Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học và thực phẩm: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hợp chất có hoạt tính sinh học từ dịch chiết sâm cau đen (Curculigo orchiodes Gaertn)

Những kết quả từ nghiên cứu này có thé được ứng dụng cho việcxây dựng quy trình trích ly các nhóm hoạt chất sinh học khác nhau từ củ sâm cau đenmột cách có hiệu quả bằng các điều kiện và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

BÙI THỤC DUYÊN

ANH HUONG CUA PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY DEN HỢP CHAT CÓ HOAT TÍNH SINH HỌC TỪ DICH CHIET

SÂM CAU ĐEN (Curculigo orchiodes Gaertn)

LUẬN VĂN THAC SY CÔNG NGHỆ HOA HỌC VÀ THUC PHAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

BÙI THỤC DUYÊN

ANH HUONG CUA PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY DEN HỢP CHAT CO HOAT TINH SINH HOC TU DICH CHIET

SAM CAU DEN (Curculigo orchiodes Gaertn)

Chuyên ngành: Công nghệ Hoá Học va Phuc pham

Mã số ngành : §.54.01.01

LUẬN VĂN THAC SY CÔNG NGHỆ HOA HỌC VÀ THUC PHAM

Hướng dẫn khoa học

TS HOÀNG VĂN CHUYÊN

TS HUỲNH TIEN DAT

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 4/2024

ANH HUONG CUA PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY DEN HỢP CHAT CO HOAT TINH SINH HOC TU DICH CHIET

SAM CAU DEN (Curculigo orchiodes Gaertn)

BUI THUC DUYEN

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS PHAN TẠI HUÂN

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

2 Thư ký: TS NGUYEN MINH XUAN HONG

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3 Ủy viên: TS NGUYÊN HUỲNH BẠCH SƠN LONG

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

ul

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Bùi Thục Duyên sinh ngày 20 tháng 11 năm 1996 tại Quang Ngãi.

Tốt nghiệm trung học phô thông tại trường trung học phố thông Tư Nghia 1

huyện Tư Nghĩa, tỉnh Quảng Ngãi năm 2014.

Tốt nghiệp trường đại học Nông Lâm thành phé Hồ Chí Minh, khoa CôngNghệ Thực Phẩm hệ chính quy năm 2019

Từ 2019 đến nay: Kinh doanh tự do tại thành phố Hồ Chí Minh

Từ tháng 2.2022 bắt đầu học cao học Khoa Công Nghệ Hoá Học và ThựcPhẩm của đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Dia chỉ liên lac: Opal Garden, đường số 20, Hiệp Bình Chánh, Thủ Đức, HCM

Số điện thoại: 0965418965

Email: thucduyen2011@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phantrong nghiên cứu của TS Hoàng Văn Chuyên, giảng viên Khoa Công nghệ Thựcphẩm dai học Sư phạm Kỹ thuật, TS Huỳnh Tiến Đạt, giảng viên Khoa Công nghệHóa học và Thực Phẩm đại học Nông Lâm làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận

văn được phép công bô với sự đông ý của chủ nhiệm đê tải.

TP.HCM, tháng 4 năm 2024.

Học viên thực hiện đề tài

Bùi Thục Duyên

IV

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành luận văn thạc sĩ này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực

Phẩm vì đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và các máy móc để tôi thực hiện đề tài

Cám ơn đến tất cả quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thứcchuyên môn, kiến thức thực tế sản xuất Đó chính là những công cụ hỗ trợ đắt lực đềtôi hoàn thành tốt đề tài cũng như hành trang kiến thức trong lĩnh vực chuyên mônsau nay.

Tôi gửi lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất đến thay TS Hoang Văn Chuyên,

TS Huỳnh Tiến Đạt đã hỗ trợ tư vấn chuyên môn, truyền đạt kiến thức và tận tình hỗtrợ trong suốt thời gian hoàn thành luận văn này

Do chưa có nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực thực tế khi làm đề tài, nên rấtmong quý thầy cô bổ sung, đóng góp dé dé tài có thé ứng dụng trong thực tiễn vàmang lại những đóng góp trong ngành sản xuất công nghiệp cũng như những lợi ích

mới cho xã hội nói chung.

Cuối cùng, tôi kính chúc Quý Thầy Cô thật nhiều sức khoẻ, hạnh phúc và

thành công.

TP.HCM, tháng 4 năm 2024 Học viên thực hiện dé tài

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của phương pháptrích ly đến hiệu suất trích ly saponin tong, phenolic tổng số và khả năng kháng oxyhóa của dịch chiết từ củ sâm cau đen (Curculigo orchioides Gaertn) Các tác độngcủa các điều kiện công nghệ như loại dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ

và thời gian trích ly đã được khảo sát và tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đápứng Ngoài ra, nghiên cứu cũng đánh giá tác động của kỹ thuật trích ly có hỗ trợ bằngsóng siêu âm đến hiệu quả trích ly Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc trích ly củsâm cau đen bằng dung môi ethanol 80% đạt hiệu suất thu hồi cao nhất Điều kiện tối

ưu cho trích ly saponins từ củ sâm cau den tại thời gian 60 phút, ở nhiệt độ 57°C với

ty lệ dung môi/nguyên liệu là 80 mL/g Điều kiện tối ưu cho việc thu hồi polyphenolstong số ở thời gian 178 phút, nhiệt độ 45°C và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 68 mL/g.Trong khi đó, hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất khi điều kiện tối ưu hóa ở thời gian

180 phút, nhiệt độ 40°C và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 80 mL/g Các thí nghiệm

xác thực ở điều kiện tối ưu cũng cho thấy hiệu quả trích ly thu được bằng thực nghiệm(saponin tổng số: 11,33 mg AE/g CK, polyphenol tổng số: 23,58 mg GAE/g CK vahoạt tinh kháng oxy hóa DPPH: 133,45 uM TE/g CK) không có su khác biệt đáng kể

về mặt tống kê so với các giá trị tối ưu được dự đoán Việc sử dụng phương pháptrích ly hỗ trợ bằng siêu âm với cùng loại và lượng dung môi giúp rút ngắn thời giantrích ly tới 18 lần (10 phút) trong khi vẫn thu được hiệu quả trích ly tương đương vớiphương pháp ngâm chiết về cả lượng saponin tông số, polyphenol tổng số và hoạttính kháng oxy hóa Những kết quả từ nghiên cứu này có thé được ứng dụng cho việcxây dựng quy trình trích ly các nhóm hoạt chất sinh học khác nhau từ củ sâm cau đenmột cách có hiệu quả bằng các điều kiện và phương pháp trích ly phù hợp với điềukiện thực tế sản xuất

Keywords: Curculigo orchioides Gaertn, trích ly, saponin, phenolic, hoạt tinh

khang oxy hoa

Vi

This study aimed to investigate the influence of diferent extraction methods

on the extraction efficiency of total saponin, total polyphenol compounds and

antioxidant capacity from the rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn The effects

of technological conditions including solvent type, solvent/material ratio, temperature, and extraction time were investigatede The study also evaluated the impact of ultrasound-assisted technique on the extraction efficiency The results of the study revealed that the extraction of Curculigo orchioides Gaertn rhizomes with 80% ethanol achieved the highest extraction yields Optimal conditions for extracting total saponin were 60 minutes, 57°C and 80 mL/g of solvent/material ratio The optimal conditions for recovering total phenolic content were 178 minutes, 45°C and the solvent/material ratio of 68 mL/g Meanwhile, the highest antioxidant activity of the extract from Curculigo orchioides Gaertn rhizomes was obtained with the optimal conditions of 180 minutes, 40°C and 80 mL/g of solvent/material The experimental validation of optimal conditions also showed that the actual obtained extraction yields (total saponins: 11.33 mg AE/g DW, total polyphenols: 23.58 mg GAE/g DW, and DPPH antioxidant activity: 133.45 uM TE/g DW) were not statistically significantly

different from the predicted values The use of ultrasound-assisted extraction method using the same type and amount of solvent shortened the extraction time by up to 18

times (10 minutes) while still achieving comparable extraction yields to the marceration method for all total saponins, total polyphenols, and DPPH antioxidant activity These results of this study are potential to be applied for the development of

effective extraction processes to recover various bioactive compound groups from

Curculigo orchioides Gaertn rhizomes based on the selection of extraction conditions and methods suit with different practical production facilities.

