Báo cáo xây dựng tiêu chuẩn dược liệu diếp cá

Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, dùng đũa thủy tinh ấn chặt xuống,thêm vài giọt dung dịch fuchsin đã khử màu để làm ướt bột ở phía trên, để yên mộtlúc.. Định tính cụ thể các hoạt ch

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y – DƯỢC ĐÀ NẴNG

ĐÀ NẴNG – THÁNG 9 NĂM 2019

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1 Tên gọi 4

2 Mô tả đặc điểm 4

3 Phân bố và thu hoạch 4

4 Vi phẫu 4

4.1 Các bước tiến hành nhuộm vi phẫu 4

4.2 Mô tả vi phẫu: 5

Trong đó: 7

A- Hình dạng tổng quát gân lá (Sketch of leaf midvein) 7

B- Vi phẫu mặt cắt ngang gân lá (Section illustration of leaf midvein) 7

C- Các hạt tinh bột và cụm tinh thể canxi oxalat rải rác trên diệp nhục (Starch granules and clusters of calcium oxalate scattered in mesophyll) 7

D- Hình dạng tổng quát thân (Sketch of stem) 7

E- Vi phẫu mặt cắt ngang thân (Section illustration of stem) 7

F- Cụm tinh thể canxi oxalat rải rác trong lõi (Clusters of calcium oxalate scattered in pith) 7

4.3 Soi bột 7

Trong đó: 9

a- Hình quan sát dưới kính hiển vi quang học (the light microscope) 9

b- Hình quan sát dưới kính hiển vi phân cực (the polarized microscope) 9

4.4 Thành phần hóa học 9

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

1 Đối tượng nghiên cứu 12

2 Thuốc thử - dung môi - hóa chất - phương tiện nghiên cứu 12

3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.1 Đặc điểm thực vật: 12

3.2 Thành phần hóa học: 12

3.2.2 Định lượng: 16

3.3.3 Độ ẩm: 16

2.3.4 Độ tro 17

2.3.5 Tỷ lệ vụn nát 17

2.3.6 Tạp chất 17

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

1 Về mặt thực vật 19

3.2 Về mặt vi phẫu 19

3.2.1 Lá 19

3.2.2 Thân 19

3.3 Bột 19

3.3.1 Lá 19

3.3.2 Thân 19

3.4 Thành phần hóa học 19

3.4.1 Kết quả phân tích sơ bộ 19

3.4.2 Kết quả định tính sắc ký lớp mỏng hợp chất Flavonoid 20

3.4.3 Kết quả định tính sắc ký lớp mỏng hợp chất Flavonoid 21

3.5 Định lượng 21

3.6 Độ ẩm 21

3.7 Độ tro 22

3.7.1 Tro toàn phần 22

3.8 Tỷ lệ vụn nát 22

CHƯƠNG IV XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU 24

4.1 Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 24

Alcaloid 24

Flavonoid 24

Đường khử 24

Polysaccharid 24

4.2 Thuyết minh tiêu chuẩn 25

4.2.4 Chỉ tiêu độ tinh khiết 26

CHƯƠNG V KẾT LUẬN 27

KIẾN NGHỊ 27

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1 Tên gọi

Tên dược liệu: Ngư tinh thảo

Tên khoa học: Herba Houttuyniae cordata

Cây cung cấp dược liệu: Diếp cá

Tên khoa học: Houttuynia cordata Thunb

Họ: Lá giấp, Giấp cá Saururaceae

Tên Việt Nam: Rau diếp cá, Rau giấp cá, Cây lá giấp, Ngư tinh thảo

2 Mô tả đặc điểm

Loại cây thân cỏ, sống nhiều năm; Chiều cao 15-50cm Thân hình trụ tròn haydẹt, cong, dài 20 cm đến 35 cm, đường kính 2 mm đến 3 mm Mặt ngoài màu vàng nâunhạt, có vân dọc nhỏ và có mấu rõ Các mấu ở gốc thân còn vết tích của rễ Màu lụchoặc tím đỏ, không có lông

Lá mọc so le, hình tim, có bẹ, đầu lá hơi nhọn Phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, có

7 gân chính từ đáy mọc lên Cuống đính ở góc lá dài chừng 2 cm đến 3 cm, gốc cuốngrộng thành bẹ mỏng Mặt trên lá màu lục, vàng sẫm đến nâu sẫm ; mặt dưới màu lụcxám đến nâu xám

Cụm hoa hình bông bao bởi 4 lá bắc màu trắng, dài 1-3cm Trong chứa nhiều hoanhỏ màu vàng nhạt, trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá bắc giống như một câyhoa đơn độc

Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn

Mùi tanh cá Vị hơi chát, se Thể chất giòn, dễ gãy

3 Phân bố và thu hoạch

Lục địa châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, cácnước Đông Nam Á Ở Việt Nam, diếp cá mọc hoang ở chỗ ẩm ướt

Có thể thu hái lá quanh năm, nhưng tốt nhất là thu hái lá vào mùa hạ, khi câyxanh tốt có nhiều cụm quả Lúc trời khô ráo cắt lấy phần trên mặt đất, loại bỏ gốc rễ,phơi hoặc sấy khô nhẹ

4 Vi phẫu

4.1 Các bước tiến hành nhuộm vi phẫu

B1: Dùng dao lam cắt vi phẩu thân, cuống lá, lá diếp cá sao cho độ dày từng látcắt khoảng <1 mm Dao lam khi cắt đặt thẳng góc với mẫu vật

B2: Ngâm vi phẩu trong nước Javel cho đến khi vi phẫu trắng

B3: Loại hết Javel ra rửa bằng nước cất (khoảng 3 đến 4 lần )

B4: Ngâm vi phẩu đã rửa trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút

B5: Loại bỏ hết acid acetic

B6: Ngâm vi phẫu trong thuốc nhuộm 30 phút

B7: Rửa thuốc nhuộm bằng nước cất

B8: Bảo quản trong nước cất rồi xem

4.2 Mô tả vi phẫu:

4.2.1 Vi phẫu lá:

Biểu bì trên và dưới của lá gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, manglông tiết đầu đơn bào, chân đa bào và lông che chở đa bào có xen lẫn tế bào tiết màuvàng ở mặt trên gân lá Ở mặt dưới phiến lá có lỗ khí Hạ bì trên từ phiến lá chạy quagân giữa gồm một lớp tế bào to, thành mỏng Hạ bì dưới tế bào bé hơn, bị ngăn cáchbởi một số tế bào mô mềm ở giữa gân lá Mô mềm có tế bào thành mỏng và ít khuyếtnhỏ Bó libe-gỗ ở giữa gân lá gồm có bó gỗ ở trên, bó libe ở dưới Mô mềm phiến lá

có những khuyết nhỏ và bó libe gỗ nhỏ

Hình 1: Vi phẫu lá, thân cây Diếp cá

Trong đó:

A- Hình dạng tổng quát gân lá (Sketch of leaf midvein)

B- Vi phẫu mặt cắt ngang gân lá (Section illustration of leaf midvein)

C- Các hạt tinh bột và cụm tinh thể canxi oxalat rải rác trên diệp nhục (Starch granules and clusters of calcium

oxalate scattered in mesophyll)

D- Hình dạng tổng quát thân (Sketch of stem)

E- Vi phẫu mặt cắt ngang thân (Section illustration of

stem)

F- Cụm tinh thể canxi oxalat rải rác trong lõi (Clusters of calcium oxalate scattered in pith)

1 Biểu bì trên (Upper epidermis)

2 Mô dậu (Palisade tissue)

3 Mô xốp (Spongy tissue)

4 Tế bào tiết tinh dầu (Oil cell)

5 Lông che chở đơn bào (Non-glandular hair)

6 Chất gỗ (Xylem)

7 Libe (Phloem)

8 Mô giữa (Collenchyma)

9 Biểu bì dưới (Lower epidermis)

10 Các hạt tinh bột (Starch granules)

11 Cụm tinh thể canxi oxalat (Cluster of calcium oxalate)

Màu lục vàng, vị hơi mặn, hơi cay, mùi tanh

Mảnh biểu bì trên và biểu bì dưới gồm tế bào hình nhiều cạnh thành hơi dày,mang tế bào tiết Biểu bì dưới có lỗ khí, tế bào tiết tròn, chứa tinh dầu màu vàng nhạthay vàng nâu, bề mặt có vân, xung quanh có 5-6 tế bào xếp toả ra Lỗ khí có 4-5 tế bào

kèm nhỏ hơn Lông che chở đa bào và tế bào tiết Hạt tinh bột hình trứng, có khi trònhay hình chuông dài 40 µm, rộng chừng 36 µm Mảnh thân gồm tế bào hình chữ nhậtthành mỏng và tế bào tiết Mảnh mạch xoắn.

Hình 2: Vi phẫu bột cây Diếp cá

1 Tế bào tiết chứa tinh dầu (Oil cell)

2 Lông che chở (Glandular hair)

3 Lông che chở đơn bào (Non-glandular hair)

4 Các cụm tinh thể canxi oxalat (Clusters of calcium oxalate (4-1 small ones, 4-2 large ones)

5 Tế bào biểu bì của lá (Epidermal cells of leaf)

Toàn cây Diếp cá có chứa tinh dầu Thành phần chủ yếu trong tinh dầu là aldehyd

và dẫn xuất nhóm ceton như methyl-n-nonyl ceton (thành phần làm rau diếp cá khi vò

có mùi tanh), l-decanal, l- dodecanal, 3-oxododecanal Nhóm terpen: bao gồmcamphen, myrcen, α-pinen, limonen, linalol, bornylacetat, geraniol, caryophylen Tùy mỗi vùng miền mà thành phần và hàm lượng trong tinh dầu cũng khác nhau:

- Tinh dầu Diếp cá khô mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong đó có 4hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen 3,15%, 2- undecanon 15,15%, propen1- methoxy-2-methyl 12,12%, 1R-α-pinen 11.03% Tinh dầu diếp cá tươi có 34 thànhphần và hàm lượng tinh dầu trong diếp cá tươi gấp 4,3 lần hàm lượng tinh dầu trongdiếp cá khô

- Tinh dầu diếp cá mọc tại miền nam có 19 hợp chất trong đó thành phần chủ yếu

là 2(10)-pinen, (1S,5S)-(-) 82,84%, ocimen 6,15%, ceton methyl nonyl 6,44%

- Diếp cá tươi mọc tại Trung Quốc có 38 thành phần, trong khi đó thành phần tinhdầu trong diếp cá khô chỉ có 22 hợp chất : β-mycen 3,47%, L- nanonol 6,21%, α-terpineol 13,24%, methyl nonyl ceton 35,2%, bornyl acetal 5,52%, n-decanoic acid10,58%, caryophyllen 3,41%, docosanoic acid ethyl ester 5,34%

Acid hữu cơ: acid caprinic, acid decanoic, acid palmetic, acidhexadecanoid.

Flavonoid: Trong lá diếp cá chứa nhiều các flavonoid như Quercitrin, Quercetin,

Isoquercitrin

QuercetinQuercitrin

Isoquercitrin

Sterol: Lá diếp cá rất giàu sterol là β-sitosterol

Alkaloid: Lá diếp cá chứa một ít các alkaloid chủ yếu như Aristolactam I (AL-I),

Aristolactam II (AL-II)

Các thành phần khác:

Theo các kết quả nghiên cứu sơ bộ được công bố gần đây, trong 100g rau diếp cá

có nước 91,5%, protid 2,9%, glucid 2,7%, lipit 0,5%, cellulose 1,8%, calci 0,3%, kali0,1mg, β-caroten 1,26mg, vitamin C 68mg

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Dược liệu cây diếp cá: thu hái tại quận Ngũ Hành Sơn, Thành phố Đà Nẵng vàotháng 9/2019

2 Thuốc thử - dung môi - hóa chất - phương tiện nghiên cứu

Thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V

Phương tiện nghiên cứu:

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Đặc điểm thực vật:

- Phân tích hình thái thực vật, vi phẫu

- Nghiên cứu đặc điểm vi học dựa theo tài liệu

3.2 Thành phần hóa học:

3.2.1 Định tính

3.2.1.1 Định tính các nhóm hoạt chất chính bằng phản ứng hóa học

Toàn thân cây diếp cá đem sấy ở nhiệt độ dưới 50 độ C, đem tán nhỏ bảo quảntrong túi nilon kín, để chỗ thoáng mát, khô ráo để làm các phản ứng hóa học định tínhtheo các tài liệu chuyên sâu

a Định tính bột diếp cá theo tiêu chuẩn DĐVN V

A Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (366 nm), thân và bột lá phát quang màu nâuhung B Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, dùng đũa thủy tinh ấn chặt xuống,thêm vài giọt dung dịch fuchsin đã khử màu để làm ướt bột ở phía trên, để yên mộtlúc Nhìn qua ống nghiệm thấy bột ướt có màu hồng hoặc màu tím đỏ

C Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol, đun hồi lưu trên cách thủy 10 min,lọc Lấy 2 ml dịch lọc, thêm ít bột magnesi và 3 giọt acid hydrocloric, đun nóng trêncách thủy, sẽ xuất hiện màu đỏ

b Định tính cụ thể các hoạt chất trong Diếp cá

Định tính tinh dầu:

Lấy 50g bột dược liệu cất lấy tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước Xác định hàm lượng tinh dầu chưng cất được, mô tả màu sắc, mùi vị đặc trưngcủa tinh dầu

Nhỏ 1 giọt tinh dầu lên giấy mỏng, để khô trong gió hay hơ nóng nhẹ cho bay hếtmùi tinh dầu Không được xuất hiện vết bóng mờ hoặc vết dầu mỡ

Định tính các thành phần trong dịch chiết nước

Lấy khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nướccất, đun sôi trong 5 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc để làm các phảnứng:

Định tính acid hữu cơ:

Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml dịch lọc, thêm 1 ít tinh thể Na2CO3,nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính

Định tính vitamin C:

Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 1-2 giọt đ HNO3, sau đó thêm2-3 giọt AgNO3 5% lắc đều, có tủa xám xuất hiện là phản ứng dương tính

Định tính đường khử :

Lấy dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm vào đó 1 ml dung dịch thuốc thử Felling

A và 1 ml dung dịch thuốc thử Felling B Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuấthiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính

Định tính acid amin:

Lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 ml, thêm 5 giọt thuốc thử Nihydrin3%, đun cách thủy trong 2 phút nếu thấy xuất hiện màu xanh thì phản ứng dương tính

Định tính Polysaccharid:

Cho dịch lọc thu được vào 3 ống nghiệm:

Ống 1 : 4ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol.

Ống 2 : 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol.

Ống 3 : 4ml dịch lọc.

Quan sát so sánh màu giữa 3 ống nghiệm Phản ứng dương tính khi ống 1 có màuđậm hơn ống 2 và ống 3

Định tính các thành phần trong ether dầu hỏa

Cân 15g bột dược liệu cho vào bình chiết Soxhlet với dung môi chiết xuất là etherdầu hỏa Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và tiến hành định tính các thành phần trongether dầu hỏa

Định tính chất béo :

Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi,quan sát xem có vết mờ hay không, nếu có thì phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thủy đếncắn Thêm vào ống nghiệm khoảng 1 ml anhydric acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Đểống ngiêng 45°, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, nếu mặt phân cách cóvòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính

Định tính các thành phần trong ethanol

Lấy 15g bột dược liệu chiết bằng ethanol 90% trong bình Soxhlet Dịch chiếtđược lọc, lấy dịch lọc để làm các phản ứng định tính:

Định tính Flavonoid:

+ Phản ứng với dd kiềm loãng:

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dd NaOH 10% nếu thấy xuấthiện tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính

+ Phản ứng Cyanidin:

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại và 3 - 5 giọtHCl đặc Lắc đều, đun cách thủy vài phút nếu xuất hiện màu hồng thì phản ứng dươngtính

Định tính alkaloid

Cho khoảng 20 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, thêm 10ml dd

H2SO4 1N, đun sôi , để nguội Lọc vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dd amoniacđặc (thử bằng giấy quì), sau đó lắc với chloroform 3 lần, mỗi lần 5ml Gạn lấy lớpdung môi hữu cơ, rồi cho bốc hơi cách thủy tới khô, thu được cắn alkaloid base Hòatan cắn alkaloid base bằng 3ml dd H2SO4 1N, chia dịch chiết này vào 3 ống nghiệm

Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Mayer → nếu xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

5 Butyl acetat – Acid formic- nước 15:5:5

Dung dịch thử : lấy một lượng dịch chiết cồn cho vào cốc có mỏ 100ml, đun cáchthủy đến cạn lấy cắn Hòa tan cắn với dung môi triển khai sắc kí trong từng hệ thíchhợp

Tiến hành chấm sắc ký: chấm lên bản mỏng 20µl dung dịch thử (chấm điểm) Saukhi khai triển, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng, quan sát bằng UV 265nm, 254nm

và thuốc thử hiện màu, ghi nhận lại sắc ký đồ

Định tính β-sitosterol:sitosterol

Chiết β-sitosterol bằng phương pháp ngâm chiết:

Nguyên liệu diếp cá khô sau khi đã được xử lý cho vào bình dung tích 5 lít, chotiếp cồn 90%, khuấy cho nguyên liệu thấm đều dung môi đậy kín bình Tiến hànhngâm chiết 3 lần, mỗi lần 3 ngày, gộp dịch chiết rồi cất đuổi dung môi thu được cao,tiếp tục chiết với dung môi ete dầu hỏa thu được cao ete dầu hỏa Tiến hành xà phònghóa cao ete dầu hỏa rồi chiết bằng dung môi n-hexan, thu hồi dung môi thu được caon-hexan

Mẫu cao n- hexan được hòa tan vào cloroform

Bảng mòng silicagel 60-F254 dày 0,2mm

Chấm khoảng 0,2µl mẫu thử lên bảng mỏng

Khảo sát hệ dung môi tiến hành sắc kí lớp mỏng, phát hiện vết bằng thuốc thửhiện màu H2SO410%/ethanol, soi UV 254nm.

3.3.3 Độ ẩm:

Khảo sát thời gian đo độ ẩm: Sấy bì đến khối lượng không đổi để xác định khốilượng bì Cân 2g bột dược liệu cho vào bì trên rồi đem sấy ở 1000C, lần 1 sấy trong 1giờ, tiếp tục những lần sau cách 30 phút đến khi khối lượng không đổi, tức là sự chênhlệch khối lượng so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg

Đo độ ẩm: Sấy bì đến khối lượng không đổi để xác định khối lượng bì, Cân 2gbột dược liệu cho vào bì trên Sau đó sấy dược liệu ở 1000C trong thời gian đã khảosát Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gelrồi cân ngay Kết quả có được là trung bình của 3 lần đo

2.3.4 Độ tro

2.3.4.1 Tro toàn phần

Tro toàn phẩn Không quá 14,0 % (Phụ lục 9.8)

Phương pháp 1: Với mẫu thử là dược liệu, thuốc từ dược liệu:

Cho 2 g đến 3 g bột mẫu thử vào một chén sử hoặc chén platin đã nung và cân bì.Nung ở nhiệt độ không quá 450°C tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân Bằngcách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khốichất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro Rửa đũathủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc Cho giấy lọc và cắn vào chénnung rồi nung đến khi thu dược tro màu trắng hoặc gần như trắng Tập trung dịch lọcvào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450°Cđến khi khối lượng không đổi Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đălàm khô trong không khí

Phương pháp 2: Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút Đểnguội trong bình hút ẩm rồi cân Lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1h ở100°C đến 105°C rồi đem nung trong lò nung ở 600°C ± 25°C Sau mỗi lần nung, lấychén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân Trong quá trình thaotác không được để tạo thành ngọn lửa Nếu sau khi đã nung lâu mà vần chưa loại hếtcarbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lạinung cắn và giấy lọc trong chén nung Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làmbốc hơi cấn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi

2.3.4.2 Tro sulfat

Nung một chén sứ hoặc chén platin tới đỏ trong 10 phút Để nguội trong bình

hút ẩm rồi cân Sau đó cho 1 g mẫu thử vào chén nung, làm ẩm với acid sulfuric (TT),đốt cẩn thận rồi lại làm ẩm với acid sulfuric (TT) và nung ở khoảng 800°C Làm nguộirồi cân Nung lại 15 phút, làm nguội rồi cân nhắc lại Lặp lại quá trình này cho đến khihai lần cân liên tiếp, khối lượng không chênh lệch nhau quá 0,5 mg

2.3.5 Tỷ lệ vụn nát

Cân một lượng dược liệu nhất định (p gam) đã được loại tạp chất Rây qua rây có

số quy định theo chuyên luận riêng Cân toàn bộ phần đã lọt qua rây (a gam) Tính tỷ

lệ vụn nát (X%) (từ kết quả trung bình của ba lần thực hiện) theo công thức: