Tổng hợp và thử hoạt tính gây Độc tế bào ung thư của một số dẫn chất hydrazon mang khung indole

TRẦN THỊ BÍCH PHƯỢNGTỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDRAZON MANG KHUNG INDOLE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn luận văn: ThS... Để tiết k

TRẦN THỊ BÍCH PHƯỢNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDRAZON MANG KHUNG INDOLE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn luận văn:

ThS CAO THỊ CẨM NHUNG

Huế, Năm 2022

Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trongquãng đời mỗi sinh viên Luận văn tốt nghiệp là tiền đề nhằm trang bị cho chúng emnhững kỹ năng nghiên cứu, những kiến thức quý báu trước khi lập nghiệp.

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô giáo hướng dẫn ThS Cao

Thị Cẩm Nhung Trong suốt thời gian tiến hành luận văn, Cô đã luôn đồng hành

bên cạnh, tận tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho

em Bên cạnh đó, Cô cũng là nguồn khích lệ tinh thần, động viên giúp em có thêmđộng lực để vượt qua khó khăn, hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Dược, các thầy cô và cácanh chị kỹ thuật viên trong Khoa cũng như các bạn trong nhóm làm đề tài đã giúp

đỡ, hỗ trợ, động viên, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm trong suốt quátrình làm đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnhkhích lệ, động viên, hỗ trợ em về mặt vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thànhluận văn đúng thời hạn một cách tốt nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 08 năm 2022

Trần Thị Bích Phượng

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện.Các số liệu và kết quả trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưađược công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Huế, tháng 08 năm 2022

Trần Thị Bích Phượng

1H nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân 1H)

13C nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

Tế bào ung thư buồng trứng người

Tế bào ung thư thận ngườiCông thức phân tử

Dimethyl sulfoxid-d6

N,N-Dimethylformamid

EthanolElectrospray Isonization Mass Spectrometry (Phổ khối lượng phun

mù điện tử)Hiệu suất

Tế bào ung thư ruột kết ngườiInhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)Liều gây chết 50%

Tế bào ung thư vú ngườiMethanol

Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus

aureus kháng Methicillin)

Mass spectrometry (Phổ khối lượng)

Tế bào ung thư phổi người

t°nc

UACC-62

Nhiệt độ nóng chảy

Tế bào khối u ác tính

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Indole 2

1.2 Tổng quan về dẫn chất hydrazon 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Nguyên liệu và thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 29

3.1 Tổng hợp hóa học 29

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 39

3.3 Xác định cấu trúc 41

3.4 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư 45

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 47

4.1 Tổng hợp hóa học 47

4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang

Bảng 1.1 Giá trị IC50 của chất 1,2-bis(3-indolyl)ethane so với mỗi đồng dạng PK 5

Bảng 1.2 Một số dược phẩm mang cấu trúc vòng indole có tác dụng hạ huyết áp 7

Bảng 1.3 Một số tác dụng sinh học khác của dẫn chất indole 7

Bảng 1.4 Hoạt tính chống ung thư của dẫn chất hydrazon mới mang khung pyridine và isatin 15

Bảng 1.5 Một số tác dụng sinh học khác của dẫn chất hydrazon 19

Bảng 2.1 Danh sách các dẫn chất hydrazon mang khung indole nghiên cứu 24

Bảng 3.1 Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất II a-f 39

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất II a-f 40

Bảng 3.3 Số liệu phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất II a-f 41

Bảng 3.4 Số liệu phân tích phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của các dẫn chất II a-f 42

Bảng 3.5 Số liệu phân tích phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của các dẫn chất II a-f 44

Bảng 3.6 Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư HT-29 của các chất thử nghiệm 45

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất II a-f 46

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của indole 2

Hình 1.2 Cấu trúc của vinblastine và vincristine 3

Hình 1.3 Cấu trúc của indole-3-carbinol 4

Hình 1.4 Dẫn chất của methyl-indole-3-carboxylate 5

Hình 1.5 Dẫn chất 3-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)-6-nitro-1H-indole 5

Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất indole-3-aldehyde hydrazone 6

Hình 1.7 Dẫn chất indole-2-carboxylate 6

Hình 1.8 Các sản phẩm proton hóa của indole 9

Hình 1.9 Các cấu trúc chính của dẫn chất hydrazon 14

Hình 1.10 Dẫn chất Nꞌ-(2-oxoindoin-3-ylidene)-2-propylentane hydrazide-hydrazone 16

Hình 1.11 Dẫn chất 5-benzyliden-2-[pyridin-4-ylmethylen)hydrazono]-thiazolidin-4-on 16

Hình1.12 Dẫn xuất etyl 2-arylhydrazono-3-oxobutyrat 17

Hình 1.13 Dẫn chất cholesterol tosylhydrazon 17

Hình 1.14 Hợp chất 2-hydroxy-4 - {[(isonicotinoylhydrazono) metyl] amino} benzoic acid 18

Hình 1.15 Hợp chất 4-methoxybenzoic acid[(5-nitrothiophene-2-yl) metylen] hydrazide 18

Hình 3.1 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết của chất I 30

Hình 3.2 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết của chất I ꞌ 35

Hình 4.1 Phổ khối lượng của dẫn chất II d 50

Hình 4.2 Biểu đồ phần trăm ức chế sinh trưởng tế bào ung thư HT-29 của các dẫn chất II a-f 51

Hình 4.3 Biểu đồ giá trị IC50 của các dẫn chất II a-c và II f 52

Sơ đồ 1.1 Các phản ứng thay thế electron của indole 8

Sơ đồ 1.2 Phản ứng nitro hóa của indole 9

Sơ đồ 1.3 Phản ứng nitro hóa của 2-methyl indole 10

Sơ đồ 1.4 Phản ứng sulfo hóa của indole 10

Sơ đồ 1.5 Phản ứng halogen hóa của indole 11

Sơ đồ 1.6 Phản ứng acyl hóa của indole 11

Sơ đồ 1.7 Phản ứng alkyl hóa của indole 12

Sơ đồ 1.8 Quá trình formyl hóa của indole 12

Sơ đồ 1.9 Phản ứng Mannich của indole 13

Sơ đồ 1.10 Sự hình thành và công thức cấu tạo chung của hydrazon 14

Sơ đồ 1.11 Sơ đồ phản ứng Japp - Klingemann 20

Sơ đồ 1.12 Tổng hợp dẫn chất hydrazon từ phản ứng ngưng tụ hydrazin với hợp chất carbonyl 20

Sơ đồ 1.13 Cơ chế phản ứng ngưng tụ hydrazin với hợp chất carbonyl 21

Sơ đồ 1.14 Sơ đồ phản ứng tạo phenylhydrazon 21

Sơ đồ 1.15 Sơ đồ phản ứng tạo 1-benzyliden-2-phenylhydrazin 21

Sơ đồ 1.16 Sơ đồ phản ứng tạo 1-phenyl-2-(propan-2-ylidene)hydrazine 22

Sơ đồ 1.17 Phản ứng tạo thành các arylhydrazon 22

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydrazon mang khung indole II a-c 26

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydrazon mang khung indole II d-f 26

Sơ đồ 3.1 Quy trình chung tổng hợp các dẫn chất II a-c 29

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất I 29

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp chất II a 31

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất II b 32

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất II c 33

Sơ đồ 3.6 Quy trình chung tổng hợp các dẫn chất II d-f 34

Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tổng hợp chất II f 38

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng tổng hợp 1H-indole-2-carbohydrazide (I) 47

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tổng hợp 1H-indole-3-carbohydrazide (Iꞌ ) 48

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng tổng hợp các chất II a-f 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những bệnh hiểm nghèo được quan tâm hầu hết ở hệthống y tế của các quốc gia trên toàn cầu Theo WHO, năm 2021, thế giới ghi nhậnkhoảng 20 triệu ca mắc và 10 triệu người đã tử vong vì ung thư Dự báo các con sốnày sẽ tiếp tục gia tăng trong những thập kỷ tới [32] Do đó, nhu cầu cấp thiết vềcác hợp chất mới để điều trị ung thư đang cao hơn bao giờ hết, thúc đẩy các nhàkhoa học nỗ lực tìm kiếm và khám phá ra các thuốc chống ung thư mới có hiệu quảcao nhưng ít gây hại hơn

Trong lĩnh vực Hóa dược, việc nghiên cứu, phát triển và tổng hợp các thuốcđiều trị mới tốn rất nhiều nhân lực và vật lực Để tiết kiệm chi phí, thời gian vànhanh chóng đưa thuốc ra thị trường, các nhà nghiên cứu thường dựa trên các chấtđang được ứng dụng làm thuốc hoặc có hoạt tính sinh học tốt, từ đó thay đổi hoặckết hợp các cấu trúc này để tạo ra các dẫn chất mới có tác dụng mong muốn hoặc cóhiệu quả cao hơn

Vòng indole được coi là phân tử chủ chốt tồn tại trong các hợp chất có hoạttính sinh học đa dạng Đặc biệt, các dẫn chất của indole được chứng minh là có tácdụng ngăn chặn sự sinh sôi và xâm lấn của nhiều tế bào ung thư [11] Bên cạnh đó,các dẫn chất hydrazon cũng cho thấy tiềm năng trong điều trị ung thư với tác dụng

ức chế sự tăng trưởng khối u trong tế bào ung thư buồng trứng, ung thư thận, [29].Nhận thấy việc lai hóa hai thành phần này trong một công thức hứa hẹn sẽ mang lạimột hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt, góp phần tạo ra những ứng viên lâmsàng đầy triển vọng trong điều trị ung thư, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dẫn chất hydrazon mang khung indole” với 2 mục tiêu:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất hydrazon mang khung indole

2 Thử được hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ INDOLE

1.1.1 Cấu trúc

Indole (1-benzazole) là một hợp chất hữu cơ dị vòng thơm với công thức

pyrrole năm cạnh Trong phân tử indole, cặp electron độc thân của nitơ tham giavào hệ liên hợp của vòng thơm nên indole không đơn thuần thể hiện tính chất củamột amin như pyrrole Indole là khung cấu trúc quan trọng của một số dẫn chất tổnghợp, bán tổng hợp và hợp chất tự nhiên (alkaloid, peptide) [26]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của indole

 Lý tính: Indole có những tính chất vật lý cơ bản sau:

- Trạng thái: Tinh thể màu trắng ở nhiệt độ phòng

- Khối lượng phân tử: 117,151 g/mol

- Phản ứng với andehyd và ceton

- Phản ứng với muối diazoni

Catharanthus roseus (L.) G DON (Vinca rosea L.) Cả hai hợp chất hoạt động

bằng cách liên kết với tubulin (khối xây dựng cơ bản của vi ống) từ đó ức chế sựhình thành vi ống và ngăn chặn sự kết tụ của chúng, ức chế khả năng phân chia của

tế bào ung thư [25]

Hình 1.2 Cấu trúc của vinblastine và vincristine

Năm 2001, H R Frydoonfar, D R McGrath và A D Spigelman đã tiến hành

nghiên cứu để quan sát tác động của indole-3-carbinol (một thành phần tự nhiên cótrong các loại rau họ cải) đối với sự tăng sinh tế bào ung thư ruột kết Sự tăng sinh

tế bào được đo bằng ba phương pháp: xét nghiệm kết hợp 3H-thymidine, đếm tế bào

và xét nghiệm so màu Việc bổ sung indole-3-carbinol đã làm giảm sự tăng sinhdòng tế bào ung thư ruột kết HT-29 ở nồng độ > 0,1 mM (P<0,05), sự tăng sinh tếbào bị giảm phụ thuộc vào liều lượng indole-3-carbinol thêm vào [14]

Hình 1.3 Cấu trúc của indole-3-carbinol

Indole-3-carbinol cũng được chứng minh là ngăn chặn sự gia tăng của các

vú, đại tràng, tuyến tiền liệt, nội mạc tử cung Hơn nữa, indole-3-carbinol ức chế sựhình thành khối u tự phát hoặc do hóa chất gây ra ở tuyến vú, gan, phổi, cổ tử cung

và đường tiêu hóa trong các nghiên cứu trên mô hình động vật khác nhau [16].Hai dẫn chất mới của methyl-indole-3-carboxylate là methyl-1-(3ꞌ-

indolymethane)-indole-3-carboxylate (1) và indolylmethane)-indole-3-carboxylate (2) đã được tổng hợp bởi Maria Niemyjska

methyl-1-(1ꞌ-benzenosulfonyl-3ꞌ-và các cộng sự methyl-1-(1ꞌ-benzenosulfonyl-3ꞌ-vào năm 2012 Cả hai hợp chất đều ức chế sự phát triển của cácdòng tế bào ung thư hắc tố, ung thư thận và ung thư phổi ở liều 10 µM Sự thay thế

nguyên tử hydro trong -NH bởi nhóm benzen sulfonyl đã tạo ra hợp chất (2) có hiệu lực mạnh hơn so với hợp chất (1) với tỷ lệ ức chế cao nhất trên dòng tế bào ung thư

vú T-47D (50,9%) Hợp chất (2) cũng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư

thận CAKI-1 và khối u ác tính UACC-62 với tỷ lệ 50,4% và 47,1% tương ứng Hợp

chất (1) cho tác dụng yếu hơn, ức chế sự phát triển của khối u ác tính

MDA-MB-435, CAKI-1 và T-47D lần lượt với tỷ lệ 48,4%; 41,5% và 31,5% [19]

Hình 1.4 Dẫn chất của methyl-indole-3-carboxylate 1.1.2.2 Tác dụng kháng khuẩn

Pyruvate kinase của Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA PK)

cho đến nay đã được công nhận là một ý tưởng tuyệt vời cho sự phát triển của cácchất kháng khuẩn mới Roya Zoraghi cùng các cộng sự đã tổng hợp được một loạtdẫn chất 1,2-bis(3-indolyl)ethane mang nhiều nhóm thế (gồm mười một hợp chất).Các dẫn chất này đều cho tác dụng ức chế MRSA PK với các mức độ khác nhau,

trong đó dẫn chất 3-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)-6-nitro-1H-indole cho tác dụng mạnh

nhất với IC50 = 0,9 µM và có khả năng chọn lọc tốt nhất chống lại cả bốn dạng đồngdạng pyruvate kinase ở người gồm hPK-M1, hPK-M2, hPK-R và hPK-L [27]

ức chế mạnh nhất đối với các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus

Hợp chất (1): R = H Hợp chất (2): R=

subtilis, MRSA và nấm Candida albicans với giá trị MIC trong khoảng từ 6,25

-12,5 g/mL và mức độ ức chế yếu hơn đối với chủng vi khuẩn Escherichia coli

với giá trị MIC = 50 g/mL [13]

Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất indole-3-aldehyde hydrazone

1.1.2.3 Tác dụng hạ huyết áp

El-Gendy và các cộng sự đã chứng minh được hoạt tính hạ huyết áp của cácdẫn chất indole-2-carboxylate bằng thử nghiệm trên động vật, cụ thể sử dụng 3 conchó đã được gây mê bằng natri pentobarbital, tiêm tĩnh mạch 40 mg/kg hợp chất

ethyl-3-((diethylamino)methyl)-1H-indole-2-carboxylate vào, sau 240 phút nhận

thấy huyết áp tâm thu của chó giảm rõ rệt từ 120 ± 10 mmHg xuống 70 ± 10 mmHgvới liều gây chết LD50 = 180 mg/kg (được tìm thấy ở thử nghiệm trên chuột) [3]

Hình 1.7 Dẫn chất indole-2-carboxylate

Ngoài ra, một số dẫn chất indole được ứng dụng vào sản xuất dược phẩm cótác dụng hạ huyết áp được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số dược phẩm mang cấu trúc vòng indole có tác dụng hạ huyết áp

Tấn công vị trí C2

E +

E

+

Sơ đồ 1.1 Các phản ứng thay thế electron của indole

Vị trí ưu tiên của sự thay thế electrophin là C3 vì cation được hình thành bởi sựtấn công của electrophin vào vị trí C3 ổn định hơn so với C2 Trong trường hợp tấncông vào C3, chất trung gian chuyển tiếp được hình thành có điện tích dương liền kềvới nguyên tử N có thể được ổn định bằng cách phân chia các cặp electron duy nhấtcủa nitơ Trong khi đó, điện tích dương của chất trung gian chuyển tiếp được hìnhthành bởi sự tấn công vào C2 không thể ổn định nếu không làm ảnh hưởng đến tínhthơm của vòng benzen Nếu vị trí C3 bị chiếm thì sự thay thế electrophin diễn ra ở

C2 và nếu cả hai vị trí đều bị chiếm thì sẽ tấn công electrophin ở vị trí C6

1.1.3.2 Proton hóa

Indole là một base rất yếu với pKa = 3,5 Nguyên tử nitơ của indole dễ dàng

được proton hóa ngay cả trong nước (ở pH = 7) tạo ra 1H-indolium cation Tuy

nhiên, về mặt nhiệt động học, cation bền nhất được hình thành bởi sự proton hóacủa C3 chứ không phải nguyên tử N 3- proton cation (3H-indolium cation) vẫn giữ

được đầy đủ tính thơm của benzen với sự phân chia điện tích trên nguyên tử nitơ vàcarbon

Hình 1.8 Các sản phẩm proton hóa của indole 1.1.3.3 Nitrat hóa

Khi sử dụng thuốc thử nitrat hóa thông thường, hỗn hợp acid (H2SO4+

được thực hiện bằng cách sử dụng chất nitrat hóa không có tính acid như benzoylnitrat và ethyl nitrat

Sơ đồ 1.2 Phản ứng nitro hóa của indole

Nitrat hóa 2-methylindole với benzoyl nitrat tạo ra dẫn chất 3-nitro (35%).

Tuy nhiên, quá trình nitrat hóa trong điều kiện acid bằng cách sử dụng acidnitric/sulfuric sẽ tạo ra sản phẩm thế 5-nitro (84%)

Các phản ứng halogen hóa của indole thường xảy ra ở vị trí số 3 và chỉ một số

ít ở vị trí số 2 Cả hai loại dẫn chất 2-haloindole và 3-haloindole đều kém bền, phải

sử dụng ngay sau khi điều chế

- Phản ứng clo hóa indole sinh ra 3-chloroindole nhờ tác dụng của SOCl2 hoặcNCS/MeOH

- Phản ứng giữa iod với indole trong DMF có mặt KOH sinh ra 3-iodoindole

0 ℃

ĐỘ00

0℃

50℃

- Phản ứng brom hóa indole sinh ra 3-bromoindole nhờ tác dụng của Br2/DMFhoặc Pyridine.Br2.

Sơ đồ 1.5 Phản ứng halogen hóa của indole 1.1.3.6 Acyl hóa

Indole phản ứng với acetic anhydride trong acid acetic ở nhiệt độ 140°C để tạo

ra 1,3-diacetylindole là chủ yếu Trong khi đó, quá trình acetyl hóa với sự có mặtcủa natri acetat hoặc 4-dimetylaminopyridin chỉ tạo ra 1-acetylindole

Quá trình acyl hóa xảy ra ở vị trí C3 trước vị trí N trong phân tử diacetylindole do đó sản phẩm N-acetylindole cho thấy khả năng chống chuyển đổithành 1,3-diacetylindole, trong khi đó 3-acetylindole dễ dàng chuyển đổi thành 1,3-diacetylindole

1,3-0℃ 80 ℃

hoặc hoặc

Sơ đồ 1.6 Phản ứng acyl hóa của indole 1.1.3.7 Alkyl hóa

Indole không phản ứng với alkyl halogenua ở nhiệt độ thường Bản thânindole bắt đầu phản ứng với methyliodide trong dimethylformamide ở khoảng 80°C

để tạo ra sản phẩm chính là 3-methyl indole Khi tăng nhiệt độ, quá trình methyl

hóa tiếp tục diễn ra tạo thành 1,2,3,3-tetrametyl-3H-indolium iodide.

Sơ đồ 1.7 Phản ứng alkyl hóa của indole 1.1.3.8 Phản ứng Vilsmeier Haack

Sự formyl hóa các hợp chất thơm giàu điện tử tạo các dẫn chất aldehyde thơmbằng tác nhân Vilsmeier được gọi là phản ứng formyl hóa Vilsmeler-Haack Tácnhân Vilsmeier là một dẫn xuất của imidoyl chloride Nó thông thường là một muối

bao gồm cation N,N-Dimethyliminium (phần tử phản ứng) và anion Cl- (còn có cả

PO2Cl2) Indole có thể dễ dàng formyl hóa tạo thành dẫn chất 3-formyl-indole thôngqua phản ứng Vilsmeier

Sơ đồ 1.8 Quá trình formyl hóa của indole 1.1.3.9 Phản ứng Mannich

Indole phản ứng với hỗn hợp formaldehyde và dimethylamin ở 0°C trong điều

kiện trung tính cho N-dimethylaminomethyl indole Trong điều kiện trung tính với nhiệt độ cao hơn hoặc trong môi trường acid acetic, N-dimetylaminometyl indole

tạo thành 3-(dimetylaminometyl)indole

Gramine có thể được điều chế trực tiếp bằng phản ứng của indole vớiformaldehyde và dimethylamin trong acid acetic cho hiệu suất cao Phản ứngMannich rất hữu ích vì sản phẩm gramine có thể được sử dụng làm chất trung gian

để liên kết các indole thay thế ở vị trí 3

t℃

nhiệt

Hiệu suất

hoặc nhiệt độ phòng

nhiệt độ phòng

Sơ đồ 1.9 Phản ứng Mannich của indole

1.2 TỔNG QUAN VỀ DẪN CHẤT HYDRAZON

1.2.1 Cấu trúc

Hydrazon là nhóm hợp chất hữu cơ thuộc họ azomethine, đặc trưng bởi sựhiện diện của một imin (-C=N) liên kết với một gốc amin (-NH2 hay -NHR) tạocông thức chung R1R2-C=N-NH2 Hydrazon có cấu trúc tương tự aldehyde và ceton

ngưng tụ giữa hydrazin với aldehyde hoặc ceton Với việc dễ điều chế, tăng độ ổnđịnh thủy phân và có xu hướng kết tinh, các dẫn chất hydrazon đóng vai trò quantrọng trong tổng hợp hữu cơ và hoạt tính sinh học

Sơ đồ 1.10 Sự hình thành và công thức cấu tạo chung của hydrazon

Việc thay đổi các nhóm thế liên kết với nguyên tử carbon và nitơ của hydrazondẫn đến sự hình thành các dẫn chất tương ứng, góp phần đa dạng hóa các mục tiêuphân tử, hay nói cách khác, thuật ngữ “hydrazon” dùng để chỉ các dẫn chất có cấu

carbonyl, khi đó, cấu trúc (I) có dạng (II) được gọi là “azin”, cũng là cấu trúc của

Y = H, Alkyl, Ar, RCO, Ht

Hình 1.9 Các cấu trúc chính của dẫn chất hydrazon

1.2.2 Tác dụng sinh học

1.2.2.1 Tác dụng chống ung thư

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới điều trị ung thư, các nhàkhoa học đã phát hiện ra một số dẫn chất mang cấu trúc hydrazon có tác dụng kìmhãm, ức chế hiệu quả sự phát triển của các tế bào ung thư

Theo nghiên cứu của Zinneddine Zebbiche và các cộng sự, chín dẫn chất

hydrazon mới mang khung pyridine và isatin (3a-i) đã được tổng hợp và nghiên cứu

độc tính tế bào theo phương pháp xét nghiệm MTT trên các dòng tế bào buồngtrứng người (A-2780) và ung thư vú ở người (MCF-7) Cả chín dẫn chất đều có hoạt

tính kháng u đầy hứa hẹn, bảy trong số chín hợp chất (3b, 3c, 3d, 3e, 3g, 3h và 3i)

cho thấy hoạt tính chống ung thư tốt nhất [34]

Bảng 1.4 Hoạt tính chống ung thư của dẫn chất hydrazon mới mang khung

hydrazide-hydrazone (4a-h) được tổng hợp bởi Ayman El-Faham cùng các cộng sự vào năm

2015 Kết quả đánh giá độc tính trên dòng tế bào ung thư gan người (HepG2), ungthư bạch cầu (Jurkat) và dòng tế bào bình thường có nguồn gốc từ thận phôi người

(HEK293) cho thấy các hợp chất (4a), (4c) và (4e) có hoạt tính chống ung thư đầy

hứa hẹn trên các dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 từ 3 đến 7 μM, so với chấtđối chiếu 5-Fluorouracil (IC50 = 32 - 50 μM) Trong số các hợp chất được thử

nghiệm, hợp chất (4a) cho thấy tính đặc hiệu khi chống lại tế bào bệnh bạch cầu

(Jurkat) với giá trị IC50 = 3,14 μM, tuy nhiên lại không có tác dụng trên dòng tế bàoung thư gan và các dòng tế bào bình thường [5]

Hình 1.10 Dẫn chất Nꞌ-(2-oxoindoin-3-ylidene)-2-propylentane

hydrazide-hydrazone

Năm 2011, Danniel Delmondes Feitoza cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứutổng hợp các dẫn chất 5-benzyliden-2-[pyridin-4-ylmethylen)hydrazono]-thiazolidin-4-on và thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H292 Kết quả cho thấy, dẫn chất với nhóm thế R = -C6H5, R1 = -N(CH3)2 cho hoạttính kháng ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 = 1,380,04 g/mL [9]

(4a): X = Y = H (4c): X = Cl, Y = H

Hình 1.11 Dẫn chất 5-benzyliden-2-[pyridin-4-ylmethylen)hydrazono]-thiazolidin-4-on 1.2.2.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao

Theo nghiên cứu của Sevim Rollas và cộng sự, các hợp chất etyl

2-arylhydrazono-3-oxobutyrat (5a-f) đã được tổng hợp và xác định hoạt tính kháng

khuẩn Hợp chất (5d) cho thấy có tác dụng đáng kể chống lại Staphylococcus

aureus trong khi những hợp khác không có tác động nào trên chủng này Hợp chất

(5e) được phát hiện là có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn những hợp chất khác trên

chủng Mycobacterium fortuitum với giá trị MIC = 32 μg/mL [28].

Hình1.12 Dẫn xuất etyl 2-arylhydrazono-3-oxobutyrat

Năm 2004, Jean Michel Brunel và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp một loạthydrazon từ các dẫn chất cholesterol khác nhau và đánh giá về hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm in vitro Kết quả nghiên cứu thu được các dẫn chất cholesterol

tosylhydrazon (6) và (7) có hoạt tính chống lại Candida albicans (CIP 1663-80)

mạnh nhất với giá trị IC50 = 1,5 g/mL [7]

P-Mycobacterium tuberculosis H 37 Rv và ba chủng không gây lao Trong đó, hợp

chất 2-hydroxy-4-{[(isonicotinoylhydrazono) metyl] amino} benzoic acid (8)

cho thấy tác dụng ức chế cao nhất (96%) trên Mycobacterium tuberculosis

H 37 Rv với giá trị IC50 là 0,39 μg/mL [4]

Hình 1.14 Hợp chất 2-hydroxy-4 - {[(isonicotinoylhydrazono) metyl] amino}

benzoic acid

Dãy benzoic acid [(5-nitro-thiophene-2-yl) metylen] hydrazide đã được tổng

hợp và thử nghiệm tác dụng chống lại Mycobacterium tuberculosis H37 Rv bởi

Rando và các cộng sự Trong sáu dẫn chất tổng hợp được, hợp chất methoxybenzoic acid[(5-nitrothiophene-2-yl) metylen] hydrazide cho thấy có hoạttính ức chế mạnh nhất với giá trị MIC = 2,0 μg/mL [8]

4-Hình 1.15 Hợp chất 4-methoxybenzoic acid[(5-nitrothiophene-2-yl) metylen]

hydrazide

1.2.2.3 Các tác dụng sinh học khác

Dẫn chất hydrazon ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm nghiên cứu củacác nhà khoa học trên thế giới do có hoạt tính sinh học đa dạng, phong phú Bảng1.5 dưới đây liệt kê một số tác dụng tiêu biểu của hydrazon đã được công bố

Bảng 1.5 Một số tác dụng sinh học khác của dẫn chất hydrazon

6 Chống HIV-1 [34]

1.2.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất hydrazon

1.2.3.1 Phản ứng Japp - Klingemann

Phản ứng này lần đầu tiên được báo cáo bởi Japp và Klingemann vào năm

1887, tổng hợp hydrazon từ β-cetoeste và muối aryl diazonium với acid hoặc base[15]

Phản ứng thuận nghịch thiên về chiều thuận nên không cần loại nước.

Cơ chế phản ứng: Nhóm carbonyl -C=O phân cực mạnh, nguyên tử C mang

điện tích dương nên tác nhân ái nhân cộng hợp dễ dàng Phản ứng có sự có mặt của

H+ để proton hóa nhóm -C=O, làm tăng khả năng phản ứng

Sơ đồ 1.13 Cơ chế phản ứng ngưng tụ hydrazin với hợp chất carbonyl

Xúc tác dùng cho phản ứng này là acid acetic hoặc acid vô cơ Lượng aciddùng làm xúc tác ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Nếu như nồng độ acid quá caolàm cho hydrazin chuyển sang dạng acid liên hợp làm giảm khả năng tấn công vàonhóm carbonyl, tốc độ phản ứng bị chậm lại Tuy nhiên, tùy hợp chất ban đầu vàhydrazon tạo thành mà chọn dung môi, xúc tác, nhiệt độ và thời gian phản ứng thíchhợp.

1.2.3.3 Ngưng tụ hydrazin với một số dẫn chất carbonyl

Hydrazin và các dẫn chất thế của nó có khả năng tạo hydrazon với một số dẫnchất của hợp chất carbonyl như:

của cyclohexanon:

Sơ đồ 1.14 Sơ đồ phản ứng tạo phenylhydrazon

Azometin: phản ứng xảy ra rất dễ dàng với các dẫn chất của hydrazin, nhưphản ứng của phenylhydrazin trong môi trường amoniac lỏng:

Sơ đồ 1.15 Sơ đồ phản ứng tạo 1-benzyliden-2-phenylhydrazin

Oxim: phản ứng với các hydrazin tương tự azometin thường tiến hành trongethanol, xúc tác là acid acetic đặc:

Sơ đồ 1.16 Sơ đồ phản ứng tạo 1-phenyl-2-(propan-2-ylidene)hydrazine 1.2.3.4 Kết hợp muối diazoni với các hợp chất chứa nhóm methyl và metylen hoạt động

Các hợp chất trong phân tử có nhóm methyl hay metylen hoạt động khi tácdụng với các muối diazoni sẽ tạo thành các arylhydrazon

C6H5-CO-CH2-X + (C6H5-N+≡N)Cl- C6H5-CO-C-X + HCl

‖‖‖‖‖‖‖‖‖‖‖

N-NH-C6H5

Trong đó, X là -COOC2H5, -SO3H, -CN

Sơ đồ 1.17 Phản ứng tạo thành các arylhydrazon

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là các dẫn chất hydrazon mang khung indole, được tổnghợp theo hai quy trình:

 Quy trình 1: Nguyên liệu ban đầu là methyl 1H-indole-2-carboxylate, sản

Bảng 2.1 Danh sách các dẫn chất hydrazon mang khung indole nghiên cứu

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Nguyên liệu

Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp được đặt mua từ các nhà cungcấp Aldrich, Merk với độ tinh khiết trên 98% và được sử dụng trực tiếp, không phảitrải qua bất kì quá trình tinh chế nào Bao gồm:

- Methyl 1H-indole-2-carboxylate - Methyl 1H-indole-3-carboxylate

- 4-chlorobenzaldehyde - 4-nitrobenzaldehyde

- 4-hydroxybenzaldehyde - Hydrazine monohydrate

Các dung môi, hóa chất khác như: n-hexan (C6H14), chloroform (CHCl3),aceton (CH3COCH3), ethanol (EtOH), methanol (MeOH), acid acetic đặc(CH3COOH), ethyl acetat (C4H8O2),

2.2.2 Thiết bị

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, 100 ml, bình nón,

phễu thủy tinh, pipet, ống đong, ống nghiệm, cốc có mỏ các loại, sinh hàn hồi lưu,

- Bình chạy sắc ký, đèn soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm, bản mỏng silicagel 60F254 (Merk)

- Cân kĩ thuật, cân phân tích Sartorius

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA, máy đo điểm nóng chảy Stuart

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Quy trình 1: Tổng hợp các dẫn chất hydrazon mang khung indole từ nguyên

liệu ban đầu là methyl 1H-indole-2-carboxylate theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydrazon mang khung indole II a-c

Tác nhân và điều kiện: a) Hydrazin, ethanol, đun hồi lưu

b) Dẫn chất benzaldehyde, ethanol, acid acetic đặc, đun 60-70 ° C.

Quy trình 2: Tổng hợp các dẫn chất hydrazon mang khung indole từ nguyên

liệu ban đầu là methyl 1H-indole-3-carboxylate theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydrazon mang khung indole II d-f

Tác nhân và điều kiện: a ꞌ ) Hydrazin, ethanol, đun hồi lưu.

b ꞌ ) Dẫn chất benzaldehyde, ethanol, acid acetic đặc, đun 60-70 ° C.

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng với ba hệ dung môipha động khác nhau, quan sát các vết sản phẩm dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm

Đo nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất tổng hợp được

2.3.1.3 Xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được

Các chất sau khi tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấutrúc bằng phương pháp phổ: Phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhânproton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR)

- Phổ MS: ghi tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam bằng máy sắc ký khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, hoạt động theo phương phápphun mù điện tử ESI, dung môi MeOH

biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million-ppm), lấy mốc là pic của chấtchuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3.2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Namtheo phương pháp của Skekan và công sự (1990)

Dòng tế bào thử nghiệm: Tế bào ung thư ruột kết ở người (HT-29).

Nguyên tắc thử: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng

số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phầnprotein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đođược tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càngnhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiệntrong điều kiện cụ thể như sau: