Thực hành độc tính trên động vật bài 1

Thực chất, đông trùng hạ thảo là sự kết hợpgiữa sâu non ấutrùng bướm của loài Thitarodes và loài nấm ký sinh Cordycepssinensis.Vào mùa đơng, lồi bướm này đẻ trứng, trứng nở thành các ấu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH

Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG SWISS BIO QUA DA

TP Thủ Đức, 11/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH

Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG SWISS BIO QUA DA

TS LÊ THỊ DIỆU TRANG NGUYỄN LAN ANH 21126009

NGUYỄN THỊ LAN ANH 21126014

ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN 21126287 PHẠM THỊ MỸ HẠNH 21126054

LÊ HOÀNG PHÚC 21126162

TP Thủ Đức, 11/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo 2

2.1.1 Khái niệm 2

2.1.2 Phân loại 3

2.2 Định nghĩa độc tính 3

2.3 Định nghĩa LC50 và LD50 4

2.3.1 Định nghĩa LC50 4

2.3.2 Định nghĩa về LD50 4

2.4 Tổng quan về chuột thí nghiệm 5

2.5 Tổng quan về xà phòng dược liệu 6

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian thực hiện 7

3.2 Mục tiêu 7

3.3 Vật liệu và đối tượng 7

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 7

3.3.3 Dụng cụ và thiết bị 7

3.4 Phương pháp nghiên cứu 7

3.4.1 Cách bố trí thí nghiệm 7

3.4.2 Các bước thực hiện 7

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

4.1 Kết quả và thảo luận 9

4.1.1 Kết quả 9

4.1.2 Thảo luận 10

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 11

5.1 Kết luận 11

5.2 Kiến nghị 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Đông trùng hạ thảo 2

Hình 2.2 Đông trùng hạ thảo 3

Hình 2.3 Chuột nhắt thí nghiệm 5

Hình 3.1 Cạo lông chuột 8

Hình 4.1 Sau khi bôi thuốc và theo dõi trong vòng 15 phút đầu tiên 9

Hình 4.2 Kết quả bôi thuốc thử sau 24 giờ 9

Hình 4.3 Kết quả bôi thuốc thử sau 48 giờ 9

Hình 4.4 Kết quả bôi thuốc thử sau 72 giờ 10

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Chỉ tiêu đánh giá triệu chứng sau khi bôi một tuần 10

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Vấn đề sức khỏe đã và đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu khoa học Mọi loại sản phẩm đều phải được kiểm duyệt chặt chẽ về độ an toàn trước khi đưa vào sử dụng cho con người Có nhiều hình thức và phương pháp kiểm định khác nhau, nhưng nổi bật trong đó là thí nghiệm trên động vật (ngoài việc đảm bảo độ

an toàn của một sản phẩm nào đó, nó còn hỗ trợ điều trị một số bệnh như ung thư vú, chấn thương não, bệnh bạch cầu ở trẻ em, bệnh xơ nang, ) Mà cụ thể trong báo cáo này là thử nghiệm xà phòng cục làm bằng dược liệu trên da của động vật (đối tượng chuột bạch)

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát, đánh giá độ an toàn của xà phòng cục làm bằng dược liệu trên phần da chuột được bôi xà phòng có phản ứng dị ứng hay bất kỳ hiện tượng phản vệ nào xảy ra sau đó hay không

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: chuẩn bị chuột để tiến hành thí nghiệm

Nội dung 2: thử nghiệm xà phòng cục làm bằng dược liệu đã chuẩn bị trên phần

da chuột đã cạo

Nội dung 3: theo dõi và quan sát trong thời gian một tuần để đưa kết quả

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo

2.1.1 Khái ni m ệm

Đông trùng hạ thảo là một loài thảo dược quý và đặc biệt, bởi chúng được xem như là "con lai" giữa động vật và thực vật Thực chất, đông trùng hạ thảo là sự kết hợp

giữa sâu non (ấutrùng bướm) của loài Thitarodes và loài nấm ký sinh Cordyceps

sinensis.

Vào mùa đông, loài bướm này đẻ trứng, trứng nở thành các ấu trùng sâu non, chúng vùi mình vào những vùng đất tơi xốp để bắt đầu tìm chỗ ngủ đông Khi ấu trùng

ăn phải bào tử nấm hoặc nhiễm nấm qua các lỗ thở, nấm sẽ sinh sôi mạnh mẽ, bắt đầu xâm chiếm các mô tế bào, ăn hết chất dinh dưỡng bên trong cơ thể ấu trùng và làm chết sâu non

Khi mùa hè tới, nấm bắt đầu mọc ra khỏi thân sâu, dần phát triển thành hình dạng cây nấm và phát tán các bào tử nấm để chuẩn bị cho cuộc đi săn ấu trùng vào mùa đông tới Tên gọi “đông trùng” có nghĩa là những con sâu sống vào mùa đông, còn “hạ thảo” là loài cây cỏ phát triển vào mùa hè, chỉ sự biến chuyển từ hình thái động vật sang thực vật của loài nấm dược liệu này

Hình dạng bên ngoài khi đông trùng hạ thảo còn tươi trông giống như những con sâu, đuôi sâu là một cành nhỏ có lá Phần "lá" được tạo thành do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non, nhìn giống như ngón tay dài từ 4 - 11cm Mặt khác, đầu sâu non dài chừng 3 - 5cm, giống như con tằm

Khi đông trùng hạ thảo được sấy khô sẽ có màu vàng nâu, vàng sậm hoặc màu

cà phê tùy thuộc vào phương pháp phơi sấy Chúng có mùi tanh như mùi cá biển, vị đắng nhẹ, nếu đốt lên thì có mùi thơm dìu dịu

Hình 2.1 Đông trùng hạ thảo.

Nguồn: dongtrungtaytang.com.vn

2.1.2 Phân lo i ại

Tên khoa học: Ocordyceps Sinensis

Giới (regnum): Fungi

Phân giới: Dikarya

Ngành: Ascomycota

Phân ngành: Pezizomycotina

Lớp: Sordariomycetes

Phân lớp: Hypocreomycetidae

Bộ (ordo): Hypocreales

Họ: Ophiocordycipitaceae

Chi (genus): Ophiocordyceps

Loài (species): O sinensis

Theo xuất xứ, đông trùng hạ thảo được phân thành hai loại là tự nhiên (tại vùng cao nguyên Tây Tạng) và nhân tạo (nuôi cấy đông trùng hạ thảo trên cơ thể ấu trùng nhộng tằm hoặc trên các vật chủ khác như hỗn hợp đậu xanh, vỏ trứng, gạo lứt và nhộng tằm xay nhỏ

Theo trạng thái, đông trùng hạ thảo được phân thành hai dạng là dạng tươi (nguyên con, cần được bảo quản ở -50°C) và dạng khô (được sấy đối lưu hoặc sấy lạnh đến khi đông trùng hạ thảo đạt độ ẩm là 5%)

Theo dạng chế phẩm, đông trùng hạ thảo được phân thành ba dạng là dạng nước, dạng viên nang (được chế biến và tổng hợp thành các viên nhộng) và dạng bột (sấy khô và xay mịn)

2.2 Định nghĩa độc tính

Độ độc cấp tính được định nghĩa là độ độc thể hiện sau khi phơi nhiễm một thời gian ngắn với chất độc Độ độc cấp tính là khả năng của một hóa chất gây ra tác động xấu tương đối sớm nhất sau khi uống hoặc sau 4 giờ tiếp xúc liên tục với một hóa chất

"tương đối sớm" thường được định nghĩa như là một khoảng thời gian phút, giờ (lên đến 24) hoặc ngày (khoảng 2 tuần) nhưng hiếm khi dài hơn

Mục đích của thử nghiệm độ độc cấp tính là thu thập thông tin về hoạt động sinh học của hóa chất và hiểu biết sâu sắc về cơ chế hoạt động của nó Các nghiên cứu dài hạn thường bắt đầu bằng việc thực hiện tìm kiếm liều lượng sử dụng trong các điều kiện cấp tính Hơn nữa, thông tin về độc tính hệ thống cấp tính được tạo ra bởi thử

Hình 2.2 Đông trùng hạ thảo.

Nguồn: xaydungso.vn

nghiệm được sử dụng trong nhận dạng nguy hiểm và quản lý rủi ro trong bối cảnh sản xuất, xử lý và sử dụng hóa chất Giá trị LD50 (preciseorapproximate) hiện đang là cơ sở cho việc phân loại chất độc hóa học và do đó được yêu cầu bởi các cơ quan chính phủ trong tình huống cụ thể Các động vật được định lượng được quan sát chặt chẽ trong

24 giờ đầu tiên và sau đó từng ngày trong khoảng thời gian 2 tuần và những thay đổi

về ngoại hình và hành vi được ghi nhận Việc sử dụng đánh giá bệnh lý rộng rãi như một phần của nghiên cứu cấp tính Tuy nhiên, tổng số ca mổ được yêu cầu tối thiểu bởi hầu hết các cơ quan quản lý chính phủ, cũng như xác định trọng lượng trước khi dùng thuốc và sau 1 và 2 tuần Xác định giá trị LD50 chính xác trong nghiên cứu về độc tính cấp tính được thúc đẩy chủ yếu bởi các yêu cầu khác nhau của chính quyền đối với việc phân loại hóa chất Trước đây LD50 đã được sử dụng cho các hóa chất công nghiệp làm cơ sở cho các hệ thống phân loại độc tính khác nhau đã hoặc đang hoạt động

2.3 Định nghĩa LC 50 và LD 50

2.3.1 Đ nh nghĩa LC ịnh nghĩa LC 50

Giá trị LC50 (Median lethal concentration): chỉ nồng độ của một chất độc có thể làm chết 50% số động vật thí nghiệm, đơn vị tính thường là mg/L dung dịch hóa chất LC50 thường được dùng để đánh giá độc tính của các chất độc dạng lỏng hoặc chất độc tan trong dung dịch nước

2.3.2 Đ nh nghĩa v LD ịnh nghĩa LC ề LD 50

Giá trị LD50(Median lethal dose), được định nghĩa là liều lượng của một chất độc có thể làm chết 50% số động vật thí nghiệm trong một khoảng thời gian nhất định, đơn vị tính thường là mg/kg động vật Giá trọ LD50 hiện là cơ sở để phân loại độc tính của hóa chất Đối với nghiên cứu LD50 cổ điển, chuột bạch và chuột cống là những loài thường được chọn Thông thường cả hai giới tính của chuột phải được sử dụng cho nghiên cứu Khi dùng đường uống được kết hợp với đường tiêm, sẽ thu được thông tin

về sinh khả dụng của hợp chất được thử nghiệm Kết quả của các cuộc thảo luận rộng rãi về tầm quan trọng của giá trị LD50 và sự phát triển đồng thời của các quy trình thay thế là các cơ quan chức năng ngày nay thường không yêu cầu các xét nghiệm LD50 cổ điển liên quan đến một số lượng lớn động vật Thử nghiệm giới hạn, quy trình liều cố định, phương pháp phân loại chất độc và phương pháp tăng giảm đều thể hiện các phương án thay thế đơn giản hóa chỉ sử dụng một số động vật Những nỗ lực cũng đã

được thực hiện để phát triển các hệ thống in vitro; ví dụ, người ta gợi ý rằng độc tính

toàn thân cấp tính có thể được chia thành một số yếu tố sinh học, tế bào và phân tử, mỗi yếu tố có thể được xác định và định lượng trong các mô hình thích hợp Sau đó, các yếu tố khác nhau có thể được sử dụng trong các kết hợp khác nhau để mô hình hóa

số lượng lớn các hiện tượng độc hại nhằm dự đoán mối nguy hiểm và phân loại các hợp chất

Hiện tại, việc dán nhãn hóa chất và phân loại độc tính hệ thống cấp tính dựa trên đường miệng bằng giá trị LD50 được khuyến nghị bởi Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) như sau: rất độc hại khi gây chết với liều lượng <5mg/kg trọng lượng cơ thể; độc hại khi gây chết với liều lượng >5<50mg/kg; có hại khi gây chết với liều lượng >50<500mg/kg; và không độc hại là >500<2000mg/kg

2.4 Tổng quan về chuột thí nghiệm

Chuột nhắt thí nghiệm, là những con chuột nhỏ thuộc Bộ Gặm nhấm, thường từ

loài chuột nhắt Mus musculus Chuột thí nghiệm thông thường có bộ lông màu trắng

(thường gọi là chuột bạch) được sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm khoa học về các lĩnh vực y học, sinh học, tâm lý học hoặc các lĩnh vực khác Các nhà nghiên cứu thường dùng chuột để làm thí nghiệm vì chúng kích thước nhỏ và khá vô hại Chuột cũng là loài động vật dễ nuôi, không cần nhiều không gian sống, có tốc độ sinh sản nhanh nên dễ nhân giống hàng loạt với giá rẻ Tuổi thọ của chuột ngắn, chỉ trong một vài năm Do đó, các nhà khoa học có thể nghiên cứu những thế hệ khác nhau của chúng dễ dàng Người và chuột có hệ gene giống nhau hơn 90% Điều này khiến chuột trở thành con vật trung gian thích hợp, giúp các nhà nghiên cứu tìm hiểu cách thức gene người phản ứng với những nhân tố môi trường tương tự Ngoài yếu tố di truyền,

hệ thống sinh học trong cơ thể chuột, chẳng hạn như các bộ phận cơ thể, cũng hoạt động rất giống con người Một trong những lý do quan trọng nhất là chuột dễ biến đổi gene

2.5 Tổng quan về xà phòng dược liệu

Các loại xà phòng được sử dụng trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta có lịch sử khoảng sáu nghìn năm Người Babylon cổ đại đã phát hiện ra rằng việc trộn mỡ động vật với tro gỗ và nước tạo ra chất tẩy rửa mà sau này được gọi là “xà phòng” Phương pháp cơ bản làm xà phòng đã được biết như xà phòng hóa Bất kể tình trạng thể chất của xà phòng, sự kết hợp của dầu và chất nền được sử dụng để chuẩn bị xà phòng Trong xà phòng rắn NaOH được dùng làm base trong khi KOH được sử dụng

để thu được chất lỏng xà phòng

Xà phòng dược liệu là một biến thể đơn giản của xà phòng thông thường xà phòng có thành phần hoạt tính sinh học tổng hợp hoặc tự nhiên được thêm vào môi trường xà phòng cơ bản để tạo ra một lượng lớn loạt các hoạt động sinh học đến cuối cùng sản phẩm Tuy nhiên, do tác dụng không mong muốn tác dụng phụ của các chất tổng hợp, nó được ưu tiên để tránh sử dụng các hóa chất tổng hợp có hại từ sản phẩm

xà phòng chữa bệnh Trong những năm gần đây, nhà máy các sản phẩm có nguồn gốc

tự nhiên đã trở thành một sản phẩm hấp dẫn thay thế để tăng cường chức năng sinh học quan trọng đặc điểm của xà phòng chữa bệnh thay thế các chất tạo bọt tổng hợp như SLS bởi saponin, chất kháng khuẩn tổng hợp như Triclosan bởi các tác nhân kháng khuẩn tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp như BHT bằng phương pháp tự nhiên các hợp chất phenolic đã phục vụ để khắc phục nhiều về các tác dụng phụ liên quan đến thuốc xà phòng dựa trên các thành phần tổng hợp Dầu dừa, dầu ô liu, dầu neem, nghệ, gỗ đàn hương, cây venivel, tinh chất hoa nhài và chanh là một trong số ít nhất thành phần thường thấy trong các sản phẩm chăm sóc da kể cả xà phòng chữa bệnh

Hình 2.3 Chuột nhắt thí nghiệm.

Nguồn: LiveScience

7

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian thực hiện

Thời gian: Vào lúc 13h30 chiều thứ 2, ngày 23/10/2023

Địa điểm: Tại phòng BIO317, tòa nhà A1, Khoa khoa học sinh học, Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Mục tiêu

Khảo sát, đánh giá độ an toàn của xà phòng cục làm bằng dược liệu trên phần da chuột được bôi xà phòng có phản ứng dị ứng hay bất kỳ hiện tượng phản vệ nào xảy ra sau đó hay không

3.3 Vật liệu và đối tượng

3.3.1 Đ i t ối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứu ng nghiên c u ứu

Chuột nhắt thí nghiệm, trọng lượng 30 ± 5 g/con với số lượng 3 con được mua từ viện Pasteur; được nuôi trong điều kiện đảm bảo các tiêu chuẩn của viện Pasteur TP HCM và chăm sóc dựa theo tiêu chuẩn động vật nghiên cứu

3.3.2 V t li u nghiên c u ật liệu nghiên cứu ệm ứu

Xà phòng dược liệu (Đông trùng hạ thảo)

3.3.3 D ng c và thi t b ụng cụ và thiết bị ụng cụ và thiết bị ết bị ịnh nghĩa LC

Dụng cụ thí nghiệm

Vật tư tiêu hao

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Cách b trí thí nghi m ối tượng nghiên cứu ệm

Phương pháp xác định độc cấp tính qua da: nhỏ trực tiếp hoặc dùng bông gòn thấm dung dịch xà phòng lau qua vùng da đã được cạo sạch lông Có thể dùng băng gạc đã thấm dung dịch xà phòng cố định lên vùng da đã được cạo sạch lông trong 15 phút Tuy nhiên, rủi ro chuột tự gỡ băng gạc xuống là rất cao

Sau 15 phút, theo dõi tình trạng, biểu hiện của vùng da chuột đã tiếp xúc với xà phòng Tiếp tục theo dõi sau 24 giờ và 72 giờ

3.4.2 Các b ước thực hiện c th c hi n ực hiện ệm

Bước 1: bắt chuột (nắm lấy phần đuôi → nhấc nhẹ và di chuyển để chuột tìm điểm bám không quay lại cắn → đè chuột xuống và giữ lấy phần da cổ)

Bước 2: Dùng bút lông kẻ hình ô vuông với diện tích 1cm2 ở vị trí sát bã vai Bước 3: Làm ướt vị trí lông cần cạo, sau đó mới cạo bằng dao cạo tại vị trí vẽ

Bước 4: tính toán lượng thuốc thử cần pha: dung dịch xà phòng được pha với tỷ

lệ là 2g xà phòng trong 120ml nước Lượng thuốc thử sử dụng khoảng 0.2ml / 1cm2 da

Bước 5: Bôi thuốc thử có 3 cách

- Nhỏ trực tiếp: nhỏ 2 lần, mỗi lần 0.1ml, lên vùng da đã cạo sạch lông (sau khi nhỏ 0.1ml lần đầu, dùng tăm bông dàn đều trên vùng da → đợi 5 phút để khô rồi nhỏ tiếp 0.1ml còn lại → tiếp tục đợi 5 phút để khô và cuối cùng là quan sát)

- Dùng gạc y tế: dùng miếng gạc thấm 0.2ml thuốc thử → áp lên vùng da đã cạo sạch lông → sau đó dùng băng keo dán cố định miếng gạc trên da → đợi 10 phút để khô → gỡ bỏ gạc → cuối cùng là quan sát

- Dùng bông gòn: dùng miếng bông thấm thuốc bôi lên vùng da đã cạo lông lần 1

→ đợi 5 phút → dùng bông gòn thấm lần 2 → đợi khô rồi quan sát

Bước 6: theo dõi và quan sát từ 15 phút đến 7 ngày

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.1 Cạo lông chuột.

Hình 3.2 Dung dịch xà phòng Đông trùng hạ thảo.