụ nhiệt độ vàdung môi thấp hơn, tiết kiệm năng lượng và hiệu suất cao

1.4.3 Trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm

Ngoài việc sử dụng enzyme giúp trích ly hiệu quả các hợp chất có tính chấtsinh học hoặc chỉ sử dụng siêu âm để trích ly thì nhiều bài báo khoa học đã cho thấyhiệu quả hơn khi kết hợp giữa hai phương pháp này Sóng siêu âm sẽ đây nhanh tốc

độ truyền khối, tăng cường khả năng xâm nhập của dung môi vào sâu bên trong tếbào, đặc biệt khi tế bào thực vật bị phá vỡ, phân mảnh, tăng cường diện tích tiếp xúcdung môi, các hợp chất sinh học được trích ly ra dung môi dễ dàng và nhanh hơn

Trong khi đó enzyme Pectinase và cellulase có khả năng thâm nhập, phá vỡ màng và

thành tế bào, để dung môi thâm nhập hiệu quả vào bên trong các mảnh mô của tế bàothực vật, và giải phóng hiệu quả các hợp chất sinh học với dịch trích ly chất lượng

cao và hàm lượng hợp chất gây nhiễu thấp Tuy nhiên enzyme không thủy phân được

hoàn toàn chất nền trong thành tế bao cũng như tăng khả năng truyền khối của dungmôi vào tế bào Chính vì vậy, sự trích ly các hợp chat sinh học bằng enzyme có hỗtrợ sóng siêu âm sẽ mang lại hàm lượng các họp chât sinh học cao hơn so với các

12

phương pháp đơn lẻ và độ tinh khiết cao Theo Drevelegka va ctv (2020) hop chat

phenolic sau khi được trích ly bằng enzyme, được xử lý siêu âm sẽ tăng được hàmlương trích ly các hợp chất sinh học được tối ưu hóa về mặt khối lượng và độ tinhkhiết Wu và ctv (2014) đã cho thấy tỉ lệ thu hồi của polysaccharides từ bí đỏ khi so

sánh giữa hai phương pháp chỉ sử dụng EAE, UAE và UAEE thì kết quả chỉ ra rằng

tỉ lệ thu hồi polysaccharides đạt mức tối đa khi sử dụng kết hợp giữa enzyme va siêu

âm là 4.33 + 0,15% trong thí nghiệm Tương tự, Yang và ctv (2017) cũng đã cho thấykhi sử dụng hai phương pháp kết hợp UAEE để trích ly hợp chất arabinoxylan từ cám

lúa mỳ cao hơn (14,26 + 0,17%) so với sử dung phương pháp EAE hoặc UAE Bên

cạnh đó, thí nghiệm kết hợp giữa UAE và EAE của Luo và ctv (2018) cũng cho thấy

trích ly hợp chất tanni từ quả sồi cao hơn so với thí nghiệm sử dụng EAE (Wen,2020).

13

Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguyên liệu nho

Phụ phẩm trong quá trình chế biến nho được thu gom từ Công ty TNHH SX

TM DV Ba Mọi, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam Phu phẩm nho sau khi thu gom tại công

ty được vận chuyên về Khoa Công Nghệ Hóa Học và Thực Phẩm Nguyên liệu sau

khi loại cảnh, hạt được sấy bơm nhiệt (35 °C),(độ 4m < 10%) Sau đó, bã nho khô

được xay mịn, sàng (< 0,5 mm), đóng gói hút chân không và bao quản ở nhiệt độ

-18°C đến khi sử dụng

Enzyme được sử dụng trong thí nghiệm gồm enzyme Cellulase (Cellulast1.5L) va enzyme Pectinase (Pectinex Ultra SP-L)được mua từ Novazymes với nhữngtiêu chuẩn kỹ thuật tại Bảng 2.1

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn kỹ thuật của hai loại enzyme

Enzyme Cellulast 1,5L Pectinex Ultra SP-L Khoang pH 3,4-5,5 3,5-4,5

pH Tối ưu 4,8-5,0

Khoang nhiét d6 (°C) 30-55 15-55

Nhiệt độ tôi ưu ~50 30-45

Hoạt tính 700 EGU/g 3800 PGNU/mL

10% (Xilong, Trung Quốc), Vanillin 4% va 8% (HiMedia Laboratories, An Độ),H2SO4 72% (Xilong, Trung Quốc), HCl 36% (Xilong, Trung Quốc).