Keywords: Curculigo orchioides Gaertn, extraction, saponin, phenolic, antioxidant

activity

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa

et eer eee neers i

(ae cc 165300020 đ0GH07DL/2E77ĐđgI-3H83024:SE18.200 11 LO) CART dOÀ Non gannesn g2 nh ga Hang Gg8014310555.DCESESSSHSSS/ESESEESSSM3'989/386/0003113-)6630811383383854E40) 02200188 1V

LOT CAM i0 V

Tình Ce cg aa ce er aera vi

PSUS TIA CE xsi cactescronws tenrsne ream stuaune HixÐg:E9dg3östÐokgrzhuSpxecmnitlgiphuBigtdgouzbs.dOndgislxsguisyty2g.csiix4Eiodiomg vil

Dati SACheCA DANG tanngganngnibinhBibitdiCGBMG0BG581019013033019VD53300G80408GGGLEGBSNSMSNGHRRIGEGBINGH30ã03530081i.08 XI

Danh sach cac Wink 01 Xi

il ngan gonodogtiintttiEiiNnGtiSEEigiGtMGi/8055050401g0i010100853681GG3THĐrgG.S00G03G80030100885 |

St a eee | eae 41.1 Tổng quan về nguyên liệu sâm cau đen 2-22 ©++22++22++2z++£z++zzz+zzrez 41.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, phân loại -2¿22222222+22E£E2+2E+2ZE2Ezzzxrzxrsrree 4

Se Seg a 5

1.1.3 Hoạt tính sinh hoc và ứng dung dược học - -5-<+<<<<+<c<xxcex 10

1.3 Tổng quan về phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học - - 141.3.1 Các kỹ thuật trích ly truyền thống -2- 2 ©2222222222E+2EE2EEzExrrrrsrrees 15

1.3.2 Các kỹ thuật trích ly hiện đại - ceeeeeeeeeeeeeeeeeseeseeseeseeseeseeseereeees 17

1.4 Tông quan về ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng cho mô hình tối ưu hóa

dé tăng hiệu suất thu hồi các hợp chat tự nhiên 2- 22 522z+2z+22z222+2 191.4.1 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology

2.2.1 Hóa chất ececccececccccececcsescscsesesesesesesesesssssesessssssssssucessevevevsevsvevavsvavavavstacacasacsceces 232.2.2 ThiẾt bị 55- 5222221 22212212112122121121112112111111211111211121121112121222 22 re 23

13, Thiết Wee TRĨ ng hÍỆNH sec cong H.NgỤ ky 0,43 01604 1/48858g 001320015730028011630 242.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ngâm chiết truyền thống

(marceration) đến hiệu quả thu hồi hoạt chất -22©225522z2zz22z55z+2 252.3.2 Tối ưu hoá các điều kiện trích ly bằng phương pháp bề mặt đáp ứng 26

2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp trích ly sử dụng hỗ trợ sóng siêu âm(UAE) đến hiệu qua thu hồi hoạt chất S122 se de 28

2.4, Phương: pháp phan tích các Chỉ HỂU seseeeeseesissesssesisessissktivs8I4305445E385538581636958/78 28

2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng saponin tông số (TSC) - - 282.4.2 Phương pháp xác định độ âm 2- 2 2£ S+2E+EE+EE+EE+EEzEEZEZEzEzzxrze 282.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenols tổng sỐ - - 28

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa - 30

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu - 2 2222+2222222zz2zzzzzzz+2 31Chương 3 KET QUA NGHIÊN CỨU -2©2222+2E22E+2E£2E22E22E222222z22zzze2 333.1 Anh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu quả trích ly 333.1.1 Anh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly -. -2-5 333.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả trích ly - 2525 373.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly -2- 2222525: 413.1.4 Anh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu quả trích ly 463.2 Kết qua tối ưu hoá các điều kiện trích ly . -2 2¿©2z+2222++z+zzzzzzzeex 493.2.1 Tối ưu hóa các điều kiện trích ly saponin tông 6 -2 - 493.2.2 Tối ưu hóa các điều kiện trích ly polyphenols tổng số - 553.2.3 Tối ưu hóa các điều kiện trích ly hoạt tính khang oxy hóa - - 603.2.4 Xác thực các giá trị tối ưu bằng thực nghiệm -2-55z55++25ze: 653.3 Anh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu quả trích ly -2 z-5+ 663.3.1 Ảnh hưởng của thời gian trích ly bang UAE đến hiệu quả trích ly saponin

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian trích ly bằng UAE đến hiệu quả trích ly polyphenols

DANH SÁCH CÁC BANG

BANG TRANGBang 1.1 Mot số hợp chất thực vật được xác định từ dịch chiết lá và rễ của

SELIG De ee ee ee ee 6Bang 2.1 Cac mức được mã hóa cho các biến đầu vào mặt sử dụng mô hình

hiệu quả trích ly polyphenols tông sỐ - 2 2 222222EE+2E£2E+z2E2z2zzzs22 57Bang 3.5 Giá tri thực nghiệm và gia tri dự đoán của mô hình đối với hoạt tính

kháng oxy hóa DPPH (uM TE/g CK) - -+5-+5<<+sx+sc+eeeereereerrrree 60

Bảng 3.6 Bảng phân tích thống kê về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến

HiogftTNH kháng ORY: HỘ Loesnueeeeeanneksirnnooiiestikkierukdksguevasrugkrasiuggrueuiictuiagatoevvisekeisas dd 62

Bang 3.7 Các giá trị thu được bằng thực nghiệm ở điều kiện tối ưu 65Bảng 3.8 So sánh hiệu quả thu hồi hợp chất từ sâm cau đen theo các phương

pháp UAE và phương pháp trích Ìy - + +++++<=+ze+zeezreerrerrrrrrrrrs 70

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANGHình 1.1 Cây, rễ sâm cau đen (Curculigo orchiodes Gaertn) (Irshad và ctv,

D DHỘU Ì ee eee 5

Hình 1.2 Dự đoán cau trúc hóa học Oacetyl-glucomannan COP90-1 (Wang

Hình 1.3 Cau trúc phân tử orcinol glucoside (Li va ctv, 2003) - 9

Hình 1.4 Terpenoids (52 — 58) của thực vật thuộc chi Curculigo (Jiao và ctv,

DOLBY se esessaeabisnsos Sionietb3Aei94g9s1etdgrtieisgzh4EphsESsgiis8esuEtesfSlksfshswituSBracsijBuisrz3ssessee 10 Hình 1.5 Cyclic peptides (59 — 66) của thực vật thuộc chi Curculigo (Wang

002/01 aa5 10

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu của đề tài 2-22 2222222222E22212212212221 22122 crxe 24Hình 2.2 Công thức hóa học của DPPH và sản phẩm khử tương ứng 30Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly saponin tổng số 33Hình 3.2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenols

0014 Hình 3.3 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng kháng oxy hóa 36Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu quả trích ly saponin tông

EU re er er sa ore rome ealoi een 38

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly polyphenols

" Ồ 39Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng kháng oxy hóa 40Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến khả năng trích ly saponin tổng

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly polyphenols tông số 43Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa của dich chiết 45Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả trích ly saponin tổng

Hình 3.11 Ảnh hưởng của ty lệ dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenols

XI

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng kháng

oxy hóa của địch chiẾt -2- 2222221 22E22212212212712711221271211221 2122 re 48Hình 3.13 Tương quan giữa giá trị dự đoán va giá trị thực tế của hiệu suất

trích ly saponins (mg AE/g CK) 2c 222221221121 2211221221 22125115111 xe, 50

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly

0900000800150 05/-40.001 53

Hình 3.15 Tác động tương hỗ của các yếu tố đến hiệu suất trích ly saponin

tong số (mg AE/g CK) -2:- 2¿©222222221222322212221221221221211211221211 222 e2 54Hình 3.16 Tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực tế của hiệu suất

trích ly polyphenols tong số (mg GAE/g CK) 2- 2z ©5z22z+2zz+z+zcs+2 56Hình 3.17 Ảnh hưởng của các yếu tô công nghệ đến hiệu suất trích ly

polyphenols (mg GIÁ Eíg CC]: cácocseesssecssl108266601023384804088843030S0E635018:433 403S583.0g408 58

Hình 3.18 Tác động tương hỗ của các yếu tố đến hiệu suất trích ly

IU90/490195105001-067209/280).0 101 59

Hình 3.19 Tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực tế của hoạt tính

kháng oxy hóa chứa trong dịch chiết từ củ sâm cau đen (uM TE/g CK) 61Hình 3.20 Ảnh hưởng của các yếu tô công nghệ đến hoạt tinh kháng oxy hóa

của các dịch chiết (UM TE/g CK) - 22 2¿2222222+2EE2EE2EE2EE2Exrzrrrrrree 63Hình 3.21 Tác động tương hỗ của các yếu tố đến hoạt tính kháng oxy hóa củacác dịch chiết (UM TE/g CK) -©222252222222E22E22EE22E221223231221 22222 crev 64Hình 3.22 Ảnh hưởng của thời gian trích ly UAE đến hiệu quả trích ly

Shin ON G0 LoeeseedeoseHiiskkboktktexbeibidkgisoitgvvEUL2g2,20i0400251a0004010cpctgemuistgrorngsi 66Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian UAE đến hiệu trích ly polyphenols tổng

Hình 3.24 Ảnh hưởng của thời gian trích ly UAE đến khả năng kháng oxy

ngôn (0h ghi oc serene tu nung niesdiEtiirEaxairgi0i05.00001000001x00808sugptnad 69

MỞ ĐẦU

Đặt vẫn đề

Trong những nam gần đây, việc sử dụng các loại thực vật như sản pham y dượctiềm năng, có khả năng chữa nhiều bệnh càng được nghiên cứu phát triển Ngày nay,việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao dé làm thuốc là một xuthế rất được các nhà khoa học quan tâm Curculigo orchioides Gaertn, còn được biếtđến với tên gọi là sâm cau đen hay tiên mao, là một loài dược liệu quý do có một sốhoạt chất có giá trị cao trong y học Những hoạt chất quan trọng bao gồm saponin,flavonoid, glycoside, và alkaloid (Agrahari và ctv, 2010) Các năm gần đây đã cóthêm nhiều nghiên cứu tìm ra một số hợp chất có hoạt tính sinh học như

polysaccharides, norlignans, phenolics và terpenoids có trong củ sâm cau đen và các

hoạt tinh sinh học của chúng (Dode và ctv, 2009; Brintha va ctv, 2017) Cac hợp chấtnày được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm,tăng cường hệ miễn dịch, và cải thiện chức năng tình dục (Asif, 2012) Vì vậy, rễ câysâm cau đen có thể sử dụng như một loại thuốc tiềm năng nhờ vảo tính chất dược lý

của chúng.

Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nguyên liệu thực vật thường được trích

ly bằng nhiều phương pháp, trong đó phô biến nhất là sử dụng dung môi hữu cơ vớicác phương pháp khác nhau như Soxhlet, ngâm chiết và các kỹ thuật hiện đại hơn mànhiều nghiên cứu đã kết hợp sử dụng như kỹ thuật hỗ trợ bằng sóng siêu âm

(Ultrasond-assisted extraction), enzyme (Enzyme-assistant extraction), vi sóng

(Microwave-assisted extraction), kich thich xung dién (Pulsed electric field) dé lamgiảm thời gian và lượng dung môi trích ly, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi hợp chat(Azmir va ctv, 2013) Mỗi phương pháp có ảnh hưởng riêng biệt đến hiệu quả thu hồi

và hoạt tính sinh học của các hợp chất trích ly Các phương pháp như Soxhlet vàngâm chiết truyền thống thường sử dụng dung môi hữu cơ có thê không hoàn toànthích hợp cho tat ca các hợp chất do sự khác biệt về độ hoà tan và ôn định hóa học

Ví dụ, nhiệt độ cao sử dụng trong phương pháp Soxhlet có thể phá hủy các hợp chất

nhạy cam với nhiệt như flavonoid va glycoside, làm giảm hoạt tính sinh hoc của dịch

chiết thu được (Bimakr va ctv, 2011) Tương tự, sự lựa chọn dung môi không phùhợp có thé làm giảm hiệu quả trích ly của các hợp chất khó tan như một số alkaloid

va saponin (Oreopoulou va ctv, 2019) Trong khi đó, các phương pháp hiện đại như

chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm và vi sóng có thể cung cấp một lựa chọn tốt hơnbằng cách giảm thời gian trích ly và nhiệt độ cần thiết, từ đó bảo vệ tốt hơn cấu trúc

và hoạt tính sinh học của các hợp chất Sóng siêu âm giúp tăng cường sự thâm nhậpcủa dung môi vào vật liệu thô và tăng tốc độ giải phóng hợp chat, trong khi vi sóngtạo ra sự điểm nóng cục bộ thúc đây quá trình trích ly mà không làm giảm tính sinhhọc của các hợp chất (Chuyen và ctv, 2018) Ngoài ra, phương pháp chiết xuất hỗ trợbang enzyme cũng là một lựa chon quan trọng, nhất là đối với các hợp chất cau trúcphức tạp và khó khuếch tán vào dung môi Enzyme có thé giúp phá vỡ các liên kếttrong vật liệu thô một cách nhẹ nhàng, tăng cường hiệu suất trích ly mà không làmmất đi hoạt tính sinh học của các hợp chất (Pasrija và Anandharamakrishnan, 2015).

Trong rất nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm dé khảo sat ảnh hưởng của cácđiều kiện công nghệ đến hiệu quả trích ly hoạt chất thì phương pháp tối ưu hóa bề

mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) đã được chứng minh là một kỹ

thuật thống kê hiệu quả đề tối ưu hóa các điều kiện trích ly, nhằm đạt được hiệu quảtốt nhất trong việc trích ly các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ thực vật RSM giúpxác định mối quan hệ giữa các biến số (như nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung mdéi/vatliệu) và kết quả (hiệu suất trích ly, hoạt tính sinh học), từ đó xác định điều kiện trích

ly ly tưởng (Elksibi và ctv, 2014; Tan và ctv, 2014).

Nghiên cứu tông quan tài liệu cho thấy mặc dù sâm cau den là một nguyên liệuchưa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học và da được sử dụng dé điều trị bệnh cũngnhư tăng cường sức khoẻ trong các bài thuốc cô truyền Tuy nhiên, các nghiên cứucũng như công bố khoa học về ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả trích ly cáchoạt chất từ nguyên liệu này vẫn còn rất hạn chế Do vậy, việc khảo sát ảnh hưởng

thực phâm và dược phẩm Với những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài nghiêncứu “Anh hưởng của phương pháp trích ly đến các hop chất có hoạt tinh sinh học

từ dịch chiết sâm cau đen (Curculigo orchiodes Gaertn) ”

Mục tiêu của khoá luận

- Phân tích được ảnh hưởng của từng các yếu tố công nghệ đến quá trình trích

ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sâm cau đen

- Xác định được điều kiện tối ưu dé trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học

từ sâm cau đen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

- Khảo sát và so sánh được hiệu quả thu hồi hoạt chất và hoạt tính kháng oxyhoá của phương pháp trích ly có hỗ trợ của siêu âm với phương pháp ngâm chiết ởđiều kiện trích ly tối ưu, từ đó xác định được phương pháp phù hợp nhất

Chương 1

TỎNG QUAN

1.1 Tổng quan về nguyên liệu sâm cau đen

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, phân loại

Sâm cau đen, với tên khoa học là Curculigo orchioides Gaertn, là một loài

thực vật thuộc họ Hypoxidaceae, trước đây được xếp vào họ Amaryllidaceae Đượcbiết đến đưới nhiều tên gọi như tiên mao hay ngải cau Đến nay, đã phát hiện tôngcộng 10 loài bao gồm: Curculigo orchioides, Curculigo capitulata, Curculigo

sinensis, Curculigo crassifolia, Curculigo breviscapa, Curculigo gracilis, Curculigo

recvata, Curculigo glabrescens, Curculigo pilosa va Curculigo latifolia Phan bô chủyếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu A như Campuchia, An Độ,Malaysia, Thái Lan, phía nam Trung Quốc, Philippines và một số tỉnh ở phía BắcViệt Nam như Cao Bằng, Lai Châu (Irshad và ctv, 2006).

Cây sâm cau đen có đặc điểm là thân ngầm hình trụ, cao khoảng 40 em và mọcthắng đứng Là loại cây một lá mam, sâm cau đen có lá dạng mac hẹp, dai từ 15 - 40

cm, rộng 12 - 35 mm, với cuống lá dai khoảng 10 cm và gân lá chạy song song Câynày cho hoa màu vàng, mọc thành từng chùm nhỏ từ 3 - 5 bông ẩn mình trong be lá,mỗi bông gồm 6 cánh Củ sâm cau, phát triển từ rễ, có hình dạng thuôn dài từ 12 - 15

mm, với nhiều rễ phụ nhỏ Sâm cau đen ưa sáng và độ am, có khả năng chịu bóng

nhẹ, thích hợp mọc ở các khu vực như chân núi đá vôi, thung lũng hay ven nương

ray Cây này phát triển mạnh mẽ nhất vào mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 7, có chu

kỳ ra hoa và kết quả hàng năm, và quả khi già sẽ tự nở đề hạt phát tán (Irshad và ctv,

2006; Francis và ctv,2007).

Hình 1.1 Cây, rễ sâm cau đen (Curculigo orchiodes Gaertn) (Irshad và ctv, 2006)

Nghiên cứu đã chứng minh rằng các chiết xuất từ sâm cau đen chứa một loạtcác hợp chất hóa học như saponin, flavonoid, và glycoside, những hợp chất này đóng

vai trò quan trọng trong các tác dụng dược lý của cây Đặc biệt, nó được sử dụng

trong điều trị các van đề liên quan đến yêu sinh lý ở nam giới và cũng như một phươngpháp hỗ trợ trong việc điều trị bệnh tiểu đường và rỗi loạn lipid máu (Chauhan vaDixit, 2008; Wang va ctv, 2021) Một số nghiên cứu cũng tap trung vào kha năng củasâm cau đen trong việc kích thích hệ thống miễn dịch và chống lại các tác nhân gâybệnh, cũng như khả năng của nó trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress

oxy hóa (Dode và ctv, 2009) Loài này cũng được ghi nhận trong Danh mục đỏ cây

thuốc Việt Nam (Đỗ Huy Bích và ctv, 2003)

1.1.2 Thành phần hoá học

Đã có rất nhiều nghiên cứu trước đây trích ly và phân lập các hợp chất thựcvật có trong chi Curculigo và đặc biệt từ củ sâm cau Nhiều hợp chất sinh học đã đượctìm thấy trong rễ cây, trong đó bao gồm các phenols va phenolic glucosides, lignans

va lignan glucosides (Zhu và ctv, 2010), triterpenes và triterpenoid glucosides (Xu và

Xu, 1992), flavones, alkaloids.

Bảng 1.1 Một số hợp chất thực vật được xác định từ dịch chiết lá và rễ của sâm cau

R Ã z > ^ r4 > ^ Dịch chiết lá của sâm cau đen Dịch chiết rễ của sâm cau đen

Hóa thực vật Phân tích định tính Nước Methanol ChloformHexane Nước Methanol ChloformHexane

(H20) (CH:OH) (CHC1:) (CsH‹s;) (HO) (CH:OH) (CHCIs) (CoH1s)

Alkaloids Wagner’s test A = + + + +

-Carbohydrates Benedict’s test - + - + = + = = Glycosides -

Steroids Hossain, 2013 - + “i + = + es + Tannins Iyengar, 1995 - + - - = + m = Triterpenes Salkowski’s test - - - - + = + =

(Bmntha và ctv, 2017)

Ghi chi: Phân tích định tinh cho thay các hợp chất hóa thực vật có trong dichchiết và được mô tả là có (+) hoặc không có (-)

Trong nghiên cứu trên đã xác định được một số thành phần hóa học có trong

lá và thân rễ của sâm cau đen bằng các dung môi qua các phương pháp khác nhau.Phần lớn các hợp chất chứa trong lá và thân rễ của sâm cau đều được phân tích GC -

MS (Gas Chromatography - Mass Spectrometry) Dựa vào phương pháp nay nhận

diện được một số hóa thực vat có trong cả hai bộ phận của cây là Cyclobarbital ởtrong lá (0,36%) và thân rễ (3,88%), vitamin D3 ở trong lá (1,71%) và thân rễ (4,13%)của dịch chiết sâm cau bằng dung môi methanol Trong dịch chiết từ thân rễ sâm cau

«+ Saponins

Saponins là một nhóm các hợp chất hóa học tự nhiên được tìm thấy rộng rãi

trong thế giới thực vật, bao gồm nhiều loại cây, ré, qua, va hat (Aziz va ctv, 2019).Saponins có một loạt các tinh chat và ứng dụng quan trong trong ngành công nghiệpthực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Trong y hoc, saponins được nghiên cứu vì cáctác dụng có lợi như khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, và khả năngtăng cường hệ miễn dịch Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong ngành công nghiệpthực phâm như chất làm đặc và ôn định (Aziz và ctv, 2019; Chen và ctv, 2021) Cácnghiên cứu đã chứng minh rằng saponins có trong sâm cau đen có khả năng chốngoxy hóa, giúp bảo vệ cơ thé khỏi tốn thương do các gốc tự do gây ra (Venukumar vàLatha 2002) Ngoài ra, saponins cũng được cho là có tác dụng chống viêm, giúp giảmthiểu tình trạng viêm nhiễm trong cơ thể Điều này làm cho nó trở thành một lựa chọntiềm năng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm mãn tính (Dode và ctv, 2009) Một số

nghiên cứu cũng đã khám phá khả năng của saponins từ sâm cau đen trong việc cải thiện chức năng tinh duc Cac saponins có trong cây được cho là có tác dụng kích

thích tăng cường sức khỏe tình dục ở nam giới, đặc biệt qua việc tăng cường sản xuất

testosterone và cải thiện chức năng cương (Onkar va ctv, 2012).

s* Polysacharides va monosaccharides

Từ rễ của sâm cau thu được Oacetyl-glucomannan COP90-1, đây là chất hòa tan trongnước và phân tử khối là 4609 Da, là một chất thúc đây tăng sinh hiệu quả và biệt hóacủa tế bào xương sơ cấp (Wang và ctv, 2017) Nghiên cứu của Wang và ctv (2019)

đã tiếp tục phân lập ra thêm một polysaccharides khác là COP70-3, nghiên cứu đồngthời đã công bố về khả năng chống loãng xương của polysaccharides COP70-3 vừa

tìm ra.

Hình 1.2 Dự đoán cau trúc hóa học Oacetyl-glucomannan COP90-1 (Wang va ctv,

2019)

«+ Chlorophenolic glucosides

Curculigine là một hợp chất có chứa clo tự nhiên, trong thân rễ của sâm cau

có chứa Chlorophenolic glucosides (Xu và Dong, 1987; Xu và Xu, 1992) Thu được

11 Chlorophenolic glucoside cho thấy sự tác động vừa phải lên sự tăng sinh của

Xương.

Clo được liên kết C-6 trong chlorophenol glycoside có thé làm giảm hoạt tinhchống loãng xương và đưa nhóm C-5 hydroxyl vào aglycone của chlorophenolglycoside làm tăng hoạt tính chống loãng xương

%* Các hợp chất phenolic

Các hợp chất phenolic là các chất chuyền hóa chính trong các loài thực vậtthuộc chi Curculigo Từ thân rễ của C orchioides thu được 2 phenolic glucosides làorcinoside H và curculigoside I và 10 hợp chat đã biết được gọi là orcinol glucoside,

orcinol glucoside B, curculigoside A, curculigoside B, curculigoside C, curculigoside

G, 3-hydroxy-5- methylphenol-1-O-[B-glucopyranosyl-(1-6)-B-D-glucopyranoside], 3-hydrox-5-metyl- phenol-1-O- [B-apiosyl- (1-6) -B-glucopyranoside], glucosyringic

của loài thực vật này Orcinol glucoside là một chất răn vô định hình màu vàng, cócông thức phân tử CI3HI§O7 (Li va ctv, 2003), cấu trúc phân tử của orcinolølucoside được thé hiện ở Hình 1.3.

Các nghiên cứu về thành phần củ sâm cau đen đã báo cáo rằng orcinolglucoside là một hợp chất ít độc hại, có hoạt tính sinh học cao và hữu ích trong việctác dụng hỗ trợ các cơ quan chống lại chất độc do thuốc và hóa chất gây ra, cho thấyđây là một hợp chất tiềm năng và đáng được quan tâm Vì thế đã có nhiều nghiên cứutìm phương pháp trích ly thích hợp nhất đề có thé thu hồi tối đa hợp chat này (Liu và

Thu được 6 terpenoid từ C orchioides là

(3S8,5R,6S,7E,9R)-megatigma-7-ene-3,5,6,9- tetrol (53), actinidionoside (54), (6S,9R)-roseoside (55), 2-O-B-D-glucopyranoside (56), (-)-angelicoideno]l-2-O-J-apiofuranosyl-(1—>6)-B-D- gluco- pyranoside (57), tetillapyrone [(7R, 9S,10R) -3-metyl-5- (4-hydroxyl-5- hydroxylmethyl- tetrahydrofuryl)] - 6-hydroxypyran-2-one (58).

Ngoài những hợp chat trên, trong thân rễ của C orchioides có chứa 8

cyclodipeotides là (L-Ala-L-Tyr) (59), (L-Ser-L-Phe) (60), (LeuAla) (61), cyclo-(Leu-Thr) (62), cyelo-(Leu-Ser) (63), cyclo-(S-Pro-R-Leu) (64), cyclo-(Val- Ala) (65) va cyclo- (Gly-D-Val) (66) (Wang & Li, 2021).

1.1.3 Hoạt tính sinh học va ứng dụng dược hoc

Củ sâm cau đen được sử dụng như một vi thuốc từ thời xa xưa, từ lần đầu tiênđược biết đến với cái tên “Charak Samhita” như một thành phần giúp giảm ho Thân

rễ của loài cây này có dược tính ngọt, giải nhiệt, lợi tiểu, kích thích tình dục, đồngthời có thể hỗ trợ điều trị các tình trạng viêm nhiễm, bệnh ngoài da, viêm phé quản,

Vi vậy, nó được sử dụng rộng rãi trong các công thức ayurvedic - một hệ thong y hocHindu truyền thống và các bài thuốc bổ giúp kích thích tình dục (Onkar va ctv, 2012).Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của củ sâm cau đen và

việc ứng dụng các hoạt tính vào dược học, đặc biệt nhờ vào các hợp chất polyphenols

có trong thành phan của rễ cây sâm cau, bao gồm các saponins, phenolic glycosides,resins (Agrahari và ctv, 2010) Một số hoạt tính sinh học và ứng dụng nổi bật của củsâm cau đen bao gồm:

% Hoạt tính chống oxy hoá

Quá trình oxy hoá trong cơ thé con người làm tôn thương các màng tế bao vàcác cấu trúc phân tử khác như proteins, lipids và DNA Quá trình oxy hoá trong cơthé sẽ lay các electron từ các phân tử khác, tao ra các gốc tự do gây ton thương chocác tế bào, làm biến đổi, rối loạn chức năng, hoặc có thé gay chét té bao (Onkar vactv, 2012) Lượng lớn các gốc tự do trong cơ thé sẽ gây ra những ton thương nghiêmtrọng cho tế bào, dẫn đến các tình trạng bệnh nghiêm trọng Vì vậy, ngày càng cónhiều các nghiên cứu sử dụng các chất chống oxy hoá nhằm trung hoà các gốc tự dotrong cơ thể

Polyphenols là các hợp chất có hoạt tính sinh học nổi trội, khả năng chống oxyhoá của chúng là một trong các hoạt tính được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong

y học Chúng giúp ngăn chặn sự hình thành của các gốc oxy đơn phân tử, giảm thiểunguy cơ gây bệnh ung thư (Ghasemzadeh và Ghasemzadeh, 2011) Trong rễ cây sâmcau đen chứa nhiều polyphenols bao gồm các flavonoids, hợp chất phenolic như cácglycosides, saponins và một lượng phytosterol Các hợp chat này khi hoạt động đơn

lẻ hoặc kết hợp với nhau đều hỗ trợ cho hoạt động chống oxy hóa (Onkar và ctv,2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hoá của các chiết xuất từ củđược báo cáo rằng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ gan khỏi các tôn thương(Asif, 2012) Chiết xuất ethanol từ thân rễ cây sâm cau đen ở hàm lượng 1 - 25 mgcho thấy hoạt tính chống oxy hoá cao đối với các gốc tự do ion âm từ oxy (superoxide

11

anion radical), các gốc hydrogen peroxide và gốc tự do DPPH và được thê hiện bởiquá trình peroxide hoá lipid tại nồng độ nhất định Ngoài ra, chiết xuất ethanol giúpngăn chặn việc mat thính giác gây ra bởi cisplatin nhờ vào quá trình peroxide hoálipid và khả năng khử gốc tự do ở liều lượng 2,5 - 25 mg (Kang và ctv, 2013) Nghiêncứu của Venukumar và Latha (2002) về khả năng chống oxy hoá của chiết xuấtmethanol trên chuột đã kết luận rằng chiết xuất methanol từ rễ cây sâm cau có hoạttính chống oxy hoá nhờ vào khả năng bắt gốc tự do và hỗ trợ tăng khả năng chốngoxy hóa của các enzyme chống oxy hóa, bao gồm superoxide dismutase (SOD),catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) va glutathione reductase (GRD) Đồng

thời, mức độ gia tăng của glutathione transferase (GTS) ở những con chuột nhiễmđộc gan nặng được quan sát thấy có xu hướng trở về bình thường, điều này là mộttrong các minh chứng cho khả năng chống oxy hóa của chiết xuất methanol trong rễ

cây sâm cau đen.

Một số nghiên cứu khác như nghiên cứu của Zhu và ctv (2010) đã chiết xuất

và phân lập được breviscapin và các hợp chat phenolic glycosides từ thân rễ của câysâm cau, góp phần chứng minh hoạt tính chống oxy hóa cũng như tính khả thi khi sử

dụng trong y học của loài thực vật này.

% Hoạt tinh chống loãng xương

Loãng xương là một bệnh xương ngày càng phô biến, bệnh có đặc điểm làmgiảm mật độ xương, làm suy giảm cấu trúc xương dẫn đến dễ gãy xương Sâm cauđen được báo cáo rằng có khả năng làm giảm nguy cơ loãng xương trong cả cácnghiên cứu in vivo và in vitro Chiết xuất ethanol trong rễ sâm cau đen làm giảmloãng xương trong xương chày của xương đùi thông qua việc điều chỉnhosteoprotegerin (OPG) - một protein được tiết ra để ngăn chặn các tế bào tủy xươngkhông tương tác với thụ thể trên tế bào hủy xương, làm giảm số tế bào tủy xương(Cao và ctv, 2008) Hoạt tính chống loãng xương của chiết xuất ethanol và các

phenolic glycosides được chứng minh qua khả năng làm tăng sinh xương va tăng hoạt

động của alkaline phosphatase (ALP), giảm khả năng hoạt động tiêu hủy xương (osteoclast) (Jiao va ctv, 2009).

$% Hoạt tính chống viêm

Ở hoạt tính chống viêm, Dode và ctv (2009) đã tính toán hiệu quả chống viêmcủa các chiết xuất hydroalcoholic và các dẫn xuất alkaloid và không alkaloid củachúng trên mô hình chuột bị viêm phù nề do carrageenan gây ra Kết quả cho thấyphần trăm ức chế viêm của các chiết xuất phụ thuộc vào liều lượng Phần trăm ức chếviêm của hydroalcoholic thô là 22,45%, 35,62%, 39,03%; của các dẫn xuất alkaloid

là 31,68%, 36,89% và 41,17%; và của không alkaloid là 28,34%, 34,49%, 37,43%,

phan trăm trên tương ứng với các liều lượng 100 mg/kg, 300 mg/kg và 500 mg/kg

s* Hoạt tính kích thích tình dục và sinh tinh trùng

Các nghiên cứu hiện tại đã tìm thấy hoạt tính kích thích tình dục và sinh tinhtrùng của chiết cuất ethanolic từ thân rễ cây sâm cau đen ở chuột bạch tạng Quá trìnhsinh tinh liên quan đến sức tác động phức tạp giữa các yếu tố cau trúc của tinh hoàn

và hormone nội tiết (McLachlan, 2000) Chiết xuất ethanolic của củ sâm cau den

được nghiên cứu có khả năng cải thiện khả năng tình dục của những con chuột đực ở

liều lượng 100 mg/kg (Chauhan và ctv, 2007) Chiết xuất làm thay đổi đáng kể hiệusuất tình dục, được đánh giá bằng cách xác định các thông số như độ cương cứng củadương vật, hiệu suất giao phối, khả năng sinh tinh và hành vi định hướng của chuộtđực Chiết xuất dang lỏng được sấy khô của cây cải thiện đáng ké khả năng tình duccủa chuột ở liều 200 mg/kg (Suri va ctv, 1999)

Ngoài ra, chiết xuất ethanolic của rễ cây sâm cau đen được đánh giá có hiệuquả đến hành vi định hướng và tao tinh trùng ở chuột bạch tạng Sự thay đổi về hành

vi định hướng được đánh gia bởi sự định hướng đến chuột cái, môi trường, cá thể vàloại chuyên động 100 mg/kg khối lượng ethanolic chiết xuất có ảnh hưởng rõ rệt đếnviệc định hướng của chuột đực với chuột cái BlamusTM, một chiết xuất tiêu chuẩnhóa được sản xuất từ củ sâm cau den, được báo cáo rang giúp tăng cường đáng kếtestosterone tự do trong huyết thanh ở chuột đực với liều 50 mg/kg thé trong (Chauhan

va Dixit, 2008).

% Hoạt tính khang tiểu đường

Các nghiên cứu của Chauhan và Dixit (2008) và Madhavan và ctv (2007) đã

báo cáo rằng chiết xuất ethanolic và dịch chiết dạng lỏng của củ sâm cau đen có hoạttính chống đái tháo đường ở chuột mắc bệnh đái thao đường Hoạt tính trên có thé sosánh với tác dụng của thuốc chống đái tháo đường glimeperide tiêu chuẩn liều lượng

500 ug/kg.

s* Các hoạt tính khác

Ngoài các hoạt tính trên, củ sâm cau đen còn có các hoạt tính khác như hoạt

tính chống viêm, hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh, bảo vệ tim mạch, khả năng điềuhòa các chức năng trong cơ thé, nhờ vào các curculigosides, hợp chat polyphenols

và một số hợp chất khác có trong củ (Wang và ctv, 2021) Ở Việt Nam, sâm cau đenđược xem là một được liệu quý van đang được khai thác và dùng trong y dược Chođến nay, các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của củ sâm cau đen vẫn đangđược nghiên cứu để giải thích cho khả năng chữa trị và sử dụng làm thuốc trong y

học (Asif, 2012).

1.3 Tổng quan về phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học

Nhờ vào các hoạt tính sinh học nổi trội của polyphenols, trong những năm ganđây đã có nhiều nghiên cứu dé phát hiện và trích ly polyphenols từ thực phẩm Nhiềutác nhân có thể ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly polyphenols từ thực vật Do bản chấtkhông bền dưới các tác nhân cũng như sự đa dạng của chúng, với mỗi polyphenols

từ những nguyên liệu thực vật khác nhau sẽ đưa ra các nghiên cứu điều kiện trích lykhác nhau để đạt hiệu suất thu hồi tối ưu nhất Vì thế, điều kiện trích ly là một kỹthuật quan trọng ảnh hưởng đến khả năng thu hồi tối đa hợp chất polyphenols và hoạttính chống oxy hóa của thực vật Dé có thé đưa ra điều kiện trích ly tốt nhất cần khảosát nhiều tác nhân, một trong số tác nhân quan trọng nhất là loại dung môi, tỷ lệ dung

môi, thời gian và nhiệt độ trích ly.

Việc trích ly đóng vai trò quan trong trong quá trình phân lập và tinh chế cáchợp chất sinh học từ thực phẩm Nhiều phương pháp trích ly truyền thống và hiện dai

đã được sử dụng dé đánh giá hiệu suất thu hồi polyphenols từ thực phẩm, bao gồm

phương pháp trích ly Soxhlet, trích ly, trích ly sử dụng hỗ trợ vi sóng, chiết lỏng siêutới hạn, trích ly sử dụng hỗ trợ enzyme, trích ly sử dụng kích thích xung điện trường

(Pasrija và Anandharamakrishnan, 2015) Tất cả các kỹ thuật trên đều có những mụctiêu chung nhằm chiết xuất hợp chất sinh học từ các mẫu thực vật phức tạp, tăng sựlựa chọn cho các phương pháp phân tích, tăng độ nhạy của phương pháp bằng cáchtăng nồng độ hợp chat phân tích, chuyền đổi các hợp chất sinh học thành dạng phù

hợp hơn cho việc phát hiện và phân tách (Smith, 2003).

% Phương pháp ngắm kiệt (Percolation)

Đây là một trong các phương pháp trích ly truyền thống sử dụng cho việc chiếtchat lỏng Dụng cụ cho phương pháp bao gồm bình ngắm kiệt Mẫu thực phẩm đượcphối trộn với nước và cho vào bình ngắm kiệt Hỗn hợp được ngâm trong khoảng thờigian 24 - 48h phụ thuộc vào mẫu thực phẩm đến khi thu được dịch chiết mong muốn.Dịch chiết sau đó được đưa vào thiết bị bay hơi để cô đặc đến nồng độ chất khô đạtyêu cầu (Sridhar và ctv, 2021) Vì đây là kỹ thuật chiết liên tục, dung môi chứa hoạtchất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới Điều này trái ngược với phươngpháp ngâm dầm (Singh, 2008) Ưu điểm nổi bật của phương pháp này bao gồm khanăng trích ly hiệu quả và nhanh chóng các hợp chất từ vật liệu, nhờ vào sự tiếp xúcliên tục và đồng đều của dung môi với vật liệu, giúp tăng cường hiệu suất trích ly.Ngoài ra, phương pháp Percolation còn cho phép kiêm soát chặt chẽ quá trình trích

ly thông qua việc điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ và áp suất, mang lại khả năngtối ưu hóa quá trình trích ly (Sridhar và ctv, 2021) Tuy nhiên, phương pháp này cũngđối mặt với một số hạn chế như yêu cầu về thiết bị chuyên dụng, có thé gây tăng chiphí đầu tư ban đầu, và khả năng gây tắc nghẽn trong quá trình trích ly, cần phải có

biện pháp xử lý cân thận Điêu kiện vận hành nhạy cảm cũng đòi hỏi sự giám sat và

15

điều chỉnh liên tục dé đảm bảo hiệu quả và chất lượng của sản phẩm trích ly (Hidayat

và Wulandari, 2021).

¢ Phuong pháp ngâm dầm (Marceration)

Đây là phương pháp trích ly don giản và thường được sử dung trong trích ly

quy mô nhỏ Quy trình chung của phương pháp ngâm dầm bao gồm chuẩn bị nguyênliệu bằng việc nghiền nhỏ mẫu nguyên liệu, sau đó đặt mẫu đã nghiền nhỏ vào bìnhkín, đỗ dung môi vào và tiễn hành trích ly Thời gian ngâm mẫu được phép kéo daitrong khoảng bảy ngày, hỗn hợp thỉnh thoảng được lắc Chất lỏng sau khi ngâm đượctách riêng dé thu dịch chiết thông qua quá trình lọc hoặc ly tâm, và phan cặn ran cònlại được gọi là marc (Singh, 2008) Ưu điểm chính của phương pháp này bao gồm sựđơn giản và dễ thực hiện, không yêu cầu thiết bị đặc biệt hoặc công nghệ cao, cũngnhư khả năng bảo toàn tốt các hợp chất nhạy cảm nhiệt, nhờ vào điều kiện trích lynhẹ nhàng Ngoài ra, Marceration thân thiện với môi trường hơn một số phương pháp

khác do việc sử dụng ít dung môi hóa học độc hại Tuy nhiên, phương pháp này cũng

gặp phải một số hạn chế, bao gồm thời gian trích ly kéo dài, từ vài ngày đến vài tuần,làm giảm hiệu quả sản xuất và tăng chỉ phí (Hidayat và Wulandari, 2021) Ngoài ra,hiệu suất trích ly thường thấp hơn so với các phương pháp khác như Soxhlet hoặcsiêu âm, đồng thời việc sử dụng lượng lớn dung môi cũng gây ra vấn đề về lãng phí

và cần phải có biện pháp xử lý dung môi sau trích ly Mặc dù có những hạn ché,Marceration vẫn là một lựa chọn ưa thích trong nhiều ứng dụng nhờ vào sự đơn giản

và khả năng bao toàn các hợp chất quý giá trong quá trình trích ly (Azmir và ctv,

2013).

¢ Phương pháp trích ly bằng Soxhlet

Phương pháp Soxhlet hay còn được gọi là phương pháp trích ly răn - lỏng, đây

là một kỹ thuật truyền thống được sử dụng dé chiết chất béo trong thực pham, chủyếu là các sản phẩm sữa Được phát minh vào năm 1879, đến nay, Soxhlet vẫn đượccoi là một trong các phương pháp trích ly tiêu chuẩn nhờ vào tính chất đơn giản(Hawthorne va ctv, 2000) Mặc dù phương pháp Soxhlet có nhiều ưu điểm, bao gồmhiệu quả trích ly cao, sự đồng nhất và tự động trong quá trình, cũng như khả năng xử

lý các vật liệu thô khó tan, nhưng nó cũng có nhược điểm như yêu cầu thiết bị phứctạp và chi phí đầu tư cao ban đầu Ngoài ra, quá trình trích ly theo phương pháp nàycũng mat thời gian và cần sự giám sát kỹ lưỡng để đảm bảo an toàn và hiệu quả(Bimakr va ctv, 2011).Vì những ly do trên, nhiều nhà nghiên cứu đã có gắng cải tiễnthiết bị Soxhlet hoặc quy trình hoạt động nhằm phát triển kỹ thuật trích ly này.

1.3.2 Các kỹ thuật trích ly hiện đại

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tiềm năng của các phương pháp trích lytruyền thống, tuy nhiên, các phương pháp này đều mang nhược điểm sử dụng lượnglớn dung môi, thời gian và năng lượng Vì thế, các kỹ thuật hiện đại được đưa vàonhằm mục đích hỗ trợ các phương pháp trích ly trên Các kỹ thuật bao gồm trích ly

sử dụng hỗ trợ sóng siêu âm, vi sóng, enzyme, trích ly chất lỏng siêu tới han, Nhiềunghiên cứu đã cho thấy các kỹ thuật này có khả năng cải thiện hàm lượng polyphenolstrích ly được 32 - 36% với lượng năng lượng tiêu thụ thấp hơn 17,6% so với các

phương pháp trích ly nhiệt thông thường (Maza và ctv, 2019).

s* Phương pháp trích ly hỗ trợ sóng siêu âm

Sóng siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của cácphần tử trong không gian, tần số sóng siêu âm hỗ trợ trích ly thường trong khoảng 20

- 200 KHz trong thời gian 10 - 30 phút Cơ chế của phương pháp trích ly hỗ trợ sóngsiêu âm dựa vào lực cơ học mà năng lượng của sóng siêu âm có tần số cao chuyênthành sẽ phá vỡ các bọt khí, điều này tạo ra các tác động vật lý, hóa học, cơ học làmphá vỡ mang sinh học, tạo điều kiện dé giải phóng các hợp chất từ mẫu nguyên liệuvào dung môi, tăng cường sự truyền khối Cho đến nay, kỹ thuật trích ly sử dụng hỗtrợ sóng siêu âm vẫn được sử dụng và quan tâm nhờ vao các ưu điểm vượt trội củaphương pháp là rút ngắn thời gian trích ly và lượng dung môi tiêu thụ (Sridhar và ctv,2021) Kỹ thuật trích ly hỗ trợ sóng siêu âm cũng thường được ứng dụng trong trích

ly hợp chat polyphenols và đã được chứng minh rang hiệu suất trích ly được cải thiện

từ 6 đến 35% với lượng nguyên liệu và dung môi nhỏ hơn các kỹ thuật trích ly truyềnthong Trong ngành công nghệ hóa học và thực phẩm, trích ly hỗ trợ sóng siêu âmđược xem là một kỹ thuật trích ly “xanh”, bảo vệ môi trường bởi ưu điểm giảm dung

17

môi và năng lượng sử dụng của phương pháp (Chemat và Khan, 2011) Tuy nhiên,

phương pháp này cũng gặp phải một số hạn chế, bao gồm chi phí đầu tư ban đầu caocho thiết bị sóng siêu âm và cần kỹ thuật viên có kỹ năng để vận hành máy móc.Ngoài ra, việc áp dụng sóng siêu âm có thé không phù hop với tất cả loại vật liệu, đặcbiệt là những vật liệu dé bị hư hại bởi tác động cơ học mạnh (Gadjalova và Mihaylova,2019) Mặc dù có những nhược điểm, phương pháp trích ly hỗ trợ sóng siêu âm vanđược ưa chuộng trong nhiều ngành công nghiệp nhờ khả năng tăng cường đáng kêhiệu quả và tốc độ của quá trình trích ly (Azmur va ctv, 2013)

4 Phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng

Vi sóng là một sóng điện từ có tần số dao động trong khoảng 300 MHz đến

300 GHz Sự gia nhiệt của vi sóng dựa trên sự tác động trực tiếp của sóng đến các vậtliệu phân cực Nguyên lý của phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng đầu tiên là sự phântách các chất tan ra khỏi chất nền vật liệu dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất tăng,nhiệt được tạo ra có thể làm yếu hoặc phá vỡ thành tế bao các hợp chất sinh học vàđược giải phóng từ chất nền nguyên liệu vào dung môi chiết (Alupului và ctv, 2012;Kaufmann và Christen, 2002) Ưu điểm nổi bat của phương pháp này bao gồm tốc độtrích ly nhanh, tiết kiệm thời gian va năng lượng, do năng lượng vi sóng trực tiếp tacđộng vào vật liệu, làm tăng nhiệt độ một cách nhanh chóng và đồng đều Điều nàykhông chỉ giúp tăng hiệu suất trích ly mà còn giảm lượng dung môi cần thiết, hỗ trợmôi trường bằng cách giảm lượng chất thải hóa học (Alupului và ctv, 2012; Chuyen

và ctv, 2018 ) Ngoài ra, phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng cũng cho phép kiểm soátchặt chẽ nhiệt độ và áp suất trong quá trình trích ly, đảm bảo chất lượng cao của cáchợp chất được trích ly Đặc biệt, kỹ thuật này mang lại hiệu quả cao với các phân tửphân cực, điển hình là các hợp chat polyphenols Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có nhược điểm như yêu cầu thiết bị đặc biệt có chi phí cao và cần kỹ thuật viên đượcđào tạo đề vận hành, cũng như khả năng không phù hợp với tất cả loại vật liệu, đặcbiệt là vật liệu dé chịu tác động nhiệt (Nayak và ctv, 2015)

4 Phương pháp trích ly hỗ trợ enzyme

Phương pháp trích ly hỗ trợ enzyme là một kỹ thuật hiện đại và đặc biệt hữu

ích trong việc cải thiện hiệu quả và chất lượng của quá trình trích ly các hợp chất từvật liệu thô Ưu điểm chính của phương pháp này bao gồm khả năng phá vỡ cấu trúc

tế bào một cách nhẹ nhàng và hiệu quả, cho phép trích ly các hợp chất mục tiêu mộtcách dé dàng hơn va giữ lại hầu hết các tính chất sinh học của chúng (Puri và ctv,

2012) Việc sử dụng enzyme giúp giảm đáng kề lượng dung môi cần thiết, giảm thờigian trích ly và tiết kiệm năng lượng, đồng thời tăng cường hiệu suất và chất lượngsản phẩm trích ly Ngoài ra, phương pháp này thân thiện với môi trường và an toànhơn so với các phương pháp sử dụng hóa chất mạnh (Nadar và ctv, 2018) Tuy nhiên,phương pháp trích ly hỗ trợ enzyme cũng gặp phải một số hạn chế Chi phí choenzyme có thể cao, đặc biệt khi cần sử dụng các enzyme chuyên biệt hoặc cần mộtlượng lớn enzyme cho quá trình trích ly Việc lựa chọn và tối ưu hóa enzyme cầnthiết cho mỗi loại vật liệu cụ thê đòi hỏi kiến thức chuyên môn sâu và nghiên cứu kỹlưỡng, có thể làm tăng chỉ phí và thời gian phát triển sản phẩm (Das và ctv, 2021).Hơn nữa, quá trình trích ly có thé bị ảnh hưởng bởi các yêu tố như pH, nhiệt độ và sựhiện diện của các chất ức chế enzyme, yêu cầu sự kiểm soát chặt chẽ các điều kiệntrích ly dé đạt được hiệu quả tối ưu

1.4 Tổng quan về ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng cho mô hình tối ưuhóa dé tăng hiệu suất thu hồi các hợp chat tự nhiên

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface

Methodology — RSM)

Phương pháp bề mat đáp ứng (RSM) là một quá trình bao gồm một loạt cáctính toán phức tạp được sử dụng dé tố ưu hóa một quy trình nhất định RSM được sửdụng dé thiết lập một hệ thống bố tri thí nghiệm có thé phối hợp các yếu tô đầu vào

và sử dụng các dữ liệu đầu vào này dé đưa ra các công thức tính toán nhằm cho ra kếtquả tối ưu dự kiến của yếu tô đầu ra mong đợi

Các giá trị của các yêu tố đầu ra được dự đoán bằng phân tích hồi quy dựa trên

sự kiểm soát giá trị của các yếu tố đầu vào và do vậy khi thay đối các giá trị đầu vàothì ta có thé dự đoán được giá trị đầu ra nhờ phân tích hồi quy này (Meilgaard va ctv,1999) Năm 1951, khi RSM được giới thiệu lần đầu bởi Box và Wilson (1992) thì

19

phương pháp này giúp đã giảm được rất nhiều số lượng thí nghiệm so với phươngpháp thiết kế thí nghiệm đầy đủ nhiều yếu tố Chính vì vậy, RSM đã được ứng dụngtrong rất nhiều nghiên cứu trong đó có các nghiên cứu về lĩnh vực thực phẩm và yhọc Bên cạnh việc giảm được đáng ké số lượng thí nghiệm thì kết quả thu được từcác nghiên cứu ứng dụng RSM đã được chứng minh là có sự tin cậy cao về mặt phântích thống kê (Tan và ctv, 2009) Việc sử dụng RSM trong tối ưu hóa quy trình đãgiúp rút ngắn được thời gian nghiên cứu tác động tương hỗ của nhiều yếu tô đầu vàolên một yếu tố đầu ra so với các phương pháp bố trí thí nghiệm truyền thống trước

đây (Schutz, 1983).

Trong thực tế, một yếu tố đầu vào thường có tác động tương hỗ với các yếu tốkhác dé gây ra ảnh hưởng đến một thông số đầu ra mong muốn Do điều này nên việcnghiên cứu tác động toàn diện của các yếu tố công nghệ bằng việc sử dụng thiết kếthí nghiệm một yếu tố là rất khó và thường không chính xác Nhược điểm này đãđược khắc phục bằng việc sử dụng RSM, phương pháp có thể cho thấy rõ tác độngqua lại giữa nhiều yếu tố đầu vào lên một yêu tố đầu ra thông qua phân tích thống kêkết quả của mô hình thí nghiệm (Elksibi và ctv, 2014)

Việc ứng dụng RSM trong tối ưu hóa bao gồm ba bước chính là: 1) thiết kế thinghiệm (thông thường sử dụng thiết kế Box Behnken hoặc thiết kế tâm khối); 2) phântích thống kê và phân tích hồi quy để xây dựng công thức hồi quy cho mô hình tối ưuhóa và 3) xác định các giá tri đầu vảo tối ưu dựa trên phương trình hồi quy đã xây

nhiệt độ, tỷ lệ giữa ethanol và ammonium sulfate, thời gian trích ly va giá tri pH đã

được nghiên cứu Trong nghiên cứu ngày, thiết kế thí nghiệm gồm 27 nghiệm thứcgồm 24 nghiệm thức phối hợp và 03 nghiệm thức trung tâm đã được sử dụng Cáckết quả thu được đã được chứng minh là phù hợp với phương trình hồi quy bậc hai

và các giá tri tối ưu được xác định là 45/1 (mL/g) tỷ lệ rắn lỏng, 25% ethanol,ammonium sulphate nồng độ 22% và pH = 3,3 Chuyen và ctv (2017) cũng đã ápdụng thành công RSM kết hợp với thiết kế Box Behnken dé thiết kế thí nghiệm dékhảo sát ảnh hưởng của 03 yếu tố là thời gian, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi/nguyên liệuđến hiệu suất trích ly carotenoids từ vỏ Gac Kết qua cho thấy tỷ lệ dung môi/nguyênliệu có anh hưởng lớn nhất đến hiệu quả trích ly sau đó đến thời gian và cuối cùng lànhiệt độ Các giá trị tối ưu cho trích ly carotenoids được xác định là 150 phút, 40,7°C

và 80 mL ethyl acetate/g nguyên liệu.

Liên quan đến ứng dung RSM trong trích ly polyphenols từ các nguồn tự nhiên,rất nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc xác định điều kiện tối ưu cho việc trích

ly và thu nhận polyphenols từ sâm, mướp đắng hoặc các loại cây khác Trong mộtnghiên cứu của Tan va ctv (2014), polyphenols từ quả mướp đắng đã được trích lybằng nước với hiệu suất cao nhất là 51,6 mg/g ở các điều kiện tối ưu là 40°C và tỷ lệ

20/1 (mL nước/g nguyên liệu) Tuy nhiên, trong nghiên cứu sau đó của Yu và He

(2018) dé thu nhận polyphenols từ lá chè, điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly được

xác định là 75 mL nước/g nguyên liệu, thời gian 1 giờ, với nhiệt độ là 80°C Như vậy,

đối với từng loại nguyên liệu khác nhau thì các điều kiện tối ưu dé trích ly polyphenolscũng khác nhau Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về cấu trúc củanguyên liệu cũng như thành phần của các loại polyphenols trong từng loại nguyên

liệu (Cheok và ctv, 2014).

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu liên quan đến các hợp chất từ củsâm cau đen (Curculigo orchioides Gaertn) dan được cộng đồng khoa học quan tâmhơn nhờ các hoạt tính sinh học nổi bật của nguyên liệu này Tuy nhiên cho đến nay

có rất ít các công bố khoa học liên quan đến việc trích ly hoạt chất từ củ sâm cau đen.Cách sử dụng phô biến vẫn là phương pháp trích ly truyền thong và dùng nước ở nhiệt

21

độ cao (đun sôi) dé trích ly hoạt chất Nhược điểm của phương pháp trích ly truyềnthong này là hiệu suất trích ly thấp và dé dẫn tới sự phân hủy của các hoạt chất sinhhọc có lợi Hầu hết các nghiên cứu chưa di sâu vào việc khảo sát ảnh hưởng của cácyếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chưa nghiên cứu về việc tối ưu hóa hiệusuất trích ly các hoạt chất từ sâm cau đen Do vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng củacác yêu tổ công nghệ và các phương pháp trích ly hiện đại nhằm tăng hiệu suất thuhồi và giảm sự phân hủy các hoạt chất từ sâm cau đen dé sản xuất các chế phẩm cóhoạt tính sinh học cao là việc làm rất cấp thiết.

đó được nghiền mịn và bảo quản kín trong túi PP Mẫu được lưu trữ tại tủ đông ở

nhiệt độ -18°C tới khi sử dụng làm thí nghiệm Trước mỗi thí nghiệm, mẫu trong túikín được dé trong bình hút 4m đến nhiệt độ phòng

2.2 Hóa chat và thiết bị

Khảo sát nhiệt độ (Nhiệt độ phòng —›

70°C)

’

Khao sát tỷ lệ dung môf/nguyên liệu (10/1 — 80/1 mL/g)

2

Tối ưu hóa điều kiện

trích ly

z

Xac thuc cac gia tri tối

ưu băng thí nghiệm

2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ngâm chiết truyền thống

(marceration) đến hiệu quả thu hồi hoạt chat

Trong thí nghiệm này, bột sâm cau đen được trích ly với các dung môi khác

nhau dé xác định được dung môi thích hợp nhất Sau đó, các điều kiện trích ly khácnhau lần lượt được khảo sát gồm thời gian, nhiệt độ, và tỷ lệ dung m6i/nguyén liệu.Các chỉ tiêu theo dõi của mỗi thí nghiệm bao gồm hàm lượng saponin tổng số,polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hoá DPPH của các dịch chiết

- Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến hiệu quả tríchly

Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra loại dung môi thích hợp dé đạt được hiệu suất thuhồi các hợp chất sinh học cao nhất

Trích ly 1 g bột sâm cau đen với các dung môi acetone, ethyl acetate va ethanol

96%, ethanol 80% và nước cất với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 (mL/g) trongđiều kiện nhiệt độ phòng, thời gian 120 phút Hỗn hợp trích ly được lọc với giấy lọc0,45 um và pha loãng đến nồng độ thích hợp dé phân tích hàm lượng saponin tong số,polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hoá của các dịch chiết thu được

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly

Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra thời gian thích hợp để đạt được hiệu suất thu hồicác hợp chất sinh học cao nhất

Trích ly 1 g bột sâm cau den với dung môi trong điều kiện nhiệt độ phòng,khảo sát thời gian 60, 120, 180, 240 phút Hỗn hợp trích ly được lọc với giấy lọc 0,45

um và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích hàm lượng saponin tông sé,polyphenols tổng số và hoạt tính kháng oxy hoá của các dịch chiết thu được

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly

Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ thích hợp dé đạt được hiệu suất thu hồicác hợp chat sinh học cao nhất

Trích ly 1 g bột sâm cau đen với dung môi ở nhiệt độ phòng, 40°C, 50°C, 60°C,

70°C trong 120 phút Hỗn hợp trích ly được lọc với giấy lọc 0,45 um và pha loãngđến nồng độ thích hợp dé phân tích hàm lượng saponin tổng số, polyphenols tổng số

25