Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Khảo sát thành phần hóa học và quy trình trích ly Flavonod

Kết quả của Luận văn: - Xác định được thành phần hóa học trong cây Diếp cá Houttuynia cordata Thumb.: flavonoid, tinh dầu, carotenoid, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, coumarin..

LÊ THỊ KIM OANH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ QUY TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP

CÁ (Houttuynia cordata Thumb.), họ Lá giấp

Tp HCM, ngày …… tháng……… năm 200

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: LÊ THỊ KIM OANH Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 28/ 09/ 1981 Nơi sinh: Long An Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ HỮU CƠ MSHV: 00503132 I-TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát thành phần hóa học và quy trình trích ly Flavonoid từ cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.), họ Lá giấp (Saururaceae)

II-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xác định thành phần hóa học của cây Diếp cá (Houttuynia cordata

Thumb.) Xác định phương pháp và điều kiện thích hợp để trích ly các hợp chất từ

cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.) Nghiên cứu phương pháp cô lập, tinh chế và xác định cấu trúc các hợp

chất thu được Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của các cao trích ly

được III-NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV-NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V-HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Trần Thị Việt Hoa CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS TS Trần Thị Việt Hoa

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

Ngày tháng năm 200 PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH KHOA QUẢN LÝ NGÀNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

PGS TS TRẦN THỊ VIỆT HOA

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày………… tháng………… năm 200

- Cô Trần Thị Việt Hoa đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong quá trình học tập và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

- Các Thầy Cô trong Hội đồng Bảo vệ Luận văn đã đóng góp những nhận xét chân thành cho kết quả đạt được của luận văn

- Các Thầy Cô trong Khoa Công Nghệ Hóa Học & Dầu Khí, trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quí báu trong những năm qua

- Các bạn trong bộ môn Hóa Hữu Cơ trường Đại Học Bách Khoa và các cô chú, anh chị tại Viện Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

- Gia đình và các bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và hỗ trợ nhiệt tình để tôi hoàn thành luận văn

Rau Diếp cá thường được dùng như một loại rau gia vị, ăn sống trong các món ăn Việt Nam Diếp cáù cũng có rất nhiều công dụng trong y học dân tộc Vì vậy, trong Luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và nghiên cứu trích ly một số hợp chất trong cây Diếp cá nhằm phục vụ cho ngành dược phẩm

Kết quả của Luận văn: - Xác định được thành phần hóa học trong cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.): flavonoid, tinh dầu, carotenoid, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, coumarin

- Xác định được phương pháp và điều kiện thích hợp để trích ly các hợp chất từ cây Diếp cá

- Xác định được hàm lượng flavonoid tổng (1.21%) và tanin tổng (4.40%) trong cây Diếp cá (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối)

- Xác định được hàm lượng beta-caroten và tỉ lệ các thành phần trong cao ete dầu hỏa không xà phòng hóa

- Cô lập được hai hợp chất tinh khiết từ cao ete dầu hỏa và xác định cấu trúc của các hợp chất là sesamin và β-sitosterol

- Cô lập được một hợp chất tinh khiết từ cao etyl acetat và xác định cấu trúc của hợp chất là quercitrin

- Xác định được tính kháng oxy hóa trên hợp chất DPPH picrylhydrazyl) của các loại cao thu được

(2,2-diphenyl-1 Xác định được tác dụng diệt khuẩn nhẹ của các loại cao đối với các vi khuẩn S aureus, Salmonella, P aeruginosa

Cần có những nghiên cứu tiếp theo về việc ứng dụng những kết quả của Luận văn trong dược phẩm

Houttuynia cordata Thumb is used as seasoning, fresh vegetable in Vietnamese cooking It also has application in traditional medecine Thus, in this thesis, we study some methods to investigate chemical composition and extract some compounds from Houttuynia cordata Thumb to serve in medecine

This result of thesis: - Determined chemical composition in Houttuynia cordata Thumb.: flavonoid, essential oil, carotenoid, phytosterol, tanin, reducing cacbohydrate, saponin, coumarine

- Determined appropriate methods and conditions to extract compounds from Houttuynia cordata Thumb

- Determined the sum of flavonoid (1.21%) and tanin (4.40%) in Houttuynia cordata Thumb (based on absolute dry wieght)

- Determined the beta-carotenoid content and the ratio of composition in the non-saponified petroleum ether fraction

- Isolated and identified the structure of two compounds from petroleum ether fraction with high purity: sesamin and β-sitosterol

- Isolated and identified the structure of the compound from ethyl acetate fraction: quercitrin

- Determined the anti-oxidization activity on DPPH picrylhydrazyl) of fractions from Houttuynia cordata Thumb

(2,2-diphenyl-1 Determined the mild anti-bacterial activity on S aureus, Salmonella, P.aeruginosa of fractions from Houttuynia cordata Thumb

It is required to have following studies in application of these results in medecine

TÓM TẮT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ- SƠ ĐỒ – HÌNH – PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1.4 Trồng trọt và thu hoạch rau Diếp cá 3

1.1.5 Tính vị và tác dụng 3

1.1.6 Công dụng và đơn thuốc 4

1.1.7 Thành phần hóa học và các công trình nghiên cứu 6

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ FLAVONOID 10

1.2.1 Định nghĩa 10

1.2.2 Phân loại 12

1.2.3 Sự phân bố flavonoid trong thực vật 14

1.2.4 Tính chất vật lý 15

1.2.5 Tính chất hóa học 15

1.2.6 Vai trò của flavonoid 17

1.2.7 Các phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa 20

1.2.8 Phương pháp chiết xuất flavonoid 22

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 25

2.1.4 Xác định hàm lượng ion vô cơ 28

2.1.5 Xác định thành phần hóa học trong cây Diếp cá 29

2.2 KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ CÂY DIẾP CÁ 32

2.2.1 Phương pháp trích nguội 32

2.2.1.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu (g)/thể tích dung môi (ml) (R/L) 33

2.2.1.2 Khảo sát thời gian trích ly 33

2.2.2 Phương pháp trích ly trên hệ thống Soxhlet 33

2.2.2.1 Dung môi ete dầu hỏa 60-90oC 35

2.2.2.2 Dung môi etyl acetat 35

2.2.2.3 Dung môi etanol 90o 35

2.2.2.4 Dung môi etanol 70o 36

2.3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỔNG TRONG CÂY DIẾP CÁ 37

2.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TANIN TỔNG TRONG CÂY DIẾP CÁ 39

2.5 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO ETE DẦU HỎA 60-90oC 40