Các hóa chất, chất chuẩn dùng cho mục đích định tính va định lượng vớiHPLC: catechin, , gallic acid, rutin.

2.1.2.2 Thiét bi va dung cu

- Thiét bi: UV-Vis Agilent 8453 (Agilent technologies, Inc, USA), may saybơm nhiệt (Việt Nam), cân phan tích PA3202 (Ohaus, USA), cân phân tích CPA-324S (Sartorius, Germany), máy ray (Jisico, Hàn Quốc), máy đo âm hồng ngoại MF-

50 (AND, Nhật Ban), tủ lạnh, máy khuấy, bể ồn định nhiệt WEB 6, máy khuấy từ,máy ghép mi, tủ say Ecocell LIS-B2V/EC55

Dụng cụ: Micropette, cốc thủy tinh, ống nghiệm, pipette, găng tay cao su,parafilm, đũa thủy tinh, bình cồn, cuvet thủy tinh, túi nilong bóng dẻo PE, bình định

mức, túi nhôm 2 mặt.

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu bột bã nho

Quy trình chuẩn bị mẫu bột từ bã nho được trình bày qua Hình 2.1 Cụ thể,phụ phẩm nho sau khi thu gom tai công ty duoc vận chuyền về Khoa Công nghệ Hóahọc và Thực phẩm Bã nho sau khi đem về được cân tổng khối lượng trước khi sơchế, bóc tách bã nho riêng từng phan thịt quả, hạt và thân Sau đó cân khối lượng từngthành phần đã được tách riêng và ghi nhận kết quả Sau đó, nguyên liệu được sấybơm nhiệt ở nhiệt độ 35°C đến độ âm < 10% Nguyên liệu sau khi sấy được xaynhuyễn và rây bằng máy xay tốc độ cao Tiếp đó, cho bột rây qua kích thước 0,5 mm.Phần bột thu được cho vào bao nhôm chắn sáng và ghép mí với khối lượng mỗi bao

là 20 g dùng làm mẫu cho mỗi lần thí nghiệm trong toàn đề tài Mẫu bột được đónggói trong bao nhôm và bảo quản ở -18°C cho đến khi sử dụng

15

; A Ộ Bao gói nhôm

Bảo quản cai

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu bộ phụ phẩm nho2.2.2 Quy trình trích ly bột bã nho bằng enzyme

Quy trình trích ly tổng quát các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bã nho bằng

enzyme được bay bay qua Hình 2.2.

16

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme đến quá trình trích ly các hợpchat sinh học trong bã nho Từ đó chọn ra loại enzyme phù hợp nhất đề tiến hành cácthí nghiệm tiếp theo.

Yếu tố thí nghiệm: Loại enzyme (Enzyme pectinase (76 U/g), enzymecellulase (14 U/g) va sự két hop cua ching)

17

Yếu tố có định

- Bột bã nho: kích thước < 0,5 mm, độ âm < 10%, khối lượng 5g

- pHban đầu là 4,5

- Nhiệt độ thủy phân 50°C, thời gian 2 giờ.

- Tilé dung môi: nguyên liệu là 10:1 (v/w).

— Chỉ tiêu theo doi: TPC, TSC, PAC.

2.2.4 Xác định tỷ lệ enzyme bồ sung thích hợp cho quá trình trích ly

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình trích ly các hợpchat sinh học trong bã nho Từ đó chọn ra tỉ lệ enzyme thích hợp dé tiễn hành các thinghiệm tiếp theo

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí lyếu tố với 3 lần lặp lại

Yếu tổ thí nghiệm: Ty lệ enzyme (tỷ lệ cellulase: 14, 28, 42 và 56 (U/g); tỉ lệpectinase: 76 và 152 (U/g)).

Yếu tố có định

- Bột bãnho: kích thước < 0,5 mm, độ âm < 10%, khối lượng 5g

- pH ban đầu là 4,5

- Nhiét độ thủy phan 50°C, thời gian 2 gio.

- Tilé dung môi: nguyên liệu là 10:1 (v/w).

Chỉ tiêu theo đõi: TPC, TSC, PAC.

2.2.5 Xác định tỷ lệ dung môi: nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly

Mục dich: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: nguyên liệu đến quá trìnhtrích ly các hợp chat sinh học trong bã nho Từ đó chọn ra tỉ lệ thích hợp dé tiến hànhcác thí nghiệm tiếp theo

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 1 yếu tố với 3 lần lặp lại

Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ dung môi: nguyên liệu/ (w:/w), gồm 4 nghiệm thức(8:1, 10:1, 12:1 và 14 :1, w/w).

Yếu tố cố định:

- Bột bã nho: kích thước < 0,5 mm, độ 4m < 10%, khối lượng 5g

- pH ban đầu là 4,5

18

- Nhiệt độ thủy phân 50°C, thời gian 2 giờ.

- _ Tỉ lệ enyme kết hợp là kết quả của thí nghiệm 2.2.4

Chỉ tiêu theo doi: TPC, TSC, PAC.

2.2.6 Xác định nhiệt độ trích ly thích hợp cho qua trình trích ly

Mục đích: Tìm ra nhiệt độ thủy phân thích hợp đề các hợp chất sinh học đượctrích ly hiệu quả nhất

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với

- Thời gian thủy phan 2 giờ.

- _ Tỉ lệ enyme kết hợp là kết quả của thí nghiệm 2.2.4

- _ Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là kết quả của thí nghiệm 2.2.5

Chỉ tiêu theo doi: TPC, TSC, PAC.

2.2.7 Xác định thời gian trích ly thích hợp cho quá trình trích ly

Mục đích: Tìm ra thời gian và nhiệt độ thủy phân thích hợp dé các hợp chatsinh học được trích ly hiệu quả nhất

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với

Tỉ lệ enyme kết hợp là kết quả của thi nghiệm 2.2.4

- Ti lệ dung môi/ nguyên liệu là kết quả của thí nghiệm 2.2.5

Nhiệt độ trích ly là kết quả của thí nghiệm 2.2.6

19

Chỉ tiêu theo doi: TPC, TSC, PAC.

2.2.8 So sánh hiệu quả của phương pháp trích ly bang enzyme, siêu âm va sựkết hợp giữa hai phương pháp

Mục đích: So sánh hiệu quả trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bột

bã nho bằng các phương pháp trích ly khác nhau là trích ly có hỗ trợ siêu âm (UAE),

trích ly có hỗ trợ enzyme (EAE) và kết hợp của hai phương pháp (E-UAE, U-EAE)

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với

3 lần lặp lại

Yếu t6 thí nghiệm: Phương pháp trích ly (EAE, UAE, E-UAE, U-EAE)Trích ly có hỗ trợ enzyme (EAE)

5g bột nho cho vào cốc thủy tinh 150ml Dùng giấy nhôm quan kín và bịt kin

cốc thủy tinh dé tránh ánh sáng Sau đó thêm dung dịch đệm Sodium axetat với tỉ lệ

10:1 (v/w) với pH 4,5 Sau đó pH hỗn hợp được điều chỉnh bằng NaOH 1M sao cho

pH đạt 4,5 phù hợp với enzyme Khuấy đều hỗn hợp sau khi hiệu chỉnh pH Sau đóquá trình trích ly được thực hiện với enzyme và điều kiện trích ly thích hợp chọn từkết quả của các thí nghiệm 2.2.3 — 2.2.7 Hỗn hợp sau trích ly sẽ lọc lấy dịch trích và

ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/ phút trong 15 phút và phân tích các chỉ tiêu

Trích ly có hỗ trợ siêu âm (UAE)

5g bột nho cho vao cốc thuỷ tinh, sau đó nước cất được thêm vào theo tỉ lệdung môi: nguyên liệu là 10:1 Sau đó mẫu được siêu âm bằng máy siêu âm dạngthanh Hielscher Ultrasonics UP100H (Đức) Mẫu được đặt sao cho khoảng cách từthanh siêu âm tới bề mặt chat lỏng trong bình vào khoảng 2 cm Hỗn hợp được siêu

âm ở nhiệt độ 50 ˆC với mật độ năng lượng siêu âm là 15 W/g trong vòng 10 phút.

Hỗn hợp sau trích ly sẽ lọc lấy dịch trích và ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/ phút trong 15phút và phân tích các chỉ tiêu.

Kết hợp trích ly bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

E-UAE: Enzyme được sử dụng để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh họctrong bột bã nho sau đó tiếp tục hỗ trợ siêu âm dé tăng cường kha năng trích ly cáchoạt chất

20

U-EAE: Siêu âm được sử dụng trước quá trình trích ly các hợp chất có hoạttính sinh học trong bã nho bằng enzyme.

2.2.9 Tối ưu hóa điều kiện trích ly hợp chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩmnho bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm

Nhiệt đô siêu âm: 50°C

Hình 2.3 Quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tinh sinh học từ phụ phẩm nho

bang enzyme có hồ trợ siêu âm

21

s* Giải thích quy trình

Chuẩn bị mẫu: Thực hiện tương tự quy trình xử lý mẫu với mẫu là bột bã

nho Lấy 1g bột dem say am hồng ngoai nhằm xác định khối lượng vật chất khô có

trong bột mẫu đem trích ly.

Chuan bị dung dịch đệm Sodium axetat: 5,7 ml acetic acid vào bình 1000 ml,thêm 800 ml nước cat Chuẩn độ pH bang cách nhỏ giọt dung dich NaOH 1M chođến khi pH đạt 4,5 Định mức lên 1000 ml và bảo quan tại nhiệt độ 4°C trong tủ lạnh

Tiến hành cân 5g mẫu vào cốc thủy tinh 150ml, lặp lại 3 lần Dùng giấy nhômquấn kín và bịt kín cốc thủy tinh để tránh ánh sáng Sau đó thêm dung dịch đệm

Sodium axetat với pH 4,5 đã pha trước đo theo quy trình pha dung dịch đệm theo tỷ

lệ được thiết kế (w/w) Khuấy đều hỗn hợp bằng đũa thủy tinh

Hiệu chỉnh pH: hỗn hợp mẫu được điều chỉnh pH bằng cách nhỏ giọt NaOH1M sao cho pH đạt 4,5 phù hợp với enzyme Khuay đều hỗn hợp sau khi hiệu chỉnhpH.

Siêu âm: mẫu sau khi hiệu chỉnh bằng pH sẽ siêu âm bằng máy siêu âm dang

thanh Hielscher Ultrasonics UP100H (Đức) Mẫu được đặt sao cho khoảng cách từthanh siêu âm tới bề mặt chất lỏng trong bình vào khoảng 2 em tại nhiệt độ 50°C với

mật độ năng lượng siêu âm là 15 W/g trong vòng 10 phút.

Thủy phần

Quá trình thủy phân được thực hiện trong bề ủ nhiệt có cánh khuấy với tốc độ

150 vòng / phút Hỗn hợp được xử lý nhiệt độ phù hợp trước khi thêm enzyme

pectinase và cellulase đã được tính toán sẵn theo tỷ lệ phù hợp Thời gian, nhiệt độthủy phân và hàm lượng enzyme bổ sung được điều chỉnh theo kế hoạch thí nghiệm

Bắt hoạt enzyme: sau thời gian thủy phân, enzyme được bắt hoạt bằng ở nhiệt

độ 85°C/ 5 phút bằng bé ủ nhiệt theo (Drevelegka, 2020)

nhau rồi cho vào máy ly tâm với chế độ 4000 vòng/ 15 phút Sau ly tâm thu được

dich trích ly va đem phân tích chỉ tiêu theo dõi.

2.2.3.2 Tối ưu hóa quá trình trích ly bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Resposne surface methodology, RSM)

để tối ưu hoá điều kiện trích ly, bao gồm: nhiệt độ và thời gian trích ly, tỉ lệ giữanguyên liệu và dung môi.

Dựa trên kết quả phân tích các chỉ tiêu khảo sát và phân tích thống kê, tiếnhành lựa chọn khoảng giá trị thích hợp của các yếu tố có ảnh hưởng có ý nghĩa vềmặt thống kê, tiến hành tối ưu hoá các điều kiện trích ly dé đạt hàm lượng các hợpchất có hoạt tính sinh học trong dịch trích ly từ phụ phẩm nho cao Mô hình đượcthiết kế theo kiều CCD dé thiết kế thí nghiệm dựa trên nhiệt độ, thời gian và ty lệdung môi: nguyên liệu (DM: NL).

Chỉ tiêu theo dõi: TPC, TSC va PAC

gallic được sử dụng là chất chuẩn và hàm lượng phenolic tổng được thé hiện bang

mg gallic trong đương trong don vị khối lượng (mg GAE/g vek)

2.3.3 Hàm lượng saponin tổng (TSC)

Hàm lượng saponin tổng được xác định bằng phương pháp đo quang phổ Dịch

trích (0,3 ml) được trộn với dung dich vanillin 8% (w/v) (0,3 ml) và acid sulphuric

72% (v/v) (3 ml) Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 60 °C trong 15 phút và làm nguội trong nước

đá trong 10 phút Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 560 nm Aecsin

được sử dụng là chất chuẩn Hàm lượng saponin tổng được thể hiện bằng mg Aecsin

tương đương trong đơn vị khối lượng (mg AE/g vek)

2.3.4 Hàm lượng proanthocyanidin tổng (PAC)

Hàm lượng proanthocyanidin tổng được xác định bằng phương pháp đo quang

phổ Dịch trích (0,5 ml) được trộn với 0,3 ml dung dich vanillin 4% (w/v) và 1,5 ml

dung dich HCl 36% Hỗn hợp sau đó được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Tiếnhành đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Catechin được sử dụng là chất chuẩn Kếtquả được thê hiện bằng mg catechin tương đương trong đơn vị khối lượng (mg CE/gvck).

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Thiết kế và xử lý số liệu thí nghiệm bằng phần mềm JMP Pro 13 và MicrosoftExcel 2013.

24

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định loại enzyme thích hợp cho quá trình trích ly các hợp chất có hoạttính sinh học từ phụ phẩm nho

Enzyme Cellulase va enzyme Pectinase đã được sử dung dé đánh giá sự ảnh

hưởng của enzyme lên quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong

dịch trích của bột bã nho như phenolic tổng, saponin tổng và proanthocyanidins Kếtquả trình bay qua Hình 3.1.

Control Cellulast Cellulast + Pectinex la] ° ° -Ƒ = = ® ”

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến TPC, TSC, PAC trong dịch trích lyCác chữ cái khác nhan trong cùng một chỉ tiêu biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thong kê (p

< 0,05)

25

Kết quả thí nghiệm cho ta thấy hàm lượng các hoạt chất sinh học sau khi trích

ly có sự khác biệt có ý nghĩa đối với việc không sử dụng enzyme, có sử dụng 1 loạienzyme, và loại kết hợp giữa hai loại enzyme Trong đó, hàm lượng các hoạt chất có

tính sinh học cao nhất từ việc trích ly có hỗ trợ của 2 loại enzyme kết hợp Hàm lượng

cao nhất là hàm lượng kết hợp giữa hai enzyme lần lượt là TPC đạt 8,870 mg GAE/g

vck, TSC đạt 28,292 mg AE/g vck va PAC đạt 2,658 mg CE/g vck Hàm lượng cáchợp chất có hoạt tính sinh học có giá tri thấp nhất khi trích ly không có sự hỗ trợ củaenzyme lần lượt là TPC dat 5,892 mg GAE/g vck, TSC dat 17,023 mg AE/g vck và

PAC đạt 1,798 mg CE/g vck.

Trong điều kiện trích ly tai pH= 4.5, thời gian trích ly là 2 giờ tại nhiệt độ ủ50°C, tỉ lệ nguyên liệu dung môi là 10:1( w/w) Hợp chất có hoạt tính sinh học đượctrích ly khi chỉ xử lý enzyme 14 U/g Cellulase so với việc chỉ xử lý bằng 76 U/g

Pectinase đã cho thấy chế phẩm cellulase giúp trích ly các hợp chất sinh học nhiều

hơn so với pectinase là 1,244 lần TPC, 1,201 lần TSC và tổng các hàm lượng các hợpchất là 1.106 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy (p < 0,05) Điều này đãcho ta thay rang loai enzyme phù hợp được chon dùng cho việc trích ly sé phụ thuộcvào thành phần cấu tạo của nguyên liệu cần xử lý Trong vỏ quả nho được cấu tạo bởipolysaccharide, hợp chất phenol và protein Hemicellulose, pectin và các protein

dạngchuỗi được thắt chặt với nhau bằng mạng lưới các vi sợi cellulose Cellulose

vapectin chiếm 30 - 40% thành phan polysaccharide của tế bao vỏ quả nho (Kiên vàctv, 2021) Chính vì vậy cellulase sẽ có hiệu quả tốt hơn trong thủy phân làm tăngcác hàm lượng hợp chất phenolic vào dung dịch Cũng theo Drevelegka và ctv (2020),khi nghiên cứu quá trình trích ly phenolic từ bã nho đã nhận thấy cellulase đã làm

tang hàm lượng phenol từ bã nho so với pectinase.

Kết quả cho thấy sự kết hợp của hai loại enzym cellulose và pectinase đã làm

tăng hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết như phenolic

tong, saponin tổng và proanthocyanidin tổng so với sử dụng một trong hai loạienzyme là cellulose hay chỉ pectiness Enzyme cellulase có tác dụng thủy phâncellulose, phá vỡ thành tế bào, và giải phóng pectin Sau đó enzyme pectinase đã phân

26