Thực hành độc tính trên động vật bài 2

Đây là một loại nấm dược liệu quý, có công dụng trong việc bồi bổ vàhồi phục sức khỏe.Cao chiết là sản phẩm của tiến trình sử dụng các phương pháp ly trích, cô đặcnhằm tách chiết các hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH

Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG SWISS BIO QUA

ĐƯỜNG MIỆNG

TP Thủ Đức, 11/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về cao chiết Đông trùng hạ thảo 2

2.1.1 Khái niệm 2

2.1.2 Công dụng 3

2.2 Định nghĩa độc tính 4

2.3 Định nghĩa LC50 và LD50 5

2.3.1 Định nghĩa LC50 5

2.3.2 Định nghĩa về LD50 5

2.4 Phương pháp xác định độc tính qua đường miệng (LD50 và LC50) 6

2.5 Tổng quan về chuột thí nghiệm 6

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian thực hiện 7

3.2 Mục tiêu 7

3.3 Vật liệu và đối tượng 7

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 7

3.3.3 Dụng cụ và thiết bị 7

3.4 Phương pháp nghiên cứu 7

3.4.1 Cách bố trí thí nghiệm 7

3.4.2 Các bước thực hiện 7

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

4.1 Kết quả và thảo luận 10

4.1.1 Kết quả 10

4.1.2 Thảo luận 11

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 13

5.1 Kết luận 13

5.2 Kiến nghị 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cordyceps militaris 2

Hình 2.2 Đông trùng hạ thảo 4

Hình 2.3 Chuột nhắt thí nghiệm 6

Hình 3.1 Cân khối lượng chuột 8

Hình 3.2 Pha liều lượng thuốc 8

Hình 3.3 Cho chuột uống thuốc 9

Hình 4.1 Sau khi uống thuốc và theo dõi trong vòng 15 phút đầu tiên 10

Hình 4.2 Kết quả uống thuốc thử sau 24 giờ 10

Hình 4.3 Kết quả uống thuốc thử sau 48 giờ 11

Hình 4.4 Kết quả uống thuốc thử sau 72 giờ 11

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Theo dõi tình trạng bất thường của chuột sau khi uống cao chiết Đông

trùng hạ thảo 12

trùng hạ thảo được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền Trung Quốc Ngày nay trênthị trường có rất nhiều thực phẩm chức năng được chiết xuất từ Đông trùng hạ thảo.

Có 400 loài Đông trùng hạ thảo, hầu hết có nguồn gốc từ Bhutan, Trung Quốc,Hàn Quốc, Nepal, Thái Lan và Việt Nam Loài dược liệu được biết đến nhiều nhất có

tên khoa học là Cordyceps sinensis, họ Ophiocordycipitaceae Nấm có thân dài bằng

ngón tay và thường có màu nâu hoặc nâu hơi nâu

Đông trùng hạ thảo được xem là một trong những dược liệu quý hiếm, mang đếnrất nhiều công dụng như tăng cường sức khoẻ, nâng cao thể trạng, phòng tránh ungthư, tốt cho đường huyết, tim mạch, huyết áp, chống oxy hóa và chống viêm Tuynhiên, việc sử dụng hàm lượng Đông trùng hạ thảo cao hay thấp, cách sử dụng có thểảnh hưởng đến công dụng của nó Do đó cần tiến hành thử nghiệm đánh giá độ độccấp tính ở chuột nhắt trắng Swiss Bio qua đường miệng

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát, đánh giá độ an toàn của dung dịch cao chiết Đông trùng hạ thông quađường miệng của chuộ,t xem xét có phản ứng dị ứng hay bất kỳ hiện tượng phản vệnào xảy ra sau đó hay không

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát lượng độc cấp tính từ dung dịch cao chiết Đông trùng hạ thảo trên chuộtqua đường miệng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cao chiết Đông trùng hạ thảo

2.1.1 Khái ni m ệm

Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris thuộc chi Cordyceps, bộ:

Hypocreales Đây là một loại nấm dược liệu quý, có công dụng trong việc bồi bổ vàhồi phục sức khỏe