2.5.1 Xà phòng hóa 40

2.5.2 Phân lập cao ete dầu hỏa không xà phòng hóa trên sắc ký cột chậm 41

2.5.3 Tinh chế phân đoạn gộp E9 sau sắc ký cột chậm 43

2.6 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO ETYL ACETAT 43

2.6.1 Phân lập cao etyl acetat bằng sắc ký cột nhanh trên hệ thống lọc hút chân không 43

2.6.2 Phân lập phân đoạn gộp của cao etyl acetat trên sắc ký cột chậm 44

2.6.3 Tinh chế phân đoạn gộp V sau sắc ký cột chậm 45

2.7.3 Đo nhiệt độ nóng chảy 46

2.7.4 Xác định bằng phổ hồng ngoại (IR) 46

2.7.5 Xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 47

2.7.6 Xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) 47

2.7.7 Xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 47

2.8 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC LOẠI CAO THU ĐƯỢC 47

2.8.1 Nguyên tắc 48

2.8.2 Cách tiến hành 49

2.9 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO THU ĐƯỢC 49

2.9.1 Nguyên tắc 49

2.9.2 Cách tiến hành 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 51

3.1.1 Xử lý nguyên liệu 51

3.1.2 Xác định độ ẩm 51

3.1.3 Xác định độ tro 51

3.1.4 Xác định hàm lượng ion vô cơ 51

3.1.5 Xác định thành phần hóa học trong cây Diếp cá 52

3.2 KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤT TỪ CÂY DIẾP CÁ 54

3.2.1 Phương pháp trích nguội 54

3.2.1.1 Trích ly các hợp chất bằng ete dầu hỏa 60-90oC 54

3.2.1.2 Trích ly các hợp chất bằng etyl acetat 56

3.2.1.3 Trích ly các hợp chất bằng etanol 90o 58

3.2.1.4 Trích ly các hợp chất bằng etanol 70o 60

DIẾP CÁ 66

3.4 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO ETDH 60-90oC 67

3.4.1 Xà phòng hóa 67

3.4.2 Xác định hàm lượng beta-caroten và tỉ lệ các thành phần trong cao ETDH không xà phòng hóa 67

3.4.2.1 Khảo sát hàm lượng beta-caroten 67

3.4.2.2 Khảo sát thành phần hóa học trong cao ETDH không xà phòng hóa bằng phương pháp GC-MS (phụ lục 3) 68

3.4.3 Phân lập cao ete dầu hỏa không xà phòng hóa trên sắc ký cột chậm 69

3.4.4 Tinh chế phân đoạn E9 71

3.5.2 Phân lập phân đoạn gộp của cao etyl acetat trên sắc ký cột chậm 78

3.5.3 Tinh chế phân đoạn V 79

3.5.4 Nhận danh 80

3.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOẠI CAO 83

3.6.1 Khảo sát tính kháng oxy hóa 83

3.6.2 Khảo sát tính kháng khuẩn 85

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC

TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Bảng 1.1: Các hợp chất phenolic thu được từ SKC dịch chiết tổng polyphenol 8

Bảng 1.2: Kết quả định lượng 4 flavonoid trong các mẫu cây trồng (μg/g) 10

Bảng 1.3: Phân loại flavonoid 13

Bảng 3.1: Kết quả độ ẩm của rau Diếp cá 51

Bảng 3.2: Kết quả độ tro (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 51

Bảng 3.3: Kết quả xác định hàm lượng các ion vô cơ (phụ lục 2) 52

Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần hoá học 53

Bảng 3.5: Hàm lượng cao ETDH ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 54

Bảng 3.6: Hàm lượng cao ETDH theo thời gian trích ly (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 55

Bảng 3.7: Hàm lượng cao EtOAc ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 56

Bảng 3.8: Hàm lượng cao EtOAc theo thời gian trích ly (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 57

Bảng 3.9: Hàm lượng cao EtOH 90o ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 58

Bảng 3.10: Hàm lượng cao EtOH 90o theo thời gian trích ly (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 59

Bảng 3.11: Hàm lượng cao EtOH 70o ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 60

Bảng 3.12: Hàm lượng cao EtOH 70o theo thời gian trích ly (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 61

Bảng 3.13: Hàm lượng cao thu được khi trích ly trên hệ thống Soxhlet (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) 63

tuyệt đối) 66

Bảng 3.17: Kết quả xà phòng hoá cao ETDH 67

Bảng 3.18: Tỉ lệ các thành phần trong cao ETDH không xà phòng hoá 68

Bảng 3.19: Kết quả sắc ký cột chậm của cao ETDH không xà phòng hoá 70

Bảng 3.20: Kết quả phổ IR của hợp chất OANH-03 72

Bảng 3.21: Kết quảso sánh phổ 1H-NMR của hợp chất OANH-03 và sesamin 72

Bảng 3.22: Kết quả so sánh phổ 13C-NMR, phổ DEPT OANH-03 và sesamin 73

Bảng 3.23: Kết quả phổ IR của hợp chất OANH-04 74

Bảng 3.24: Kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất OANH-04 75

Bảng 3.25: Kết quả phổ 13C-NMR, phổ DEPT của OANH-04 và β-sitosterol 75

Bảng 3.26: Kết quả sắc ký cột nhanh của cao EtOAc 78

Bảng 3.27: Kết quả sắc ký cột chậm phân đoạn gộp EA6 của cao EtOAc 79

Bảng 3.28: Kết quả phổ IR của hợp chất OANH-8 80

Bảng 3.29: Kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất OANH-8 81

Bảng 3.30: Kết quả phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất OANH-8 81

Bảng 3.31: Kết quả phổ LC-MS của hợp chất OANH-8 (phụ lục 14)

Bảng 3.323: Kết quả đo hoạt tính kháng oxy hóa 83

Bảng 3.34: Giá trị EC50 trong khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao 85

Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao (phụ lục 20) 85

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát phương pháp trích nguội 86

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát phương pháp trích Soxhlet 86

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Hàm lượng cao ETDH ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội 55

Đồ thị 3.2: Hàm lượng cao ETDH theo thời gian trích ly 56

Đồ thị 3.3: Hàm lượng cao EtOAc ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội 57

Đồ thị 3.4: Hàm lượng cao EtOAc theo thời gian trích ly 58

Đồ thị 3.5: Hàm lượng cao EtOH 90o ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội 59

Đồ thị 3.6: Hàm lượng cao EtOH 90o theo thời gian trích ly 60

Đồ thị 3.7: Hàm lượng cao EtOH 70o ở các tỉ lệ R/L theo phương pháp trích nguội 61

Đồ thị 3.8: Hàm lượng cao EtOH 70o theo thời gian trích ly 62

Đồ thị 3.9: So sánh hàm lượng cao thu được ở các phương pháp 65

Đồ thị 3.10: Đồ thị xác định EC50 của vitamin C 84

Đồ thị 3.11: Đồ thị xác định EC50 của cao EtOAc 84

Đồ thị 3.12: Đồ thị xác định EC50 của cao EtOH 70o 84

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Qui trình chiết xuất flavonoid 22

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thực nghiệm tổng quát 25

Sơ đồ 2.2: Qui trình xác định hàm lượng flavonoid tổng 37

Sơ đồ 2.3: Qui trình xác định hàm lượng tanin tổng 39

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.) và hoa 2

Hình 2.1: Vùng nguyên liệu rau Diếp cá tại Tiền Giang 26

Hình 2.2: Thiết bị trích ly Soxhlet 34

Hình 2.3: Cột sắc ký chậm 41

dầu hỏa với hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) 71 Hình 3.2: Kết quả sắc ký lớp mỏng hợp chất thu được sau tinh chế từ cao etyl acetat với hệ dung môi BuOH-acid acetic-nước (4:1:5) 80 DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Tính toán Phụ lục 2: Kết quả hàm lượng ion vô cơ trong tro rau Diếp cá Phụ lục 3: Kết quả hàm lượng beta-caroten và các thành phần trong cao ETDH không xà phòng hóa

Phụ lục 4: Kết quả phổ IR của mẫu OANH-03 Phụ lục 5: Kết quả phổ 1H– NMR của mẫu OANH-03 Phụ lục 6: Kết quả phổ 13C – NMR của mẫu OANH-03 Phụ lục 7: Kết quả phổ DEPT của mẫu OANH-03 Phụ lục 8: Kết quả phổ IR của mẫu OANH-04 Phụ lục 9: Kết quả phổ GC-MS của mẫu OANH-04 Phụ lục 10: Kết quả phổ 1H– NMR của mẫu OANH-04 Phụ lục 11: Kết quả phổ 13C – NMR của mẫu OANH-04 Phụ lục 12: Kết quả phổ DEPT của mẫu OANH-04 Phụ lục 13: Kết quả phổ IR của mẫu OANH-8 Phụ lục 14: Kết quả phổ LC-MS của mẫu OANH-8 Phụ lục 15: Kết quả phổ 1H– NMR của mẫu OANH-8 Phụ lục 16: Kết quả phổ 13C – NMR của mẫu OANH-8 Phụ lục 17: Kết quả phổ DEPT của mẫu OANH-8 Phụ lục 18: Kết quả phổ 1H-NMR và 13C – NMR của sesamin Phụ lục 19: Kết quả phổ 13C – NMR của β-sitosterol

Phụ lục 20: Kết quả phổ 13C – NMR của Quercitrin Phụ lục 21: Kết quả khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao

ETDH : Ete dầu hỏa EtOAc : Etyl acetat MeOH : Metanol EtOH : Etanol BuOH : n-butanol TB : Trung bình R/L : Tỉ lệ nguyên liệu (g)/ thể tích dung môi (ml) PĐ : Phân đoạn

KL : Khối lượng SKLM : Sắc ký lớp mỏng AH : Chất kháng oxy hóa DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

MỞ ĐẦÂU

Hoá học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm không những ở các nước đang phát triển mà còn ở cả các nước tiên tiến do phạm vi ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm… Người tiêu dùng hiện nay ưa thích sử dụng những chất có nguồn gốc tự nhiên hơn là những chất tổng hợp do nguồn nguyên liệu sẵn có, dễ tìm, ít độc tính và phù hợp với cơ thể người

Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa trải dài từ Bắêc xuống Nam nên hệ thực vật rất phong phú Do đó nguồn tài nguyên về dược liệu là rất đa dạng, đây là diều kiện rất tốt cho việc tìm tòi và nghiên cứu trị bệnh Diếp cá là một loại rau rất phổ biến trong các bữa ăn của người Việt Nam, đồng thời cũng là một vị thuốc tốt trị các bệnh như ho, trĩ, mát gan, giải độc…

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây rau Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.), bộ Hồ tiêu (Piperales), thuộc họ Lá giấp (Saururaceae) đã được sử dụng trong y học dân tộc để chữa trị trĩ, kháng viêm, bền mao mạch, lợi tiểu, Mục đích của đề tài:

- Khảo sát thành phần hoá học của cây Diếp cá - Nghiên cứu qui trình trích ly các hợp chất từ cây Diếp cá - Nghiên cứu phương pháp cô lập, tinh chế và xác định cấu trúc các

hợp chất thu được từ cây Diếp cá - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của các cao trích

ly được Chúng tôi hy vọng với kết quả nghiên cứu thu được về cây rau Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.) ở Việt Nam sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học và nâng cao giá trị sử dụng loại rau này

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DIẾP CÁ 1.1.1 TÊN GỌI [1,2]

Tên Việt Nam: Diếp cá, rau Giấp, cây Lá giấp, Ngư tinh thảo Tên khoa học: Houttuynia cordata Thumb., thuộc bộ Hồ tiêu (Piperales), họ Lá giấp (Saururaceae)

1.1.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT [2] Là cây thảo cao 15-50cm, thân màu lục hoặc tím đỏ Lá mọc so le, hình tim, có bẹ, khi vò ra có mùi tanh như mùi cá Cụm hoa hình bông bao bởi bốn lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn

Mùa hoa từ tháng 5 đến tháng 8, mùa quả từ tháng 7 đến tháng 10

Hình 1.1: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thumb.) và hoa 1.1.3 PHÂN BỐ [2]

Loài của lục địa châu Á, phân bố từ Aán Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và các nước Đông Dương Ở nước ta, Diếp cá thường mọc hoang khắp nơi thành từng đám ở những chỗ ẩm ướt như ven sông, bờ ao, kênh rạch Diếp cá

là cây chịu bóng và ưa ẩm, thường được trồng làm rau ăn hoặc làm thuốc Thường dùng tươi, có thể phơi hay sấy khô để dùng dần

1.1.4 TRỒNG TRỌT VÀ THU HOẠCH RAU DIẾP CÁ [9] Cây sinh trưởng mạnh từ giữa mùa xuân đến mùa đông lạnh hoặc mùa khô ở các tỉnh phía Nam.Vào mùa khô hoặc mùa đông cây ngừng sinh trưởng và có hiện tượng lụi qua đông

Từ một cây diếp cá ban đầu nếu không gặp trở ngại, sau 1-2 năm có thể phát triển thành đám Ngoài phương thức phát triển từ hạt, Diếp cá có khả năng tái sinh chồi mạnh từ thân rễ

Thời vụ trồng tốt nhất là vào mùa xuân trong các tháng 2-4 Trồng bằng cách giâm cành hoặc nhổ tách gốc lấy những cây con đem trồng Đất trồng cần được làm kĩ, tơi nhỏ Sau đó lên luống rộng từ 60-70cm, cao 10-15cm Cây trồng từ trên xuống với khoảng cách 10 x10cm Khi bứng cây để trồng chú ý không được làm đứt rễ vì Diếp cá có bộ rễ ăn tương đối sâu Lúc mớùi trồng cây cần ở độ ẩm cao và làm sạch cỏ Từ khi cây ra hoa quả trở đi, Diếp cá có thể phát triển thành bãi

Mùa cho nhiều lá nhất là từ tháng 4 đến tháng 9 Sau mỗi lần thu hái cây cần được bón thúc để phát triển Cây rau Diếp cá có thể cho thu hái trong nhiều năm

1.1.5 TÍNH VỊ VÀ TÁC DỤNG 1.1.5.1 Tính vị [2]

Diếp cá có vị cay chua, mùi tanh, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, ức chế thần kinh và chống viêm loét

1.1.5.2 Tác dụng

Người ta đã biết cordalin ( alkaloid) có tác dụng kích thích gây phồng, flavonoid của Diếp cá có tác dụng vitamin P, quercitrin có tác dụng lợi tiểu mạnh ngoài ra còn có tác dụng làm bền mao mạch và kháng viêm [5]

Tinh dầu của Diếp cá có tác dụng kháng khuẩn mạnh Tinh dầu ức chế trực tiếp các loại virus sau: virus gây bệnh herpes ( mụn rộp) chủng 1, virus gây bệnh cúm và HIV chủng 1 của người, nhưng không thấy có tác dụng chống virus gây bại liệt Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lí bằng thuốc [3]

Theo GS-BS Trần Văn Kỉ, Diếp cá có tính kháng khuẩn mạnh: ức chế các loại tụ cầu vàng, liên cầu dung huyết, phế cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu, leptospira, nấm, virus cúm Dịch chiết xuất bằng ete có tác dụng ức chế trực khuẩn lao ( invitro) với nồng độ thấp nhất là 1:32000 Diếp cá còn có tác dụng tăng chức năng miễn dịch của cơ thể, kháng viêm và lợi tiểu

Theo sách Trung dược học, các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện trong Diếp cá có chất ngư tinh thảo tố có tác dụng ức chế ung thư

1.1.6 CÔNG DỤNG VÀ ĐƠN THUỐC [2] 1.1.6.1 Công dụng

Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt Nam, nhất là ở các tỉnh phía Nam Thường được dùng làm rau ăn sống, rau gia vị cùng các loại rau khác Diếp cá cũng được sử dụng làm thuốc trị: táo bón, lòi dom, trẻ em lên sởi, mề đay, viêm vú, viêm mô tế bào, viêm tai giữa, mắt đau nhặm đỏ hoặc nhiễm trùng gây mủ xanh, viêm mủ màng phổi, viêm ruột, lị, viêm nhiễm đường tiết niệu, viêm thận, phù thủng, phụ nữ kinh nguyệt không đều Còn dùng trị sốt rét, sài giật trẻ em, đau răng, trâu bò bị rắn

cắn Liều dùng 6-12g khô, hoặc 20-40g tươi, dạng thuốc sắc hoặc giã nát lấy nước uống, dùng ngoài lấy lá tươi giã nhỏ đắp

Ở Thái Lan người ta dùng lá tươi để trị bệnh hoa liễu và trị các bệnh ngoài da Toàn cây được dùng làm thuốc lợi tiểu, sát khuẩn đường tiết niệu sinh dục

Ở Trung Quốc người ta cũng sử dụng diếp cá trong các trường hợp viêm mủ màng phổi, dị ứng, mẫn ngứa, mề đay, thử nghiệm điều trị ung thư phổi 1.1.6.2 Một số đơn thuốc

− Viêm tuyến sữa: lá Diếp cá, lá Cải trời mỗi vị 30g giã nát, chế nước sôi vào vắt lấy nước cốt uống nóng, bã trộn với giấm, đắp rịt

− Kinh nguyệt không đều: dùng lá Diếp cá giã nát thêm nước uống − Đau mắt nhặm đỏ, đau mắt do trực trùng mủ xanh: dùng lá Diếp cá tươi giã nát, trộn với lòng trắng trứng gà để đắp lên mi mắt khi đi ngủ

− Bệnh trĩ đau nhức: dùng lá Diếp cá nấu nước xông, ngâm rửa lúc còn nóng, còn bã dùng để đắp vào chỗ đau, cũng có thể dùng Diếp cá uống tươi hoặc sắc uống liên tục trong 3 tháng

− Bệnh sởi: lấy 30g bánh tẻ cây Diếp cá rửa sạch ( có thể sao qua ) sắc nước đặc để nguội uống, ngày làm vài lần để tiệt nọc và không tái phát

− Đái buốt, đái dắt: dùng rau Diếp cá, rau Má tươi mỗi thứ 50g, lá Mã đề rửa sạch vò với nước sôi để nguội gạn trong uống

− Viêm phổi, viêm ruột, kiết lị, viêm thận, phù thủng: dùng lá Diếp cá 50g sắc uống

1.1.7 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.7.1 Tinh dầu và các thành phần dễ bay hơi

Trong cây Diếp cá, tinh dầu chiếm 0.0049% Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metyl nonyl ceton CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), myrcen (C10H46), acid caprinic (C19H19COOH) và lauryl aldehyd [1]

Một số công bố gần đây cũng cho thấy thành phần trong tinh dầu Diếp cá thì khác nhau tùy theo nguồn gốc [8]:

− Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong đó có 4 hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồmβ-pinen ( 3.15%), 2-undecanon (15.15%), 1-metoxy-2-metyl propen (12.12%), 1R-α-pinen (11.03%)

− Tinh dầu Diếp cá mọc tại Nhật công bố gồm các hợp chất chủ yếu là decanal ( capryl aldehyd ), dodecanal (lauryl aldehyd ) và 2-hexadecanon (metyl nonyl ceton )

− Tinh dầu Diếp cá mọc tại Trung Quốc có thành phần chủ yếu là lauryl aldehyd, myrcen, metyl nonyl ceton Ngoài ra còn có 3-oxododecanol (decanoyl acetaldehyd ), đây là chất có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm cao

Định lượng tinh dầu cho Diếp cá tươi và khô lần lượt là: 1.81 ± 0.26% và ± 0.42 % Như vậy Diếp cá tươi chứa nhiều tinh dầu hơn Diếp cá khô [14]â

Meiling Qui, Xiaoxia Ge, Minmin Liang và Ruonong Fu-Khoa Hĩa trường Kỹ thuật thuộc Viện cơng nghệ Beijing Trung Quốc đã sử dụng phương pháp sắc ký khí nhanh ghép khối phổ (FGC – MS) để phân tích các hợp chất dễ bay hơi từ cây

Houttuynia cordata Thumb.Với phương pháp này, bột dược liệu mịn cĩ thể được sử

dụng trực tiếp cho quá trình phân tích, khơng cần phải qua giai đoạn chiết nên thời gian phân tích được rút ngắn Ngồi ra, lượng mẫu cần sử dụng ít: chỉ khoảng vài mg bột Phương pháp FGC - MS cho kết quả: 50 hợp chất được phân tách và 39

chất trong số đĩ được xác định bằng cách phân tích khối phổ Các hợp chất chính gồm: 3-metyl-butanoic acid, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-metyl-4H-pyran-4-on, 2-undecanon, 1-decen-3-on, n-decanoic acid, dodecanoic acid, pentadecanol, hexadecyl-oxiran, tetrametyl-2-hexadecen-1-ol, palmitic acid, linoleic acid, phytol và decanoyl acetadehyd Kết quả này tương tự với kết quả thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) nguyên thủy sử dụng tinh dầu chiết được làm mẫu phân tích [18]

Theo Cheng-Jian Xu, Yi-Zeng Liang-Trường Cao đẳng Hĩa và Kỹ thuật hĩa học, trung tâm nghiên cứu hiện đại hĩa dược liệu Trung Quốc, Đại học Nam Trung và Foo-Tim Chau-Phịng thí nghiệm Dược liệu và hĩa học, Khoa Cơng nghệ hĩa học và sinh học ứng dụng, Đại học Bách khoa Hongkong Trung Quốc: các thành

phần chủ yếu của cây Houttuynia cordata cĩ thể được xác định bằng cách sử dụng

phương pháp ước lượng tích hợp để phân tích bộ phổ GC – MS Các chất chủ yếu thu được gồm: [Z]-2-nonenal, [Z]-β-terpineol, capric aldehyd, 1-decanol, metyl-n-nonylketon, lauraldehyd, decanoic acid, 1-dodecanol Đây là phương pháp triển vọng để tách phổ tinh từ các bộ phổ GC – MS phức tạp, giúp cho các nhà hĩa phân tích và dược sĩ thu nhận được nhiều thơng tin về bản chất hĩa học của các phổ cĩ độ phức tạp cao [20]

Theo Minmin Liang, Meiling Qi, Ruonong Fu-Khoa Hĩa trường Khoa học vật liệu và Kỹ thuật hĩa học, Viện cơng nghệ Beijing, Changbin Zhang-Trung tâm nghiên cứu khoa học mơi trường sinh thái thuộc Học viện khoa học Trung Quốc và Shan Zhou-Trung tâm Kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh thành phố Beijing Trung Quốc: để chuẩn bị mẫu cho quá trình phân tích sắc ký khí ghép khối phổ các hợp

chất dễ bay hơi trong cây Houttuynia cordata Thumb., kỹ thuật chiết vi lượng pha

rắn (SPME) đã được sử dụng SPME là phương pháp nhanh chĩng, đơn giản và chọn lọc trong việc cơ lập các họat chất từ dược liệu và đưa ra số lượng tổng cộng các chất thu được cao hơn so với phương pháp hĩa hơi nhanh hoặc chưng cất lơi cuốn hơi nước 2-undecanon (22.21%) và houttuynium (7.23%) là các thành phần

chủ yếu trong mẫu chiết thu được từ cây Houttuynia cordata bằng phương pháp

SPME [21] 1.1.7.2 Flavonoid

Các flavonoid đáng chú ý trong Diếp cá gồm có quercitrin, isoquercitrin và phloretin Các chất này được coi là những hợp chất có tác dụng kháng oxy hóa do có khả năng dập tắt các gốc tự do Flavonoid được dùng để điều trị các bệnh tim mạch, lão hóa, thoái hóa gan, ung thư,

Diếp cá mọc tại Việt Nam có tài liệu công bố trong hoa và quả có chứa isoquercitrin, trong lá có chứa quercitrin (0,2%) [2]

Theo Hồng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo và Nguyễn Danh Thục-Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên: bằng phương pháp chiết bột lá Diếp cá thu hái tại Từ Liêm (Hà Nội) với aceton 70% trong nước, sắc ký cột (SKC) trên Sephadex LH20 với metanol-nước (tỉ lệ 0% - 100%, bước nhảy 10%) thu được dịch chiết tổng polyphenol là các phân đoạn tương ứng với tỉ lệ dung mơi 30% - 70% Sắc ký dịch chiết tổng polyphenol trên cột Sephadex như trên đã phân lập và nhận dạng cấu trúc được 4 hợp chất sau: phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin), quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (hyperin), quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin), isoquercitrin [15]

Bảng 1.1: Các hợp chất phenolic thu được từ SKC dịch chiết tổng polyphenol

Các phân đoạn

Tỷ lệ dung mơi

0 – 2 3 4 5 6

0 – 20 30 40 60 70

Đường, các acid phenolic phân cực Phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid Phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid Quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid Avicularin, hyperin, isoquercitrin, các oligomer

Dịch chiết tổng polyphenol và phân đoạn 5 được sử dụng để đánh giá hoạt tính đối với gan thơng qua tác dụng lên sự peroxy hĩa lipid màng tế bào gan (invitro) và tác dụng đối với khả năng thải độc của tế bào gan thơng qua phương pháp nghiệm lọc BSP (invitro) cho kết quả khả quan

Bằng phương pháp điện di mao quản với đầu dị điện hĩa, các nhà khoa học Xuequin Xu, Wei Wang, Lishuang Yu, Guonan Chen-Khoa Hĩa, Đại học Fuzhou Trung Quốc và Hongzhi Ye-Phịng thí nghiệm trung tâm thuộc Cao đẳng Dược liệu cổ truyền Trung Quốc đã xác định được 4 flavonoid: rutin, hyperoisd, quercitrin và

quercetin trong cây Houttuynia cordata Thumb và cây Saururus chinensis (Lour.)

Bail (từ tỉnh Fujian, Trung Quốc) [22]

O

OHOH

OHOOHO

O

OHOH

OOOHO

OCH2OHOH

OHOH

Quercetin Hyperosid

O

OHOH

OOOHOH

OCH2OH

OHOHO

OH

OHOHCH3

O

O

OHOH

OOOHOH

OO

H

OHOHCH3

Rutin Quercitrin Hàm lượng 4 flavonoid trong các phần khác nhau của cây thì khác nhau, trong lá nhiều hơn trong thân

Bảng 1.2: Kết quả định lượng 4 flavonoid trong các mẫu cây trồng (µg/g)

Houttuynia cordata Thumb

Lá Thân

100.8 -

474.4 26.4

1054.0 53.3

112.4 -

Saururus chinensis (Lour.) Bail

Lá Thân

- 56.1

276.0 16.1

761.5 28.4

69.4 10.0 (Độ lệch chuẩn tương đối từ 1,2% - 7,7%)

1.1.7.3 Các thành phần khác

− Thành phần tính theo g%: nước (91.5), protid (2.9), glucid (2.7), lipid (0.5) cellulose (1.8), dẫn xuất không protein (2.2), khoáng toàn phần (1.1) [2]

− Thành phần tính theo mg%: canxi (0.3), kali (0.1), carotenoid (1.26), vitamin C (0.68) [2]

− Độ tro toàn phần: 11.4%, tro không tan trong acid hydrocloric: 2.7% [1] − Người ta còn tìm thấy trong thành phần Diếp cá có chứa Fe, Mg, Mn Đây là những khoáng chất cần thiết cho cơ thể Trong Diếp cá không có các kim loại nặng như arsen, cadmi, crom hoặc chì

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ FLAVONOID 1.2.1 ĐỊNH NGHĨA [5, 7, 17]

Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu tạo khung theo kiểuC6-C3- C6 hay nói cách khác khung cơ bản gồm hai vòng benzen nối với nhau qua một mạch ba cacbon Cấu trúc có thể là vòng kín hoặc hở Trong đa số trường hợp thì mạch ba cacbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng có oxi C

Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn xuất có gốc phenyl của các nhân trên Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxi rồi tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ Trong trường hợp không có vòng C tức là mạch 3 cacbon hở, ví dụ như trường hợp chalcon, thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ

O

12

3456

2'3'4'5'6'

O1

234561'

2'3'4'

5'6'

1.2.2 PHÂN LOẠI [5, 7] Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí các gốc aryl ( vòng B) và mức độ oxy hoá của mạch 3 cacbon Flavonoid được phân loại như sau:

− Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C2

− Isoflavonoid là các gốc flavonoid có gốc aryl ở vị trí C3

− Neoflavonoid là các gốc flavonoid có gốc aryl ở vị trí C4 Ngoài ra còn có:

− Biflavonoid là những flavonoid dimer

− Triflavonoid là những flavonoid trimer

− Flavonlignan là phân tử flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

B1

2

3456

5'6'

4'3'2'

OO

Bảng 1.3: Phân loại flavonoid

STT Phân loại Đặc điểm Cấu tạo 1 Flavon Vòng B gắn vào vòng C

(pyran) qua dây nối ở C2

2 Flavonol Có thêm nhóm OH ở C3

3 Flavanon Thiếu dây nối đôi ở C2 và

C3 Tất cả flavanon thường có nhóm OH ở vòng A hoặc B

4 Flavanol Không có nối đôi ở C2-C3,

có thêm nhóm OH ở C3

5 Chalcon Là flavonoid vòng mở, 2

nhân thơm kết hợp nhau qua 1 dãy 3 cacbon α, β không bão hòa

6 Dihydrochalcon Là chalcon bị mất nối đôi

α-β

7 Anthocyanidin Không có nhóm carbonyl ở

C4 R1, R2 là OH, OCH3, H R3 là glycosyl

R4 là OH, glycosyl

8 Auron Là một hệ thống hai

benzylliden cumaron

O

OCH

O

OOH

OO

OH3

O

2'

6'5'

56

432

αβ

O

2'

6'5'

56

432

αβ

O+

R1R4

R2

R3

R4R4

1.2.3 SÖÏ PHAĐN BOÂ FLAVONOID TRONG THÖÏC VAÔT [14] Trong thöïc vaôt baôc thaâp flavonoid ít ñöôïc gaịp Trong ngaønh ređu chư phaùt hieôn ñöôïc raât ít chaât Trong döông xư soâ löôïng flavonoid ít nhöng ñeău coù maịt caùc nhoùm: anthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon

Ngaønh hát traăn coù khoạng 700 loaøi, 20 hó, soâ löôïng coù chöùa flavonoid cuõng khođng nhieău nhöng cuõng ñụ caùc nhoùm anthocyianidin, flavonon, flavon, flavonol, leucoanthocyanidin, isoflavon Ngaønh hát traăn khaùc thöïc vaôt baôc thaâp vaø ngaønh hát kín ôû choê coù söï hieôn dieôn cụa nhieău hôïp chaât biflavonoid

Flavonoid taôp trung ôû ngaønh hát kín thuoôc lôùp hai laù maăm Coù raât nhieău loái chöùa flavonoid vaø ñụ loái flavonoid:

− Hó Fabaceae thöôøng hay gaịp caùc chaẫt thuoôc nhoùm isoflavonoid − Hó Rutaceae thöôøng gaịp caùc flavon vaø flavonol coù nhieău nhoùm metoxy − Hó Theaceae hay gaịp caùc 3-ol flavan

− Hó Polygonaceae hay gaịp caùc flavon vaø flavonol … Lôùp moôt laù maăm coù 53 hó nhöng ñeân nay chư coù khoạng tređn 10 hó tìm thaây coù flavonoid

Ñoông vaôt khođng toơng hôïp ñöôïc flavonoid nhöng trong moôt soâ loaøi böôùm khi phađn tích thaây coù flavonoid laø do chuùng laây thöùc aín töø thöïc vaôt

Haøm löôïng vaø cạ thaønh phaăn flavonoid trong cađy phú thuoôc vaøo nôi móc Cađy móc ôû nhöõng nôi coù aùnh saùng cao thì haøm löôïng cao hôn nhöõng cađy móc ôû nôi thieâu aùnh saùng

1.2.4 TÍNH CHẤT VẬT LÝ [5]

− Các flavonoid thường có màu vàng, dễ kết tinh − Do có nhiều nhóm OH và các gốc đường nên flavonoid có tính phân cực mạnh

− Flavonoid tan tốt trong các dung môi phân cực mạnh 1.2.5 TÍNH CHẤT HÓA HỌC [5, 7, 17, 36]

Do có nhiều nhóm OH phenolic nên các flavonoid có khả năng liên kết với nhau để tạo thành phân tử phức tạp hơn hoặc phản ứng với các hợp chất khác trong cây (kết hợp với oza tạo glycosid, kết hợp với muối tạo các phức…) 1.2.5.1 Phản ứng thủy phân

OC6H10O4O C6H11O4

+NH4OH

+OH

O

OHOH

OC6H10O4 O C6H11O4OH

O

OHOH

OC6H10O4 O C6H11O4

H2O/H2SO4

C6H12O6 C6H12O5GlucoseRhamnose

OH

1.2.5.3 Phản ứng ghép đôi với muối diazoni

1.2.5.4 Phản ứng tạo phức với các ion kim loại nặng

1.2.5.5 Phản ứng tạo muối

OHHO

O

O

OHOH

OC6H10O4

O

C6H10O4

OC6H11O4

SO3NaN=N

SO3HH2N

OC6H10O4 O C6H11O4

O

OHOH

OC6H10O4O C6H11O4

O

C6H10O4 O C6H11O4Pb

1.2.5.5 Phản ứng thế ở nhân thơm

1.2.6 VAI TRÒ CỦA FLAVONOID [5,7, 28, 29, 33, 34, 35] 1.2.6.1 Các phản ứng sinh hóa

Các nhóm phenol của flavonoid có vai trò trong sự hòa tan các chất vì di chuyển dễ dàng qua các màng sinh lý Một số flavonoid có tác dụng như một chất chống oxy hóa, bảo vệ như acid ascobic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật Một số có tác dụng ức chế các enzym và các chất độc của cây

1.2.6.2 Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng

Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoid Nhóm chức hydroxy có vai trò quyết định về tác dụng này Ví dụ: trong cây Ổi, các flavonoid có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của enzym trong khi các flavonoid có OH ở 3’ và 4’ lại có tính ức chế Flavonoid còn tham gia vào sự hô hấp quang hợp

1.2.6.3 Vai trò tạo màu sắc

Flavonoid đóng vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả Sâu bọ, nhờ hệ thống thị giác đặc biệt, chúng rất nhạy cảm đối với màu sắc của cây cỏ

OH

O

OHOH

OC6H10O4O C6H11O4

+Br2

OHHO O

O

OHOH

OC6H10O4 O C6H11O4Br Br

BrBr

Br-HBr

Trong việc tạo màu, các flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng trong khi các anthocyanin cho các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm

1.2.6.4 Vai trò một chất bảo vệ cây

Một số flavonoid không màu trong lá đóng vai trò một chất bảo vệ cây, ngăn trở đối với các động vật ăn cỏ Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này 1.2.6.5 Vai trò của flavonoid trong y học

Gốc tự do là những hợp chất hoạt tính cao, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài Do có năng lượng lớn nên các gốc tự do có xu hướng phản ứng với một chất hóa học nào đó trong cơ thể để trở về mức năng lượng thấp hơn, do đó chúng làm thay đổi các quá trình, hợp chất trong cơ thể Chúng là nguyên nhân gây nên trên 60 loại bệnh của cơ thể, bao gồm các bệnh liên quan đến quá trình lão hóa, ung thư và xơ cứng động mạch Cơ thể cũng cung cấp một số emzym "trung hòa" các gốc tự do này nhưng không đủ Do đó cung cấp thêm các chất chống oxi hóa từ nguồn dinh dưỡng là cần thiết cho cơ thể

Các dẫn xuất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HOz, ROOz Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh ADN thì sẽ gây ra ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa

Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyd hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào Đưa các chất chống oxy hóa như flavonoid vào

cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như: xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxy- hóa khử Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase Enzym này làm tăng tính thấm của mao mạch Khi enzym này thừa sẽ gây ra hiện tượng xuất huyết dưới da còn gọi là bệnh thiếu vitamin P Thực nghiệm cho thấy các flavonoid có nhóm OH tự do ở vị trí 3’, 4’ có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch

1.2.6.6 Khả năng kháng oxy hóa của hợp chất flavonoid

Các họ oxy hoạt tính là nguyên nhân gây ra các phá hủy tế bào sinh học như carbohydrat, lipid, protein, DNA [41] Một số nhóm oxy hoạt tính nổi bậc như: ROOz, NOz, O2z, H2O2, HOz,… Gốc HOz là gốc rất quan trọng vì có khả năng phản ứng cực kỳ mạnh Các ion kim loại như Fe2+, Cu2+ , có rất rộng rãi trong tế bào sống, đóng vai trò quan trong trong quá trình xúc tác để tạo ra các gốc HOz

Trong dung môi phân cực hay không phân cực, pH cao hay thấp thì sự oxi hóa cũng xảy ra khác nhau Các nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, loại các gốc tự do gây hại cho cơ thể còn chứng minh rằng khả năng đó không chỉ phụ thuộc vào số lượng nhóm OH mà còn tùy thuộc vào vi trí của chúng trong cấu trúc

Flavonoid là chất chống oxi hoá bằng cách phản ứng với gốc tự do peroxyl của lipid, chặt đứt phản ứng dây chuyền Trong quá trình phản ứng, các gốc tự do của flavonoid còn đồng thời kích hoạt cho chuỗi phản ứng mới bằng cách lấy đi H trong các acid béo không bão hoà

Bên cạnh khả năng hoạt động như là một chất chống oxy hóa, các flavonoid còn được thể hiện như là một chất tăng cường oxi hóa Tác động này là do sự tạo thành các superoxid và hydro peroxid trong quá trình tự oxi hóa và làm giảm hóa trị của ion kim loại (phản ứng dạng Fenton) Ví dụ:

erdim/Quinone

DạngAH

A

LAHA

LH

ALOOHAH

LOO

LOOL

O

+→

+→+

+→

+→+

•

••

••

••

2

2

(AH: chất chống oxi hóa dạng flavonoid; LH: acid linoleic)

Đôi khi, hoạt tính kích hoạt các gốc tự do của flavonoid lại vượt trội Với nồng độ thấp (dưới 1-2x10-6 mol/dm3) thì tính chất thúc đẩy oxi hóa thể hiện tốt nhất Nồng độ cao hơn thì ngược lại, sự ức chế nổi bật Đối với metyl linoleat trong một số dung môi, hằng số tốc độ của phản ứng đứt mạch dây chuyền của quá trình tự oxi hóa đã được xác định rõ ràng

1.2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA [3] 1.2.7.1 Phương pháp dùng gốc tự do DPPH• (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

Khả năng quét gốc tự do DPPH• được xác định bằng sự giảm độ hấp thu A ở bước sóng 515nm do gốc tự do DPPH• bị khử bởi chất kháng oxy hóa (AH) hay do DPPH• kết hợp với các gốc tự do khác (R’):

DPPH• + AH → DPPH –H + A•

DPPH• + R• → DPPH –R

NON

2

22

NO

NON

2

22

1.2.7.2 Phương pháp dùng cation gốc ABTS•+

Cation gốc tự do ABTS•+ được tạo thành khi cho ABTS phản ứng với kalipersulphat trong tối, để qua đêm Cation gốc này mang màu và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 734nm Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng độ giảm độ hấp thu A của cation gốc tự do, và đánh giá thông qua giá trị TEAC (khả năng kháng oxy hóa tương đương với chất chuẩn Trolox)

NS

NN

SN

HO S3

C H

SO H3

2525C H

1.2.7.3 Phương pháp xác định kháng oxy hóa tiền in vivo-MDA

Khả năng ức chế peroxy hóa lipit của mẫu được đánh giá thông qua việc xác định hàm lượng malonyl aldehyd (MDA) là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với axit thibarbituric cho phức màu hồng có độ hấp thu cực đại ở 532nm

Hoạt tính kháng oxy hóa đánh giá bằng:

% chất béo bị oxy hóa = (A532 mẫu trắng – A532 mẫu thử) / A532 mẫu trắnghoặc % ức chế sự oxy hóa = 100 - % chất béo bị oxy hóa

NNS

OHOH

OHClH O

OHOH

CHCH

CHN

NOH

OHSH

1.2.8 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT FLAVONOID [5] Qui trình chiết xuất hợp chất flavonoid được thể hiện khái quát qua các bước sau:

Sơ đồ 1.1: Qui trình chiết xuất flavonoid

Bột dược liệu

Dược liệu đã loại béo

- Loại béo

- Chiết với dung môi thích hợp

- Loại tạp cơ học, clorophyl, chất nhày, nhựa,…

- Cô giảm áp đến cắn

- Cô lập và tinh chế bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản dày, kết tinh lại,… Dịch chiết

Dịch chứa flavonoid

Flavonoid thô

Sản phẩm flavonoid

1.2.8.1 Loại béo:

Hợp chất flavonoid có hầu hết ở các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, hoa, hạt, sáp,…) do đó tùy theo bộ phận sử dụng mà quyết định có cần loại béo hay không Nhưng nói chung, muốn có một hỗn hợp tinh khiết thì thường phải tiến hành loại mỡ Dung môi thường dùng là các dung môi kém phân cực (ete dầu hỏa, diclometan,…)

1.2.8.2 Chiết xuất:

Việc lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của từng flavonoid khác nhau, tùy thuộc vào nguyên liệu và các tạp chất đi kèm

Các glycosid, flavon, flavonol có nhiều nhóm OH, biflavon, auron, chalcon đều là những chất phân cực mạnh nên có thể sử dụng nước, cồn, metanol để chiết

Đối với các aglycon thì isoflavon, flavonon, dihydroflavonol, flavon và flavonol có nhiều nhóm metoxy thường là những chất phân cực yếu nên có thể chiết bằng dung môi kém phân cực như ete dầu hỏa, benzen, cloroform,…

Các polyglycosid, anthocyanidin được chiết bằng nước nóng Các flavonoid có nhiều nhóm OH phenolic có thể chiết bằng dung dịch kiềm loãng

Chiết anthocyan bằng dung môi được acid hóa nhẹ (HCl 0,4%) vì các hợp chất này không bền trong môi trường trung tính hoặc kiềm

1.2.8.3 Loại tạp dịch chiết:

Có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau tùy thuộc vào bản chất của flavonoid và tạp chất chứa trong dịch chiết

Cô dịch chiết đến cắn, sau đó hoà với nước nóng, lọc sẽ loại được tạp cơ học, clorophyl Để dịch chiết ở nhiệt độ 3-4oC qua đêm sau đó lọc sẽ loại được chất nhày, nhựa Điền chỉnh pH thích hợp để thu được flavonid thô

Cũng có thể lắc dịch lọc với dung môi thích hợp, flavonoid sẽ hòa tan trong dung môi, tạp chất ở lại trong dịch nứơc Hoặc sử dụng các chất hấp phụ (silicagel, polyamid,…) để lọc dịch chiết

1.2.8.4 Tinh chế:

Dịch lọc sau khi loại tạp sẽ được cô giảm áp đến cắn, kết tinh lại trong các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp, hoặc tinh chế qua sắc ký cột, sắc ký bản dày Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, polyamid, sephadex, cellulose, nhôm oxit,…Ngoài ra, người ta cũng có thể sử dụng các phương pháp khác để tinh chế

MỤC ĐÍCH NGIÊN CỨU: - Xác định thành phần hóa học trong cây Diếp cá - Khảo sát phương pháp và điều kiện trích ly các thành phần hóa học với

các dung môi có độ phân cực khác nhau (điều chế các cao) - Xác định hàm lượng flavonoid tổng và tanin tổng trong cây Diếp cá - Cô lập, tinh chế và nhận danh một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa và

cao etyl acetat - Khảo sát tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của các loại cao thu được

Sơ đồ 2.1:Sơ đồ thực nghiệm tổng quát

-Sắc ký cột nhanh, cột chậm - Sắc ký bản dày

- Kết tinh trong dung môi

-Xác định độ ẩm, độ tro - Hàm lượng các ion vô cơ trong tro - Xác định sơ bộ thành phần hóa học

Xác định hàm lượng của một số hợp chất

tiêu biểu -- Tanin tổng Flavonoid tổng

Khảo sát phương pháp và điều kiện trích ly các thành phần hóa học (điều chế các cao)

-Trích nguội - Trích bằng Soxhlet

Khảo sát tính kháng oxyhóa và kháng khuẩn

Cô lập, tinh chế một số hợp chất từ các cao

Nhận danh các hợp chất -- Phổ IR,LC-MS,GC-MS,NMR Nhiệt độ nóng chảy Xử lý và đánh giá

Nguyên liệu