Tóm Tắt: Nghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ VÂN NGA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẤU ẤN SINH HỌC TRONG HUYẾT THANH Ở BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CÓ BIẾN CHỨNG VÕNG MẠC Chuyên nNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạcNghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

VŨ VÂN NGA

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẤU ẤN SINH HỌC TRONG

HUYẾT THANH Ở BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

TYPE 2 CÓ BIẾN CHỨNG VÕNG MẠC

Chuyên ngành : Hóa sinh y học

Mã số : 9720101

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Trần Vân Khánh

2 PGS TS Vũ Thị Thơm

Phản biện 1: PGS.TS Huỳnh Quang Thuận Phản biện 2: TS Mai Quốc Tùng

Phản biện 3: PGS.TS Lương Thị Lan Anh

Luận án sẽ bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường, tại Trường Đại học Y Hà Nội

Vào hồi…….giờ, ngày…….tháng…….năm 2024

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Đại học Y Hà Nội

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Vu Van Nga, Nguyen Thi Binh Minh, Dinh Thi My Dung,

Nguyen Thi Lan Anh, Nguyen Cong Huu, Bui Thi Van Anh,

Nguyen Xuan Hiep, Hoang Thi Thu Ha, Tran Van Khanh, Vu Thi

Thom, Le Ngoc Thanh (2023), Risk factors related to diabetic

retinopathy in Vietnamese patients with type 2 diabetes mellitus,

Endocrine and Metabolic Science, 13 (2023) 100145

2 Vu Van Nga, Nguyen Thi Binh Minh, Dinh Thi My Dung,

Nguyen Thi Lan Anh, Hoang Thi Thu Ha, Le Thi Minh Phuong,

Do Thi Le Hang, Do Thi Quynh, Pham Thi Thuy An, Le Ngoc

Thanh, Vu Thi Thom,Tran Van Khanh (2024), Serum Vascular

endothelial growth factor levels and some characteristics in diabetic

retinopathy patients, Tạp chí nghiên cứu Y học, 177 E14 (04)

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Tính thời sự của đề tài Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một vấn đề y tế toàn cầu, có tỷ lệ mắc cao và thời gian điều trị kéo dài với chi phí lớn Ở Việt Nam theo báo cáo năm 2017 có 3,5 triệu người mắc đái tháo đường, trong đó có hơn 90% là đái tháo đường type 2 với nhiều biến chứng phức tạp tại tim mạch, thận, mắt, thần kinh Trong các dạng biến chứng này, biến chứng võng mạc là biến chứng mạn tính phổ biến với các mức độ tổn thương khác nhau Các nghiên cứu đã cho thấy khoảng một phần ba số bệnh nhân mắc đái tháo đường có dấu hiệu của biến chứng võng mạc Nếu không được phát hiện và điều trị sớm, những tổn thương của bệnh ở đáy mắt sẽ rất nặng nề như phù hoàng điểm, xuất huyết võng mạc, xuất huyết dịch kính, bong võng mạc Đây cũng là nguyên nhân gây mù hàng đầu ở độ tuổi lao động ở các nước phát triển

Cơ chế bệnh sinh của biến chứng võng mạc có sự tham gia của nhiều yếu tố trong hệ mạch máu, đặc biệt là các yếu tố đáp ứng viêm và các yếu tố liên quan tới tính thấm thành mạch Trong diễn biến bệnh sinh của biến chứng võng mạc, các dấu ấn sinh học xuất hiện ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình khởi phát và tiến triển bệnh Trong các dấu ấn sinh học này, VEGF (Vascular endothelial growth factor - Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu), APOA1 (Apolipoprotein A1), C7 (Complement component C7 – Yếu tố bổ thể C7) là các dấu ấn sinh học đã được chứng minh là nhân tố quan trọng của quá trình phát triển biến chứng võng mạc đái tháo đường Để phát hiện và theo dõi được sự tiến triển của biến chứng này thì việc xác định được sự thay đổi nồng độ các dấu ấn này trong huyết thanh để từ đó có các biện pháp phòng ngừa, điều trị cho bệnh nhân là rất cấp thiết Ngoài các dấu ấn sinh học trên thì cơ chế bệnh sinh của biến chứng võng mạc đái tháo đường còn ghi nhận có nhiều dấu ấn khác tham gia mà việc phân tích từng dấu ấn sẽ gây khó khăn cho đánh giá chung và tốn nhiều chi phí, thời gian Vì vậy, sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích hệ protein trong huyết thanh rất có ý nghĩa trong việc cung cấp thông tin nền tảng về hoạt động tương tác, các biểu hiện chức năng của các dấu

ấn sinh học protein trong biến chứng võng mạc Tại Việt Nam hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào về các dấu ấn VEGF, APOA1, C7 và hệ protein trong huyết thanh liên quan đến biến chứng võng mạc đái tháo đường

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu một số dấu ấn sinh học trong huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc” với 2 mục tiêu sau:

1 Mục tiêu 1: Xác định nồng độ và khảo sát mối liên quan của các dấu ấn sinh học VEGF, APOA1, C7 trong huyết thanh với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

2 Mục tiêu 2: Xác định các protein trong hệ protein huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

2 Những đóng góp mới của luận án Luận án đã xác định được nồng độ VEGF huyết thanh có ý nghĩa dự đoán biến chứng võng mạc ở bệnh nhân đái tháo đường với điểm cut-off là 86,10 pg/mL,

độ nhạy 68%, độ đặc hiệu 75,7%, AUC=0,800

Luận án đã xác định được một số protein trong huyết thanh của các nhóm

nghiên cứu, trong đó nhóm có biến chứng võng mạc nhận diện được nhiều protein

nhất (328 protein) Kết quả phân tích chức năng các protein đặc trưng của nhóm có

biến chứng võng mạc ghi nhận một số con đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến

cơ chế bệnh: con đường liên quan sự hình thành mạch, con đường truyền tín hiệu

qua endothelin, con đường truyền tín hiệu VEGF, con đường truyền tín hiệu FGF,

con đường liên quan đến quá trình hoạt hóa bổ thể và đông máu

Luận án đã xác định được một số protein có mức độ tương tác cao trong các

protein đặc trưng của nhóm có biến chứng võng mạc là GAPDH, YWHAZ, APP,

UBB, HSPB1

3 Bố cục của luận án

Luận án gồm 115 trang (Không kể tài liệu tham khảo và phụ lục), trong đó

phần đặt vấn đề 2 trang, tổng quan tài liệu 33 trang, đối tượng và phương pháp

nghiên cứu 17 trang, kết quả nghiên cứu 32 trang, bàn luận 28 trang, kết luận 1

trang và kiến nghị 1 trang Luận án có 21 bảng, 24 hình; 211 tài liệu tham khảo

Nghiên cứu sinh có 2 bái báo đã đăng trên các tạp chí chuyên ngành có uy tín,

là bài báo Tiếng Anh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh võng mạc đái tháo đường

Bệnh võng mạc đái tháo đường (hay biến chứng võng mạc ở bệnh nhân đái

tháo đường) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây giảm và mất thị lực ở

người trong độ tuổi lao động Các mức độ tổn thương do võng mạc đái tháo đường

(VMĐTĐ) làm giảm chất lượng cuộc sống và khả năng làm việc của bệnh nhân Tỷ

lệ mắc VMĐTĐ được ước tính là 22,27% trong số các bệnh nhân ĐTĐ trên toàn

cầu Ở Việt Nam hiện nay, tỉ lệ mắc VMĐTĐ ở các bệnh nhân ĐTĐ type 2 trong

khoảng từ 22,4% - 42,5% Cơ chế sinh lý bệnh của bệnh VMĐTĐ là sản xuất quá

mức các gốc oxy tự do liên quan đến cơ chế stress oxy hóa, tình trạng viêm gây ra

các tổn thương của bệnh VMĐTĐ Một số dấu ấn sinh học có liên quan đến các

quá trình này như: VEGF, yếu tố bổ thể, một số apolipoprotein

1 2 Một số dấu ấn sinh học huyết thanh liên quan bệnh võng mạc đái tháo đường

VEGF là một glycoprotein, là yếu tố tăng trưởng có chức năng chỉ dấu protein

cho cả sự vận mạch và sự hình thành mạch VEGF là yếu tố hoạt động mạch mạnh

nhất, biểu hiện bình thường cần thiết để duy trì cân bằng nội môi cấu trúc và chức

năng của tế bào võng mạc, nhưng sự biểu hiện quá mức có thể dẫn đến hình thành

mạch võng mạc do tác động của các yếu tố bệnh lý như thiếu oxy và tăng đường

huyết Các nghiên cứu cho thấy nồng độ VEGF huyết thanh cao hơn rõ rệt ở bệnh

nhân mắc VMĐTĐ so với bệnh nhân không mắc và nồng độ VEGF huyết thanh

cũng tăng cao theo các mức độ nặng của bệnh VMĐTĐ, nhưng không có sự khác

biệt nồng độ VEGF huyết tương giữa các nhóm bệnh nhân

Protein bổ thể C7 là một glycoprotein chuỗi đơn là một thành phần của con

đường hoạt hóa bổ thể C7 được biểu hiện trong các tế bào nội mô như một cái bẫy

để lắp ráp phức hợp tấn công màng tế bào Nghiên cứu của Jin năm 2016, phân tích định lượng nồng độ các protein trong huyết thanh nhận thấy có sự khác biệt về nồng độ protein C7 giữa nhóm bệnh nhân ĐTĐ có và không có tổn thương võng mạc (giá trị AUC > 0,7) Nghiên cứu này cũng đề xuất C7 là một trong 4 protein thuộc panel (ITIH2, APOA4, C7 và CLU) có thể phân biệt tình trạng có và không tổn thương VMĐTĐ

Apolipoprotein A1, thành phần chủ yếu apolipoprotein của lipoprotein mật độ cao APOA1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ bề mặt mắt hoặc võng mạc khỏi stress oxy hóa Nồng độ APOA1 cao có thể bảo vệ tế bào nội mô mạch máu võng mạc chống lại tổn thương do oxy hóa và viêm nhiễm để duy trì tính toàn vẹn của mạch võng mạc và ngăn ngừa sự phát triển của biến chứng VMĐTĐ

1.3 Một số nghiên cứu về hệ protein ở bệnh nhân VMĐTĐ:

Phân tích hệ protein bằng khối phổ (proteomic) là một kỹ thuật hữu ích để xác định các protein liên quan đến các trạng thái sinh lý và bệnh lý khác nhau Jin (2015) đã phân tích dựa trên các nghiên cứu trước đó để tìm được 96 protein để phân tích proteomics bán định lượng nồng độ trong huyết tương và chọn được 15 protein phân tích sâu hơn liên quan đến tình trạng mắc VMĐTĐ gồm: APLP2, APOA4, APOH, B3GNT1, C4B, C5, C7, CD14, CLU, FN1, GSN, ITIH2, KRT1, SERPINF1 và VTN Kết quả phân tích đa điểm đã chỉ ra 4 protein trong huyết tương là APO4, C7, CLU và ITIH2 có thể được sử dụng làm dấu ấn sinh học phát hiện VMĐTĐ với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Kết quả phân tích tổng quan của Zulvikar (2023) cho thấy có 80 protein thường được nhận diện trong các mẫu và 10 protein chung được nhận diện trong các loại mẫu thủy tinh thể, thủy dịch và huyết tương/huyết thanh gồm: APOA4, APOA1, CP, FGB, TF, APOA2, ORM2, FGA, A2M, ORM1 Phân tích biểu hiện của protein nhận thấy đáp ứng với kích thích bên ngoài, quá trình đông máu và hoạt hóa bổ thể là những con đường tín hiệu tăng biểu hiện ở các bệnh nhân VMĐTĐ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc và nhóm đối chứng gồm bệnh nhân đái tháo đường type 2 không có biến chứng võng mạc và người khỏe mạnh cả nam và nữ, đến khám và điều trị tại bệnh viện E và bệnh viện Mắt Trung ương từ tháng 1 năm 2020 đến tháng 3 năm 2023 thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ như sau:

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân Bệnh nhân được chẩn đoán ĐTĐ theo tiêu chuẩn của Hiệp Hội Đái tháo đường Mỹ – ADA 2019

a) Glucose huyết tương lúc đói (Fasting Plasma Glucose - FPG) ≥ 126 mg/dL (hay 7 mmol/L) Bệnh nhân phải nhịn ăn (không uống nước ngọt, có thể uống nước

lọc, nước đun sôi để nguội) ít nhất 8 giờ (thường phải nhịn đói qua đêm từ 8 -14

giờ), hoặc:

b) Glucose huyết tương ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp

glucose đường uống 75g (Oral Glucose Tolerance Test - OGTT) ≥ 200 mg/dL (hay

11,1 mmol/L) Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống phải được thực hiện

theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới: Bệnh nhân nhịn đói từ nửa đêm trước

khi làm nghiệm pháp, dùng một lượng glucose tương đương với 75g glucose, hòa

tan trong 250-300 mL nước, uống trong 5 phút; trong 3 ngày trước đó bệnh nhân ăn

khẩu phần có khoảng 150-200 gam carbohydrat mỗi ngày

c) HbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol)

d) Ở bệnh nhân có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết hoặc mức

glucose huyết tương ở thời điểm bất kỳ ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L)

Nếu không có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết (bao gồm tiểu

nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, sụt cân không rõ nguyên nhân), xét nghiệm chẩn đoán

a, b, d ở trên cần được thực hiện lặp lại lần 2 để xác định chẩn đoán Thời gian thực

hiện xét nghiệm lần 2 sau lần thứ nhất có thể từ 1 đến 7 ngày

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân đã có chẩn đoán ung thư, viêm khớp dạng thấp

- Bệnh nhân có đục môi trường trong suốt không soi được được đáy mắt

- Bệnh nhân đã được điều trị tiêm VEGF nội nhãn, hoặc đã điều trị laser

quang đông

- Bệnh nhân mắc đái tháo đường các type khác

- Bệnh nhân không phù hợp tiêu chuẩn lựa chọn ở trên

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Nhóm người khỏe mạnh:

Người khỏe mạnh được chọn từ những người đến khám sức khỏe không mắc

đái tháo đường, không mắc bệnh lý võng mạc

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang có nhóm chứng

Các đối tượng nghiên cứu được chia thành ba nhóm gồm:

 Nhóm 1: Bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

 Nhóm 2: Bệnh nhân đái tháo đường type 2 không có biến chứng võng mạc

 Nhóm 3: Người khỏe mạnh không mắc đái tháo đường và bệnh lý võng mạc

- Cỡ mẫu: dùng công thức cỡ mẫu cho ước lượng một tỉ lệ với tỉ lệ mắc

VMĐTĐ là 0,425,

n = 𝑍 / ( )

( )

n: cỡ mẫu nghiên cứu; p: 0,425; Z1-α/2: 1,96; ε: 0,28

Thay vào công thức có n = 66,29 Như vậy, cỡ mẫu tối thiểu của nhóm có

biến chứng võng mạc là 67 Nghiên cứu thu thập được 75 bệnh nhân nhóm có biến

chứng võng mạc Số lượng bệnh nhân ở nhóm không có biến chứng VMĐTĐ và

người khỏe mạnh lấy tương ứng là 75 mỗi nhóm Tổng số là 225, gồm 217 đối

tượng ở bệnh viện E và 8 bệnh nhân tại bệnh viện Mắt Trung ương

2.2.2.1 Các bước tiến hành nghiên cứu

- Tất cả các đối tượng nghiên cứu được thu thập các thông tin về đặc điểm chung (tuổi và giới), khai thác tiền sử, bệnh sử, thăm khám lâm sàng, khám mắt, chỉ định làm các xét nghiệm hóa: hóa sinh máu (glucose, ure, creatinine, acid uric, cholesterol, triglyceride, HDL_C, LDL_C, HbA1C) và công thức máu Chẩn đoán xác định, chấn đoán mức độ bệnh VMĐTĐ được thực hiện bởi các bác sỹ lâm sàng phụ trách trực tiếp

- Lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu: 4mL mẫu máu tĩnh mạch thu vào 2 ống chứa các hạt silicagel

- Tất cả các thông tin chung, lâm sàng và chỉ số cận lâm sàng sẽ được thu thập

và lưu vào mẫu bệnh án nghiên cứu

2.2.2.2 Các biến số, chỉ số nghiên cứu:

- Tuổi (năm): phân bố độ tuổi ở từng nhóm nghiên cứu

- Giới (nam, nữ; tỷ lệ nam/nữ) ở từng nhóm nghiên cứu

- Tiền sử bản thân:

+ Thời gian mắc đái tháo đường: <5 năm, 5-10 năm, 10-15 năm và ≥ 15 năm + Tăng huyết áp: có/không

+ Lạm dụng rượu: có/không + Hút thuốc lá: có/không

- Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index – BMI) (kg/m2):

+ BMI = Cân nặng / Chiều cao + Phân độ BMI theo tiêu chuẩn chẩn đoán béo phì của tổ chức y tế thế giới (WHO) dành cho các nước Châu Á

- Huyết áp: bệnh nhân được nghỉ ngơi trước khi đo huyết áp, đo huyết áp tay phải, đo hai lần rồi lấy trung bình cộng của hai lần đo

- Khám mắt: được thực hiện bởi các bác sĩ chuyên khoa Mắt + Đo thị lực 2 mắt: không kính và có kính theo bảng thị lực Snellen, quy đổi sang thị lực Logmar

+ Đo nhãn áp bằng nhãn áp kế Maclakov + Khám bán phần trước: để đánh giá các môi trường trong suốt, phát hiện tình trạng viêm nhiễm

+ Soi đáy mắt: Đánh giá tình trạng võng mạc, dịch kính, gai thị

- Xác định, đánh giá các tổn thương võng mạc do đái tháo đường theo phân loại bệnh võng mạc đái tháo đường của Hội đồng nhãn khoa quốc tế (2017)

- Phân mức thị lực thành ba nhóm theo phân loại của ICD-10 (2019) với bảng thị lực LogMar

- Các chỉ số hóa sinh máu và công thức máu: Trong nghiên cứu, mẫu bệnh phẩm xét nghiệm Hóa sinh máu, công thức máu của các bệnh nhân thu thập tại Bệnh viện Mắt Trung ương được vận chuyển về Bệnh viện E

- Mức lọc cầu thận (MLCT) tính theo công thức MDRD

- Nồng độ VEGF (pg/mL), APOA1 (mg/dL), C7 (µg/mL) trong mẫu huyết thanh

- Kết quả phân tích định tính các protein được nhận dạng trong mẫu huyết thanh theo phương pháp khối phổ

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.4 Kỹ thuật định lượng protein VEGF, APOA1, C7:

Định lượng protein huyết thanh VEGF, APOA1, C7 bằng phương pháp

sandwich Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay) sử dụng bộ kit ELISA của

MyBioSource (Mỹ) Kit Elisa phân tích VEGF (MBS355343), Kit Elisa phân tích

APOA1 (MBS564036), Kit Elisa phân tích C7 (MBS765771) Phân tích được tiến

hành tại phòng thí nghiệm của bộ môn Y dược học cơ sở - Trường Đại học Y dược

- Đại học quốc gia Hà Nội

2.2.5 Kỹ thuật phân tích khối phổ các protein trong mẫu huyết thanh:

Do phân tích khối phổ là kĩ thuật hiện đại, cần phải tiến hành ở nước ngoài

với chi phí cao nên chúng tôi tiến hành lựa chọn các mẫu điển hình có độ tương

đồng cao ở các chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng để phân tích Tiến hành phân tích

khối phổ mười mẫu huyết thanh của từng nhóm nghiên cứu: nhóm người khỏe

mạnh, nhóm không BCVM, nhóm có BCVM Các đối tượng được lựa chọn để

phân tích khối phổ được lựa chọn dựa trên sự đồng nhất về các thông số chung của

bệnh nhân (tuổi, giới) và sự đồng nhất về các dữ liệu cận lâm sàng (kết quả xét

nghiệm hóa sinh máu và kết quả xét nghiệm công thức máu)

Các bước tiến hành phân tích khối phổ

- Xử lý, tách chiết protein

- Điện SDS-PAGE và thủy phân protein

- Phân tích và nhận dạng protein bằng phương pháp sắc ký lỏng nano kết nối

khối phổ được thực hiện tại viện Hàn lâm khoa học Đài Loan Academia Sinica

Phân tích số liệu lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả định lượng nồng độ protein,

phân tích thông tin các protein từ kết quả khối phổ ở các nhóm bệnh nhân

Thu thập mẫu tại Bệnh viện E và Bệnh viện Mắt Trung ương

Thông tin

chung, tiền

sử, lâm sàng,

cận lâm sàng

Nhóm bệnh nhân đái tháo đường

Người khỏe mạnh

Thông tin chung, tiền sử, khám tổng quát, khám mắt, các kết quả xét nghiệm

Không BCVM

n= 75

Có BCVM

Định lượng nồng độ protein VEGF, APOA1, C7 bằng phương pháp ELISA

Phân tích proteomic bằng phương pháp khối phổ cho mười mẫu huyết thanh ở

từng nhóm nghiên cứu

- Phân tích kết quả khối phổ: bằng các phần mềm tin sinh: PEAKS 6.0, STRING, PANTHER

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2020 đến tháng 03/2023 Địa điểm nghiên cứu:

bệnh viện E, bệnh viện Mắt Trung Ương, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, viện Hàn lâm khoa học Đài Loan Academia Sinica

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu Nghiên cứu đã được chấp thuận bởi Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học trường Đại học y Hà Nội

2.6 Xử lý và phân tích số liệu

Số liệu sau khi thu thập, thực hiện các phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 25.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên 225 đối tượng tham gia thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ, trong đó có 150 bệnh nhân mắc đái tháo đường type 2 (75 có biến chứng võng mạc, 75 không biến chứng võng mạc) và 75 người khỏe mạnh

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi và giới ở các nhóm nghiên cứu

n=75

Không BCVM n=75

Có BCVM

Tuổi (năm)

<0,001 a Trung vị

(Min-Max)

56,00 (35,00-73,00)

66,00 (36,00-88,00)

71,00 (38,00-81,00)

<0,001 b

a: Kruskal wallis test; b: Chi-square test; *: khác biệt với NKM (p<0,05), #: khác biệt với nhóm có BCVM (p<0,05) Người khỏe mạnh (NKM), đái tháo đường không biến chứng võng mạc (Không BCVM), đái tháo đường có biến chứng võng mạc (có BCVM)

Nhóm có BCVM có số lượng bệnh nhân trên 60 tuổi cao nhất (46,3%) Nhóm người khỏe mạnh và nhóm có BCVM có tỉ lệ nữ cao hơn nam

3.1.2 Các đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân đái tháo đường type 2

Bảng 3.2 Các đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân đái tháo đường type 2

Trung vị (Min-max)

Không BCVM (x̅ ± SD) Trung vị (Min-max)

Có BCVM (x̅ ± SD)

81,20 (42,70-161,60) 88,70 (48,70-161,60) 74,60 (42,70-153,80)

318,20

137,00

a: Independent simple T-test test; b: Mann-Whitney test;

Nồng độ creatinine, axit uric ở nhóm có biến chứng võng mạc cao hơn nhóm

không có biến chứng (p<0,05) còn MLCT, số lượng hồng cầu, huyết sắc tố và

Hematocrit thấp hơn (p<0,05)

3.2 Xác định nồng độ và khảo sát mối liên quan của các dấu ấn sinh học VEGF,

APOA1, C7 trong huyết thanh với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh

nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

3.2.1 Nồng độ protein VEGF

* Nồng độ VEGF ở các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.3 Nồng độ VEGF ở các đối tượng nghiên cứu

(x̅ ± SD)

Không BCVM (x̅ ± SD)

Có BCVM

<0,001 Trung vị

(Min-Max)

35,06 (6,30-210,94)

52,50 (9,18-356,82)

133,29 (32,12-885,38)

Kruskal wallis test; #: khác biệt với nhóm có BCVM (p<0,05)

Hình 3.1 Nồng độ VEGF ở các đối tượng nghiên cứu

Nồng độ VEGF có sự khác biệt giữa 3 nhóm người khỏe mạnh, đái tháo đường có và không biến chứng võng mạc với p<0,001 (Kruskal-wallis test) Nhóm

có biến chứng có nồng độ VEGF cao hơn so với 2 nhóm còn lại với p<0,001 (Mann-Whitney test)

* Mối tương quan của nồng độ protein VEGF với các chỉ số cận lâm sàng Bảng 3.4 Phân tích tương quan Spearman của nồng độ protein VEGF với các

chỉ số cận lâm sàng ở các đối tượng nghiên cứu

ho p rho p rho p Glucose (mmol/L) 0,047 0,690 -0,301 0,009 -0,089 0,447 HbA1C (%) -0,013 0,909 -0,064 0,584 0,085 0,470 Ure (mmol/L) 0,120 0,304 -0,051 0,663 -0,051 0,664 Creatinine (µmol/L) 0,189 0,105 -0,141 0,227 -0,045 0,699 MLCT (mL/phút/ 1,73m2) -0,099 0,398 0,086 0,462 0,039 0,740 Axit uric (µmol/L) 0,122 0,298 -0,115 0,324 -0,198 0,088 Cholesterol (mmol/L) 0,143 0,222 0,033 0,781 -0,078 0,506 Triglyceride (mmol/L) 0,007 0,952 -0,170 0,146 -0,171 0,143 HDL_Cholesterol (mmol/L) 0,183 0,115 0,151 0,195 0,069 0,558 LDL_Cholesterol (mmol/L) 0,131 0,261 0,045 0,703 -0,084 0,472

Số lượng hồng cầu (T/L) 0,047 0,689 -0,040 0,732 -0,028 0,808 Huyết sắc tố (g/L) 0,145 0,214 -0,093 0,426 -0,052 0,659 Hematocrit (L/L) 0,163 0,162 -0,087 0,458 -0,056 0,632

Chú thích: rh 0 hệ số tương quan Spearman

Nồng độ VEGF và nồng độ glucose tương quan mức độ trung bình ở nhóm đái tháo đường không có biến chứng võng mạc (rh0 =-0,301, p=0,009) Nồng độ VEGF không có tương quan với nồng độ các chỉ số HbA1C, ure, creatinine, axit uric, cholesterol, triglyceride, HDL_Cholesterol, LDL_Cholesterol ở các nhóm

* Nồng độ VEGF phân theo mức độ biến chứng võng mạc

Hình 3.2 Nồng độ protein VEGF ở các nhóm mắc ĐTĐ

Phân tích nồng độ VEGF ở các bệnh nhân đái tháo đường cho thấy nồng độ

VEGF khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm ĐTĐ không biến chứng võng

mạc, VMĐTĐ không tăng sinh và VMĐTĐ tăng sinh với p<0,001 (Kruskal-Wallis

test) Nồng độ VEGF ở nhóm không mắc biến chứng nhỏ hơn hai nhóm mắc biến

chứng (p<0,05; Mann Whitney test) Ở các nhóm bệnh nhân mắc BCVM, nồng độ

VEGF có xu hướng tăng dần nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

(p>0,05, Mann Whitney test)

3.2.2 Nồng độ protein C7

* Nồng độ C7 ở các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.5 Nồng độ C7 ở các nhóm nghiên cứu

(x̅ ± SD)

Không BCVM (x̅ ± SD)

Có BCVM (x̅ ± SD) p C7 (µg/mL) 14,40 ± 7,80 14,36 ± 9,01# 18,73 ± 14,15

0,062 Trung vị

(Min-Max) (7,18-49,92) 12,39 (7,61-64,54) 11,39 (6,52-92,03) 13,05

Kruskal wallis test; #: khác biệt với nhóm có BCVM (p<0,05)

Hình 3.3 Nồng độ protein C7 giữa các nhóm nghiên cứu

Phân tích nồng độ protein C7 ở các nhóm nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt giữa 3 nhóm người khỏe mạnh, đái tháo đường có và không biến chứng võng mạc với p=0,062 (Kruskal-wallis test) Nhóm có biến chứng có nồng độ C7 cao hơn so với nhóm không biến chứng võng mạc với p=0,025 (Mann-Whitney test)

*Tương quan giữa nồng độ C7 với các nhóm chỉ số cận lâm sàng Bảng 3.6 Phân tích tương quan Spearman của nồng độ protein C7 với các

chỉ số cận lâm sàng ở các đối tượng nghiên cứu

Chú thích: rh0 hệ số tương quan Spearman Nồng độ C7 và nồng độ HbA1C tương quan nghịch mức độ yếu ở các bệnh nhân có biến chứng võng mạc (rh0 = -0,229, p=0,048) Ở nhóm bệnh nhân không có biến chứng võng mạc, nồng độ C7 tương quan nghịch mức độ yếu với số lượng hồng cầu (rh0=-0,283, p=0,014) và hematocrit (rh0=-0,234, p=0,043)

* Nồng độ C7 các bệnh nhân ĐTĐ type 2 phân theo mức độ biến chứng võng mạc

Hình 3.4 Nồng độ C7 ở các nhóm mắc ĐTĐ

Nồng độ C7 khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm không mắc biến chứng

võng mạc và nhóm VMĐTĐ không tăng sinh với p=0,033 (Mann Whitney test);

nhưng không có sự khác biệt giữa nhóm không biến chứng võng mạc với nhóm

VMĐTĐ tăng sinh, không có sự khác biệt giữa 2 nhóm VMĐTĐ tăng sinh và

không tăng sinh (Mann Whitney test (p=0,264 và p=1,0) Khi phân tích nồng độ C7

giữa các nhóm: không mắc biến chứng võng mạc, VMĐTĐ không tăng sinh và

nhóm VMĐTĐ tăng sinh, chúng tôi không nhận thấy có sự khác biệt giữa các

nhóm với p=0,080 (Kruskal-Wallis test)

3.2.3 Nồng độ protein APOA1

* Nồng độ APOA1 ở các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.7 Nồng độ APOA1 ở các đối tượng nghiên cứu

Đặc điểm (x̅ ± SD) NKM Không BCVM (x̅ ± SD) Có BCVM (x̅ ± SD) p

APOA1

(mg/dL) 268,35 ± 226,77 169,20*,218,04 ± # 190,44 ± 38,14*

<0,001 Trung vị

(Min-Max) (156,10-1322,77) 199,30 (112,95-1208,39) 173,49 (112,39-275,30) 190,69

Kruskal Wallis test; *: khác biệt với NKM (p<0,05), #: khác biệt với nhóm có

BCVM (p<0,05)

Hình 3.5 Nồng độ APOA1 ở các đối tượng nghiên cứu

Phân tích nồng độ protein APOA1 ở các nhóm nghiên cứu cho thấy nồng độ

APOA1 có sự khác biệt giữa 3 nhóm người khỏe mạnh, ĐTĐ mắc và không mắc

biến chứng võng mạc với p<0,001 (Kruskal-wallis test) Nhóm khỏe mạnh có nồng

độ APOA1 cao hơn hai nhóm mắc ĐTĐ với p<0,001 và p=0,014 (Mann-Whitney

test) Nồng độ APOA1 ở nhóm không mắc biến chứng võng mạc thấp hơn nhóm

mắc biến chứng võng mạc (p = 0,043; Mann-Whitney test)

* Mối Tương quan giữa nồng độ APOA1 với các chỉ số cận lâm sàng ở các đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.8 Phân tích tương quan Spearman của nồng độ protein APOA1 với một

số chỉ số cận lâm sàng ở các đối tượng nghiên cứu

Chú thích: rh 0 hệ số tương quan Spearman

Ở nhóm mắc biến chứng võng mạc, nồng độ acid uric có tương quan nghịch với nồng độ APOA1 (rh0=-0,273; p=0,018) Nồng độ APOA1 không tương quan với các chỉ số glucose, HbA1C, ure, creatinine, axit uric, cholesterol, triglyceride, HDL_Cholesterol, LDL_Cholesterol ở các nhóm bệnh nhân mắc ĐTĐ và nhóm người khỏe mạnh

* Nồng độ APOA1 phân theo mức độ biến chứng võng mạc

Hình 3.6 Nồng độ protein APOA1 ở các nhóm mắc ĐTĐ Phân tích nồng độ APOA1 ở các bệnh nhân ĐTĐ cho thấy nồng độ APOA1 khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm ĐTĐ không biến chứng võng mạc, VMĐTĐ không tăng sinh và VMĐTĐ tăng sinh với p=0,025 (Kruskal-Wallis test); nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm không biến chứng võng mạc và nhóm VMĐTĐ không tăng sinh (Mann Whitney test (p=0,086); giữa

nhóm VMĐTĐ không tăng sinh và tăng sinh (Mann Whitney test (p=0,05) Nồng

độ APOA1 ở nhóm không mắc biến chứng võng mạc nhỏ hơn nhóm mắc VMĐTĐ

tăng sinh (p=0,027; Mann Whitney test)

3.2.4 Tương quan giữa nồng độ 3 protein VEGF, C7, APOA1

Hình 3.7 Mối tương quan giữa nồng độ VEGF, C7, APOA1 ở các nhóm

nghiên cứu Khi phân tích mối tương quan Spearman giữa nồng độ VEGF, C7, APOA1 ở

các nhóm nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy ở nhóm có biến chứng võng mạc có mối

tương quan thuận mức độ trung bình giữa nồng độ VEGF và APOA1 (rh0=0,429;

p<0,001)

3.2.5 Giá trị của nồng độ VEGF, C7, APOA1 huyết thanh trong dự đoán khả năng mắc biến chứng võng mạc

Hình 3.8 Giá trị của nồng độ VEGF, C7, APOA1 huyết thanh trong dự đoán

khả năng mắc VMĐTĐ Kết quả phân tích ngưỡng cut-off và độ nhạy, độ đặc hiệu của nồng độ VEGF, C7, APOA1 huyết thanh trong dự đoán khả năng mắc biến chứng võng mạc được thể hiện ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Ngưỡng cut-off và độ nhạy, độ đặc hiệu của nồng độ VEGF, C7

và APOA1 huyết thanh trong dự đoán khả năng mắc BCVM Chỉ số Cut-off AUC 95%CI p Độ nhạy (%) hiệu (%) Độ dặc VEGF

(pg/mL) 86,10 0,800 0,370-0,870 <0,001 68,0 75,7 C7

(µg/mL) 18,42 0,602 0,511-0,693 0,031 37,3 82,4 APOA1

(mg/dL) 187,32 0,596 0,504-0,689 0,043 57,3 64,9 Kết quả diện tích dưới đường cong cho thấy nồng độ VEGF có khả năng dự đoán mắc biến chứng võng mạc ở bệnh nhân ĐTĐ ở mức tốt, C7 ở mức trung bình còn APOA1 chưa thấy có giá trị dự đoán trong nghiên cứu này

3.3 Xác định các protein trong hệ protein huyết thanh ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng võng mạc

Để tìm hiểu về biểu hiện hệ protein và sự tương tác giữa các protein liên quan đến tình trạng mắc biến chứng võng mạc, mười mẫu huyết thanh của từng nhóm nghiên cứu (nhóm người khỏe mạnh, nhóm bệnh nhân đái tháo đường không mắc

và nhóm mắc biến chứng võng mạc) được sử dụng để phân tích khối phổ

3.3.1 Các protein có ở các nhóm mẫu

Kết quả phân tích khối phổ cho thấy số lượng protein nhận diện được giữa các

nhóm nghiên cứu có sự khác biệt Nhóm người khỏe mạnh nhận diện được tổng

206 protein Nhóm không biến chứng võng mạc xác định được tổng 240 protein

Nhóm biến chứng võng mạc xác định được tổng 328 protein

Hình 3.9 Sự tương quan giữa các protein của các nhóm

Khi tiến hành so sánh sự giống và khác nhau giữa danh sách protein của các

nhóm, chúng tôi thấy có 104 protein chung nhận diện được ở cả ba nhóm Một

điểm đáng lưu ý, nhóm bệnh nhân đái tháo đường có biến chứng võng mạc phân

tích được lượng lớn số loại protein trong mẫu bệnh phẩm (328 protein) So sánh

giữa nhóm đái tháo đường có biến chứng võng mạc và nhóm đái tháo đường không

biến chứng võng mạc có 181 protein chung giữa hai nhóm Trong đó, có 77 protein

chỉ nhận diện được ở hai nhóm này Nhóm bệnh nhân ĐTĐ có biến chứng võng

mạc có 130 protein đặc trưng và nhóm bệnh nhân ĐTĐ không có biến chứng võng

mạc có 48 protein đặc trưng

3.3.2 Kết quả phân tích tương tác giữa các protein trong các nhóm

Ở bước đầu tiên của phân tích chức năng, chúng tôi đã tiến hành phân tích

mạng lưới tương tác protein network (Protein protein interaction - PPi) để phân tích

mối quan hệ tương tác giữa các protein Đầu tiên chúng tôi phân tích các protein

chung giữa 3 nhóm nghiên cứu, sau đó chúng tôi phân tích các protein nhận diện ở

nhóm bệnh nhân ĐTĐ (bao gồm cả có và không có BCVM) mà không nhận diện

được ở nhóm người khỏe mạnh Để nhận biết sự biểu hiện khác nhau giữa các loại

protein ở 2 nhóm ĐTĐ, tiếp theo chúng tôi phân tích những protein nhận diện ở

nhóm đái tháo đường có BCVM mà không nhận diện được ở nhóm không BCVM

3.3.2.1 Mạng lưới tương tác giữa các protein chung của ba nhóm nghiên cứu:

Trước tiên, chúng tôi phân tích mạng lưới tương tác giữa các protein chung

của cả 3 nhóm nghiên cứu

Hình 3.10 PPI network giữa các protein chung giữa 3 nhóm nghiên cứu

Sự tương tác giữa các protein này có 87 nút, số lượng tương tác là 253, giá trị trung bình của nút là 5,82 Giá trị hệ số phân cụm cục bộ (Local clustering coeficient – CC) trung bình là 0,588 Network cho thấy các cụm liên quan đến protein nhóm apolipoprotein, nhóm bổ thể và nhóm keratin Trong các protein, có

70 protein có tương tác với các protein khác, các protein nhóm apolipoprotein có số nút tương tác lớn như: APOA1 (23 nút), APOE (18 nút), APOL1 (17 nút), nhóm bổ thể có số nút nhỏ hơn: C4A, C4B (9 nút), C3 (7 nút), nhóm keratin các protein có

từ 4 đến 6 nút Hai nhóm protein có tần suất lớn trong các tương tác này liên quan đến con đường hoạt hóa bổ thể và quá trình đông máu (gồm 24 protein) và chuyển hóa cholesterol (gồm 9 protein)

3.3.2.2 Network giữa các protein chung của nhóm có và không có biến chứng võng mạc

Khi phân tích network giữa các protein chung ở nhóm bệnh nhân đái tháo đường mà không nhận diện được ở nhóm người khỏe, chúng tôi nhận được kết quả

sự tương tác giữa các protein ở hai nhóm này có 31 nút, số lượng tương tác 39, giá trị trung bình của nút là 2,52 Giá trị hệ số phân cụm cục bộ (Local clustering coeficient – CC) trung bình là 0,484 Network cho thấy các cụm liên quan đến protein nhóm bổ thể và nhóm liên quan yếu tố đông máu Trong các protein, có 19 protein có tương tác với các protein khác, các protein trong network có số nút