Cao chiết là sản phẩm của tiến trình sử dụng các phương pháp ly trích, cô đặc

nhằm tách chiết các hợp chất quý từ C militaris, dược liệu tự nhiên Sau đó, các thành

phần này được sử dụng để tổng hợp thành thuốc, thực phẩm sức khỏe… Nhờ đó, conngười có những sản phẩm bổ dưỡng để bổ sung, nâng cao và cải thiện tình hình bệnhtật…Chiết xuất Đông trùng hạ thảo nhằm tạo ra chế phẩm an toàn, đảm bảo các tiêuchuẩn cụ thể Thông thường, sau quá trình này thu được dạng dung dịch hoặc dạng caodược liệu có tác dụng mạnh hơn, hạn chế các tác dụng phụ không mong muốn

Thực hiện chiết xuất là cách để loại bỏ hỗn hợp tạp chất ẩm mốc, nấm hoặc vikhuẩn cùng nhiều loại côn trùng phát triển trong quá trình phơi khô, sấy khô chứatrong đông trùng hạ thảo

Hình 2.1 Cordyceps militaris.

Nguồn: www.dreamstime.com

Duy trì quá trình tuần hoàn, tăng cường oxy trong máu: Adenosin có trong Đôngtrùng hạ thảo giúp gia tăng lượng oxy trong máu, hỗ trợ sự giãn nở của các mạch máu,cung cấp dưỡng khí cho sự tuần hoàn máu của cơ thể.

Cải thiện sức khỏe: Adenosine cùng các thành phần khác trong đông trùng hạthảo có khả năng cung cấp năng lượng cùng các chất dinh dinh dưỡng cần thiết giúpduy trì các hoạt động sống của cơ thể đồng thời hồi phục sức khỏe cũng những ngườimới ốm dậy, cơ thể suy nhược

Cải thiện khả năng sinh lí: Adenosine có tác dụng tích cực trong việc cải thiệntuần hoàn vi và lưu lượng máu cục bộ của thận, bên cạnh đó, hoạt chất này có thể điềutiết hàm lượng prostaglandin trong thận cùng các nội tiết tố, các tổ chức thần kinh củachức năng sinh dục

Ổn định thần kinh: hoạt chất này giúp ổn định tinh thần, giải tỏa căng thẳng mệtmỏi, giảm bớt tình trạng đau đầu, chóng mặt, hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh Bêncạnh đó, Adenosine giúp điều tiết quá trình sinh hóa của giấc ngủ, giúp chúng ta cógiấc ngủ sâu, ổn định thông qua tác dụng ổn định và chống thiếu dưỡng khí Theo một

số kết quả nghiên cứu trên thế giới, Adenosine được ghi nhận với tác dụng giảm kíchthích thần kinh, hoạt chất này có nồng độ thấp bất thường trong những bệnh nhân bịđộng kinh đồng thời làm giảm các cơn co giật của căn bệnh này khi thí nghiệm trênchuột

Hoạt chất adenosine trong đông trùng hạ thảo được ghi nhận với hàm lượng khácao Bởi vậy, việc sử dụng đông trùng hạ thảo sẽ giúp cơ thể hấp thụ được các dưỡng

"tương đối sớm" thường được định nghĩa như là một khoảng thời gian phút, giờ (lênđến 24) hoặc ngày (khoảng 2 tuần) nhưng hiếm khi dài hơn.

Mục đích của thử nghiệm độ độc cấp tính là thu thập thông tin về hoạt độngsinh học của hóa chất và hiểu biết sâu sắc về cơ chế hoạt động của nó Các nghiên cứudài hạn thường bắt đầu bằng việc thực hiện tìm kiếm liều lượng sử dụng trong các điềukiện cấp tính Hơn nữa, thông tin về độc tính hệ thống cấp tính được tạo ra bởi thửnghiệm được sử dụng trong nhận dạng nguy hiểm và quản lý rủi ro trong bối cảnh sảnxuất, xử lý và sử dụng hóa chất Giá trị LD50 (preciseorapproximate) hiện đang là cơ sởcho việc phân loại chất độc hóa học và do đó được yêu cầu bởi các cơ quan chính phủtrong tình huống cụ thể Các động vật được định lượng được quan sát chặt chẽ trong

24 giờ đầu tiên và sau đó từng ngày trong khoảng thời gian 2 tuần và những thay đổi

về ngoại hình và hành vi được ghi nhận Việc sử dụng đánh giá bệnh lý rộng rãi nhưmột phần của nghiên cứu cấp tính Tuy nhiên, tổng số ca mổ được yêu cầu tối thiểu

Hình 2.2 Đông trùng hạ thảo.

Nguồn: nhatnamyvien.com

bởi hầu hết các cơ quan quản lý chính phủ, cũng như xác định trọng lượng trước khidùng thuốc và sau 1 và 2 tuần Xác định giá trị LD50 chính xác trong nghiên cứu về độctính cấp tính được thúc đẩy chủ yếu bởi các yêu cầu khác nhau của chính quyền đốivới việc phân loại hóa chất Trước đây LD50 đã được sử dụng cho các hóa chất côngnghiệp làm cơ sở cho các hệ thống phân loại độc tính khác nhau đã hoặc đang hoạtđộng

về sinh khả dụng của hợp chất được thử nghiệm Kết quả của các cuộc thảo luận rộngrãi về tầm quan trọng của giá trị LD50 và sự phát triển đồng thời của các quy trình thaythế là các cơ quan chức năng ngày nay thường không yêu cầu các xét nghiệm LD50 cổđiển liên quan đến một số lượng lớn động vật Thử nghiệm giới hạn, quy trình liều cốđịnh, phương pháp phân loại chất độc và phương pháp tăng giảm đều thể hiện cácphương án thay thế đơn giản hóa chỉ sử dụng một số động vật Những nỗ lực cũng đã

được thực hiện để phát triển các hệ thống in vitro; ví dụ, người ta gợi ý rằng độc tính

toàn thân cấp tính có thể được chia thành một số yếu tố sinh học, tế bào và phân tử,mỗi yếu tố có thể được xác định và định lượng trong các mô hình thích hợp Sau đó,các yếu tố khác nhau có thể được sử dụng trong các kết hợp khác nhau để mô hình hóa

số lượng lớn các hiện tượng độc hại nhằm dự đoán mối nguy hiểm và phân loại cáchợp chất

Hiện tại, việc dán nhãn hóa chất và phân loại độc tính hệ thống cấp tính dựatrên đường miệng bằng giá trị LD50 được khuyến nghị bởi Tổ chức Hợp tác và Pháttriển Kinh tế (OECD) như sau: rất độc hại khi gây chết với liều lượng <5mg/kg trọnglượng cơ thể; độc hại khi gây chết với liều lượng >5<50mg/kg; có hại khi gây chết vớiliều lượng >50<500mg/kg; và không độc hại là >500<2000mg/kg

2.4 Phương pháp xác định độc tính qua đường miệng (LD 50 và LC 50 )

Nghiên cứu xác định độc tính qua đường miệng sử dụng những con chuột khôngnhịn ăn hoặc nhịn ăn trong vòng 16 giờ và đánh giá lâm sàng dựa trên biểu hiện hành

vi hoặc mức độ gây chết của chuột qua giá trị LC50 và LD50

2.5 Tổng quan về chuột thí nghiệm

Chuột nhắt thí nghiệm, là những con chuột nhỏ thuộc Bộ Gặm nhấm, thường từ

loài chuột nhắt Mus musculus Chuột thí nghiệm thông thường có bộ lông màu trắng

(thường gọi là chuột bạch) được sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm khoa học vềcác lĩnh vực y học, sinh học, tâm lý học hoặc các lĩnh vực khác Các nhà nghiên cứuthường dùng chuột để làm thí nghiệm vì chúng kích thước nhỏ và khá vô hại Chuộtcũng là loài động vật dễ nuôi, không cần nhiều không gian sống, có tốc độ sinh sảnnhanh nên dễ nhân giống hàng loạt với giá rẻ Tuổi thọ của chuột ngắn, chỉ trong mộtvài năm Do đó, các nhà khoa học có thể nghiên cứu những thế hệ khác nhau củachúng dễ dàng Người và chuột có hệ gene giống nhau hơn 90% Điều này khiến chuộttrở thành con vật trung gian thích hợp, giúp các nhà nghiên cứu tìm hiểu cách thứcgene người phản ứng với những nhân tố môi trường tương tự Ngoài yếu tố di truyền,

hệ thống sinh học trong cơ thể chuột, chẳng hạn như các bộ phận cơ thể, cũng hoạtđộng rất giống con người Một trong những lý do quan trọng nhất là chuột dễ biến đổigene

Hình 2.3 Chuột nhắt thí nghiệm.

Nguồn: LiveScience

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian thực hiện

Thời gian: Vào lúc 13h30 chiều thứ 2, ngày 30/10/2023

Địa điểm: Tại phòng BIO317, tòa nhà A1, Khoa khoa học sinh học, Đại họcNông Lâm TP HCM

3.2 Mục tiêu

Khảo sát, đánh giá độ an toàn của dung dịch cao chiết Đông trùng hạ thông quađường miệng của chuột xem xét có phản ứng dị ứng hay bất kỳ hiện tượng phản vệnào xảy ra sau đó hay không

3.3 Vật liệu và đối tượng

3.3.1 Đ i t ối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứu ng nghiên c u ứu

Chuột nhắt thí nghiệm, trọng lượng 30 ± 5 g/con với số lượng 3 con được mua từviện Pasteur; được nuôi trong điều kiện đảm bảo các tiêu chuẩn của viện Pasteur TP.HCM và chăm sóc dựa theo tiêu chuẩn động vật nghiên cứu

3.3.2 V t li u nghiên c u ật liệu nghiên cứu ệm ứu

Dung dịch cao chiết Đông trùng hạ thảo

3.3.3 D ng c và thi t b ụng ụng ết bị ịnh nghĩa LC

Dụng cụ thí nghiệm

Vật tư tiêu hao

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Cách b trí thí nghi m ối tượng nghiên cứu ệm

Phương pháp xác định độc cấp tính đường miệng: cho đối tượng thí nghiệm trựctiếp thử nghiệm mẫu dịch thông qua đường tiêu hóa

Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc thử trên chuột nhắt trắng Swiss Bio bằngđường uống trong thí nghiệm này dựa theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon, hướngdẫn của Tổ chức Y tế Thế giới và thông tư hướng dẫn về thử thuốc trên lâm sàng của

Bộ Y tế

Sau khi cho chuột uống thuốc quan sát, theo dõi biểu hiện và hoạt động của chuộtsau khi uống thuốc 15 phút; 24 giờ và 3 ngày

3.4.2 Các b ước thực hiện c th c hi n ực hiện ệm

Bước 1: cân khối lượng chuột

Bước 2: pha liều 5000mg/kg thể trọng chuột (chuột có trọng lượng trung bìnhkhoảng 33g) Ta có 33g × 5000mg/100g = 165mg mẫu Cân 165mg chế phẩm phatrong 5mL nước/chuột, nhân với số chuột cần uống Sau đó chiết 1mL dung dịch chochuột uống

Bước 3: bắt chuột ra khỏi chuồng bằng cách nắm đuôi chuột Một tay nắm đuôichuột, ngón cái và ngón trỏ của tay còn lại nắm chặt phần da gáy và 2 lỗ tai chuột, đặt

Hình 3.1 Cân khối lượng chuột (a) Khối lượng con chuột 1; (b) Khối lượng con chuột

2; (c) Khối lượng con chuột 3.

C B

A

B A

Hình 3.2 Pha liều lượng thuốc (a) Cân cao chiết Đông trùng hạ thảo; (b) Dung

dịch cao chiết Đông trùng hạ thảo.

chuột nằm ngửa trong lòng bàn tay, 3 ngón còn lại nắm da lưng chuột và giữ thânchuột thẳng

Bước 4: cho kim cong đầu tù vào mõm chuột, đẩy nhẹ từ từ và hơi ngả phần đầu

tù nhẹ vào phía sau đầu chuột để đầu kim vào thực quản thẳng tới dạ dày

Bước 4: theo dõi tình trạng chung của chuột trong vòng 15 phút sau đó quan sáttình trạng và số lượng chuột chết trong vòng 24 giờ kể từ khi cho uống

Bước 5: tiếp tục theo dõi chuột trong 7 ngày tiếp theo Tìm liều cao nhất khônggây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) Từ đó xây dựng

đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử (nếu có)

Hình 3.3 Cho chuột uống thuốc.

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả và thảo luận

4.1.1 K t qu ết bị ả

Kết quả sau khi uống 15 phút: biểu hiện có chút mệt, nằm một chỗ

Ngày thứ nhất sau khi uống: không xuất hiện triệu chứng bất thường (co rút, chán

ăn, sùi bọt mép, ) Tuy nhiên, chuột mệt mỏi nhẹ, giảm vận động

Ngày thứ hai sau khi uống: bình thường, không có biểu hiện chán ăn, hay tiêu chảy, tỉ lệ đề kháng (kháng độc) tốt, chuột hoạt động lại tốt, không có dấu hiệu stress, phân không xuất hiện tiêu chảy hay mùi hôi bất thường

C B

A

Hình 4.1 Sau khi uống thuốc và theo dõi trong vòng 15 phút đầu tiên A Con chuột số 1;

B Con chuột số 2; C Con chuột số 3.

Hình 4.2 Kết quả uống thuốc thử sau 24 giờ A Con chuột số 1; B Con chuột số 2; C Con

chuột số 3.

C B

A

Ngày thứ ba sau khi uống thuốc: chuột bình thường, khỏe mạnh, ăn uống tốt

4.1.2 Th o lu n ả ật liệu nghiên cứu

Sau khi cho chuột uống cao chiết Đông trùng hạ thảo, tất cả chuột khỏe mạnh, ăncám viên, uống nước, tiểu tiện, cử động bình thường và không có chuột chết trong 72giờ quan sát Tiếp tục theo dõi chuột trong 14 ngày ở điều kiện chăm sóc bình thường,kết quả cho thấy không có chuột nào chết, chuột không có dấu hiệu bất thường vềhành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiểu tiện Như vậy, cao chiết Đông trùng hạ thảokhông thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng Swiss Bio

Ảnh hưởng lên tình trạng chung và trọng lượng cơ thể chuột: trong thời gian thínghiệm, 3 con chuột đều sống, hoạt động, ăn uống bình thường, lông mượt, không bịrụng lông hoặc khô cứng lông, mắt sáng, phân khô, nước tiểu bình thường

Hình 4.3 Kết quả uống thuốc thử sau 48 giờ A Con chuột số 1; B Con chuột số 2; C Con

chuột số 3.

C B

A

C B

A

Hình 4.4 Kết quả uống thuốc thử sau 72 giờ A Con chuột số 1; B Con chuột số 2; C Con

chuột số 3.

5.2 Kiến nghị

Đối với thử nghiệm sau, cần tiến hành đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên các

bộ phận trong cơ thể chuột Tiến hành thử nghiệm cao chiết ở các liều lượng khácnhau và số lượng chuột tham gia thử nghiệm lớn hơn để thu thập số liệu từ đó đưa rachính xác liều lượng gây độc LD50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Walum, E (1998) Acute oral toxicity Environmental health perspectives,

106(suppl 2), 497-503

2 Melina, Remy "Why do medical researchers use mice?" LiveScience Nov 16,

2010 (July 2, 2014)

3 WMANK, W., & Perera, B G K (2016) Preparation of medicinal soap

products using the leaf extracts of Punica granatum (pomegranate) International Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 6(2), 7-16.

4 Hanh, V V., Nguyet, N T., Huong, N M., Thanh, H N., Hang, N T., Chi, N.K., & Hoan, N V (2015) a study on acute - and subchronic toxicity of xanthan

gum on white swiss mice Tap Chi Sinh Hoc, 3

https://doi.org/10.15625/0866-7160/v36n3.5978

5 Nguyễn, N T., Lê, Q C., & Nguyễn, T B (2022) Nghiên cứu tính kích ứng da

của gel nano Berberin trên da lành của động vật thực nghiệm Tạp Chí Y Học Thảm Hoạ và Bỏng, 2, 13–22 https://doi.org/10.54804/yhthvb.2.2022.123.

6 Nguyễn Ngọc Trai (2017), "Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi nấm đông trùng

hạ thảo (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh”, Báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường, Trường Đại học Trà Vinh, QT6.2/KHCN 1 -

BM3