Nghiên cứu thành phần hóa học và Đánh giá hoạt tính kháng viêm của cây dây quai bị (tetrastigma strumarum (planch ) gagnep ) Ở việt nam

Hơn nữa, các nghiên cứu về cây Dây quai bi Tetrastigma strumarium 6 Viét Nam hầu như mới chỉ tập trung vào khía cạnh nhận biết, liệt kê, mô tả hoặc tổng kết kinh nghiệm sử dụng trong dân

KHOA HOC VA CONG NGHE VN

HOC VIEN KHOA HOC VA CONG NGHE

Dinh Duy Hung

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC VA DANH GIA HOAT TINH KHANGVIEM CUA CAY DAY QUAI BI (TESTRATIGMA

STRUMARIUM (PLANCH.)GAGNEP.) O VIET NAM

LUAN VAN THAC Si HOA HUU CO

Hà Nội - 2024

BO GIAO DUC VA DAO TAO VIEN HAN LAM

KHOA HOC VA CONG NGHE VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Dinh Duy Hung

NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HOÁ HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TINH KHANG VIEM CUA CAY DAY QUAI BI (TESTRATIGMA

STRUMARIUM(PLANCH.)GAGNEP.) O VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỮU CƠ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên

cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên

cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất Đông thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bắt cứ một nghiên cứu

nào Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn foàn chịm trách nhiệm

Tác giả

Dinh Duy Hung

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện

- Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam -

Tôi xin bày tỏ lời cắm ơn sâu sắc và kính trọng nhất tới TS Đỗ Tiến Lâm va TS

Phan Tứ Quý đã tận tâm hướng dân chỉ dạy cho tôi về mặt chuyên môn, và tạo

mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ và Viện Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi trong quá trình học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn

bè, đồng nghiệp cơ quan và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin tran trong cam on!

ĐẶT VẤN ĐÈ

CHUONG 1 TONG QUAN NGHIEN CỨU c-c-ece.eeecerereree 3

1.1 Đặc điểm thực vật và công dụng của các thực vật chi Tetrastigma

1.1.1 Đặc điểm thực vật

1.1.2 Công dụng - eeerreriieriirrrririreririirrirrririiirirrree 3 1.2 Thành phần hóa học của các thực vật chỉ 7efrasfig1d 4

1.3 Hoạt tính sinh học .- s«-<<eseeeseeeeeeeeeserssrsrsesersersersrnseseeseee 19

1.3.1 Hoạt tính chống ung thư -ccc5ccccvvvveerrrrrrrtrrrrrrrrrrrrrrir 19

1.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa stseeeeirrrrrrrrrrreee TỢ

1.3.3 Hoạt tính kháng viêm và giảm đau -cccceeseeererrrerre 20

1.3.4 Hoạt tính bảo vệ gan -. i-ccxccetseserrierierrrrrrrirriiieirrrrie 20 13.5 Hoạt tính chẳng tiểu đƯỜNg ccscsscacccacacsccsarscssssssossurvevecrssvercsscersvvencecses 21

1.3.6 Hoạt tính kháng virus

1:37 Hogtitiihi KHẢ cá oseesikniiAeLi10811004206111005100384213234120035831001n03A 22

1.4 Giới thiệu về Dây Quai bị sessessascoscacssescssesssssseooscnuvansnsnsenseonssnunnsesccenannpenes 22

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

'VÀ THỰC NGHIỆM 2-cccteteteteE 000.0 0 0 24 2.1 Đối tượng HgHiỆU CỨU-ssseseieE2 Hinh nHHÀ 4844444840810 gghdghH ghe 24

2.2 Phương pháp nghiên CỨu - -s s«esssceseesertereeresrererreersrdae 24

32.1 Phương pháp chiết xuất 2400104000100 000 0n 01001010106 24 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chắt - Ônggagoasal 24

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 20 2.2.5 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in Viir0 -. -. -2Õ 2.3 Thực nghiỆm «‹-<csecsesesesareieere

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết từ dây quai b

2.3.2 Phân lập và tinh chế các chất từ cặn ethyl acetate của dây quai bị 27

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN . -«-e-+ 29 3.1 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong đây quai bị 29

8,1,1 Các hợp chấtflayodoli ceec há ng ng go da nã 4h g4 I 29 3.2.2 Hợp chất triterpenoid: fagarasterol (Ä) - -c-ccccveevee 35 3.2.3 Hợp chất steroid: daucosterol (5) -+ csccccrevrrrrerrrrrrri 4I

3.2 Kết quả về thử hoạt tính Chống 0x1 OA sasesssssssscasasssssenecrsnnccccousssncsccrnesioss 45 3.3 Kết quá về thử hoạt tính kháng viêm -ccesc -steeterer 43 KẾT THẢ Nền Ben htện ty HE HhyÐ Hình Anh DHANHeekưanH.1Tmmeaesinihannren 49

400.1700088 50

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BÓ ccccceceekerrrrrrrer 51 TÀI LIỆU THAM KHAO ccsssssssssssssccesseseecsssssssmnnnnsencsconnensnnsncnssessssnssssenseee 52

Bảng 1.1 Ténva nguồn gốc của các hợp chất được phân lập từ chỉ 7e/rastigrma 14

Bảng 3.1 Số liệu phổ 'H- và '8C-NMR của 3 và tham khảo - 30 Bảng 3.2 Các số liệu phổ !H- và 'C-NMR của 6 và tham khảo - 32 Bảng 3.3 Số liệu phổ !H- và '3C-NMR của 4 và tham khảo

Bảng 3.4 Số liệu phổ 'H- và 'C-NMR của 2 và tham khảo - 34 Bang 3.5 Số liệu phổ 'H- và 'C-NMR của 1 và tham khảo 36 Bảng 3.6 Số liệu phổ 'H- và '3C-NMR của 5 và tham khảo 41 Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính chéng oxi héa in vitro cla cay Day quai bi 43 Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng viém in vitro của cây Dây quai bị 46

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây Dây Quai bị ăeeeeeeiiirrriiiiiiiiiiiiiereeeee 27

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chat tir cn ethyl acetate ctia day quai bi .30 Hình 3.1 Câu trúc hóa học và tương tác HMBC (H—>C) chính của 3 34 Hình 3.2 Phỗ ESI-MS của 3

#Phji 33: PHẾ TH-NNMIR DŨI Ô sang Dhggg2naF ga nnờn

ii 3:4: Phố ŠC-NMIR:GGỖA73: e esesaeiDiiicE.tDDGNG228010ng3HA.ĐHGUĐ0B80 36 Hình 3.5 Phố HMBC của 3 ảcoocccccccceeerrrrrrrrrtrrrirrrrirrrrrrrrrrier 36 Từng dối Phẩ HS Q CŨ Ã con gi dd ng ng ng RHDR2 H3 pH AC nghhe, 37

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC (HC) chính của 4 37 Hình 3.8 Phổ !IH-NMR của Á c c-ccccceesrteereetttttrrrrrrrrrrrrrrrrrre 38 Tiình:3.0 Phố SŒNMN GÌ Go cong Rg thang ghi ng g3 ha va HAI gà 38 Hình 3.10 Phổ DEPT của 4

Hình 3.11 Câu trúc hóa học và tương tác HMBC (HC) chính của 6

Hinh3.12) PhO FENMR cũ Š ooesssekiodibbGiG8:c0sxg0g8308H8.Agtunape 41 Hirth 3.13 PA& !3C-NMR C110 6 sesssssessssessnssssscessssessssssssseescsnecessssnecssnneccessnneessanee 41 itil 3.14, PRG DEPT GIÁ G wxinssssssscszsepsessevvvusssosnsscsssscsensvseasovvcescesvensnnsssseevsentees 42 i03 TũI TPhẩ HD của §uinauniaaoniililiSSUASS40G01AG0G82101080086:.088 42 Hình 3.16, PhO HSOC của 6 : cccccccccccctcSSSSxtttttrtrrttrrrrrtrrtrrrrrrrrrrr 43 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC (H->C) chính của 2 44 Hình 3.18 Phố 'H-NMR của 2

Hình 3.27 PRE HMBC Citar oaascscscascccascoseansvesassensvissesnvvsvsvasssaninevesscassonecevessasees 48 Hình 3.28 Phé HSQC cia 1

Hình 3.29 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC (H¬>C) chính của 5

0i 3:30 PHẾ THNMRLĐÒN Ễ thun thai Ghi th À0 HgHg£nggggEE3248822.8.2u646 50 Hình 3.31 Phễ !3C-NMR của 5 co cnnrihhhhrrrrriiiirrirrrriee 50 Hình 3.32 PhO DEPT của 5 - cccccc nhe 51 Tình 3:33 Phỗ HMEBC GŨA Ấ: os5661606 025D 001005 0114 c.a ng Gia ggngieggsnag 51 Hirnh 3.34 PhO HSQC clita 5.csssscscsscscsssssssssssnesescessessnneesseessssssnieeeesssssseesseeessssss 52 Hinh 3.35, Hoat tinh chéng oxi héa in vitro của cây Dây quai bị 52 Hình 3.36 Hoạt tính kháng viêm ïn viro của cây Dây quai bị 55

DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU CAI VIET TAT

NMR Nuclear Magnetic Phô cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance

TH-NMR Proton Nuclear Magnetic Phô cộng hưởng từ hạt nhân

BC-NMR Carbon 13- Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Spectroscopy

Enhancement by Polarisation Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Phô tương tác di hạt nhân qua

Bond Correlation nhiều liên kết H-C

HSQC Heteronuclear Single Phố tương tác di hạt nhân trực

MeOH Methanol Methanol

ồn Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của

ĐẶT VẤN ĐÈ

Viêm rất phổ biến ở Việt Nam cững như trên thế giới Viêm là một phản

ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công của một tác nhân bên ngoài

(như vi sinh vật, tác nhân hóa, lý ) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu

máu cục bộ, bệnh tự miễn) Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng,

nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương

Khi tình trạng viêm kéo dài sẽ có thể trở thành viêm mạn tính Các yếu tố tham

gia quá trình viêm như: đại thực bào, nhan kappa B (NF-«B) va nitric oxide (NO)

là một phân tử tín hiệu đóng vai trò quan trọng liên quan đến đáp ứng miễn dich

bởi các đại thực bào kích hoạt cytokine Ức chế sản sinh NO là sự tiến bộ quan trọng trong điều trị các bệnh viêm như: viêm gan; ruột thừa, đại tràng, niêm mạc

dạ dày, viêm não, viêm phỏi, Viêm được điều trị bằng thuốc kháng viêm có và không có steroid, nhưng chúng có tác dụng phụ không tốt đến nhiều cơ quan trên

được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác nhau Đặc biệt là Dây quai bị

(Tetrastigma strumarium) chita quai bi, trang nhac, gãy xương, nhọt mủ, viêm tai

gitta Theo y học hiện đại, các loài thuộc chỉ Tứ thư đã được chứng minh có hoạt

tính sinh học vô cùng phong phú đa dạng như làm bền thành mạch, chống độc,

làm giảm thương tốn gan, kháng viêm, chống oxi hoá, virus và ung thư Điều

đó cho biết một số thực vật chỉ Tir thu (Tetrastigma) và Dây quai bị (Tetrastigma strumarium) cé tac dung khang viém tốt Hơn nữa, các nghiên cứu về cây Dây quai bi (Tetrastigma strumarium) 6 Viét Nam hầu như mới chỉ tập trung vào khía

cạnh nhận biết, liệt kê, mô tả hoặc tổng kết kinh nghiệm sử dụng trong dân gian

mả chưa có các nghiên cứu về cả hóa học và hoạt tính sinh học, đặc biệt hoạt tính

kháng viêm và ung thư Đây cũng là lý do đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học

và đánh giá hoạt tính kháng viêm của cây dây quai bị (7e(rasfigima strumarium

2 (Planch.) Gagnep.) ở Việt Nam” được lựa chọn nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt

chất có hoạt tính tốt, góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khoẻ cộng đồng

Mục đích nghiên cứu

~ Phân lập và xác định cấu trúc 3-4 hợp chất sạch từ phần trên mat dat day quai bi (Tetrastigma strumarium) 6 Viet Nam

- Danh gid hoat tinh khang viém in vitro cha cdc can chiét va chat sach phan

lập được từ cây dây quai bi (Tetrastigma strumarium)

Nội dung nghiên cứu

- Thu và xử lý mẫu dây quai bi (Zetrastigma strumarium)

- Tiến hành chiết tách phân lập các chất sạch bằng những phương pháp

thích hợp

- Ghi phổ, xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng các phương pháp:

MS, NMR

- Thử hoạt tính kháng viêm in vitro cha cdc cin chiết và chất sạch phân lập

được cây dây quai bị (7efrastigima sirumarium)

Những đóng góp mới của luận văn

Lần đầu tiên, đã phân lập và nhận dạng được 06 hợp chất sạch từ dịch chiết ethyl acetate của bị quai bị (?erastigma strumarium), bao gồm 4 hợp chất

flavonoid: Rhamnolutein (2), epicatechol (3), sophoretin (4) va (2R,35)-

3,5,7,3',5'-pentahydroxyflavanone 3-rhamnoside (6); 1 hop chat triterpenoid:

fagarasterol (1) va 1 hop chat steroid: f-sitosterol-3-O-f-D-glucopyranoside (5)

Lần đầu tiên đã đánh giá hoạt tính tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RA W264.7và chống oxi hóa theo phương pháp DPPH của cao chiết và các chất sạch phân lập được từ thân lá Dây quai bị (Tetrastigma sírumarium) ở Việt Nam Trong đó, Cao tổng (TS) thể hiện hoạt tính kháng viêm và chống oxi héa in vitro tốt với giá trị ICso là 21,3 g/ml và SCsọ

là 35,11 ug/ml Cao chiết phân doan, cao ethyl acetate (TSE) thé hién hoat tinh

khang viém va chống oxi hóa im vifro tốt nhất với giá trị ICao là 9,6 wg/ml va SCso

14 21,7 ug/ml Hop chat (22,35)-3,5,7,3',5'-pentahydroxyflavanone 3-rhamnoside (6) có khả năng ức chế sản sinh NO mạnh và không gây độc cho cho tế bào tốt

nhất với ICso là 45,28 g/ml và hợp chất sophoretin (4) thể hiện được hoạt tính

chống oxi hóa tốt nhất với giá trị SCso la 12,46 ug/ml

CHUONG 1 TONG QUAN NGHIEN CUU

Chỉ 7e/rastigma thuộc họ Vitaceae có nhiều giá trị về kinh tế, với hơn 100

loài, phân bố rộng rãi khắp châu Á và châu Đại Dương [1,2,3] Trong đó, có 45 loài đặc hữu của Trung Quốc, chủ yếu được tìm thấy ở Quảng Đông, Vân Nam

và Quảng Tây [3,4] Ở Việt Nam, chi Tetrastigma gồm có 39 loài, trong số đó có

11 loài đặc hữu [5-8] Chỉ 7efrastigma có thành phần hóa học rất thú vị và tác

dụng được học tốt, có tiềm năng làm thực phẩm và phát triển thành các loại thuốc

là hình cầu, bầu dục, chứa từ 1 đến 4 hạt [9,10]

1.1.2 Công dụng

Tại Trung Quốc, trong y học cổ truyền, nhiều loài 7efras/igma đã được sử

dụng làm thuốc để điều trị các bệnh khác nhau như 72/stigima hemsleyanum

được sử dụng trong bài thuốc “Sanyeqing”, Tetrastigma hypoglaucum duge sử

dung trong bài thuốc “Wuzhua/inlong”, và Tetrastigma obtectum duge sit dung

trong bai thuéc “YanwuJia” Loai 7: hemsleyanum thường sử dụng rễ hoặc cả cây

làm thuốc, có tác dụng bảo vệ gan, giải nhiệt, khu phong, tăng cường tuần hoàn

máu và giảm đau Loài 7 #goglaueum được ghi chép trong Dược điển Trung Quốc Rễ hoặc cả cây có thể được sử dụng làm thuốc và nó có vị đắng Loài 7 planicaule là một trong 108 loại được liệu cổ Trung Quốc Toàn bộ cây được sử dụng làm thuốc và nó có vị cay và tính ấm, có tác dụng trừ cảm mạo, tăng cường tuần hoàn máu, bổ gân xương Loài 7: oblectum duge ghi chép trong Si Chuan Zhong Yao Zhi (mét tir dién y hoc Trung Quốc) Rễ hoặc cả cây có thể được sử

4

dụng làm thuốc và nó có tính ấm, vị cay và không độc, có tác dụng trừ cảm mạo

và đào thải độc Trong số 100 loài Tetrastigma được xác định, chỉ có năm loài

được sử dụng trong y học cỗ truyền Trung Quốc Trong đó, 7: hemsleyanum là loài được sử dụng và nghiên cứu rộng rãi nhất [11]

Nhiều loài chỉ 7easiigma được sử dụng trong y học dân tộc Việt Nam, với nhiều tác dụng khác nhau như 7eirasfigrna rupestris được sử dụng để điều trị sau khi sinh; ?e#astigma planicaule giúp giảm đau lưng và đau đầu gối, Tetrastigma strumarium gitp ha sốt và giảm đau đầu; 7efrastigma lanceolarium được sử dụng để chữa trị sưng mủ; 7eírastigma obtectum dùng để giảm đau đầu

và lành vết thương; 72østigma erubescens điều trị cham va dau da day;

Tetrastigma tubereulatum được sử dụng chữa rắn cắn; Tetrastigma yunnanensis dùng chữa đau khớp và xương, và 7efrastigina retinervium được sử dụng như biện

pháp phòng ngừa sảy thai [5-10]

1.2 Thành phần hóa học của các thực vật chỉ Tetrastigma Đến nay, các nhà hóa học đã phân lập và nhận dạng được 248 hợp chất từ

nam loai thuéc chi Tetrastigma, bao gồm Tetrastigma hemsleyanum, Teirastigima

hypoglaucum, Tetrastigma obtectum, Tetrastigma planicaule va Tetrastigma

erubescens [12,13] Những hợp chất này thuộc về nhiều lớp khác nhau, bao gồm

flavonoid và flavonoid glycoside, saccharide, terpenoid, sferoid,

phenylpropanoid, alkaloid va céc hop chất khác Trong số này, flavonoid và

flavonoid glycoside 1a thanh phần chính trong chi Tetrastigma [14]

1.2.1 Flavonoid

Elavonoid là những thành phần hóa học chính và đặc trưng của chỉ Tetrastigma Cho dén nay, đã có hơn 70 flavonoid được phân lập từ chỉ này và hầu hết chúng là các hợp chất flavonoid glycoside [15] Dựa vào cấu trúc, chúng

có thể được chia thành bến loại: flavone, flavonol, flavanone, và flavan-3-ol

Aglycone của những flavonoid này chủ yếu là kaempferol, apigenin, orientin, vitexin, isorhamnetin và sophoretin Hầu hết các đơn vị đường của flavonoid glycoside là glucose, rhamnose và xylose, thường được gắn ở vị trí C-3, C-6, C-7

hoặc C-§ Hơn nữa, có các nhóm thế chứa oxy tại C-7, chẳng hạn như -OH, -

OCH; hoặc glycosyl trong hầu hết các flavonoid glycoside

Đến nay, đã có 38 hợp chất flavone và glycoside của chúng được báo cáo

từ chỉ 7efrastigma Đặc điểm của những hợp chất này thường là có các nhóm

hydroxyl tại C-5 và C-7, và các aglycone chủ yêu là apigenin, orientin, vitexin và

isorhamnetin Hơn nữa, dãy hợp chất này chủ yếu là flavone carbon ølycoside với don vi glycosyl kết nối tại C-6 hoặc C-8 Các hợp chat Apigenin-6-C-a-L-

rhmnnopyranosyl-(1-4)-z-L-arabinopymnoside và apigenin-8-C-a-L-

rhmnnopyranosyl-(1-4)- œ-L-arabinopymnoside đã được phân lập từ loài 7

hemsleyanum [16-18] Đã có 24 hợp chất flavonol và ølycoside của chúng được

phân lập từ chỉ này, chủ yếu được tim thấy ở loài T hemsleyanum, voi cấu trúc mono-O-glycoside va di-O-glycoside, va cac glycosyl gắn tại C-3 hoặc C-7

Aglycone chủ yếu là kaempferol va sophoretin, Có các nhóm thế chứa oxy: -OH

va -OCH; tai C-3’ va C-4’

Ngoài các flavonoid và flavonol, còn có mười hợp chất thuộc các nhóm khác nhau, gồm 1 đihydrochalcone, 2 flavanone, và 8 flavan-3-ol Các hợp chất được phân lập từ 7 hemsleyanum là các dẫn xuất flavan-3-ol tannin [19]

T hemsleyanum có độ tình khiết cao với khối lượng phân tử 1244,2 kDa chủ yếu bao gồm bốn loại monosaccharide là arabinose, galacturonic acid, galactose và fructose [21] Polysaccharide TTP-1 duge phan lap tir tễ loài 7: hemsleyanum v6i

trọng lượng phân tử trung bình là 478,33 kDa, được tạo thanh tir 38,91% mannose, 14,87% glucuronic acid, 1,31% galacturonic acid, 42,81% galactose va 2,1%

arabinose [22,23] M6t polysaccharide mdi có tên là TDGP-3 được phân lập từ lá của loài 7: hemsleyanum với trọng lượng phân tử 3,31x105 Da, gồm các liên kết

1,4-Glep, 1,4-Glap và 1,3,6-Manp trong chuỗi chính Trong khi đó, một

polysaccharide mới có tên là THDP-3 [24] được tìm thấy trong lá mía của 7: hemsleyanum với trọng lượng phân tử 77,98 kDa gồm các loại rhamnose, arabinose, mannose, glucose va galactose Mét polysaccharide tan trong nước có tên THP [25] với trọng lượng phân tử 93307 Da bao gồm các loại rhamnose,

arabinose, mannose, glucose, galactose là một polysaccharide được phân lập từ

8 phan than ctia 7 hemsleyanum véi trong lugng phan tử trung bình 66,2 kDa gồm

các loai galacturonic acid, glucose, mannose, arabinose, galactose va rhamnose

Một sesquiterpen và 4 monoterpen được phân lập từ 7 #emsleyanum Đặc biệt,

còn có 2 norisoprenoid được tìm thấy trong thân của 7: erubescens [27,28]

Steroid là một nhóm chất sinh học khác được tìm thấy trong các loài chỉ Tetrastigma Steroid là các chất chuyển hóa thứ cấp được tạo thành bởi vòng

cyclopentano-perhydrophenthrene với bốn hệ vòng (6/6/6/5) trong khung cơ bản

của chúng Đến nay, đã xác định được 19 steroid trong chỉ Tetrastigma, chủ yêu được tìm thây ở loài 7: planicaule và T hemsleyanum [28]

10

1.2.5 Phenylpropanoid

Hiện nay, đã phân lập và xác định cầu trúc hóa học của 21 phenylpropanoid

từ các loài 7efrasfigma Dựa trên đặc điểm cấu trúc, chúng có thể được chia thành

hai loại: coumarin và lignan Trong đó, 2 coumarin và | lignan da duoc phan lập

từ thân loài 7; er„bescens, 2 coumarin da được phân lập từ than loai 7 planicaule

Ngoài ra, hầu hết các phenylpropanoid được tìm thấy ở loài 7: hemsleyanum, va

là các đồng đẳng và dẫn xuất của chlorogenic acid [29]

được báo cáo từ chỉ này, gồm 9 alkaloid indole va 5 alkaloid khac Alkaloid

indole: tetrastigmindole A va tetrastigmindole B 1a cac chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ loai 7 obtectum Ngoai ra, 7 alkaloid indole, 1 amide, 1

maleimide va | carboline được phân lập từ loài 7: hemsleyanum, và chúng là các

alkaloid duoc phân lập 14n dau tién tir chi Tetrastigma [30]

12

1.2.7 Hợp chất khác

Các hợp chất aliphatic, phenolic acid và các hợp chất khác cũng xuất hiện

phong phú trong chi nay

Nonadeca-9, 12, 15-Trienoic Acid Arachidic acid

9

Dotriacontanoic acid

Lignoceric acid 9,12,15-Eicosatrienoic acid

SSPE PLP Gy okey XS ——————i„

Margaric acid aproie aoldi Pentadecylic acid

34 Taraxerone T planicaule | Canh leo

35 Taraxerol T hemsleyanum — vn mặt đât

46 Ergosterol # Steroid T hemsleyanum Phân trên eee mặt đất

54 Bergenin T erubescens Than

55 1-Caffeoylquinic acid

56 | 5-p-Coumaroylquinic acid Phan trén

58 | Cryptochlorogenic acid

59 | Coumaroylquinic acid l

60 Feruloylquinic acid enylpropanoi a

61 Chlorogenic acid T hemsleyanum | Phan 6

70 | Indole-3-propanoic acid Alkaloid 1 hemsleyanum ak đất

enoic acid

92 | Glyceryl monopalmitate T planicaule | Canh leo

96 Pentacosane ‘ : dat

98 Tricosanol TZ planicaule |Toan cay

18

117 Vanillic acid

118 Syringic acid

119 Catechol 120| Protocatechualdehyde

T hemsleyanum | Toàn cây

1.3 Hoạt tính sinh học

Một số loài chỉ 7etrasigma đã được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau, bao gồm viêm phổi, viêm thận, viêm gan,

thấp khớp, đau khớp, bầm dập, viêm nhiễm, sốt, rắn cắn, Các thuộc tính được

lý hiện đại của các loài 7easfigma như kháng viêm, chống nhiễm trùng và giảm đau, đã góp phần làm sáng tô việc sử dụng chúng trong y học cổ truyền

1.3.1 Hoạt tính chỗng ung thư

Hợp chất apigenin được phân lập từ 7: hemsleyanum thé hiện hoạt tính gây

độc đối với tế bào ung thư HepG2 (gan), HCT-8 (dai trang) va A549 (nang biểu

mô phổi) với giá trị ICso lần lượt là 73,16; 45,04 va 48,66 pg/ml Ø-sitosterol và

oleanolic acid tir 7 hemsleyanum da thé hién hoat tinh gây độc mạnh đối với dong

tế bào Hela 229 (tế bào ung thư cổ tử cung) với gia tri ICso lần lượt là 40,78 và 25,69 ug/ml Hơn nữa, oleanolic acid thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với dòng tế bào A375 (tế bảo ung thư đa) với giá trị ICso là 69,87 ng/ml Hợp chất resveratrol va kaempferol đã thể hiện hoạt tính chống ung thư đáng kể với giá trị

ICzo lần lượt là 92,4 và 294,2 pg/ml Hop chat tetrastigmindole A va tetrastigmindole B duge phan lap duge tir 7 obtectum da thể hiện tác động tích cực đối với sự lan rộng của dòng tế bào ung thư MDA-MB-23I (đòng tế bào ung thư vú người) ở nồng độ 20 tg/ml với tỷ lệ ức chế trên tế bào MDA-MB-231 lần lượt là 70,3% và 59,2% Hợp chất isoquercitrin, rutin, astragalin, catechin va kaempferol-3-rutinoside ti 7 hems/eyanum thé hién hoat tinh tiém nang chống ung thư đối với dòng tế bào HepG2 với giá trị [Cso tir 218,31 dén 592,12 pg/ml

Axitp-hydroxybenzoic từ 7: hemsleyanum đã thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt đối với dòng tế bào MDA-MB-435S với gid tri ICso 14 92,39 pg/ml [31,32]

1.3.2 Hoạt tính chỗng oxi hóa

Các hợp chất phlorizin, (+)-lyoniresinol, epicatechin-3-Ó-gallate, tetrasigmol A, resveratrol, catechin, 3-O-galloybergenin va (E)-2,3,5,4'- tetrahydroxystilbene-2-O-f-D-glucoside, duge phan lập từ thân 7 erubescens da

thé hién hoat tinh chéng oxy hóa mạnh, với giá tri ICso trong khoang tir 1,8 dén

60,4 umol/I Hợp chất 3-O-galloyberrgenin, catechin va epicatechin-3-O-gallate

20

đã thể hiện được hoạt tính cao hơn so với đối chứng trolox (ICs = 7,0 mol/l) với

giá trị của ICao lần lượt là 5,4; 2,2 và 1,8 nmol/1 [33] Cao chiết tổng tr 7

planicaule đã thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt, có thể được quy cho do hàm lượng flavonoid [34] Chiết xuất từ rễ củ và phần thân cây của 7 hemsleyanum

đã có khả năng khử gốc tự do 2,2-diphenyl-I-picrylhydrazyl (DPPH) Các polysaccharide tir 7 hemsleyanum da thể hiện hoạt tính chống oxy hóa với tỷ lệ

khử DPPH, radicale hydroxyl và superoxide anion là lần lượt 36,8%, 65,1% và

36,8% [35]

1.3.3 Hoạt tính kháng viêm và giảm đau

Hydroxy-3,4-dihydro-1-oxo-b-carboline, hippophamide va S-(-)-trolline

từ phần trên mặt đất của cay T hemsleyanum da thể hiện được hoạt tính ức chế

mạnh sự sản sinh NO trên tế bào RA W264.7 với giá trị ICso lần lượt là 31,9; 25,2

và 6,3 Imol/I Trong số chúng, 5-(-)-trolline đã thể hiện hoạt tính chống viêm tốt

bằng cách ức chế hoạt động của yếu tổ NF-KB và đường tín hiệu ERK-MAPK trong tế bào RAW264.7 theo cách phụ thuộc vào liều lượng [36] Hơn nữa, các nghiên cứu cụ thể về mối quan hệ cầu trúc hoạt tính đã chứng minh rằng phần lactam có thể là một yếu tố cấu trúc quan trọng trong hoạt tính chống viêm của các hợp chất này Polysaccharide từ 7 hemsÍeyanum cũng thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt và nồng độ của TNF-ø và IL-6 trong tế bào RAW264.7 đã giảm đáng kể

so với đối chứng theo cách phụ thuộc vào liều lượng [37] Khả năng chống viêm

in vitro va in vivo cia cao chiết tông và các phân đoạn từ lá Tefrastigma sulcatum

đã được nghiên cứu [38] Kaempferol-3-O-rutinoside, isoquercitrin, rutin trong rễ

và vitexin và orientin trong lá của cây 7: hemsileyanum cũng đã thể hiện hoạt tính

chống viêm bằng cách tương tác với protein Keapl và kích hoạt Nrf2 [39]

1.3.4 Hoạt tính bảo vệ gan

Sử dụng ANIT (a-isothiocyanatoacetate) để tái tạo mô hình gây viêm gan

cấp tính ở chuột và phát hiện rằng chiết xuất cồn từ 7: hemsleyanum có tác dụng bảo vệ gan [40] Cơ chế hoạt động thông qua việc giảm sản xuất các yếu tố viêm nhiễm, thúc đầy quá trình chuyền hóa tổng hợp bilirubin, và giảm mức độ peroxid

hóa lipid Chiết xuất cồn từ 7: plamicaule có tác dụng bảo vệ đáng ké chống lại

tổn thương gan bằng cách ngăn chan sy gia tang cla enzym aspartate transaminase (AST) va alanine transaminase (ALT) trong huyết thanh chuột, hạ nồng độ malondi-aldehyd (MDA), tang cudng hoat déng enzyme superoxide dismutase (SOD) va cai thién dang kể các biến đối bệnh lý trong mô gan [41]

1.3.5 Hoạt tính chống tiễu đường

Polysaccharide THDP-3 tir la 7 hemsleyanum thể hiện hoạt tính giảm đường huyết đáng kể trên chuột bị tiểu đường do alloxan gây ra THDP-3 có khả năng thúc đẩy tổng hợp glycogen va ức chế gluconeogenesis để giảm đường huyết, liên quan đến các enzyme quan trọng đến chuyển hóa glycogen gan bao gồm phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), glucose-6-phosphatase (G6Pase), glucokinase (GK) va protein kinase kich hoat bang AMP (AMPK) [36]

Trong đó, THP, một polysaccharide tan trong nue tir 7 hemsleyanum da thé hién

hoạt tính giảm đường huyết đáng kể trên chuột bị tiểu đường do alloxan gây ra

Kết quả nhuộm mô so sánh với glibenclamide trên chuột bị tiểu đường do alloxan gây ra cho thay rằng nó gây ra ít tác động phụ đối với gan hoặc thận Do đó, nghiên cứu trên đã đem tới cơ sở rằng THP có thể được coi như một ứng tiềm năng chữa bệnh tiểu đường với ít tác động phụ Hợp chat cis-apigenin-6-vinyl-7'- thamnoside, tetrastigmindole A và apigenin-8-C-[6-deoxy-2-O-(a-L- rhamnopyranosyl)-xylo-hexopyranos-3-uloside từ 7 obtectum da thể hiện hoạt tính chống tiểu đường tiềm năng bằng cách tăng cường chuyền vị GLUT4 và thúc đây hấp thụ glucose [42,43]

1.3.6 Hoạt tính kháng virus

Hoạt tính kháng virus của rutin, kaempferol, astragalin, quercitrin,

sophoretin, kaempferol-3-O-rutinoside, procyanidin dimmer và epicatechin từ rễ của 7 hemsleyanuim đã được tiến hành Từ kết quả thấy rằng những hợp chất trên

có mối quan hệ tích cực với hoạt tính kháng virus [43,44] Các cao chiết n-butanol

va ethyl acetate từ T: hemsleyanum đã thể hiện được hoạt tính kháng virus đối với virus hô hấp syncytial (RSV) véi chi số điều trị (T1) lần lượt là 128 và 64, vượt trội hơn ribavirin (T1 = 6,25) Các cao chiết từ 7: hemsleyanum (n-hexane, ethyl acetate, đichloromethane và ø-butanol) có tác dụng ức chế virus viêm gan B

22 (HBV) bằng cách giảm sự tiết HbsAg va HbeAg [32] Cao chiết cồn từ rễ của 7:

hemsleyanum đã cải thiện tỷ lệ sống sót của chuột bị nhiễm virus cũúm A HIN1

[32-34]

1.3.7 Hoạt tính khác

Các flavonoid từ 7: hemsleyamum đã được chứng mình khả năng ức chế đáng kể đối với sự sống và tăng trưởng của tế bào bạch cầu NB-4 bằng cách sử

dụng thử nghiệm CCk8 và kiém tra BrdU, ICso sau 48 giờ là 2.26 g/L Hơn nữa,

chúng có thể gây tử vong tế bào bạch cầu NB-4 thông qua đường tín hiệu p38 MAPK [33] Cao chiét 7 hypoglaucum cé tac dụng bảo vệ chống lại chấn thương

tái cắp tìm mạch Nó có thể giảm thiểu tổn thương tế bào tìm mạch và giảm thiểu

căng thẳng oxy hóa và phản ứng viêm Chiết xuất từ 7: hemsieyanum có thể thúc đây sự tăng trưởng và thay đổi chức năng của tế bào NK ở bệnh nhân mắc viêm gan B mãn tính và tăng biểu hiện bề mặt của tế bào NK như PFP, GrB, CD107a

va IFN-c [25] Cao chiét 7: hypoglaucum cho thây hiệu quả ức chế vi khuẩn mạnh với giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) đối với 55 dng MRSE (Staphylococcus epidermidis khang methicillin) va 43 dong MSSE (Staphylococcus epidermidis kháng và nhạy cảm voi methicillin) lần lượt là 1185 Ig/ml và 286 Ig/ml [1,26]

Các loài 7etrasfigma có nhiều thành phần hóa học thú vị và các hoạt tính

được lý phong phú Do đó, loài 7eastigima có thể được xem xét là ứng viên tiềm

năng cho các bồ sung dinh dưỡng và khám phá thuốc mới

1.4 Giới thiệu về Dây Quai bị [6-8]

Còn gọi là dây dác, para (Phan rang)

Tên khoa hoc Tetrastigma strumarium (Planch) Gagnep., (Tetrastigma crassipes var strumarium Planch.)

Mô tả cây: Dây quai bị là một loại dày mọc leo, trên thân có bì khổng Lá kép chân vịt gồm 5 lá chét Lá chét giữa lớn nhất, mép có răng cưa ở 2/3 phía trên,

đài 4-6cm, rộng 2-3cm, những lá chét thường có cuống chung, 2 lá chét một cuống

chung Cụm hoa mọc thành ngù, có thể to tới 2- 2,5cm đường kính Quả mọng hình cầu hay hình trứng, màu vàng nhạt, đường kính ISmm, có 2- 3 hạt hình 3

cạnh

Phân bố, thu hái và chế biến: Dây quai bị mọc hoang khắp những nơi cao

và lạnh ở miền Bắc và miền Trung nước ta, như Cao Bằng, Lạng Sơn, vùng thấp,

nóng gần đồng bằng như Hà Tây đều có Tại các nước khác, còn thấy mọc ở

Philipin Người ta dùng lá tươi hái vào mùa nực, trước và đang khi ra hoa

Công dung và liều dùng: Thay it ding trong nhân dân Mặc dầu tên cây là

dây quai bị nhưng ít thấy dùng chữa bệnh nảy Tại Phan Rang, người ta hái lá tươi

về giã nhỏ thêm ít nước vào, vắt lầy nước uống chữa sốt, nhức đầu, bà con lại đem nặn và xoa bóp khắp người như kiểu đánh gió

24

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VA THUC NGHIEM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần ở trên mặt đất của cây được thu tại Tuyên Quang vào tháng 09 năm

2022, được Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình, thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam —

VAST xác định tén khoa hoc 1a Tetrastigma strumarium (Planch) Gagnep., ho Vitaceae Mau tiéu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

— Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Cây Dây Quai bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất

Sau khi thu hái, mẫu dây quai bị (7erasfigma strumarium) được thái nhỏ

và phơi khô Sau đó, mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 60°C cho đến khi khối lượng

không thay đổi Tiếp theo, mẫu được nghiền nhỏ và được cho ngâm chiết ba lần bằng ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng Dịch chiết từ ba lần ngâm

sẽ được cất để tách dung môi đưới áp suất giảm và ở nhiệt độ dưới 50°C Kết quả của quá trình này sẽ thu được cao chiết methanol, có thể được dùng làm nguyên liệu để phân lập các hoạt chất

2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất

Dé phân lập được các hợp chất từ cao chiết của cây, sử dụng phối hợp nhiều

phương pháp sắc ký khác nhau Cụ thể sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC): DC- Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC

RP 18 (Merck): YMC RP-18 với cỡ hạt là 30-50 jm (FuJisilica Chemical Ltd.), sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck): silica gel 60 với cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh)

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

Để xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất, phải sử dụng các thiết

bị hiện đại cùng với những phương pháp tiên tiến Cụ thể, đã áp dụng các thiết bị

và phương pháp sau:

Phổ khối lượng (MS): phô khối (phun mù điện tử) ESI-MS để đo trên máy Agilent 1200 TRAP ở Viện Hóa học - VAST

Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): đo NMR đã được tiến hành trên máy

Bruckker avance 500 MHz với chất chuẩn nội là TMS, tại Viện Hoá học - VAST

Sử dụng những kỹ thuật phô cộng hưởng từ hạt nhân sau đây

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiéu: ‘H-NMR, !3C-NMR va DEPT

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng viêm [45]

Thử nghiệm hoạt tính khang viém in vitro đã được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm iw vi/ro, sử dụng phương pháp ức chế sản

sinh NO trên dòng tế bào RAW264.7 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) Các tế bào RAW264.7 (tế bảo đại thực bào chuột) được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Dulbecco cải tiến (DMEM-Dulbecco's Modified Eagle Medium) trong 48 gid & didu kién 37°C, 5% CO2 va 10% huyết thanh phéi bo (FBS-Fetal Bovine Serum) Tiép theo, chuyén té bào lên giếng phiến 96 với mật độ 2,5x10° tế bào/giếng Nồng độ của mẫu thử cao nhất là 256 pg/ml

Té bao sé duoc kich thich bang 2 pl mau đối chứng (-) LPS (0,1 mg/ml)

trong 24 giờ, sau đó thêm các chất thử hoặc thuốc Chất thử được sử dụng để đánh

giá hoạt tính kháng viêm là cardamonin Sau đó, dịch huyền phù của tế bào sẽ được ủ với thuốc thử Griess và NaNO; ở những nồng độ khác nhau để xây dựng

26 đường chuẩn Sự tăng lên của mật độ quang tại bước sóng À = 570 nm tng voi su tăng hàm lượng NO, được đo bằng phương pháp này Mức độ ức chế sản sinh ra

NO của mẫu được tính bằng cách so sánh với mẫu đối chứng (-) LPS và được xác

định theo công thức xác định đã được mô tả

Hàm lượng NO mẫu thir

% Ue ché = 100 - *100

eucene Him lvong NOLPS

2.2.5 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in vifro [46]

Phân tích về khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) Nồng độ cuối của mẫu thử từ 200 /g/ml đến 12,5 g/ml (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 nig/mL đến 3,1 ug/mL (mẫu tỉnh sạch)

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình đề xử lý số liệu Excel theo công thức:

OD thi nghiem - OD pMsO

tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel

Scientific, USA) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ của chất thử tương ứng

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Thụ nhận các dịch chiết từ dây quai bị

Mẫu thân lá cây tươi được sấy khô (3000), nghiền nhỏ rồi ngâm 3 lần với ethanol sau dé duoc gom lại và cất loại dung môi thu được cao ethanol tổng (TS,

195 ø) Sau đó, cao ethanol sẽ được bổ sung nước và chiết lần lượt với n-hexane, ethyl acetate, sau khi đuổi hết dung môi ta thu được các cao tương ứng là cao n- hexane (TSH, 62 g), ethyl acetate (TSE, 50 g) và nước (TSW, 82 g)

2.3.2 Phân lập và tỉnh chế các chất từ cặn ethyl acetafe của dây quai bj

Lấy 45 g cặn chiết ethyl acetate (TSE) được tiến hành tách thô trên sắc ký

cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CH;C];/MeOH (tỷ lệ MeOH tăng từ 0—>100%) thu được 7 phân đoạn (TSE1—>TSE7)

Phân đoạn TSE2 (1,6 g) phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường với

hệ dung môi n-hexane-EtOAc (20:1—>10:1) thu được hợp chat fagarasterol (8,5 mg: 1) Từ phân đoạn TSE3 (2,0 g) kết tỉnh lại trong acetone thu được

rhamnolutein (22,0 mg: 2)

Phân đoạn TSE4 (2,0 g) phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường với

hệ dung môi ø-hexane-EtOAc (10:1—2:1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (TSE4.1>TSE4.4), sau d6 phân đoạn TSE4.1 kết tỉnh lại trong dung môi aceton thu được hợp chat epicatechol (6,9 mg: 3) Phân đoạn TSE4.4 phân tách trên sắc

ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi -hexane-EtOAc (5:1—>2:1) sau đó kết tinh lại trong đung môi axeton thu được hợp chất sophoretin (9,8 mg: 4)

TSE (45g)

28 Phân đoạn TSE5 (3,0g) được tách lại trên cột silica gel với hệ dung môi

CH;Clz/MeOH (99:1—›50: I) thu được khối chất vô định hình Khối chất này được kết tỉnh lại trong dung môi methanol thu được hợp chất /-sitosterol-3'-0-/-D- glucopyranoside ( 11,2 mg: 5)

Phân đoạn TSE6 (1,8g) được tách lại trên cột silica gel với hệ dung môi CH;Cl;/MeOH (50:1—>10:1) thu được khối chất vô định hình Khối chất này được

tách lại trên cột pha đảo RP-18 với dung môi MeOH-HaO (3:7), ta thu được 4 phân đoạn nhỏ TSE6.I—›TSE6.4, phân đoạn TSE6.3 sau đó được tinh chế lại trên cột sephadex LH20 với dung môi rửa giải MeOH sẽ thu được hợp chất (2R,3S)-3,5,7,3',5'-pentahydroxyflavanone 3-rhamnoside ( 8,2 mg: 6)

Hợp chất fagarasterol (1) Hợp chất 1 thu được dưới đạng hình kim, không màu

Số liệu phổ !H- và 'C-NMR của 1 được trình bày như bảng 3.5 (trang 35)

Hợp chất rhamnolutein (2) Hợp chất 2 thu được có dạng tỉnh thể hình kim màu vàng

Số liệu phé 'H- va “C-NMR ciia 2 được trình bày như bảng 3.4 (trang 33)

Hợp chất epicatechol (3) Hợp chất 3 thu được đưới dạng chất bột màu vàng

Số liệu phổ !H- và '3C-NMR của 3 được trình bày như bảng 3.1 (trang 29)

Hợp chất sophoretin (4):

Hợp chất 4 thu được dưới đạng chất bột màu vàng

Số liệu phổ !H- và !3C-NMR của 4 được trình bảy như bảng 3.3 (trang 32) Họp chất daueosterol (8)

Hop chất 5 thu được dưới dạng vô định hình, không màu

Số liệu phổ !H- và '3C-NMR của 5 được trình bày như bảng 3.6 (trang 39)

Hợp chất (2R,3S)-3,5,7,31,5 -penfahydroxyflavanone 3-rhamnoside (6) Hop chất 6 (hu được dưới dạng vô định hình, không màu

Số liệu phổ !H- và '*C-NMR của 6 được trình bày như bảng 3.2 (trang 31)

CHUONG 3 KET QUA VA THAO LUAN

3.1 Phân lập và nhận dạng các hợp chat có trong dây quai bị

Từ dây quai bị đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 6 hợp chất,

bao gồm 4 hop chat flavonoid: Rhamnolutein (2), epicatechol (3), sophoretin (4)

và (2R,3S)-3,5,7,3',5'-pentahydroxyflavanone 3-rhamnoside (6); 1 hop chat

triterpenoid: fagarasterol (1) va | hop chat steroid: Ø-sitosterol-3-O-/-D- glucopyranoside (5)

3.1.1 Các hop chit flavonoid

© Hop chit epicatechol (3) Phé khéi LC-ESI/MS (m/z) cho [M+H]* 290 amu, két hop với các đữ kiện phổ

NMR cho céng thite phan tử của 3 tương ứng là C¡zHi4O¿

Phổ !H-NMR của 3 cho biết 5 tín hiệu proton thom tai dy 7,04 (1H, d, J=

1.5 Hz, H-2’), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,81 (1H, dd, J = 1,0 va 8,0 Hz, H-

69, 6,01 (1H, d, J= 2,5 Hz, H-6) va 5,91 (1H, d, J= 2,5 Hz, H-8); tin hiệu của 2

proton thuộc nhom methine gắn voi nhém hydroxy tai đi 4,87 (1H, s, H-2) và 4,21 (1H, m, H-3) Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu proton của nhóm methylene

tại Ou 2,86 (1H, dd, J= 16,75 va 5 Hz , H-4a) và 2,73 (1H,dd, J= 16,75 va 3,0 Hz, H-4b)

Phổ 'C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho biết trong phân tử của 3 có tổng

số 15 nguyên tử carbon, gồm 7 carbon bậc 4, 7 nhóm methine, | nhém methylene

Trong đó, có tín hiệu của 2 carbon methine gắn oxy tại ẩ: 79,4 (C-2) và 66,9 (C- 3) ppm, tín hiệu của 4 carbon bậc 4 gắn với nhóm hydroxyl tai & 157,6 (C-5),

157,6 (C-7), 145,4 (C-3') và 145.3 (C-4'), tín hiệu của các carbon methine thuộc vòng A tại & 96,2 (C-6) va 95,7 (C-8) va 03 carbon methine thuộc vòng B tại ẩ:

115,5 (C-2'; 115,7 (C-5' và 119,3 (C-6') Đặc biệt, trên phổ 'C-NMR còn cho

biết có tín hiệu của nhóm methylene tại ä: 29,0 (C-4) với proton tương ứng tại ổi

ỗ

30

2,86 (H-4a) và 2,73 (H-4b), những tín hiệu này rất đặc trưng cho hợp chất kiểu khung flavonoid

Việc gán các dữ liệu phổ !H và '*C NMR của 3 dựa trên các tương tác trên

phé HSQC và HMBC Các dữ liệu phô !H và 'C-NMR của 3 được trình bày ở

bảng 3.1

Phân tích các số liệu phổ của 3 kết hợp so sánh với các dữ kiện phổ của epicatechol trong các tài liệu đã công bố [47] cho thấy hoàn toàn phù hợp Điều này cho phép xác định 3 là epicatechol, có cấu trúc hóa học như sau: