Thực hành vi sinh thực hành vi sinh bệnh Động vật

Cach pha môi trường thể lỏng Bước 1: Dựa trên hướng dẫn trên nhãn dán, ta tính ra được lượng môi trường cần dùng, sử dụng cân điện tử để cân lượng môi trường rồi dùng máy khuấy từ gia nh

Urs

Đại học Công nghệ Tp.HCM

Khoa Thú Y — Chăn Nuôi

BAO CAO THUC HANH VI SINH

BENH DONG VAT

Ngành: Thú Y — Chăn Nuôi

Sinh viên thực hiện: Lớp:

ly

Họ và tên các sinh

viên:

-MSSV:

-MSSV:

-MSSV:

Nhan xét chung

Điêm báo cáo

Ths Truong Anh Thy

MỤC LỤC

I Dung cu, hoa chất và vật tee thOU AGO ccccccccccccccssescscevesesesvsveveceseseeveesesesevsvavevivseseseseses 5

2 Thiết bị Vi SỈHỈ - 55c 2 St 2 E2 2121211 2t 2e 5

3 Miẫu bệnh phẩm: Thịt, phôi, gan, ruột, phan (ChO) 0.cccccccccccsceesseseesseseeeesessesvseeeeees 6

1, M6i trudng MC (MacConkey) 0n ốốeeewẽgÖ)Ẵ|1 7

3 Môi trường BGA (Prilliant (1reeH ÁĐŒF)L à cctckn HH HH HH HH tk hà, 9

4 Môi trường BA (Bloodl ẢB@F) ác kTnkHS HH TH KH HH TH Hy TH KH tk KH kg kh 9

III Quy trình cấy mẫu lên đĩa thạch petri 5 ss sessssssse se se se saesssessese 11

IV Phương pháp nhuộm TFA - 75G 7G 0 356018303030309 34 5 9590300904 ng ng 09 t 12

TL Chudin bi cart KRUGI cc cccccccccccccccscccscscscscscscsescscsvsvecsvecevivevevavevevavevevacevsssesecsesececsesees 13

2 Thie nghiém trén mGi truOng di AGING ccc ccc ccc cect cette t nets ees teeeaeeces teens teeeeennes 14

3 Thre nghiém phan veng OXIAGSC cece cece cece cee cette eect ce ee cee e eee ee TT TH KH khay 14

S27 7, sẽ nh e 15

a Két quả thứ nghiệm trên môi trường di động, cay 15

b Kết quá thử nghiệm phản ứng ÓOxiqs€ SH H Hee 15

ôn ố 17

b Tiến hàn ST TT HH HH HH HH HH HH HH rue 17

I Chuẩn bị

I Dung cụ, hóa chat va vật tư tiếu hao

- Đĩa petri vô tring, que cay thang, que cấy vòng

- Binh Duran, ống đong

- Cén 90°C

- Nước cất

- Ông nghiệm, bông gòn không thắm đề nút ống nghiệm -Môi trường nuôi cấy:

+MC (MacConkey)

+ RVS (Rappaport Vassnliadis Soya Broth)

+ BGA (Brilliant Green Agar)

+ BA (Blood Agar)

+ MSA (Mannitol Salt Agar)

- Dén con

- Khau trang

- But viét kinh

- Bật lửa

- Côn sát trùng tay nhanh

- Micropipep

- Phién kinh

- Bộ thuốc nhuộm Gram

2 Thiết bị vi sinh

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Cân điện

Hình 1.2: Can điện

- Nồi hấp tiệt trùng

Hình 1.3: Nỗi hấp tiệt trùng

- Tu say

- Tủ ấm

3 Mẫu bệnh phẩm: Thịt, phôi, gan, ruột, phân (chó)

4 Môi trường nuôi cấy

a Cách pha môi trường thỂ rắn

Bước 1: Dựa vào hướng trên nhãn chai (về liều lượng) và quy tắc tam suất (dé tính liều

lượng) đề pha đủ lượng môi trường cần dùng Sử dụng cân điện tử để cân đủ lượng môi

trường cần dùng

Bước 2: Bỏ cá từ vào bình duran và đặt lên máy khuấy từ gia nhiệt, cho đến khi bột hòa tan vào trong nước cất

Bước 3: Cho bình duran cùng các dụng cụ cay vào nổi tiệt trùng với nhiệt độ 121°C trong

khoảng 30 phút, đợi đến khi nhiệt độ trở về còn 70°C thì lấy ra, để ngụi xuống khoảng 50°C (có thể sẽ phải trộn thêm máu cừu như của môi trường BA)

Bước 4: Lấy bình duran đồ vào từng đĩa petri (phải luôn giữ bình đung duran ở nhiệt độ khoảng 50 °C) và cùng lúc đó mỗi lần đỗ sẽ hơ miệng bình duran trên đèn cồn I lần để

khử trùng, đảm bảo kết quả khi thực hiện

* Phuong pháp đồ đĩa

- Van nap bình duran tv tu sau đó hơ miệng bình qua đèn cồn lập lại thao tác suốt

quá trình làm

mở hé nắp trên của đĩa

- _ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc

- Sau khi thạch dộng lật ngược hộp petr1 để hơi nước bốc ra không bị rớt ngược lại

môi trường

Bước 5: Chờ thạch đông hoặc chúng ta có thể bắt đầu bỏ vào tủ sấy cho khi thạch khô ráo hoàn toàn va bat dau cay

b Cach pha môi trường thể lỏng

Bước 1: Dựa trên hướng dẫn trên nhãn dán, ta tính ra được lượng môi trường cần dùng,

sử dụng cân điện tử để cân lượng môi trường rồi dùng máy khuấy từ gia nhiệt đê khoáy đều hỗn hợp môi trường

Bước 2: Cho hỗn hợp môi trường vào ống nghiệm rồi cho vào nồi tiệt trùng với nhiệt độ

121°C trong khoảng 30 phút

Hình 1.4: Môi trường RVS được đựng trong ống nghiệm

Bước 3: Chờ hỗn hợp môi trường ngựi rồi bắt đầu cấy bệnh phẩm vào

IL Một số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn

1, M6i truong MC (MacConkey)

* MacConkey Agar dung để nuôi cay chon loc cac truc khuan gram am, dac biét danh cho

nuôi họ vi khuân đường ruột và chỉ Pseudomonas E.coli trên môi trường MC tạo khuẩn lạc màu hồng đỏ, hơi lỗi, trơn bóng, đường kính khoảng 1-2mm Salmonella trén méi trường MC tạo khuẩn lạc màu trắng phớt hồng, tròn, trơn, đường kính khoảng Imm

* Macconkey Agar còn có khả năng phân biệt được giữa vi khuẩn có lên men lactose và không lên men lactose #.cø/; lên men đường lactose nên sinh ra axIt => pH môi trường

SẼ giảm => môi trường sẽ có màu đỏ trung tính, tạo khuân lạc đỏ hông

2 Méi truong RVS (Rappaport Vassiiliadis Soya Broth)

*® Môi trường RVS hay môi trường tăng sinh, được sử dụng trong quá trình phân lập Salmonella Vi khuan Salmonella hién dién it trong mau va dé tốn thương trong quá trình phân lập, nuôi cấy Nên vi khuẩn cần cần gia tăng số lượng ở môi trường RVS trước khi được cấy vào môi trường BGA

4 KÝ“

Bx de đồ Š

3 Môi trường BGA (Briliiant Green Agar)

* Sau khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh RVS, ủ ở nhiệt độ 41°C trong 24h, sau đó cây truyền sang môi truong BGA dé nudi cay Salmonella

Hình 2.5: Môi trường BGA — Hình 2.6: Khuân lạc trong môi trường thạch BGA

4 Môi trường BA (Blood Agar)

* Thạch máu (BA) là môi trường làm giàu được sử dụng để nuôi cấy những vi khuân

hoặc vi sinh vật mà không cấy dễ dàng Những vi khuẩn này được gọi là “khó tính” vì

chúng cần một môi trường giàu dinh dưỡng đặc biệt được so sánh với những vi khuẩn thông thường khác

* Loại máu tốt nhất đề làm thạch máu là máu cừu

3 Méi trudng MSA (Mannitol Salt Agar)

* Manitol Salt Agar duoc str dung dé phan lap, phát hiện và đếm khuẩn tụ cầu gây bệnh trong nước lọc như trong nước hồ bơi, nước uông hoặc suôi nước khoáng Nó cũng được dùng đề phát hiện Staphylococcus aureus

% Đặc điểm môi trường sau khi cấy:

Mẫu từ gan

Đặc điềm

Khuẩn lạc có màu vàng

Môi trường xung quanh chưa chuyền màu

Khuan lac tron, 16i , hình cầu

Kích thước: 0,1-0,4cm

Giải thích

Vi khuẩn lên men đường => sinh ra axit =>giảm pH, môi

Hình 2.9-1: Khuẩn lạc mẫu gan

Những vi khuẩn không lên men đường sẽ có màu trắng

hồng và môi trường không chuyên màu

Mẫu cấy từ thịt

Đặc điềm

Khuẩn lạc có màu vàng

Môi trường xung quanh vàng đậm vàng nhạt và một ít đỏ,

khuân lạc nhỏ, tròn, lôi

i xc: 0,05-0,3cm ; me

Vi khuẩn lên men đường => sinh ra axit =>giam pH, môi trường sẽ chuyên sang vàng,

khuẩn lạc sẽ có màu vàng

Những vi khuẩn không lên men đường sẽ có màu trắng hồng

và môi trường không chuyên màu

Mẫu cấy từ phối

Đặc điềm

Khuẩn lạc có màu trắng và vàng đậm

Môi trường xung quanh chưa có một vùng vàng còn lại không

thay đôi

Khuân lạc tròn, loang, lôi

Hình 2.9-3: Khuẩn lạc phối trong

Kích thước: 0.2-0 8cm

Giải thích

Vi khuẩn lên men đường => sinh ra axit =>giảm pH, môi trường sẽ chuyên sang vàng

khuẩn lạc sẽ có màu vàng

Những vi khuẩn không lên men đường sẽ có màu trắng hồng và môi trường không chuyên màu

II Quy trình cây mẫu lên đĩa thạch petri

Bước 1: Nhúng đầu que cấy vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng Sau đó, để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa

Bước 2: Dùng gap vô trùng gấp mẫu bệnh phẩm quet val duong lên đĩa thạch petri (đối với mẫu bệnh phẩm là khuẩn lạc thì dùng que cấy thăng lấy mẫu rồi pha với khoảng “A giọt nước muối sinh lý được chấm sẵn trên lam kính sau đó mới dùng que cay vòng cây lên đĩa thạch petri hay đối với mẫu bệnh phẩm ở dạng lỏng thì dùng que cấy vòng chấm vào dung dịch mẫu bệnh phẩm rồi cấy lên đĩa thạch petri) Thao tác cấy được thực hiện như sau:

Lưu ý: Nếu dùng: que cấy kim loại thì sau moi lan cay 6 1 vung khác đều phải đốt tiệt trùng que cấu nếu dùng que cấy vô khuẩn 1 lần thì sau mỗi lần chuyên vùng cấy cần thay que khác

+Cay vùng I: Dùng que cấy có bệnh phẩm tạo một vùng nguyên ủy ở rìa đĩa thạch nuôi cay sau do na déu v1 khuân theo đường zIczac với diện tích chiêm 1/4 diện tích đĩa thạch Luu ý: các đường cây ở vùng sau phải chạm vào đường cây ở vùng trước đề đảm bảo vi

khuân mọc được ở tất cả các vùng và tạo khuẩn lạc riêng rễ

+ Cay vùng 2: xoay đĩa 90 độ, tiến hành cấy vùng 2 bằng cách di chuyển que cấy theo đường zIczac thưa hơn so với vùng | va ving 2 cũng chiêm 1/4 đĩa

+ Cay vùng 3: xoay đĩa 90 độ và cấy tương tự như cấy vùng 2 Sao cho 2 - 3 đường cấy ở vùng 3 cũng phải chạm vào vùng 2 và đường cây thưa hơn so với vùng 2 Diện tích cây là

1/4 đĩa thạch tiếp theo

+ Cấy vùng 4: xoay đĩa 90 độ và cấy tương tự như trên ở 1⁄4 đĩa cuối cùng

Bước 3: Sau khi cấy xong thì mang đĩa môi trường (MC, MSA, BA) đã cấy vào tủ ấm (37 °C), môi trường RVS (ống nghiệm) vào tủ ấm ( 41.5°C ) có thể có khí CO; hoặc không (tùy từng loại môi trường) Sau 24 giờ lấy mẫu ra khỏi tủ âm và quan sát khuẩn lạc trên môi trường MC, MSA, BA Tiến hành cấy truyền mẫu từ môi trường RVS vào môi trường BGA

Hình 3: Minh họa kĩ thuật cấy vì khuẩn lên đĩa thạch petri

IV Phương pháp nhuộm Gram

1 Nguyên tắc nhuộm Gram

* Vi khuan bat mau Gram - hay Gram + do sự khác nhau về thành phần vách tế bào của vi khuẩn:

Gram - (peptidoglycan mỏng) bắt màu đỏ hồng

Gram + (peptidoglycan day) bat mau fim

2 Kỹ thuật nhuộm (ram

« Vẽ vòng tròn kích thước 1⁄3 tắm lame và viết kí hiệu ( tên, mẫu, màu) bằng bút lông

* Khử trùng que cấy bằng đèn cồn, dùng que cấy lấy l giọt nước muối sinh lý cho vào giữa hình tròn đã vẽ trên tâm lame, tiếp tục dùng que cấy lấy mẫu khuẩn lạc đã chọn bỏ vào giọt nước rồi phân tán đều trong vòng tròn của tắm lame ( các bước đều phải khử trùng que cấy)

* Hơ tắm lame với khoảng cánh vừa đủ đề làm khô mẫu

s Nhuộm:

1 nhỏ Crystal Violet khắp mẫu, sau l phút rửa lại bằng nước

2 Nhỏ lugol khắp mẫu, sau I phút rửa lại bằng nước

3 Tây cồn trong 3s rồi rửa lại bằng nước

4 Nhỏ Safranin khắp mẫu, sau 1 phút rửa lại bằng nước

=> ta có tiêu bản nhuộm Gram

* Quan sát dưới kính hiển vi điện tử

12

Hình 4.1: Trực khuẩn bắt màu Gram (-); Hình 4.2: Câu khuẩn bắt màu Gram (+)

V Phan ứng sinh hóa

1 Chuẩn bị canh khuẩn

« Cho vào ống nghiệm khoảng 3ml nước mudi sinh ly bang Micropipet Sau do dem di hap tiét tring

* Chon mau, ding que cay thang khir khuan bang nhiét ho nong trén dén c6n, cham lay

mé6t it vi khuan cho vao, lac déu So d6 duc ctia canh khuan voi d6 dyc chuan Me

Farland trén nén giấy trắng Nếu đục hơn so với độ đục chuân Mc Farland thì thêm

vào nước cất, nêu trong hơn thì thêm vào vi khuẩn

Vị khuân được chọn làm canh khuẩn là:

cv le

a >S đà

AM Sz, kAo$z-

ae

Hình 5.1: Khuẩn lạc mẫu phối trên môi trường MSA và mẫu nhuộm Gram soi dưới kính

hiển vì điện tứ

13

Miêu tả khuẩn lạc và mẫu nhuộm Gram:

+ Khuân lạc màu vàng, tròn, trơn láng, môi trường xung quanh bắt màu vàng

+ Tiêu bảng nhuộm vi khuẩn hình cầu, bắt màu tím hơi xanh

> Nghỉ ngờ là vi khuẩn Staphylococcus

2 Thứ nghiệm trên môi trường di động

* Mở nắp lọ Motility và dùng que cấy thăng đã khử khuân lây nhúm khuẩn và cắm thăng

đứng vào môi trường di động

Lieu ý cắm kim cấy cách 12 đáy lọ và rút kìm cấy theo chiều thăng đứng

* Sau đó vặn nắp lọ

* Đọc kết quá sau khi ủ 37 °C /24 giờ

3 1hứ nghiém phan ung Oxidase

* Nhỏ giọt muối sinh lý vô trùng trén lame

* Dùng đĩa kẹp lấy đĩa giấy Oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý vô trùng cho vừa

đủ ướt (không làm quá ướt dia gidy Oxidase) va dat trén lame

* Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giay Oxidase Doc két qua trong | phút

4 Tiến hành phản tng sinh hóa trong 12 giếng

* Dùng Micropipet lấy 100 l canh khuân vào 12 “giếng” trong bộ kít sinh hóa

* Thém | giot parafilm vao giéng 1, giéng 4, giéng 12

* Thém | giot KOH va a - Napthtol vào giếng 10

* Thém | giot thuéc thử tìm Nitrite vào giếng 2 ° 3 a

ki

* Thêm I giọt thuốc thử FeC13 vào giếng 5

ung sinh hoa

* Dậy nắp bảng nhựa lại và nuôi ủ 35 - 37 °C/ 16 - 24 giờ

5 Đọc kết qua

a Kết quả thứ nghiệm trên môi trường di động

* Môi trường có màu đỏ lan khỏi đường cấy => kết quả dương tính (+) (vi khuẩn di động)

Motility

b Kết quá thử nghiệm phản ứng Oxidase

+ Dĩa giấy không đổi màu xanh tím => Oxidase ÂM TÍNH

c Kết quả của phản ứng sinh hóa

Dựa vào bảng sau để độc kết quả những thử nghiệm sinh hóa:

Phenylalanine | s FeCI3 | Dung dich màu xanh

deaminase Nếu để

(PAD) bị mắt

Hình 5.3: Bảng so sánh kết quả của các ứng sinh hóa

Hình 5.4: Kết quả các phản ứng Bảng tổng kết quả của các phản ứng sinh hóa

Nitrate

ONPG

Urease

PAD

Citrate

Esculin

Indol (gi 9

6 Phương pháp kháng sinh đồ

Ý nghĩa: Phương pháp kháng sinh đồ dùng đề xác định sự nhạy cảm của vi khuẩn với

các loại kháng sinh

a Chuan bi

Nguyên vật liệu

- - Chọn đĩa môi trường đã cấy mẫu: Mẫu phổi heo cấy trên môi trường MSA

Cefoperazone (Cf), Polymyxin (Pb), Cefotaxime (Ct), Ampicillin (Am)

* Chuan bi canh khuẩn

° Ông so độ đục Mc Farland

Dung cu:

° Dia petri

° Tu am 37°C

17