Cùng với sự phát triển của các phương pháp điều trị ung thư mới sử dụng các kỹ thuật và thiết bị hiện đại, các thuốc & chế phẩm điều trị, hỗ trợ điều trị và phòng ngừa ung thư mới luôn l
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Giới thiệu chung về a-Mangostin
α-Mangostin là một dẫn xuất xanthone quan trọng có trong vỏ cây Garcinia mangostana L., thường được trồng tại Thái Lan, Việt Nam, Indonesia và các quốc gia nhiệt đới khác Hợp chất này là yếu tố chính trong nhiều hoạt động sinh học của Garcinia mangostana, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng α-mangostin mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Mangostin được biết đến nhiều nhất trong việc chống ung thư
α-Mangostin, với công thức phân tử C₂₄H₂₆O₆, sở hữu cấu trúc xanthone đặc trưng với một nhóm methoxy tại C7 và ba nhóm hydroxy tại C1, C3, C6 Cấu trúc này là nền tảng cho hoạt tính sinh học mạnh mẽ của hợp chất, giúp ức chế các gốc tự do và các quá trình viêm nhiễm liên quan đến ung thư.
Hàm lượng α-Mangostin trong vỏ măng cụt dao động từ 5-10% khối lượng khô, và một số giống măng cụt có thể đạt đến 17% hàm lượng [1]
Quy trình chiết xuất α-Mangostin hiệu quả nhất thường sử dụng dung môi ethanol hoặc methanol Đầu tiên, vỏ măng cụt được rửa sạch, làm khô và nghiền thành bột mịn Bột này được ngâm trong dung môi ethanol ở nhiệt độ khoảng 60°C trong khoảng 1 giờ để tối ưu hóa quá trình chiết xuất Sau đó, dịch chiết được lọc để loại bỏ bã và cô đặc nhằm thu được α-Mangostin tinh khiết Các yếu tố như tỷ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết xuất có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi α-Mangostin Nghiên cứu của Huỳnh Thị Như Quỳnh và cộng sự (2024) chỉ ra rằng sử dụng ethanol 90% với tỷ lệ dung môi/dược liệu 8:1, nhiệt độ 60°C và thời gian 1 giờ có thể nâng cao hiệu suất chiết xuất lên đến 85,01% Tối ưu hóa quy trình không chỉ tăng hiệu suất mà còn giảm chi phí, giúp α-Mangostin được ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe với giá cả hợp lý.
α-Mangostin đã được nghiên cứu ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư như ung thư gan, phổi và ung thư vú Các nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy α-Mangostin có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú MCF-7 lên đến 70% khi sử dụng liều điều trị tiêu chuẩn Thử nghiệm trên chuột cho thấy α-Mangostin có thể giảm kích thước khối u trung bình từ 40-50% sau 4 tuần sử dụng với liều 20 mg/kg, khẳng định tiềm năng lớn của hợp chất này trong điều trị ung thư.
Mặc dù α-Mangostin có nhiều lợi ích, nhưng nó cũng gặp phải một số hạn chế đáng chú ý Đầu tiên, độ tan trong nước của hợp chất này rất thấp, chỉ khoảng 0.05 mg/mL, điều này gây khó khăn cho việc hấp thu qua đường tiêu hóa và làm giảm khả năng sinh khả dụng trong cơ thể Thêm vào đó, các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng α-Mangostin ở liều cao có thể gây độc tính cho gan và thận Hơn nữa, một số dòng tế bào ung thư có thể phát triển cơ chế kháng lại α-Mangostin sau thời gian dài điều trị.
Hệ thống dẫn truyền thuốc (Drug delivery system - DDS)
1.2.1 Giới thiệu chung về DDS
Hệ thống dẫn truyền thuốc (Drug delivery system - DDS) là công nghệ quan trọng trong y tế, giúp cung cấp thuốc vào cơ thể qua nhiều phương thức như miệng, tiêm, hít, hoặc tiêm trực tiếp vào vùng bị ảnh hưởng DDS được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý khác nhau, nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.
Các hệ thống cung cấp thuốc có thể được thiết kế để phân phối thuốc dưới dạng rải rác hoặc lỏng qua đường miệng hoặc tiêm trực tiếp Những hệ thống này cho phép tùy chỉnh liều thuốc chính xác vào thời điểm và vị trí cần thiết, từ đó giảm thiểu tác dụng phụ và nâng cao hiệu quả điều trị Một số loại hệ thống phổ biến bao gồm thuốc dạng viên, thuốc tiêm, thuốc bột hít và thuốc da Ngoài ra, các hệ thống này có thể được thiết kế để cung cấp thuốc trong thời gian ngắn hoặc dài hạn, tùy thuộc vào mục đích điều trị.
Hệ thống dẫn truyền thuốc hướng đích hiện nay đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh lý như ung thư, tiểu đường, bệnh tim mạch và Parkinson, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và trở thành một phần thiết yếu trong lĩnh vực y tế.
1.2.2 Một số hệ dẫn truyền thuốc
Hệ thống vận chuyển thuốc nano được phân loại dựa trên điểm xuất phát như mắt, mũi, miệng, da và phương thức phân phối thuốc trực tiếp hoặc gián tiếp Các hệ thống phổ biến bao gồm liposome, mixen, dendrimer, hạt nano silica, hạt nano vàng, hạt nano oxit sắt siêu thuận từ (SPION), ống nano carbon và hạt lượng tử Việc lựa chọn hệ thống phân phối thuốc phù hợp phụ thuộc vào các đặc tính sinh học của từng hợp chất.
Silic và cacbon là hai phi kim quan trọng trong cuộc sống con người, nhờ vào đặc tính vật lý và hóa học nổi bật, cùng với chi phí thấp và khả năng tương thích sinh học cao Chúng được sử dụng để phát triển các chất mang nano, hỗ trợ trong chẩn đoán và điều trị ung thư Gần đây, các hạt nano phi kim loại như hạt nano silic (SiNP), hạt nano silic xốp (PSiNP), graphene và oxit graphene (GO) đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu mới, đặc biệt trong việc phát triển hệ thống phân phối thuốc cho điều trị ung thư.
Hình 1 2: Các hạt nano vận chuyển thuốc
Kim loại là các nguyên tố tự nhiên trên Trái đất, có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học và đời sống hàng ngày Trong lĩnh vực vật liệu nano, kim loại được sử dụng để tổng hợp các hạt nano kim loại (MtNP) như AgNP, AuNP, ZnONP, Fe2O3NP và CuONP.
Al2O3NP là vật liệu phổ biến trong tổng hợp MtNP, những vật liệu này không chỉ sở hữu các đặc tính hóa lý riêng mà còn có tính kháng khuẩn, chống ung thư, xúc tác, quang học, điện tử và từ tính, được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, thực phẩm, nông nghiệp, kỹ thuật, điện tử, mỹ phẩm và y học Các nghiên cứu chỉ ra rằng AgNP và AuNP được sử dụng trong nghiên cứu ung thư nhờ tính gây độc tế bào Ngoài việc sử dụng độc lập, các NP này có thể kết hợp với các chất phân tử sinh học như peptide, kháng thể và DNA/RNA Nghiên cứu của Zhou và cộng sự đã phát triển đầu dò nano AgNPs@MnO2-DOX-Apt nhắm mục tiêu nucleolin trên tế bào HeLa, cho phép giải phóng AgNPs và DOX thông qua quá trình khử MnO2 Kết quả cho thấy AgNP và DOX đều gây độc tế bào chủ yếu qua quá trình chết theo chương trình do ROS từ ty thể, trong đó AgNPs@MnO2-DOX-Apt có hiệu quả điều trị mạnh hơn nhờ sự hiệp lực của AgNPs và DOX.
Hạt nano từ polymer tự nhiên
Chitosan (CS), một dẫn xuất của chitin, là một polyme sinh học tự nhiên với nhiều đặc tính ưu việt như khả năng tương thích sinh học, không độc hại, và hoạt tính kháng khuẩn, được ứng dụng trong kỹ thuật mô và chữa lành vết thương Tuy nhiên, khả năng hòa tan kém của CS trong nước hạn chế ứng dụng của nó, do đó, các dẫn xuất như carboxymethyl chitosan (CMC) đã được phát triển để cải thiện khả năng hòa tan và mở rộng ứng dụng y sinh Các nanoparticle (NP) từ CMC có điện tích bề mặt dương, giúp chúng bám vào màng nhầy và giải phóng thuốc một cách bền vững, đồng thời thể hiện khả năng giải phóng thuốc phụ thuộc vào pH Để tăng cường hiệu quả điều trị ung thư, việc phát triển các NP dựa trên CS với khả năng nhắm mục tiêu khối u bằng cách chức năng hóa với các phối tử như axit folic (FA) đã được chú trọng Hệ thống FA-OCMCS có khả năng phân phối siRNA hiệu quả, nhắm vào các thụ thể folate trên tế bào ung thư, đồng thời bảo vệ siRNA khỏi sự thoái biến trong huyết thanh, góp phần vào quá trình chết theo chương trình của tế bào khối u.
Exosome là các túi ngoại bào được tiết ra từ tế bào động vật có vú, có kích thước nano từ 50 đến 100 nm và được cấu tạo từ màng tế bào kép phospholipid Chúng mang nhiều loại protein và protein phối tử như ALIX, tetraspanin (CD9, CD63, CD81), integrins và các phân tử bám dính tế bào, phản ánh nguồn gốc nội sinh và giúp vận chuyển tải trọng tới tế bào mục tiêu Exosome có tính ổn định, khả năng tương thích sinh học cao, miễn dịch thấp và độc tính thấp, cho phép chúng nhắm mục tiêu các mô và cơ quan bệnh một cách hiệu quả Gần đây, các nanoparticle (NP) mô phỏng sinh học exosome đã thu hút sự chú ý như một nền tảng phân phối thuốc hiệu quả, được tạo ra qua các chu kỳ ép đùn vật lý hoặc đóng băng/tan băng lặp đi lặp lại, mặc dù điều này có thể ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của protein trên màng exosome và gây trở ngại cho liệu pháp điều trị ung thư.
Các PSiNP phát quang đã được sử dụng để tổng hợp tế bào khối u tương thích sinh học, với các PSiNP mô phỏng sinh học exosome (E-PSiNP) làm chất mang thuốc cho hóa trị liệu ung thư nhắm mục tiêu Những PSiNP này có khả năng tải thuốc xuất sắc, tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học Các PSiNP được nạp DOX có vỏ bọc exosome (DOX@E-PSiNP) cho phép phân phối nhắm mục tiêu DOX hiệu quả Trong ống nghiệm, DOX@E-PSiNP làm giảm biểu hiện protein đa kháng P-glycoprotein (P-gp), tăng cường khả năng lưu giữ nội bào và nhắm mục tiêu đến các tế bào khối u điều chỉnh bởi CD54 (ICAM1), dẫn đến sự hấp thu tế bào mạnh mẽ hơn So với DOX hoặc DOX@PSiNP miễn phí, DOX@E-PSiNP thể hiện khả năng gây độc tế bào vượt trội đối với tế bào gốc ung thư (CSC).
Sau khi tiêm tĩnh mạch, DOX @ E-PSiNP cho thấy sự tích lũy khối u được tăng cường, cùng với sự xâm nhập và hấp thu tế bào phản ứng chéo của nhiều tế bào ung thư và tế bào gốc ung thư (CSC) Kết quả là, DOX được làm giàu trong tổng số tế bào khối u và các tế bào bên, điều này có khả năng nâng cao hiệu quả chống ung thư.
Donald A Tomalia đã phát minh ra dendrimer poly (amidoamine) (PAMAM) đầu tiên vào năm 1979 và công bố tác phẩm có ảnh hưởng lớn của ông vào năm 1985 Dendrimers là loại polymer tổng hợp mới, có cấu trúc nano đại phân tử với kích thước từ 1 đến 100 nm, mang hình dạng ba chiều, phân nhánh và có độ phân tán cao, được tổng hợp qua các bước.
Cấu trúc dendrimer mang đến một chiến lược mới để hòa tan các loại thuốc không tan trong nước, với ba vị trí chính để bẫy thuốc Các vị trí này bao gồm các khoảng trống (bẫy phân tử), các điểm phân nhánh (liên kết hydro) và các nhóm bề mặt bên ngoài (tương tác điện tích) Điều này tạo ra một thuộc tính vật chứa nano độc đáo, giúp tối ưu hóa quá trình vận chuyển thuốc.
Dendrimers cung cấp một nền tảng đa trị để liên kết nhiều mục tiêu sinh học, cải thiện hiệu quả điều trị và đã được ứng dụng trong sản xuất thuốc nano cho các phương pháp điều trị kháng vi-rút và chống viêm Chúng đã được chứng minh là tăng cường khả năng thẩm thấu qua da và nhắm mục tiêu thuốc cụ thể, như indomethacin, cho các chiến lược điều trị chống viêm Trong điều trị ung thư, dendrimers là công cụ quan trọng, có khả năng tương thích sinh học cao và ít tác dụng phụ, đồng thời cải thiện khả năng hòa tan và sinh khả dụng của thuốc chống ung thư Dendrimers ghép với Trastuzumab (TZ) đã được phát triển để nâng cao hiệu quả phân phối DTX đến các tế bào ung thư vú HER2 dương tính, với khả năng nhắm mục tiêu và nội hóa tế bào cao hơn, cùng với độc tính tán huyết thấp hơn Thêm vào đó, chúng cũng ảnh hưởng đến mức độ ROS, tiềm năng màng ty thể, phân bố chu kỳ tế bào và hoạt động của caspase 3/7.
Liên hợp PAMAM-DTX-TZ đã được nghiên cứu và so sánh với DTX tự do, với mục tiêu phát triển hồ sơ điều trị hiệu quả hơn cho bệnh ung thư vú dương tính với HER2 Những phát hiện này có thể góp phần quan trọng trong việc cải thiện phương pháp điều trị cho bệnh nhân.
Liposome vận chuyển thuốc
Liposome là một công nghệ bào chế thuốc hiệu quả, nổi bật với khả năng hòa tan các khoáng chất khó tan như sắt, magie và kẽm, tăng cường hấp thu qua màng tế bào, giảm tác dụng phụ của thuốc điều trị ung thư, và cung cấp phospholipid bảo vệ dạ dày, tá tràng khỏi viêm loét Được phát minh bởi Alec Douglas Bangham vào năm 1965, liposome đã trải qua nhiều cải tiến và hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong mỹ phẩm, dược mỹ phẩm và dược phẩm Với cấu trúc hình cầu, liposome bao gồm một nhân nước ở giữa và được bao bọc bởi vỏ phospholipid nhiều lớp, đã khẳng định vai trò quan trọng trong việc phát triển các dạng thuốc nhằm nâng cao hiệu quả điều trị.
Hình 1 3: Cấu trúc của Liposome Thành phần chính của liposome
Thành phần chính của liposome bao gồm phospholipid, cholesterol và một số chất hoạt động bề mặt, có sự phù hợp sinh học cao [25]
Phospholipid chiếm tỷ lệ lớn trong cấu trúc của liposome, là loại lipid chứa phospho với cấu trúc lưỡng tính, bao gồm đầu phosphate ưa nước và đuôi hydrocarbon kỵ nước Tính lưỡng tính này giúp phospholipid tự lắp ráp trong môi trường nước, tạo thành lớp màng lipid kép, ổn định nhũ tương Là thành phần chính của màng tế bào, liposome có tính tương hợp cao với tế bào và mô Nhờ cấu trúc khép kín với một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước, phospholipid có khả năng cuộn lại thành các hạt hình cầu với lớp màng phospholipid kép.
Phospholipid trong các công thức tổng hợp có nguồn gốc tự nhiên, tổng hợp hoặc bán tổng hợp Liposome được tạo ra từ phospholipid tự nhiên thường có độ tương hợp sinh học cao hơn so với các loại liposome khác.
Sử dụng Liposome làm hệ vận chuyển thuốc trong cơ thể là một hướng đi mới, đặc biệt trong điều trị ung thư, gene và protein tái tổ hợp Công nghệ Liposome giúp vận chuyển các hoạt chất đến tế bào đích một cách chính xác, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm độc tính so với thuốc truyền thống.
Hình 1 4: Cấu trúc màng lipid của Liposome tương đồng với cấu trúc màng
Công nghệ Liposome trong điều chế dược phẩm giúp cải thiện khả năng hấp thụ của các hoạt chất kém tan, đặc biệt là sắt, vào thành ruột non, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị Việc ứng dụng công nghệ này không chỉ giúp người dùng không cảm nhận được vị tanh của kim loại mà còn giảm thiểu các triệu chứng khó chịu như ợ nóng, buồn nôn và táo bón khi sử dụng viên sắt.
Khi được đóng gói trong cấu trúc liposome, các phân tử này có khả năng tích tụ tại khối u tăng gấp 2-3 lần Thuốc trong liposome không chỉ cải thiện khả năng tuần hoàn trong máu mà còn tăng cường lắng đọng tại các khối u, bảo vệ thuốc khỏi quá trình chuyển hóa và phân phối đến các mô ung thư, đồng thời hạn chế tác động đến mô lành Liposome cũng tăng cường hấp thụ tại các cơ quan giàu đơn bào như gan, lá lách và tuyết xuơng, trong khi giảm hấp thu tại thận, cơ tim và não Để đạt được mục tiêu tại khối u, liposome cần tồn tại lâu trong tuần hoàn máu, tiếp cận khối u thông qua cơ chế thụ động và tập trung tại các mô đích Khả năng tập trung này được gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và tính lưu giữ (EPR).
Hình 1 5: Khả năng tập trung tại mô đích của Liposome dựa trên hiệu ứng
Hiệu ứng EPR (Enhanced Permeability and Retention) dựa trên sự khác biệt giữa cấu trúc mô ung thư và mô thường Các khối u thường chứa nhiều mao mạch với hình dạng bất thường và khe hở lớn, cho phép các phân tử thuốc liposome có đường kính nhỏ hơn 400 nm dễ dàng đi vào và phóng thích thuốc Trong khi đó, khe hở ở mạch máu mô bình thường có đường kính nhỏ hơn 10 nm, ngăn chặn sự thâm nhập của các phân tử thuốc, bảo vệ mô lành khỏi tác động của thuốc Nhờ đặc điểm này, các hạt nano có khả năng tích tụ tại khối u, trong khi các tế bào nội mô ở mô bình thường kết hợp chặt chẽ, ngăn cản sự khuếch tán của các hạt nano ra ngoài mạch máu.
Hình 1 6: Sự khác biệt giữa mạch máu ở mô bình thường và mô ung thư
1.3.2 Các phương pháp tổng hợp liposome vận chuyển thuốc
Phương pháp hydrate hoá màng mỏng lipid: được Alec Douglas
Phương pháp Bangham, được giới thiệu vào năm 1964, là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để tổng hợp liposome hiện nay Cơ chế của phương pháp này bao gồm việc tạo ra lớp màng phospholipid mỏng thông qua quá trình cô quay chân không, sau đó bao bọc dược chất trong quá trình hydrat hóa Dược chất ưa nước sẽ hòa tan trong dung môi nước, trong khi dược chất kỵ nước sẽ được đưa vào dung môi hữu cơ.
Tạo màng lipid: Hoà tan hỗn hợp lipid trong dung môi thích hợp, tỉ lệ 10
Để tạo thành màng mỏng lipid, cần sử dụng 20 mg lipid trong 1 ml dung môi, sau đó tiến hành bốc hơi dung môi bằng thiết bị cất quay chân không hoặc đông khô lipid Trong quá trình này, dược chất có thể được phối hợp và hòa tan vào dung môi hữu cơ cùng với các lipid, giúp dược chất liên kết hiệu quả với lipid khi dung môi được bốc hơi.
Hydrate hóa lipid là quá trình kết hợp lipid với môi trường hydrate ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, sử dụng quay tốc độ cao để tạo thành hỗn dịch liposome Môi trường hydrate hóa có thể là nước, dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch đệm như citrat, phosphat, Hepes, hoặc dung dịch đường như glucose, dextrose, sucrose, và có thể chứa muối, chất ổn định, và dược chất Để đảm bảo tính linh động trong quá trình sắp xếp hệ mang thuốc, quá trình hydrate hóa nên được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của lipid Tc khoảng 10°C, thường từ 50-60°C Thời gian hydrate hóa phụ thuộc vào loại phospholipid được sử dụng.
Phương pháp tiêm ethanol, được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng ethanol Quy trình này bao gồm việc hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol, sau đó bơm nhanh dung dịch vào môi trường nước cất hoặc hệ đệm Tris hydrochloric, kết hợp với khuấy trộn Quá trình này tạo ra các SUV có kích thước khoảng 25 nm Sau đó, siêu lọc được sử dụng để loại bỏ ethanol và tinh chế liposome Liposome thu được có kích thước nhỏ (30 - 110 nm) khá đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng dung môi ít độc hại như ethanol và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất.
Phương pháp tiêm ether là kỹ thuật hòa tan dược chất trong nước và đun cách thủy ở nhiệt độ 55 – 65 o C Các thành phần tạo màng liposome được hòa tan trong ether hoặc diethyl ether/methanol Dung dịch ether được bơm từ từ vào dung dịch nước từ phía đáy, khi ether tiếp xúc với pha nước, nó sẽ bốc hơi dưới áp suất giảm, tạo ra liposome không đồng nhất với kích thước từ 200 – 1000 nm Mặc dù phương pháp này thực hiện nhanh chóng, nhưng hiệu suất tạo liposome lại thấp, và dược chất tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của chế phẩm.
Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse-phase evaporation method) sử dụng các dung môi hữu cơ như diethyl ether hoặc hỗn hợp diethyl ether với chloroform và methanol để hòa tan phospholipid, sau đó tiến hành bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm Quá trình này tạo ra micelle đảo bằng cách thêm pha nước và siêu âm cho đến khi hình thành hệ phân tán nhũ tương nước trong dầu Các micelle đảo có cấu trúc phospholipid đơn lớp bao quanh nhân nước, và khi bốc hơi dung môi, các micelle sẽ sát nhập vào nhau, chuyển sang trạng thái gel Tiếp tục bốc hơi sẽ phá vỡ cấu trúc gel, dẫn đến sự tái sắp xếp phospholipid và hình thành liposome Phương pháp này có ưu điểm là tỷ lệ đóng gói dược chất cao, lý tưởng cho các chất có cấu trúc phân tử lớn như albumin Tuy nhiên, nhược điểm là tạo ra liposome có kích thước lớn, không đồng nhất, và yêu cầu kiểm soát dư lượng dung môi cũng như khó khăn trong việc mở rộng quy mô sản xuất.
Sau khi bào chế, liposome thường có kích thước lớn và đa lớp, do đó cần thực hiện các bước tiếp theo để giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân bằng những phương pháp phù hợp.
Phương pháp siêu âm sử dụng năng lượng siêu âm để phân chia và tái tạo liposome đa lớp kích thước lớn thành liposome đơn lớp kích thước nhỏ Thanh siêu âm mang lại hiệu quả cao cho thể tích nhỏ nhưng dễ làm nóng và có nguy cơ đưa tạp chất vào mẫu Ngược lại, bể siêu âm có khả năng xử lý lượng lớn mẫu nhưng khó kiểm soát kích thước và độ đồng nhất do các thông số siêu âm khó quản lý.
Giải phóng thuốc khỏi Endosome
1.4.1 Giới thiệu quá trình Endosome
Endosome là bào quan nội bào quan trọng trong việc vận chuyển và phân loại các phân tử mà tế bào hấp thu từ môi trường ngoại bào Quá trình hình thành endosome bắt đầu khi các phân tử như protein, lipid hoặc thuốc gắn vào thụ thể trên màng tế bào, kích hoạt nhập bào (endocytosis) Trong giai đoạn đầu, endosome sớm được hình thành từ màng tế bào với pH trung tính (khoảng 6.0–6.5) và hoạt động như trạm phân loại, nơi mà một số phân tử có thể quay trở lại màng tế bào hoặc được chuyển vào các endosome muộn.
Khi chuyển sang giai đoạn endosome muộn, các túi này di chuyển sâu vào tế bào và pH giảm xuống khoảng 5.0–6.0 Cuối cùng, endosome muộn hợp nhất với lysosome, nơi có pH rất thấp (4.5–5.0), để phân giải các phân tử ngoại lai và thải ra các thành phần không cần thiết Quá trình chuyển đổi pH trong endosome tạo ra thách thức lớn cho các hệ thống vận chuyển thuốc, vì nhiều loại thuốc có thể bị phân hủy trong môi trường axit của lysosome trước khi đến đích điều trị nội bào Do đó, phát triển các hệ thống giải phóng thuốc khỏi endosome trước khi bị phân giải là cần thiết và là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong dược học và sinh học tế bào.
1.4.2 Giới thiệu về polymer thay đổi điện tích
Polymer thay đổi điện tích (CCP) là loại polymer có khả năng điều chỉnh điện tích bề mặt khi tiếp xúc với các điều kiện pH khác nhau, đặc biệt là từ pH trung tính sang pH axit Ở pH trung tính (khoảng 7.4, như trong máu), các polymer này thường mang điện tích âm, giúp giảm thiểu tương tác không mong muốn với protein huyết thanh và hạn chế sự loại bỏ của hệ thống miễn dịch, từ đó duy trì sự ổn định trong hệ thống vận chuyển máu Khi polymer đi vào bên trong endosome, nơi có môi trường pH axit hơn, các nhóm chức trên polymer hấp thụ proton (H⁺), dẫn đến sự chuyển đổi từ điện tích âm sang điện tích dương.
Polymer PAsp(DET-Cit) là một ví dụ tiêu biểu, trong đó các nhóm chức chứa citraconic anhydride được gắn vào chuỗi bên của polymer Khi môi trường trở nên axit, citraconic anhydride sẽ thủy phân, giải phóng nhóm amino và tăng điện tích dương trên bề mặt polymer Sự thay đổi này không chỉ tăng cường tương tác với màng endosome mà còn giúp phá vỡ màng endosome, tạo điều kiện cho việc giải phóng thuốc trực tiếp vào bào tương của tế bào đích.
Polymer chuyển đổi điện tích có tiềm năng lớn trong việc vận chuyển thuốc điều trị ung thư và ứng dụng hiệu quả trong điều trị các bệnh lý cần tính chính xác cao, bao gồm điều trị gen và các bệnh tự miễn dịch.
1.4.3 Cơ chế giải phóng khỏi endosome của polymer thay đổi điện tích
Cơ chế giải phóng thuốc từ endosome của polymer phụ thuộc vào sự chuyển đổi điện tích bề mặt từ âm sang dương khi tiếp xúc với môi trường axit trong endosome Sau khi polymer được hấp thụ vào tế bào qua quá trình nhập bào, nó sẽ bị bao bọc trong các túi endosome Trong giai đoạn endosome sớm, với pH khoảng 6.0–6.5, polymer duy trì điện tích âm, giúp giảm tương tác với màng nội bào và ngăn chặn các tương tác không mong muốn với các cấu trúc khác trong tế bào.
Khi endosome chuyển sang giai đoạn muộn và pH giảm xuống khoảng 5.0–6.0, các nhóm citraconic anhydride trên polymer bắt đầu thủy phân, giải phóng nhóm amino và làm tăng điện tích dương của polymer Sự tích lũy điện tích dương trên bề mặt polymer tạo áp lực đẩy lên màng endosome, dẫn đến giãn nở và có thể gây ra lỗ hổng trong màng này Quá trình này cho phép hệ thống vận chuyển và thuốc thoát ra khỏi endosome trước khi chúng hợp nhất với lysosome, đặc biệt hữu ích cho các hoạt chất như α-mangostin, một hợp chất chống ung thư, giúp giải phóng vào môi trường bào tương mà không bị phân hủy trong môi trường axit.
Nghiên cứu của Tan et al (2018) chỉ ra rằng polymer PAsp(DET-Cit) có khả năng tạo ra sự chuyển đổi điện tích đáng kể trong môi trường axit, từ đó tăng cường khả năng phá vỡ màng endosome và giải phóng thuốc vào bào tương Khi pH giảm từ 7.4 xuống 5.0, thế zeta của hệ thống chuyển đổi từ âm sang dương, tạo ra lực đẩy mạnh mẽ với màng endosome, dẫn đến sự phá vỡ màng và giúp thuốc thoát ra ngoài Hình ảnh từ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy các hạt liposome chứa polymer PAsp(DET-Cit) có hình thái cầu ổn định trong máu, nhưng khi tiếp xúc với môi trường axit của endosome, hình thái và điện tích của chúng thay đổi, tạo điều kiện thuận lợi cho sự giải phóng thuốc.
Các nghiên cứu cho thấy polymer chuyển đổi điện tích không chỉ nâng cao hiệu quả giải phóng thuốc mà còn tăng cường tính ổn định của hệ thống vận chuyển trong tuần hoàn máu Cụ thể, tỷ lệ thuốc được giải phóng từ hệ thống PAsp(DET-Cit)–Toc đạt 80% sau 24 giờ trong môi trường endosome mô phỏng, trong khi polymer không có khả năng chuyển đổi điện tích chỉ đạt 30–40% Kết quả này chứng minh khả năng tối ưu hóa quá trình giải phóng thuốc của polymer PAsp(DET-Cit) nhờ cơ chế chuyển đổi điện tích trong môi trường axit, mở ra tiềm năng ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc hướng đích trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác.
Polymer chuyển đổi điện tích PAsp(DET-Cit) không chỉ hiệu quả trong việc giải phóng thuốc khỏi endosome mà còn đảm bảo an toàn và ổn định trong cơ thể Cơ chế chuyển đổi điện tích của polymer này giúp nâng cao hiệu quả điều trị, giảm thiểu sự phân hủy thuốc trong lysosome và bảo vệ các hoạt chất nhạy cảm khỏi enzyme tiêu hóa Nghiên cứu tiếp tục khẳng định tiềm năng của polymer trong việc cải thiện hiệu quả và an toàn cho các liệu pháp điều trị hiện đại, đặc biệt là trong các lĩnh vực yêu cầu độ chính xác cao như điều trị gen và miễn dịch.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Hình 2 1:Vỏ quả măng cụt
- Vỏ quả măng cụt được thu thập trên thị trường, có nguồn gốc Việt Nam
2.1.2 Vật liệu, hoá chất và dung môi nghiên cứu
- Các dung môi n-hexane và ethyl acetate được mua từ Thermo Fisher
Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), Chloroform (CHCl3), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), and Penicillin-Streptomycin (PS) were sourced from Sigma-Aldrich in St Louis, Missouri, USA, along with N-hydroxysuccinimide (NHS).
N,N-dimethylformamide (DMF), dicloromethane (DCM), methanol
Methanol (MeOH), diethylenetriamine (DET), and N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) were supplied by Wako Pure Chemical Industries, Ltd All other chemicals used met analytical quality standards, and polycarbonate membranes were provided by Whatman Inc The TCS SP5 AOBS confocal laser microscope was utilized for observation and evaluation.
- Tocopheryl succinate, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC), Benzyl-L-aspartate N-carboxy-anhydride (BLA–
NCA), n-butylamine, citraconic anhydride của hãng Sigma Aldrich (Hoa
Lecithin đậu nành (Lec) được chiết xuất từ hạt đậu nành, trong khi Tocopherol (Toc) được lấy từ α-mangostin của hãng Sigma Aldrich (Hoa Kỳ) Màng polycarbonate có kích thước lỗ 100 nm được cung cấp bởi Avanti® Polar Lipids (Alabaster, Mỹ) α-MG được phân lập từ vỏ măng cụt trong phòng thí nghiệm Nước cất được sử dụng từ hãng Sartorius (Đức) và màng thẩm tách có kích thước lỗ 14.000 Da cũng đến từ Sigma Aldrich (Hoa Kỳ).
- Tế bào ung thư gan (HepG2) được cung cấp bởi American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập a-Mangostin từ vỏ quả măng cụt
2.2.1.1 Xây dựng quy trình tiền xử lý nguyên liệu
Vỏ quả măng cụt Phân loại Vỏ tươi Chặt nhỏ
Hình 2 2: Sơ đồ quy trình tiền xử lý nguyên liệu
Mẫu vỏ măng cụt sau khi thu mua được xử lý để chiết tách và phân lập α - mangostin Đầu tiên, mẫu được phân loại để loại bỏ phần thối hỏng, sau đó rửa sạch và chặt thành đoạn 3-5cm Tiếp theo, mẫu được sấy khô qua hai giai đoạn: sấy diệt men ở 110°C trong 15 phút, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 60 ± 5°C cho đến khi hàm ẩm dưới 10% Cuối cùng, mẫu khô được nghiền bằng máy nghiền với đường kính lỗ sàng 0.3 mm, thu được bột nguyên liệu rễ cây cơm rượu trái hẹp, sau đó được chiết tách để thu α - mangostin.
2.2.1.2 Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập hợp chất a-Mangostin
Hình 2 3: Sơ đồ quy trình chiết xuất, phân lập hợp chất a-Mangostin
Bột vỏ măng cụt được chiết xuất để phân lập hợp chất α-Mangostin bằng cách sử dụng 100g bột nguyên liệu với dung môi ethanol 96% Sau khi chiết xuất, dịch chiết được cô quay để thu được cao chiết, hàm lượng α-Mangostin được kiểm tra bằng HPLC nhằm đánh giá hiệu quả chiết xuất và tối ưu hóa các thông số công nghệ Cao chiết được hòa tan với nước và chiết phân bố bằng EtOAc, sau đó thu lấy pha hữu cơ và cô quay ở áp suất giảm để thu được cao chiết EtOAc Tiến hành sắc ký cột gradient với hệ dung môi n-hexan/EtOAc (90/1, v/v) và kiểm tra bằng TLC cho đến khi không còn vệt α-Mangostin trên cột Các phân đoạn chứa α-Mangostin được gom lại và tiếp tục sắc ký cột lần 2 với hệ đẳng dung môi n-hexan/EtOAc (4/1), sau đó cô quay để thu được hỗn hợp chứa α-Mangostin.
Mangostin thô Hỗn hợp này được kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan/EtOAC
2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết xuất α-Mangostin
Các thông số công nghệ như nhiệt độ chiết xuất, công suất siêu âm, thời gian chiết xuất và tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu sẽ được khảo sát đơn biến Việc đánh giá và lựa chọn điều kiện phù hợp sẽ dựa trên hàm lượng α-mangostin (%) trong cao chiết và hiệu suất thu hồi cao chiết (%).
- Độ thu hồi α-Mangostin được tính bằng công thức: Độ thu hồi α-Mangostin = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 α−𝑀𝑎𝑛𝑔𝑜𝑠𝑡𝑖𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡
- Hiệu suất chiết cao toàn phần được xác định bằng công thức:
Hiệu suất chiết = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡 𝑡ℎ𝑢 đượ𝑐
Bằng kinh nghiệm chiết xuất các loại dược liệu Ban đầu chúng tôi lựa chọn điểm gốc cho các yếu tố công nghệ như sau:
+ Thời gian chiết xuất: 240 phút
+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 6/1
+ Công suất siêu âm 2,5 w/cm 3
Khi khảo sát sự phụ thuộc của từng biến độc lập, các biến còn lại sẽ được giữ cố định ở mức gốc hoặc mức tối ưu từ các khảo sát trước đó.
2.2.1.4 Xác định a-Mangostin bằng các phương pháp phổ
Các hợp chất sau khi được phân lập sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và đối chiếu với tài liệu tham khảo Trong phổ 1H-NMR, mỗi loại proton cộng hưởng ở các trường khác nhau, từ đó độ dịch chuyển hóa học của các proton cho phép xác định loại và số lượng proton của mỗi loại.
Phổ carbon 13 C-NMR cho phép phân tích từng nguyên tử cacbon trong hợp chất, với mỗi nguyên tử tạo ra tín hiệu phổ riêng biệt Điều này giúp xác định các loại cacbon và cung cấp thông tin về bộ khung cacbon của hợp chất Độ dịch chuyển hóa học trong phổ cũng cho biết loại nhóm chức có mặt.
2.2.2 Tổng hợp Polymer thay đổi điện tích
2.2.2.1 Tổng hợp N- Succinimidyl Tocopheryl Succinate
Tocopheryl succinate (1,74 g, 3,28 mmol) được kết hợp với N-hydroxysuccinimide (NHS) (0,38 g, 3,28 mmol) và xúc tác 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) (0,64 g, 3,38 mmol) trong 50 ml dung môi dichloromethane (DCM) Hỗn hợp được khuấy trong môi trường khí argon trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Sau phản ứng, dung dịch được rửa bằng 100 ml nước cất trước khi chiết pha hữu cơ, sử dụng dung môi DCM, thực hiện hai lần chiết ngược mỗi lần 50 ml Sau khi lọc, pha hữu cơ được làm khô bằng MgSO4 và cô đặc bằng phương pháp bay hơi, thu được gel màu vàng (1,9 g, hiệu suất 91%) Sản phẩm N-succinimidyl tocopheryl succinate được xác minh bằng phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc và tỷ lệ chuyển đổi của nhóm carboxyl.
2.2.2.2 Tổng hợp Poly(β-benzyl L-aspartate) (PBLA) n-Butylamine được sử dụng để trùng hợp mở vòng benzyl-L-aspartate N- carboxyanhydride (BLA–NCA), dẫn đến sự tổng hợp poly(β-benzyl L-aspartate) (PBLA) BLA–NCA (2,49 g, 10 mmol) được cân và bảo quản trong túi argon để tránh tiếp xúc với nước, sau đó được hòa tan trong hỗn hợp Dimethylformamide (DMF) (10,0 mL) và dichloromethane (DCM) (100 mL) ở 40°C Dung môi DCM được sử dụng để pha loãng n-butylamine (14,6 mg, 200 mmol) trước khi thêm vào dung dịch BLA–NCA Phản ứng trùng hợp được tiến hành trong 48 giờ ở 40°C dưới môi trường argon
Sau khi phản ứng hoàn tất, sản phẩm được tinh chế bằng cách kết tủa ba lần trong diethyl ether và sau đó lọc trước khi đông khô bằng benzen Để kiểm tra độ tinh khiết và xác định mức độ polymer hóa của PBLA, phương pháp phổ ¹H-NMR được sử dụng.
2.2.2.3 Tổng hợp Poly(β-benzyl L-aspartate) Tocopherol ( PPLA -Toc)
Sự liên hợp của nhóm kỵ nước α–tocopherol vào đầu mạch của poly(β-benzyl L-aspartate) (PBLA) được thực hiện thông qua phản ứng với axit tocopheryl succinate kích hoạt bằng N-hydroxysuccinimide PBLA đông khô (DP = 20; m = 150 mg, 0,0375 mmol) được hòa tan trong 10 mL dicloromethane (DCM), sau đó thêm vào 50 lần lượng N-succinimidyl tocopheryl succinate (1,2 mg, 1,875 mmol) hòa tan trong 7 mL DCM Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ dưới áp suất argon Sản phẩm thu được bằng cách kết tủa trong 300 mL diethyl ether, sau đó đông khô để tạo thành bột trắng (167,2 mg, hiệu suất 98%) Sản phẩm PBLA–Toc được xác định bằng phổ 1H NMR để kiểm tra sự hình thành của liên kết amide.
2.2.2.4 Tổng hợp Pasp(DET)-Toc
Phản ứng aminolysis của poly(β-benzyl L-aspartate) (PBLA) với diethylenetriamine (DET) được thực hiện trong điều kiện khan và trung bình nhằm đưa các nhóm amin vào mạch nhánh của PBLA PBLA-Toc đã được đông khô với độ polyme hóa (DP) là 20, khối lượng 150 mg tương đương 0,65 mmol benzyl-L-aspartate (BLA), sau đó hòa tan trong 10 mL N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) để tạo thành dung dịch A DET được sử dụng với thể tích 3,5 mL và nồng độ 32,5 mmol.
Dung dịch BLA được pha loãng trong NMP (5 mL) và làm lạnh xuống 4°C trước khi nhỏ giọt dung dịch A vào dung dịch B Hỗn hợp này được khuấy ở 4°C trong 4 giờ, sau đó dung dịch thu được được trung hòa dần bằng HCl 0,5 N, sử dụng hỗn hợp muối và đá để kiểm soát nhiệt độ dưới 2°C Dung dịch trung hòa được thẩm tách qua dung dịch axit hydrochloric 0,01 N (4 lần) và nước cất (1 lần) Cuối cùng, bột trắng PAsp(DET)–Toc được thu dưới dạng muối hydrochloride sau khi đông khô và được kiểm tra bằng phổ ạH NMR để xác định sự hình thành thành phẩm.
2.2.2.5 Tổng hợp PAsp(DET-Cit)–Toc
PBLA (DP = 20, m = 50 mg, 0,22 mmol Asp(DET)) được hòa tan trong 450 mL dung dịch đệm NaHCO₃ 0,5 M (pH = 8,92) Cis-aconitic anhydride (m = 1,75 g, 11,1 mmol, tương đương gấp 50 lần Asp(DET)) được thêm từ từ vào dung dịch này Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 4°C trong 4 giờ Cuối cùng, dung dịch được tinh chế 3 lần bằng nước cất qua các đơn vị lọc Amicon Ultra (MWCO = 3000; Millipore).
Tại Billerica, MA, USA, sản phẩm thu được sau quá trình đông khô là bột trắng với khối lượng 67 mg và hiệu suất đạt 78% Sự hình thành thành công của PAsp(DET-Cit)–Toc đã được xác minh thông qua phổ 1H-NMR và phân tích kích thước hạt bằng phương pháp Dynamic Light Scattering (DLS).
2.2.3 Tổng hợp liposome chứa a -Mangostin có CCP
2.2.3.1 Tổng hợp Liposome chứa a-Mangostin có CPP
Quy trình chế tạo liposome α-mangostin tải CCP (CCP–liposome) sử dụng phương pháp hydrat hóa màng phim kết hợp với đùn (extrusion) Đầu tiên, chuẩn bị dung dịch bao gồm 0.3 mL PAsp(DET-Cit)–Toc 0.01 M, 2.5 mL DOPC 0.025 M và 1 mL α-mangostin 0.02 M trong chloroform Hỗn hợp được khuấy đều trong 2 phút và sau đó bay hơi trên Rotavapor R-100 ở 40°C, áp suất 250 mBar Tiếp theo, thêm 3 mL nước cất vào hỗn hợp và siêu âm ở 40°C trong 30 giây để tạo thành huyền phù chứa CCP–liposome α-mangostin Cuối cùng, thực hiện quá trình thẩm tách (MWCO = 14.000 Da, 2 L nước cất, 24 giờ) để loại bỏ α-mangostin tự do không được bao gói.