Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Định danh nấm rễ nội cộng sinh vesicular arbuscular mycorrhiza trên măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cơ chất đến sinh khối nấm rễ nội cộng sinh

TÓM TẮTĐề tài “Định danh nắm rễ nội cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza trên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cơ chất đếnsinh khối nam rễ cộng sinh”?. M

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

3k 2s 2s os 2 sk sk

KHOA LUAN TOT NGHIEP

DINH DANH NAM RE NOI CONG SINH VESICULAR ARBUSCULAR MYCORRHIZA TREN MANG CUT BANG

KY THUAT SINH HQC PHAN TU VA ANH HUONG CUA

CO CHAT DEN SINH KHOI NAM RE NOI CONG SINH

SINH VIEN THUC HIEN : NGUYEN TIEN DUNGNGANH : NONG HOC

KHOA : 2020 — 2024

ĐỊNH DANH NAM RE NỘI CỘNG SINH VESICULAR ARBUSCULAR MYCORRHIZA TREN MĂNG CUT BẰNG

KỸ THUẬT SINH HỌC PHAN TỬ VÀ ANH HUONG CUA

CO CHAT DEN SINH KHOI NAM RE NỘI CỘNG SINH

Tac gia

NGUYEN TIEN DUNG

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Hướng dẫn khoa học

ThS THÁI NGUYEN DIEM HƯƠNG

ThS NGUYEN CAO KIỆT

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 5/2024

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã sinh thành và nuôi

dạy con nên người.

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu và các quý thầy cô trường đại họcNông Lâm thành phó Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nông học và quý thầy cô trongkhoa đã tận tình giúp đỡ và dạy dỗ em trong suốt quá trình học tập tại trường

Đặc biệt em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Cô Thái Nguyễn Diễm Hương và Thầy Nguyễn Cao Kiệt đã trực tiếp hướng dẫn,tận tình, động viên quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em thực hiện và hoànthành khóa luận tốt nghiệp

Bộ môn Sinh Lý —Sinh Hóa thực vật, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Bộ môn Khoa

học Đất- Phân bón đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng máy móc thiết bị để em

thực hành phân tích các chỉ tiêu trong suốt qua trình thí nghiệm

TS Nguyễn Châu Niên tạo điều kiện thuận lợi cho phép mượn nhà lưới dé thực

hiện nội dung nhân sinh khối nam rễ nội cộng sinh

TS Trần Thị Ngọc Bích đã tận tình hướng dẫn các kỹ thuật ly trích DNA, PCR

và điện di trong thời gian vừa qua.

TS Bùi Minh Tri đã tận tình chỉ dạy, bổ sung thêm kiến thức về sinh học phân tử.Anh Nguyễn Vị Quốc công ty Syngenta đã cung cấp hạt giống bắp cho việc nhân

giống nắm rễ nội cộng sinh

Bên cạnh đó, mình xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các bạn Nguyễn Thị Kiều

Loan, Đặng Đăng Khoa, Nguyễn Đức Phương Nam, Phạm Hoàng Nam, Trần AnhDũng, Sử Minh Hiển, Phạm Vạn Hưng, Nguyễn Thị Ngọc Thuan đã hỗ trợ và giúp đỡmình trong quá trình thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chi Minh, tháng 5 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tiến Dũng

TÓM TẮT

Đề tài “Định danh nắm rễ nội cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza

trên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cơ chất đếnsinh khối nam rễ cộng sinh”? được thực hiện từ tháng 8/2023 đến tháng 4/2024 Mục

tiêu nghiên cứu của đề tai là định danh được loài nam rễ nội cộng sinh có trong vùng rễ

cây măng cụt tại huyện Dầu Tiếng, tỉnh Bình Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử,đồng thời tìm ra cơ chất thích hợp đề nhân sinh khối nắm VAM với cây ký chủ là bắp

và xác định mối tương quan giữa các chỉ tiêu liên quan đến VAM và lý hóa tính trong

cơ chất

Tiến hành ly trích hơn 200 bào tử VAM đơn loài hiện diện phổ biến trong đấttrồng măng cụt tai huyện Dầu Tiếng, tỉnh Bình Dương thông qua các đặc điểm hình thái

và khuếch đại bằng cặp mỗi NS1/NS4 cho phan ứng PCR lần 1, sản phẩm đạt yêu cầu

sẽ được khuếch đại lần 2 bằng cặp mỗi AML1/AML2 Kết quả đã định danh được loàiAcaulospora mellea là loài nam cộng sinh hiện diện chủ yếu trong đất vùng rễ cây măngcụt với độ bao phủ 100% và độ tương đồng từ 99,72% — 99,86% so với các trình tự cótrên GenBank.

Thí nghiệm nhân sinh khối được thực hiện trong nhà màng, bồ tri trong chậu theokiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại cơ chất phối trộn:

NT1: 1 cát; NT2: 2 cát: 1 phân bò; NT3: 1 cát: 1 phân bò; NT4: 1 cát:1 phân bò:l xơ

dừa Kết quả cho thấy sau 1 chu kì nuôi cấy trên bắp (90 ngày sau chủng), nghiệm thức

1 cát: 1 phân bò cho mật độ bao tử/100g cao nhất (107,3 bào tử), tỉ lệ xâm nhiễm 93,7%,khả năng tăng sinh 65,7 lần Kết quả cũng cho thấy có sự tương quan chặt giữa tỉ lệ xâmnhiễm, mật độ bào tử trong 100 g giá thé với EC, chất hữu cơ, đạm dễ tiêu, , tương quantrung bình giữa tỉ lệ xâm nhiễm, mật độ bao tử trong 100 g giá thé với pH, lân dễ tiêucủa giá thể và không tương quan giữa tỉ lệ xâm nhiễm, mật độ bao tử trong 100 g giá thévới độ xốp, độ thoáng khí, khả năng giữ nước, hàm lượng đạm và lân tổng số trong giáthé

MỤC LỤC

Trang

WG: CU brsesnbnssttirssiEDSSAE23800000888BSSSBGHSEABSBESGSGBBENGSGEBSSEIDEESGEGMHEHSGISEIDGSSHEGRAISBSUEIEBHEESHGE.H.8E33ud0ES0 1

TC CAIN oo ae sot nia a Sie neo sua Sa Su2Enjl2iesbsjazBySEsassossbcseioclesas3»lbezb<esgoe3bsoeSosSssbsausEsiSbla-So, 1"

Mle Gsásssisssceedn toi ta G5t eee enema eee rae ea ree 1V

LJarili:s46h:6Ä67 Dai ĐisseseseeeeinssoenidrreokdnaxitianlrdarinesdiditrirdtiiltrtL.rsglemddlrponEqiorosidu/1i10g.00g0' u4inrame Vill

IDäfẩih/SGH›GáG:,HÌHNH, « se 4626216 ccissnii ai uniidek bnesuisna tet chnwaaa andonsanuidnadtanrdiariauiastnadaembnannants 1X

9089:1120 2 1

Chương TÔNG QUAN TAT ces teeranssseenscmnconerercrennnnnonerranecnsennarnananarsnins 41.1 Sơ lược về cây măng cụt -2-©2¿22222222222212211211221211221 2112112212121 1c xe 4cee ee oe) | hư chHg28L22gg2g 2 1g gruilectrgogE2.medorloroed 41.1.2 Đặc điểm thực vật học 2 2+2 2s+2+E£2E9E12E25221211212122121112112111211 2211 Xe 4

1.2 Tổng quan về nam rễ nội cộng sinh (VAM) 2:©22¿©22222+222z2222z22zzzzzsrscez 6

1.2.1 Khái niệm về nam rễ nội cộng sinh (VAM) - -55-55-2cccccccrrrrrrrrrcee 61.2.2 Phân loại về nam rễ nội cộng sinh (VAM) -2 2¿222222222222222222EczErcrxee 71.2.3 Một số nghiên cứu về VAM cccccccssesssessecsesssessesssesssesssenessseseesessuessessseneeneesees 91.2.4 Một số nghiên cứu về VAM trên măng cụt - -2-©22©2+222++2+++zz+zczzz 101.2.5 Một số nghiên cứu về nhân sinh khối VAM -¿ 2¿52222+2z+2z+zzzzzzzsz2 11

De re ree eer 12

1.2.7 Tổng quan về Nested PCR -2-©2222222E22222EE22E222E2732221271 221221222 re 13

1.2.8 KY thuat diGin 0 14

1.2.9 Cơ sở và nghiên cứu liên quan về việc chọn méi cho phan ứng PCR 14

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - l6

2.1 Thời gian và địa điỂm -¿ 2-©22©2+2222E12212211221211221221121121121121121211 21c yee 162.2 Nội dung nghiên cứu đề tab oo ccc cceceseseeessessessessessesseseseseeseessessesseseesseeeeeeee 162.3 Nội dung 1: Dinh danh nam rễ nội cộng sinh Vescurlar Arbuscular Mycorrhiza

trên cây măng cụt bang kỹ thuật sinh học phân tử -2- ¿22++2sz+2szz2szz 16

DS) NAb CULT SAT CT CUCU si Sẻ ố ốc 16

23,3 PHƯƠnE Phap WENT CUO s sescassanswes seers asvenes cones 061005486 85800149984E58595 906.43515953800333004004338838 LZ

9 Elôn Tân bu TÚ HH cancacaccanseccmcnncencaranrcommrntaccnaneins etna ane snnasinierdnantamnnmoanse T72.3.3.2 Định danh bằng sinh học phân tử - 2-22 222222++2++22+2EE+2E+2Exzzxzzzrzrxs 182.4 Nội dung 2: Nhân sinh khối nam rễ nội cộng sinh trên các loại cơ chất khác nhau202.4.1 Vat li@u nghién nnnn 20 2:4:2.Phương pháp NEDIEH CỨU::sccsssssssssossseiiiesiisisissetitioSiSS0015381011014046644610114397084EE 20

DA Chi H6U[ep Di srscsteosceislebtaini:iNdGSGGHIRLIGSEGIRIBIRSEiSHMSEGGIGEAGinpHiXRESQGiQSqtagB 32

2.4.4 Xử lý số liệu 2-©22222221221221221122122112112112112112112112112112122121 21 re 22

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2: ©2222222E222222E222E22xczxzrree 24

3.1 Nội dung 1: Định danh nắm rễ nội cộng sinh Vescurlar Arbuscular Mycorrhizatrên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử -2-22222222z22++2zz+zzzz+z 243.1.1 Đặc điểm hình thái -©2- s22E22ES2ESEEE7E22E2121712121212121 111 rxe 243.2 Nội dung 2: Nhân sinh khối nắm rễ nội cộng sinh trên các loại cơ chất khác nhau283.2.1 Đặc điểm bào tử sử dung để nhân sinh khối -222552+2+2z2222z22522 283.2.2 Kết quả phân tích giá thê -2-55252222Es2zsrserxrrrrerrrrrrerrrrrerrerrrerre c 303.2.3 Ảnh hưởng của cơ chất đến VAM ©225222E22Eszsszrsrszrereee- 33.2.3.1 Ảnh hưởng của cơ chất đến rễ và tỉ lệ đoạn rễ có sự CONG SỈHisasessssssssszee 313.2.4 Kết quả phân tích tương quan giữa VAM và một số đặc điểm của cơ chat làm

A LỊĐ DIỆP FA sree emer See ere ae oh ae, 36

3.2.4.1 Sự tương quan giữa tỉ lệ xâm nhiễm với EC eeseseeseseseesteeeeees 36

3.2.4.2 Sự tương quan giữa tỉ lệ xâm nhiễm với CHC 2- 2 2 2+2222>zz2+z2 373.2.4.3 Sự tương quan giữa tỉ lệ xâm nhiễm với đạm dễ tiêu 383.2.4.4 Sự tương quan giữa mật độ bào tử/100 g cơ chất với EC của cơ chit 383.2.4.5 Sự tương quan giữa mật độ bào tử với CHC 55-<£++c++scrseeeesxee 393.2.4.6 Sự tương quan giữa mật độ bào tử với đạm dễ tiêu -5 40KẾT TẠI ee Ne, | AlTÀI LIEU THAM KHAO coco ceo ces cesses cossesessesseseteeeessssesseeecsceesenssesseseeseeeseeees 42PHU LUC 0 46

Cong tac vién

Diethylpyrocarbonate Deoxyribonucleic acid Deoxynuclotides

Ethylene Diamine Tetra acetic Acid National Center for Biotechnology Information Ngày sau chủng

Nghiệm thức Nghiệm thức

Phân bò

Polymerase chain reaction Polyvinyl — lactose — glycerol Ribonucleic acid

Sodium dodecyl] sulphate Tris — acetate -EDTA

Tiêu chuẩn Việt Nam

TE Tris - EDTA

VAM Vesicular Arbuscular Mycorrhiza (Nam rễ nội cộng sinh)

XD Xo dừa

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 2.1 Các cặp primer được sử dụng trong khuếch đại DNA nam VAM 17Bang 2.2 Thanh phan hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR -2222- 5522 19Bang 2.3 Chu trình nhiệt cho phan ứng PCRevecccccavssearsessnssneravseesmeresvernevacsensvensnes 20Bảng 3.1 So sánh kết quả với các mẫu tương đồng -2¿z©2+2cxzzcr+z 37

Bảng 3.2 So sánh số nuclecotide khác biệt của mẫu ACAU thu thập với các trình tựtrrợneđỦng cũ sẵn trên Ghent Battle susseesstisgdoGiESu0.d05G20250401600-01083080G1G1030540300338.44010.2 0 28

Bảng 3.3 Kết quả phân tích lý, hóa tính của cơ chất trong thí nghiệm 30Bảng 3.4 Ảnh hưởng của cơ chất đến tỉ lệ xâm nhiễm, kiểu xâm nhiễm của VAMtrong rễ bắp giai đoạn thu hoạch -2¿©2¿52¿2222E+2E+2E2E+2EZEZEzEzEzxzxrze, 32

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nam VAM đến sinh khối cây ky chủ - 34

Bang 3.6 Kích thước bao tử trước và sau thí nghiệm - +52 =5s5<<++ 35Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cơ chất đến mật độ bào tử (bào tử/100 g) và khả năng tăngsinh bao ti 11777 35Bang 3.8 Hệ số tương quan giữa VAM và chi tiêu hóa tinh của co chat 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 A: Cấu trúc dạng túi (Vesicle), B: Cấu trúc dang sợi (Hypha), C: Cấu trúc dangsợi (Hypha) của nắm rễ bên trong rễ cây trồng8

Hình 1.2 cây pha hệ nam rễ nội cộng sinh VAM -©2¿©225222222E22E+zEczxczxrze 8

Hình 2.1 Sơ đồ bồ trí thí mghigm oo ecce cece ceceecseeessesssesseessesseeessessueesieesseesteeneees 21

Hinh 3.1 Hinh thai Acaulospora sp dugc tim thay trong mau dat trai ving ré mang cut

trí huyện Tà Tiếng tình i BT gr seseesdesgee cu he khanggg.S00500016001025G0010 0800305102314 gi3Ó 24

Hình 3.2 Kết quả điện mẫu DNA khuếch đại lần 1 -22©22525522552<: 25Hình 3.3 Kết quả điện di mau DNA khuếch đại lần 2 2 222252222z2222£- 26Hình 3.4 Hình thái Bào tử Acaulospora spp được sử dụng dé đem nhân nuôi 28Hình 3.5 Ảnh hưởng của cơ chất đến tỉ lệ xâm nhiễm theo thời gian 31Hình 3.6 Các dạng xâm nhiễm của VAM ở rễ bắp giai đoạn thu hoạch 33Hình 3.7 Đường hồi quy giữa tỉ lệ xâm nhiễm của nấm VAM (%) và EC (mS/cm) trong

Hình 3.8 Đường hồi quy giữa ti lệ xâm nhiễm của nam VAM (%) va CHC (%) trong cơ

en 37Hình 3.9 Đường hoi quy giữa ti lệ xâm nhiễm của nam VAM (%) va Dam dễ tiêu(mg/100g) trong CO Chat 88 38Hình 3.10 Đường hồi quy giữa mật độ bao tử trên 100g cơ chất va EC (mS/cm) trong10.12 39Hình 3.11 Đường hồi quy giữa mật độ bào tử trên 100g cơ và CHC (%) trong cơ chất

Hình 3.12 Đường hồi quy giữa mật độ bào tử trên 100g cơ và đạm dé tiêu (mg/100g)hon CO CHA 0P 4 40

GIƠI THIEU

Đặt vấn đề

Mang cụt là một loại trái cây nhiệt đới được giới tiêu thụ Âu Mỹ đánh gia là mộttrong những trái cây ngon nhất, được đánh giá là “Hoàng hậu của các loại trái cây”?(Queen of fruits) Mang cut là một loại trái cây quý, có phẩm chất rất ngon vi vi ngọt,mát thơm đặc trưng, được ưa chuộng nên có giá trị thương phâm cao và là một trongnhững loại trái cây có tiềm năng xuất khâu ở nước ta Do vậy việc canh tác cây măng

cụt rất được chú trọng Dé cây măng cut phát triển tốt cần rất nhiều yếu tố quan trọng,

một trong số đó không thé thiếu đi chính là sự hiện diện của các loại nam cộng sinh và

đặc biệt là nam rê nội cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza.

Nam rễ nội cộng sinh (VAM- Vesicular Arbuscular Mycorrhiza) là một nhómnắm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao, đóng vai trò quantrọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái VAM được xem lànhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng Mặc dù là nội cộng sinh bắtbuộc nhưng giữa nam và thực vật được được coi là mối quan hệ “Hội sinh”, mang lại

lợi ích cho cả vật chủ và nắm Trước hết, nắm được nhận các sản phẩm quang hợp từ

thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới hệsợi nam trong vùng bau rễ dé tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và cung

cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng

thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh đưỡng như phốt pho, lưu huỳnh,nito và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nam tạo ra ngoài vùng rễ Ngoài ra sự cộngsinh của nam còn giúp cây trồng có khả năng chống chịu được sự khô han, đề kháng vớimột số tác nhân gây bệnh (Morton va Benny, 1990) Hiện nay với xu hướng phat triểnnông nghiệp bền vững, ứng phó với biến đổi khi hậu, việc thay thé các loại phân bónhóa học, thuốc trừ sâu hóa học bằng những chế phẩm vi sinh, phân bón thân thiện vớimỗi trường dang rat được quan tâm, bên cạnh đó hình thức nhân sinh khối nam rễ nội

Việc định danh VAM trên cây măng cụt đang ngày càng được phô biến với một

số nghiên cứu nhưng đa số chỉ định danh bằng hình thái Mặc dù phương pháp này rấtphô biến nhưng vẫn còn hạn chế nhất định vì bào tử nắm cộng sinh có kiểu hình khá đadạng nên dễ gây nhằm lẫn trong việc định danh bằng phương pháp này Trong khi đốivới phương pháp định danh bằng sinh học phân tử sẽ có thé khắc phục được nhược điểm

này và cho kết quả chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp định danh chính xác

các loài, đặc biệt là các loài gần, loài đồng hình, có ý nghĩa lớn trong phân loại học hiệnnay (Hồ Viết Hiếu và ctv, 2018)

Ti những van dé trên, dé tài “Định danh nắm rễ nội cộng sinh VesicularArbuscular Mycorrhiza trên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử va ảnh

hướng của cơ chất đến sinh khối nắm rễ cộng sinh? đã được thực hiện

Tiến hành ly trích DNA loài nam hiện diện phổ biến trong đất trồng măng cut tại

huyện Dầu Tiếng, tỉnh Bình Dương, khuếch đại mẫu bằng phương pháp Nested PCR,

sử dụng 2 cặp mồi khác nhau và kiểm tra lại bằng phương pháp điện di, dam bảo sản

phẩm PCR đạt chất lượng tốt, thích hợp cho giải trình tự

Bồ trí thí nghiệm chính quy trong chậu, theo dõi chỉ tiêu đúng phương pháp, xácđịnh ảnh hưởng của các cơ chất khác nhau đến tỉ lệ đoạn rễ có VAM cộng sinh, mật độ

bao tử và khả năng tăng sinh bao tử, sinh khối rễ của cây ký chủ

Giới hạn đề tài

Đề tai được thực hiện từ thang 08 năm 2023 đến tháng 05 năm 2024, các thínghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm và nhà màng Trại thực nghiệm của khoa

Nông học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với một loài và 1 chinắm rễ nội cộng sinh hiện diện phổ biến trong đất trồng măng cụt tại huyện Dầu Tiếng,tỉnh Bình Dương.

Do kinh phí có hạn nên chỉ giải trình trình tự gen của 1 loài hiện diện phổ biếntrong đất trồng măng cụt tại Dầu Tiếng, Bình Dương

Số lượng bào tử phân lập có hạn nên chỉ sử dụng 5 chậu/ô thí nghiệm sau đó tiến

hành chủng 15 bào tử/chậu.

Thời gian làm đề tài ngắn nên chỉ đánh giá sinh khối trên 1 chu kỳ và trên 4 loại

cơ chất khác nhau

Loài: Gracinia mangostana Linn

Cây măng cut là một loài cây nhiệt đới có nguồn gốc từ Malaysia và những daothuộc vùng xích đạo gần Indonesia, có lịch sử hàng chục thế kỷ Xuất hiện ở Thái Lannăm 1880, trồng tại Anh trong các nhà kính từ năm 1885, sau đó được đưa đến vùngWest Indies (bờ biển Trung Mỹ dưới Florida ) từ giữa thế kỷ IXX Ở những quốc giakhác nhau, măng cụt có những tên khác nhau như ở Anh là mangosteen, Trung Quốc

gọi là sơn trúc tử, Thái Lan gọi là mangkhut Cây măng cụt có thể được tìm thấy ngoàihoang dã (Richard, 1990) Tuy nhiên chỉ có một báo cáo duy nhất công bó về sự tồn tại

của măng cụt hoang dã của Corner vào năm 1990 Theo Whitmore (1973) cây măng cụtđược tìm thấy hoang dã là không chính xác Nhiều tác giả cho rằng nguồn gốc là từ Mã

Lai, Nam Dương, Malaca, Moluku, Đông Nam Á, Án Độ, Myanma, Sri Lanka,

Philipines Từ các nơi này nhờ các nhà truyền giáo Gia Tô di thực vào Miền Nam ViệtNam, sau đó được trồng nhiều ở Tây Ninh, Gia Định, Thủ Dầu Một (Nguyễn Văn Kế,2001).

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Thân: Thân cây dạng trung bình, thắng đứng, cây trưởng thành cao từ 10 — 25

m, đường kinh thân từ 25 — 35 cm (cây măng cụt ở vùng ĐBSCL thường cao từ 6 — 8m

và cho tán rộng 6 — 10 m sau 30 năm trồng) Cây măng cut phát triển chậm bởi vì hệ

thống rễ đa phần nằm ở lớp đất mặt; khả năng hấp thu nước, chất khoáng và ánh sángthấp Cây măng cụt trồng từ hạt cho qua sau 10 — 15 năm sau khi trồng (Pawan, 2015).

Lá: Lá măng cụt là là đơn và mọc đối xứng nhau Lá có hình bầu dục, hơi đài vàdày, cuống ngắn, phiến lá nguyên, thuôn dài, có gân giữa nổi rõ Lá màu xanh sam và

bóng ở mặt trên, xanh vàng và mốc ở mặt dưới Mỗi năm cây ra từ 2 — 3 đợt lá Lá dài

từ 12 — 25 cm, rộng 7 — 13 cm Nước trích từ lá măng cụt có tac dụng cải thiện hệ thốngtiêu hóa và cân bang sự trao đổi chat trong cơ thé (Drasal, 2014)

Hoa: Hoa măng cụt là hoa đực hoặc hoa lưỡng tính, thường mọc đơn độc hoặctừng cặp ở ngọn của những cành từ 2 năm tuổi trở lên Hoa cứng, có cuống đài 1,5 — 2

cm, đường kính hoa từ 4 — 6 cm, có 4 đài hoa mau mau xanh vàng bọc bên ngoài Bốncánh hoa mau vàng xanh có viền đỏ hoặc toàn bộ cánh hoa đều đỏ, kích thước 2,5 x 3,0

cm Nhị đực mang 1 — 3 bao phan, hoàn toàn bắt thụ, hạt sau khi thụ phan chi phát triển

bởi tế bào trứng (hiện tượng trinh sinh) cây con mọc tự hạt mang đặc tính của cây mẹmang ý nghĩa rat lớn trong việc nhân giống Bầu noãn không có cuống, có 4 — 8 buồng.Num nhụy không có vòi nhụy mang nhiều thủy (4 — 8 thủy) tùy số buồng Ở miền Nam,hoa măng cụt thường nở từ thang | — 3 dương lịch và cho quả chín vào tháng 5 — 8dương lịch Hoa măng cụt rất nhanh tàn, nếu hoa nở vào buổi chiều tối thì hoa sẽ nhanhchóng rụng không lâu sau đó (Drasal, 2014).

Quả: Quả măng cụt là quả nang còn mang đài hoa ở cuống và núm nhụy ở chópquả Vỏ quả khi còn non có màu xanh dot chuối, khi chín vỏ đỏ dần, rồi chuyển sang đỏhồng hoặc tim sam Quả măng cụt có dạng hình cầu, đáy phẳng, nặng 75 — 100 gram

Vỏ qua láng, độ dày vỏ quả từ 0,8 — 1,0 cm, màu tim hay tim nau ở mặt ngoài và tim ở

trong Trong vỏ chứa nhiều nhựa màu vàng tiết ra khi quả bị thương

Phần thịt quả chứa 5 — 7 múi màu trang duc Mỗi quả thường chứa 1 — 3 hạt phát

triển, các hạt còn lại là hạt lép Các hạt lớn màu tím sậm, được bao bọc bởi một lớp áomỏng Hạt hình thành từ một lớp tế bao mới chứ không phải do thụ phan như các câytrồng khác nên trong hạt không có lá mầm và thời gian sống của hạt cũng ngắn nếukhông được bảo quản ở điều kiện thích hợp Hạt dùng để nhân giống trong lai giốngmang cụt.

1.2 Tong quan về nắm rễ nội cộng sinh (VAM)

1.2.1 Khái niệm về nắm rễ nội cộng sinh (VAM)

Mycorrhiza là thé cộng sinh giữa hệ sợi nằm trong đất với rễ của thực vật bậc cao

Frank là người đầu tiên phát hiện ra đặc điểm kết hợp đặc biệt này ở rễ của câyCupuliferene vào năm 1885 và gọi đó là mycorrhiza Từ “mycorrhiza" có nghĩa là “nam

- rễ” tác giả đã dung từ này dé nhấn mạnh mối quan hệ giữa nam và rễ cây (Roger và

ctv, 2004) Nam tế nội cộng sinh VAM được xác định là mối quan hệ không thé thiếu

ở hầu hết các loài thực vật (hơn 90% các loài thực vật có khả năng hình thành cộng sinh

VAM) Sự kết hợp đó mang lại lợi ích cho cả thực vật và vi sinh vật qua đó, nắm có

được các hợp chất đồng hóa từ thực vật để sống, đồng thời nam lại giúp rễ cây tăngcường khả năng hấp thụ nước các chất hữu cơ hòa tan trong đất đặc biệt là phospho,chống chịu các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng Do đó, có tác dụng

cải tao và ôn định câu trúc dat, cân bang hệ sinh thái.

Quan hệ cộng sinh này đặc biệt thé hiện vai trò trên những vùng đất khô can, hệsinh thái bị xáo trộn nghiêm trọng, nghèo dinh dưỡng hay có tiềm năng độc hại cao Vìvậy, công nghệ AM có khả năng áp dụng rộng cho nhiều loài cây lâm nghiệp, không chỉgiúp tạo ra được nguyên liệu cây trong rừng có chất lượng cao, khả năng thích nghi vànăng suất tốt trên những vùng đất cằn cỗi mà còn đáp ứng tốt nhất cho nhu cầu sử dụng

hiệu quả nguồn tài nguyên đất đai theo mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng rừng nhưng

không cạnh tranh với đất trồng cây nông nghiệp, tăng cường hiệu quả sử dụng các vùng

đất hoang hóa theo cách bền vững và thân thiện với môi trường (Nguyễn Thị Giang,

2012) Mycorrhiza có phân bố ở hầu khắp các nơi, ở cây cỏ, rêu, đương xỉ, một số cây

lá kim và hầu hết các cây lá rộng Sự phổ biến cùng với những vai trò tích cực của nắm

rễ đã kích thích việc nghiên cứu về mycorhiza ngày càng mở rộng và sâu sắc hơn Trong

khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu cơ bản được thực hiện bởi hàng trăm các

nhà nghiên cứu từ các nước khác nhau trên thế giới đã đem lại nhiều kết qua hết sức ý

nghĩa cho ứng dụng mycorrhiza trong hệ sinh thái nông nghiệp, lâm nghiệp và môi trường.

Soi nam của chúng xâm nhập vảo bên trong vỏ ré của thực vat bậc cao va không gây nên những biên đôi hình thái bên ngoài của rê, thường có một phân của sợi nam còn

nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp vỏ bao ngoài rễ Cấu trúc điển hình củaendomyeorhiza là sự hình thành những cau trúc đặc biệt vesicules và arbuscules Ở một

số nhóm endomycorrhiza người ta quan sát thấy có vesicules (Vesicular mycorrhiza,VM) hoặc arbuscules (Arbuscular mycorrhiza, AM) hoặc đồng thời cả hai cau trúc nàytrong tế bào và rễ (Vesicular arbuscular mycorrhiza, VAM) Vậy VAM là thể cộng sinh

giữa nắm với rễ cây ở thực vật bậc cao mà hình thành nên cấu trúc đặc biệt vesicules,arbuscules trong tế bào vỏ rễ và không gây biến đổi hình thái ngoài của rễ Do tính phổ

biển, có lợi và không có hữu cho 1 loài nên nhóm vesicules arbuscular mycorrhiza ratđược quan tâm nghiên cứu dé ứng dụng trong nông nghiệp cũng như trong lâm nghiệp

1.2.2 Phân loại về nam rễ nội cộng sinh (VAM)

Việc phân loại nắm VAM được tiến hành từ rất sớm kê từ khi nam VAM đượcnghiên cứu đến nay Gedermann và Trappe (1974) đã phân loại AM thành 44 loàithuộc

7 chỉ nắm của họ Endogonaceae Năm 1990, Morton và Benny đã phân loại Gomerales

thành 3 họ là Glomeraceae Acaulosporaceae va Gigasporaceae Trong đó, họ

Glomeraceae gồm 2 chi nam là Glomus và Sclerocystic; Acaulosporaceae gồm 2 chi

nam là Acaulospora va Entrophospora; cuỗi cùng là 2 chi nam Gigaspora vaScutellospora thuộc họ Gigasporaceae Trong một thời gian dai VAM được xếp vàongành phụ nam tiếp hợp (Zygomycota) do cấu trúc sợi nam không có vách ngăn, lớpnâm tiếp hợp (Zygomycetes) Trong quá trình khảo sát nhận thấy trong các mẫu rễ cây

trồng có sự xâm nhiễm của ba dạng cấu trúc: cấu trúc dạng sợi nam, dang tui va dangbụi Hiện nay, bang những nghiên cứu mức độ phân tử hệ thống phát sinh loài đã cho

thấy Zygomycota là ngành đa hệ (poli-phyletic), do đó nằm VAM được tách ra khỏingành Zygomycota hình thành lên ngành mới là Glomeromycota Phân loại đến cấp họcho VAM được dựa trên 4 tiêu chí cơ bản:

- Cau trúc mycorrhiza cộng sinh trong rễ

- Phương thức hình thành bào tử khi được phân lập trong đất

- Cấu trúc nội bảo tử

- Phương thức nảy mầm bảo tử

Nguồn: Tao Wu, 2009Hình 1.1 A: Cấu trúc dạng túi (Vesicle), B: Cấu trúc dạng sợi (Hypha), C: Cấu trúcdạng sợi (Hypha) của nắm rễ bên trong rễ cây trồng

1.2.3 Một số nghiên cứu về VAM

Năm 2012 Trần Thị Như Hằng và ctv đã nghiên cứu đa dạng VAM trên lúa và

cà chua, các tác giả đã phát hiện ra 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acsulospora,

Gigaspora, và Entrophospora.

Một nghiên cứu khác cho thấy trên rễ cây cam ở Quỳ Hợp, Nghệ An phát hiện

được 6 chi: Glomus, Acsulospora, Gigaspora, Entrophospora, Sclerocystis, Glomites.

Theo khảo sát su xâm nhiễm và hiện diện của bảo tử nam rễ nội cộng sinh(arbuscular mycorrhiza) trong mẫu rễ và vùng đất của cây băp, mè, ớt được trồng ởthành phố Cần Thơ được thực hiện bởi Đỗ Thị Xuân và ctv (2016) Kết quả cho thấy rễ

bắp, mè và ớt có sự xâm nhiễm của nắm rễ, định danh được bốn chi nam là Acaulospora,

Entrophosphora, Glomus, Gigaspora.

Da số các nghiên cứu về nam rễ nội cộng sinh ở Việt Nam đều thực hiện định

danh dựa trên hình thái của bào tử nắm

Các nghiên cứu khác trên thế giới thì sự đa dạng này không phải là trường hợpngoại lệ: Zhang và cs 2003 đã tìm được 47 loài VAM từ đất khô han hay Wang và ctv(2008) đã tìm được 33 loài VAM từ đất ngập mặn, Zhao và ctvp (2003) tìm được 5 chi,

27 loài VAM từ rừng mưa nhiệt đới Xishangbanna.

Các nghiên cứu rất đa dạng chủ yếu là các nghiên cứu chuyên sâu như vai trò của

mycorrhiza đến sự hấp thu dinh dưỡng của cây trồng (Koide, 1991; Smith và ctv, 1994;Harrison và ctv, 2002; Smith va ctv, 2011), ảnh hưởng của các yếu tô pH, nhiệt độ, độ

am (Habte và Soedarjo, 1996; Gavito và ctv, 2005) đến sự phát triển của nắm VAM hayứng dụng mycorrhiza trong kiểm soát sinh học (Hol va Cook, 2005; Akhtar và Siddiqui,2008; Wehner và ctv, 2010; Vos và ctv, 2014).

Bên cạnh đó yếu tổ nhiệt độ va dinh dưỡng cũng ảnh hưởng đến sự tang sinh

của nam rễ nội cộng sinh Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nắm phát triển, hìnhthành sợi và xâm nhiễm vào thực vật Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọngảnh hưởng đến sự hình thành nam rễ AM Một nghiên cứu của Gavito và ctv (2005)

về sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và hoạt động của nắm rễ AM Kếtqua cho thấy nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của sợi nam nội bao,

sợi nam ngoại bào, khả năng tạo bụi và túi trong tế bào mà còn ảnh hưởng đến khanăng vận chuyên chất dinh dưỡng từ nam đến rễ cây Năm 1996, Habte và Soedarjo

dã đánh giá sự ảnh hương của pH bằng việc chúng nắm Glomus aggregatum vào câyAcacia mangium ở các mức pH từ thấp đến cao (4,3 - 6,0) thì tỉ lệ xâm nhiễm củanắm vào cây ký chủ qua các mức độ pH cũng tăng theo Rhoyadi và ctv (2004) cũngthử nghiệm trên 2 loài nam Gigaspora margarita va Glomus etunicatum ở các mức

độ pH tăng dần (4,7 - 5,2) cho thấy tỉ lệ xâm nhiễm vào cây chủ của loài Gi margaritacao nhất ở mức pH = 4,7, còn tỉ lệ xâm nhiễm của G etunicatum cao nhất ở pH= 5.2

Ngoài ra các nghiên cứu của Green và ctv (1976), Siqueira và ctv (1985), chỉ ra rằng

nam Glomus phát triển tốt ở vùng có pH từ trung tính đến cao, còn Gigaspora vàAcaulospora phát triển tốt ở vùng có pH thấp Từ đó có thé kết luận rằng pH là mộtyếu tố quan trọng trong sự phân bố và sự xâm nhiễm vào cây chủ của nam rễ cộngsinh AM.

Hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy các nắm nội rễ cộng sinh phát hiện được

thuộc các chi: Scutellospora, Glomus, Acsulospora, Gigaspora, và Entrophospora Da

SỐ các nghiên cứu ở Việt Nam hiện nay chỉ định danh bằng hình thái bào tử nên độ chính

xác chưa cao vì bào tử có tính đa hình

1.2.4 Một số nghiên cứu về VAM trên măng cụt

Định Thanh Thúy Nga (2022), đã định danh được ba chi bào tử VAM dựa trên

hình thái chiếm ưu thé là chi Glomus, chi Acaulospora và chỉ Diversispora trên đất trồngmăng cụt tại Thuận An, Bình Dương.

Trong 30 mẫu đất thu thập bởi Lê Thanh Quang (2023) ở vùng rễ cây măng cụt

tại Dầu Tiếng, Binh Dương đã phân lập được ba chi bao tử nam rễ và một số chi chưađịnh danh được Ba chi bào tử nấm rễ được định danh bao gồm chi Glomus, chi

Acaulospora và chi Diversispora Trong đó chi Acaulospora chiém wu thé với tỷ lệ từ28,4 — 76,3 %, kế đến là chi Glomus chiếm từ 20,3 — 60,6 % và ít phô biến nhất là chi

Diversispora với mật độ từ 0 đến 21,2 % và phần trăm còn lại là các chi chưa định danhđược Dạng cộng sinh phô biến của nam Vesicular Arbuscular Mycorrhiza trong rễ măng

cụt là dạng sợi, kế đến là dạng túi và dạng bụi, với tỷ lệ xâm nhiễm từ 11,4 - 100%

Một nghiên cứu được thực hiện tại vườn cây ăn quả tại Đại học nông nghiệpKerala để gải quyết tình trạng tăng trưởng chậm của măng cụt, Yusuf và ctv (2014) đãthực hiện thí nghiệm việc kết hợp sử dụng VAM và phân bón đánh giá sự phát triển trêncây măng cụt Kết quả thí nghiệm cho thấy những cây đối chứng có các giá trị tăngtrưởng thấp hơn so với những cây được cây VAM và kết hợp bón phân.

Nghiên cứu về tác động của Martina va ctv (2017) nam Vesicular-Arbuscular

mycorrhizal (VAM) được cấy đồng thời với Bokashi vào măng cụt để nghiên cứu tác

động của VAM kết hợp với Bokashi lên sự phát triển của cây Trong nghiên cứu này,với ba liều lượng VAM (0, 10, 20 g/cây con) và ba liều lượng Bokashi (0,65 và 85 g/câycon) Kết quả cho thấy liều lượng VAM 20 g/cây con không bón Bokashi cho hiệu quả

sinh trưởng của cây tốt nhất Liều lượng VAM 20 g/cây con không có Bokashi có ý

nghĩa đên chiêu cao và trọng lượng khô của cây.

1.2.5 Một số nghiên cứu về nhân sinh khối VAM

Lựa chon cây ký chủ trong việc nhân giống nam VAM môi trường nuôi cấy trongchậu là một quyết định quan trọng Vì là nắm rễ nội cộng sinh nghĩa là sự cộng sinh giữaloài nam và cây ký chủ nên nắm rễ nội cộng sinh chỉ được phát triển, sản sinh bào tử khi

có sự cộng sinh trực tiếp giữa nam rễ nội cộng sinh va cây ký chủ Vì vậy để nhân nuôinắm VAM bắt buộc cần có cây ký chủ

Sự sinh trưởng của nắm phụ thuộc rất nhiều vào các yêu tố môi trường như mức

phốt pho, hàm lượng nước trong đất, độ pH, độ mặn, nhiệt độ, cường độ và chất lượng

ánh sáng Vì vậy việc lựa chọn cơ chất để thực hiện nhân nuôi VAM rất quan trọng vì

mỗi cơ chất, với mỗi tỉ lệ thành phần cơ chất khác nhau với đặc điểm lý, hóa tính khác

nhau sẽ ảnh hưởng đên kết quả việc nhân nuôi nam VAM.

Tính chất quan trọng trong việc lựa chọn cơ chat để phục vụ cho việc nhân sinhkhối đó chính là duy trì được khả năng thoáng khí tốt nếu không đáp ứng được điều kiệnnày thì rễ sẽ phát triển không đồng đều, mặt khác các cơ chất thích hợp nên là các loại

được phối trộn giữa các thành phần khác nhau, dé tăng khả năng thoáng khí thì nên phối

trộn với cát Theo nghiên cứu phân lập nam rễ nội cộng sinh trong đất trồng bắp và sảnxuất chế phẩm vi sinh (Lê Thị Hoàng Yến và ctv, 2018) đã sử dụng môi trường nhân

1:1:0,5 (MT1); 2:1:1 (MT2), 0:1:0 (MT3); 1:2:1 (MT4) và 1:1:1 (MTS) với định lượng

100 g cơ chất Kết quả cho thay môi trường MTS gồm đất cát: đất dinh dưỡng: xo dừa

tỉ lệ 1:1:1 là môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của cây cũng như sự hình thànhVAM Kết quả này tương tự báo cáo trước đó cho thấy khi b6 sung thêm VAM đã làmtăng số lượng lá, tổng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây bắp con Tuy nhiên

phương pháp này chưa thu được số lượng bao tử nam như mong muốn

Thí nghiệm về nhân nuôi và định danh cộng đồng nắm rễ bản địa tại đất trồng

cây ăn quả ở ĐBSCL của Nguyễn Văn Hòa và ctv (2019) Kết quả thí nghiệm cho thấytrên cây ký chủ là bắp với giá thé đất, cát, than bùn với tỉ lệ 1:1:1 là môi trường nhânnuôi tốt nhất so với ký chủ còn lại là cao lương với số lượng bào tử là 371 bào tử/50 g

giá thé với tỉ lệ bào tử xâm nhiễm là 91% trong khi đối với ký chủ là cao lương số bao

tử chỉ đạt 301 bào tử/50 g giá thé với tỉ lệ xâm nhiễm chỉ đạt 71%

1.2.6 Tổng quan về PCR

PCR là kỹ thuật nhân bản DNA và sử dụng các yếu tố cơ bản của quá trình nhânbản DNA tự nhiên Trong một tế bào sống, một quá trình rất phức tạp liên quan đếnnhiều protein khác nhau nhân bản thành bộ gen hoàn chỉnh Nói một cách đơn giản,DNA được mở ra và mỗi sợi của phân tử gốc được sử dụng như một khuôn mẫu để tạo

ra một sợi mới bé sung Sự nhân bản này dựa trên khả năng của nucleotide đối với cặp

bazơ theo các quy tac Watson va Crick nổi tiếng: A luôn cặp với T và G luôn cặp với C

Do đó, chuỗi mẫu chỉ định trình tự cơ sở của chuỗi DNA mới Một số lượng lớn protein

và các phân tử khác, chăng hạn như mỗi RNA, được yêu cầu dé dam bảo rằng quá trìnhsao chép DNA xảy ra hiệu quả với ít sai lầm (độ trung thực cao) và theo cách được quyđịnh chặt chẽ.

PCR chỉ sử dụng các thành phần cơ bản của bộ máy sao chép phức tạp này để saochép các đoạn DNA ngắn trong ông nghiệm Trong một hệ thống đệm đơn giản, một vùng

của phân tử DNA mẫu được sao chép bởi DNA polymerase sử dụng deoxynucleotide làm

khối xây dựng của các sợi mới Các moi oligonucleotide cu thé theo trình tự liên kết với

mẫu theo các quy tắc ghép cơ sở thông thường xác định vùng của mẫu sẽ được sao chép

Các sợi của mẫu được phân tách bằng nhiệt, làm cho các liên kết hydro giữa các cặp bazơ

của các sợi DNA bị phá vỡ, một quá trình được gọi là biến tính

1.2.7 Tổng quan về Nested PCR

Nested PCR là phản ứng chuỗi polymerase lồng nhau được sử dụng trong cáctình huống cần tăng độ nhạy hoặc độ đặc hiệu của PCR, chăng hạn như khi khuếch đạiđại bản sao cDNA của mARN có mặt với số lượng rất thấp trong mẫu vật lâm sàng chứaquan thé các loại tế bào không đồng nhất Nested PCR thường bao gồm hai phan ứng

khuếch đại tuần tự, mỗi phản ứng sử dụng một cặp mỗi khác nhau Sản phẩm của phản

ứng khuếch đại đầu tiên được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai, đượcmôi bởi các oligonucleotide được đặt bên trong cặp mồi đầu tiên Việc sử dụng hai cặp

oligonucleotide cho phép thực hiện số lượng chu kỳ cao hơn, do đó làm tăng độ nhạy

của PCR Độ đặc hiệu được cải thiện của phản ứng bắt nguồn từ sự liên kết của hai bộmồi riêng biệt với cùng một mẫu đích Nested PCR là một phương pháp hiệu qua dé

khuêch đại các đoạn của mâu dài nhưng đòi hỏi kiên thức về trình tự của mục tiêu.

Mặc dù Nested PCR là lựa chọn tốt nhất dé đạt được độ đặc hiệu, nhưng nó vẫn

có một hạn chế lớn đó là rất dễ gây ngoại nhiễm Khi thực hiện quy trình điện di sauphản ứng PCR thứ hai, bạn bắt buộc phải mở nắp ống sản phẩm của phản ứng PCR thứhai dé tiến hành nạp vào gel điện di Thao tác mở nắp này, cũng như các bước hút nha

sản phẩm PCR bằng micropipette sau đó chắc chắn sẽ làm phóng thích ít nhiều sản phẩm

PCR vào không khí, vì sau hai lần thực hiện PCR hàm lượng sản phâm khuếch đại cuốicùng là rất lớn Lượng sản phẩm PCR này sẽ lơ lửng trong không khí suốt nhiều nămliền và rơi vào những ống phản ứng PCR của những lần chạy kế tiếp, và tất nhiên sẽ gây

ra hiện tượng dương tính giả Việc ngoại nhiễm này sẽ làm hỏng thí nghiệm dẫn đến hao

phí thời gian và tiền bạc Hiện nay, sự kết hợp giữa các phương pháp phòng ngừa chủđộng và thao tác phòng thí nghiệm cận thận có thé giúp ngăn ngừa nguy cơ ngoại nhiễm.Một phương pháp phòng ngừa chủ động được đánh giá rất hiệu quả là sử dụng enzymeUNG (Uracil-DNA glycosidase) Nguyên tắc của giải pháp này là dùng các mix PCR cóthêm dUTP và enzyme UNG ngay từ khi sử dụng dé khuếch đại sản phẩm ở phản ứngPCR thứ hai, dé các sản phẩm khuếch đại cuối cùng sẽ được đánh dấu khác biệt vớiDNA đích nhờ nhiều vị trí Thymine trên trình tự chuỗi của sản phẩm khuếch dai bị thay

thế bởi Uracil do enzyme polymerase nhằm lẫn giữa Thymine va Uracil khi thực hiệnkhuếch đại Chính nhờ vậy, mà sản phẩm khuếch đại cuối cùng nêu bị ngoại nhiễm vào

mix mới sẽ không thê tham gia vào phan ứng khuếch đại vì sẽ bi enzyme UNG phá hủytrước khi thực hiện khuếch đại (Green và Sambrook, 2019).

1.2.8 Kỹ thuật điện di

Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử

dụng chủ yếu đề phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được

sử dụng dé phân tách RNA hoặc protein

Phân tử DNA được cau tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn(backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate Theo cấu trúc này, mỗi mộtnucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ thuậnvới khối lượng (mass-to-charge) Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường cóthê khiến DNA di chuyền về phía điện cực dương Mẫu DNA được pha với dung dịchnạp mẫu (loading dye) nhằm giữ mẫu chim trong giếng và cung cấp chỉ thị màu dé nhậnbiết sự điện di Điện di là một kỹ thuật quan trọng dé xác nhận rằng quá trình PCR cóxảy ra không, ngoài ra điện di còn hỗ trợ việc thu hồi đoạn DNA với kích thước mong

muốn.

1.2.9 Cơ sở và nghiên cứu liên quan về việc chọn môi cho phản ứng PCR

Thiết kế mỗi là một quá trình lặp đi lặp lại như trình tự mới thông tin trở nên cósẵn Khi phát sinh loài của một nhóm sinh vật được hiểu rõ hơn, đáng tin cậy hơn moi

có thé được thiết kế Trên cơ sở đó Glomeromycota là don ngành (SchuBler va ctv,2001), chúng tôi cho rằng sẽ có các tính năng dẫn xuất được chia sẻ của các chuỗi VAM

điều đó sẽ phân biệt chúng với các trình tự không phải VAM mà sẽ hiện diện cùng vớiDNA của VAM trong các mẫu thực địa

Bởi vì sự khuếch đại PCR chọn lọc phụ thuộc vào tính đặc hiệu của môi, đã cómột số nỗ lực đề mồi thiết kế dành riêng cho VAM (Simon và ctv, 1992; Helgason vactv 1998) Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn tiết lộ rằng những không thé khuếch dai

trình tự từ một số nhóm VAM có được mô tả gần đây hơn, và đôi khi chúng khuếch đại

DNA của các sinh vật khác (Clapp va ctv, 1995, 1999; Helgason va ctv, 1999) MôiPCR cho các phân nhóm hoặc một số các đơn vị phân loại mục tiêu của VAM tương đối

dễ thiết kế và đã được được sử dụng thành công trong một số nghiên cứu (Sanders ctv

1995; Bago va ctv, 1998; Lanfranco và ctv, 1999; Kjoller & Rosendahl, 2000; Redecker, 2000; Gamper & Leuchtmann, 2007).

Trong một nghiên cứu của Maaten van Geel va ctv (2014) về việc đánh giá các

cặp mỗi được sử dụng trong việc định danh VAM, kết quả cho thấy rằng một trong

những cặp môi được đánh giá là AML1/AML2 vượt trội so với những cặp môi đã đượcđánh giá trước đó về độ đặc hiệu đối với VAM

Nghiên cứu về quản lý nam cộng sinh Arbuscular Mycorrhizal Lê Thị Thủy(2012) cũng chỉ ra rằng các cặp mỗi LSU primer có tính đặc hiệu cao đối với chi phổ

biên của Glomeromycota nhưu Glomus, Acaulospora.

Các cặp mỗi LSURK4f/ LSURK7r, AML1/AML2 và LSU0061/LSU0599 cũng

đã được Trần Trọng Nghia (2022) sử dụng để khuyếch đại DNA nam rễ nội cộng sinh(VAM) Két qua cho thay từ 50 mau đất trong dưa leo và 50 mau rễ, đã xác định được

16 trình tự thuộc nam rễ nội cộng sinh gồm các loài Acaulospora, Gigaspora,

Rhizophagus, Claroideoglomus.

Trong một nghiên cứu của Zita Sasvari và ctv (2012) cũng đã sử dụng cặp mooig

NS1/NS4 cho phan ứng PCR lần 1 và tiếp tục nested bằng cặp mỗi AMLI/AML2 kết

quả cũng thu được đoạn DNA với kích thước ~800 bp.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ thang 8 năm 2023 đến tháng 2năm 2024, tại phòng thí nghiệm của khoa Nông học và nhà màng Trại thực nghiệm khoaNông Học, Trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh

2.2 Nội dung nghiên cứu đề tài

Nội dung 1: Định danh nam rễ nội cộng sinh Vescurlar Arbuscular Mycorrhiza

trên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Nội dung 2: Nhân sinh khối nắm rễ nội cộng sinh trên các loại cơ chất khác nhau

2.3 Nội dung 1: Định danh nam ré nội cộng sinh Vescurlar Arbuscular Mycorrhiza trêncây măng cut bằng kỹ thuật sinh hoc phân tử

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Nắm ré nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza trên cây măng cụt có trong mẫu đấtvùng rễ vườn măng cụt ở Dầu Tiếng, Bình Dương, được cung cấp bởi bộ môn CâyLương Thực - Rau Hoa Quả, khoa Nông Học.

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cu: Dia petri, bông gòn thắm nước, kẹp gấp, giấy, viết, chày nghiền mau,

eppendorf 1,5 ml, eppendorf 0,2 ml, đầu tuýp 10 um -200 um-1000 wm, Micropippet,

ống nghiệm, ống đong, đèn cồn, bình thủy tinh, lam kính, lame, kéo, gang tay,ongphancon, chậu nhựa bố trí thí nghiệm, ray 38 um - 50 um — 100 pm - 1000 um

Thiết bị: Kính hiển vi soi nỗi, kính hiển vi quang hoc Olympus BX40 (Nhật

Bản), máy ảnh, laptop, máy PCR, máy ly tâm, hệ thống chụp gel UVP, tủ ủ nhiệt (hoặc

tủ định ôn), tủ lạnh -20°C, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vi sinh, lò vi sóng, máy điện di,máy vortex, bộ ray sử dung trong sang wot.

Ly trích DNA: sử dụng PLANT DNA EXTRACTION KIT.

Dién di: Agarose 1%, TAE 1X, 6XGelred DNA Loading buffer tricolor, Ladder 100bp.

Bang 2.1: Các cặp primer được sử dung trong khuếch dai DNA nam VAM

Primer Kíchthước Ngu6n tham

Trinh tự nucleotide 5’-3’ v3

dự kiên khảo

AMLI ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA eet

AML2 GAACCCAAACACTTTGGTTTCC : Sasvari

12560-kỹ thuật sinh học phân tử.

Sau khi phân lập bào tử và chọn ra 1 loài phổ biến nhất với 20 bào tử, tiến hànhquan sát các đặc điêm :

- Màu sắc bao tử: quan sát qua kính hién vi (vật kính 10x hoặc 40x) khi nhuộmPVLG và Melzer.

- Kích thước (um): đo qua kính hién vi trên lam kính có chứa 1 giọt PVLG

- Số vách tế bào: dùng lamen ép vỡ bào tử sau khi nhuộm PVLG và Melzer

sau 24 tiếng và quan sát qua kính hiển vi

2.3.3.2 Định danh bằng sinh học phân tử

- Thêm 400 pl PLSI buffer vào tube 1,5 ml chứa mẫu đã nghiền, cho tiếp 10 ul Rnase

A vào votex đều và ủ 6 65°C trong 30 phút

- Cho 130 pl PLS2 buffer vào, trộn đều và ủ ở 2 — 8°C trong phòng 5 phút

- Ly tâm ở tốc độ 13,000 vòng/phút trong 5 phút, hút 300 pl dich nổi chuyên sang tube

1,5 ml mới thêm 450 pl PBB vào trộn đều

- Chuyên hỗn hợp sang cột Silica đặt săn trong tube 2 ml Ly tâm ở tốc độ 13,000vòng/phút trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phan chat lỏng bên dưới

- Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ, thêm 500 pl PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13,000vòng/phút trong 1 phút, giữ lại cột và bỏ phần chat lỏng bên dưới Lap lại bước này 1lần nữa

- Đặt lại cột vào tube cũ, làm khô cột bằng cách ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút

- Chuyên cột sang tube 1,5 ml mới Thêm 50 ul EB buffer và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút,

ly tâm tốc độ 13,000 vòng/ phút trong 1 phút , thu phần dịch chưa DNA bên dưới cóthể sử dụng luôn hoặc bảo quan ở -20°C

Phản ứng PCR

DNA tổng số sau khi tách chiết thực hiện phản ứng PCR Thành phần và chutrình nhiệt phản ứng PCR được thể hiện trong các Bảng 2.2, Bảng 2.3

Bảng 2.2 Thành phần cho phản ứng PCR

Thuốc thử Nồng độ gốc Nồng độ cuối cùng Thể tích (ml)

Master Mix 2X 1X 12.5

Môi xuôi 10uM 0,25uM 0,5

Môi ngược 10uM 0,25uM 0,5

NSI/NS4 (PCR lân 1) AML1/AML2 (PCR lần 2)

Bién tinh ban

Tỉnh sạch

Những sản phâm đúng kích thước dự kiến được tinh sạch trên gel bằng MicoElute

DNA Clean/Extraction kit theo quy trình của nhà sản xuất và gửi đi giải trình tự theo

hai chiều tại công ty Nam Khoa Sau khi có kết quả, các trình tự được xử lý bằng phầnmềm BioEdit 7.0.5.3 và phân tích bằng công cụ online NCBI BLAST để so sánh với cơ

sở dữ liệu GenBank trên NCBI.

2.4 Nội dung 2: Nhân sinh khối nam rễ nội cộng sinh trên các loại cơ chất khác nhau

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu

Hạt giống: giống bắp NK7328 sản xuất bởi Syngenta

Chậu nhựa: Chậu nhựa C8 (18x15em), màu đen có đục 16 dé thoát nước

Đĩa nhựa: đường kính 18 cm

được phơi khô tự nhiên

+ Phan bò: Sử dung phân bò đã ủ hoai.

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu

Chọn chi Acaulospora là chi nam rễ nội cộng sinh hiện diện phô biến trong đất

trồng măng cụt tại Dầu Tiếng, Bình Dương để tiễn hành thí nghiệm

Thí nghiệm đơn yếu tô được bồ trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 NT, 3

LLL, mỗi ô thí nghiệm gồm 5 chậu (Hamlim và ctv., 2022) 4 NT tương ứng với 4 tỷ

lệ cơ chất khác nhau dé nhân sinh khối VAM Dé tránh thất thoát bào tử, các chậu được

lót dĩa nhựa và kê gạch bên dưới.

Cơ chất sử dụng trong thí nghiệm được phối trộn bởi 3 thành phần: cát, xơ dừa,

phân bò theo tỉ lệ thé tích khác nhau

NTI: 1 cát (1C)

NT2: 2 cát:1 phân bò (2C: 1PB)

NT3: 1 cát: 1 phân bò (1C: 1PB)

NT4: 1 cát: 1 phân bò : xơ dừa (1C: IPB: 1XD)Tổng sé chậu sử dụng trong thí nghiệm là 4NT x 3LLL x 5 chậu/ô =60 chậu, thé

tích cơ chất cho vào mỗi chậu là 1,6 dm° Dé đảm bảo sự đồng đều giữa các lần lặp lại,

lượng cơ chất cho vào từng chậu sẽ được ghi nhận trọng lượng tương ứng

NTI NT3 NT4

NT3 NT4 NT3

NT2 NTI NT2

NT2 NT4 NTI

Hình 2.1 Sơ đồ bố tri thí nghiệm

Xử lý hạt giống: Hạt giống thí nghiệm được khử trùng bằng cồn, NaOCI 1% vàrửa lại bằng nước cất, sau đó ủ hạt cho đến khi hạt nhú mầm

Chậu nhựa : lau sạch bằng cồn

Giá thể: khử trùng bang autoclave 121°C trong 30 phút

Bào tử nam thu thập bằng phương pháp sang ướt ly tâm nỗi theo TCVN 1:2018 được cho trực tiếp vào giá thé, sau đó gieo hat đã nhú mầm rồi phủ lớp cơ chấtmỏng Số lượng bào tử sử dụng: 15 bào tử/chậu

12560-Bón phân: (Lượng bón và cách bón được xây dựng theo quy chuân khảo nghiệm

bắp QCVN 01-56:2011.)

Luong bón: 2,1g N + 1,05g P2Os + 1,05g K›O/chậu, tương đương với 4,6g Ure

+ 6,56g lân + 2,1g KCI/chậu, chia làm 3 lần bón, bắt đầu bón lúc 12 ngày sau gieo, bón

3 lần trong suốt qua trình thực hiện thí nghiệm.

Tưới nước: đảm bảo lượng nước được tưới như nhau ở các chậu, trung bìnhkhoảng 200 ml/chau, mỗi ngày 1 lần

2.4.3 Chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu tỉ lệ xâm nhiễm được theo dõi ở giai đoạn 30, 45, 60 ngày sau chủng Các

chỉ tiêu còn lại được theo dõi ở giai đoạn thu hoạch (khoảng 90 ngày sau chủng).

Phương pháp thu thập rễ: Dùng khoan có đường kính 2 em, khoan cách gốc

5cm tại 3 vi trí trong chậu, tach bỏ đất, giữ lại phần rễ non, rửa sạch dưới vòi nước, sau

đó xử lý dé quan sát sự xâm nhiễm sau khi nhuộm trypan blue (TCVN 12560-2:2018)

Tỉ lệ xâm nhiễm (%): (số đoạn rễ xâm có xâm nhiễm / số đoạn rễ quan sát trên 1g rễ)

X 100 Rễ được nhuộm bang trypan blue và quan sát dưới kính hién vi

Ti lệ các dạng cau trúc cộng sinh trong rễ (%) : (số đoạn rễ có dang cấu trúc tươngứng/số đoạn rễ có xâm nhiễm) X 100

Kích thước rễ (cm): đo chiều dài và đường kính rễ

Trọng lượng ré tươi (g/cây): trọng rễ tươi được tính sau khi thu hoạch và làmsạch đất

Trọng lượng rễ khô (g/cây): say khô rễ ở nhiệt độ 70°C đến khi có trọng lượngkhông đổi

Mật độ bào tử/100g: đếm số lượng bào tử có trong 100g cơ chất

Khả năng tăng sinh bào tử (lần) = (mật độ bào tử thu được — mật độ bào tử banđầu)/mật độ bảo tử ban đầu

dé đánh giá sự tương quan giữa VAM và thành phan, đặc điểm lý hóa tính của cơ chat,t-test để so sánh 2 giá trị trung bình, sử dụng phần mềm DSSASTAT để phân tích

ANOVA và trắc nghiệm phân hang LSD ở mức ý nghĩa Œ = 0,01 hoặc Œ = 0,05

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Định danh nấm rễ nội cộng sinh Vescurlar Arbuseular Mycorrhiza

trên cây măng cụt bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.1.1 Đặc điểm hình thái

a, b: quan sát ở độ phóng đại 400 lần; c, e: quan sát dưới kính soi nổi ở độ phóng đại

40 lần, d: quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 100 lần

Hình 3.1 Hình thái Acaulospora sp được tìm thấy trong mau đất trại vùng rễ măng cụt

tại huyện Dầu Tiếng tỉnh Bình Dương

Các bào tử thuộc được thu thập trong mẫu đất vùng rễ măng cụt tại huyện DauTiếng, tinh Binh Duong chủ yếu có hình cầu, gần hình cau, hau hết là các bào tử don,

bề mặt bào tử nhẫn bóng, dé vỡ khi ép bằng lamen, kích thước bào tử dao động trong

khoảng từ 122,5 — 185 um Quan sát trong PVLG cho thay bào tử có màu vàng cam,nâu vàng ở tất cả các lớp, chỉ bắt màu nâu hay nâu đỏ ở lớp trong cùng khi nhuộm vớithuốc nhuộm Melzer Bào tử khi vỡ bào tử có dich bào tử tuôn ra, thành bao tử có 3 lớp.Dựa vào đặc điểm hình thái theo các tiêu chí của INVAM cho thấy bao tử thuộc chiAcaulospora

3.1.2 Dinh danh bang Neted PCR

3.1.2.1 Kết quả điện di san phẩm PCR

Sau khi thu thập hơn 200 bào tử đơn loài có cùng đặc điểm hình thái như đãmiêu tả ở mục 3.1.1, tiến hành ly trích DNA và khuếch đại DNA đã ly trích bằng cặpprimer NS1/NS4 Kết quả điện di mẫu ACAU cho băng sáng, rõ với kích thước ~

1100 bp đúng như dự kiến theo nghiên cứu của Savari và ctv (2012)

———

M: Maker Ikb, P1: Acaulospora sp., P2: Acaulospora spHình 3.2 Kết qua điện mau DNA khuếch dai lần 1

Sau khi có kết quả khuếch dai DNA, tiếp tục sử dụng cặp primer AML1/AML2

dé khuếch đại mẫu PCR lần 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 cũng cho băngsáng, rõ ở kích thước ~ 800 bp đúng với kích thước dự kiến và trùng khớp với nghiêncứu cua Lee và ctv (2008).

Hình 3.3 Kết qua điện di mau DNA khuếch dai lần 2

Sau khi tinh sạch sản pham PCR lần 2 bằng MicoElute DNA Clean/Extractionkit, mẫu DNA được gửi giải trình bằng phương pháp Sanger Sản phẩm được xử lýbằng phần mềm Bioedit, kết quả thu được có kích thước 770 bp, kết quả đoạn DNA

Trình tự được kiểm tra và đối chiếu trên GenBank thông qua công cụ NCBIBLAST, kết quả cho thấy trình tự tương đồng với loài Acaulospora mellea được thuthập ở các quốc gia khác nhau trên thế giới Độ tương đồng dao động từ 99,72% -99,86% so với các trình tự được tìm thấy trên GenBank với độ bao phủ là 100%.

Mau ACAU trong nghiên cứu có độ tương đồng cao với mẫu Acaulosporamellea, được thu thu thập từ Hàn Quốc, theo Eo,J.-K va ctv (2018), với 5 nucleotidesai khác.

Bảng 3.1 So sánh kết quả với các mẫu tương đồng

Loài, chỉ trơng Quoc gia Độ bao Độ tương Tác giả

đồng phủ đồng

Acaulospora Han Quéc 100% 99.86% Eo,J -K., Park,H.

va

Acaulospora Trung 100% 99.72% Long,CL (2024)

mellea (A2) Quốc

Acaulospora Han Quéc 100% 99.72% _ - oe

mellea (A3)

Acaulospora Trung 100% 99.72% cm Bông:

mellea (A4) Quốc

Acaulospora sp Peru 100% 99.58% oa

(A5) Gutierrez,K.,

Polo,MA, Ormeno,E.va Zuniga-Davila, D (2022)

Bảng 3.2 So sánh số nuclecotide khác biệt của mẫu ACAU thu thập với các trình tựtương đồng có sẵn trên GenBank

Tai vị trí khác biệt 132 có thé phân thành hai nhóm, mẫu A3 chứa C (Cytosine)

khác biệt với các mẫu còn lại chứa T (Thymine)

Tại vị trí khác biệt 291 có thể phân làm hai nhóm, mẫu A5 chứa A (Adenine)

khác biệt với các mẫu còn lại chứa G (Guanine)

Tại vị trí khác biệt 319 có thể phân làm hai nhóm, các mẫu A5,A3,A2,A,A1chứa T (Thymine) khác biệt với mẫu C (Cytosine)

Tại vị trí khác biệt 370 có thể phân thành hai nhóm, hai mẫu A5 và A chứa C(Cytosine) khác biệt với các nhóm còn lại chứa T (Thymine).

3.2 Nội dung 2: Nhân sinh khối nam rễ nội cộng sinh trên các loại cơ chất khácnhau

3.2.1 Đặc điểm bào tử sử dụng để nhân sinh khối

Các bào tử Acaulospora spp được thu thập trong mẫu đất vùng rễ măng cụt dé

thực hiện thí nghiệm có dạng hình cầu, gần hình cầu, bề mặt bao tử nhẫn bóng, hầu hết

là các bào tử đơn Khi ép bào tử bằng lamen trong 1 giọt PVLG, bào tử có màu vàngcam ở tất cả các lớp Tuy nhiên khi nhuộm với thuốc nhuộm Melzer, kết quả cho thấy ởlớp trong của bào tử bắt màu nâu cam hoặc nâu đỏ, khi vỡ có thê thấy dịch bào tử ở hầuhết các bao tử Thành bào tử có 3 - 4 vách, kích thước 122,5 — 185 pm

b; f; e; 1) bào tử Acaulospora spp nhuộm trong PVLG

c; h) quan thé nam VAM chỉ Acaulospora phân lập trong mau dat dưới kính hién vi

soi nổiHình 3.4 Hình thái Bào tử Acaulospora spp được sử dụng dé đem nhân nuôi

3.2.2 Kết quả phân tích giá thể

Bảng 3.3 Kết quả phân tích lý, hóa tính của cơ chất trong thí nghiệm

Dam dé tiéu (mg/100g dat) 0,03 1,54 1,7 2,16

Độ xốp, độ thoáng khí va kha năng giữ nước là tinh chat vật lý quan trọng của

cơ chất, đặc biệt cơ chất sử dụng dé nhân giống VAM Một cơ chất lý tưởng được sửdụng dé nhân giống VAM phải có đặc điểm thoáng khí tốt Kết quả phân tích cho thay

có sự tương quan rất chặt giữa tỉ lệ cát trong cơ chất với độ xốp, độ thoáng khí và khả

năng giữ nước của cơ chất Do hạt cát sử dụng trong thí nghiệm có kích thước nhỏ