Chủ Đề Ảnh hưởng của bột gạo lứt nảy mầm Được biến tính bởi mase lên chuột mắc bệnh tiểu Đường loại 2 và khả năng gây Độc tế bào của tế bào hepg2

ĐẶT VẤN ĐỀ Mục đích của nghiên cứu này nhằm khám phá xem việc sử dụng maltogenic amylase MAse để biến đổi tinh bột trong bột gạo lứt nảy mầm có thể tăng cường tinh bột tiêu hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



BÁO CÁO BÀI BÁO KHOA HỌC

CHỦ ĐỀ: ẢNH HƯỞNG CỦA BỘT GẠO LỨT NẢY MẦM ĐƯỢC BIẾN TÍNH BỞI MAse LÊN CHUỘT MẮC BỆNH TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2 VÀ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC

TẾ BÀO CỦA TẾ BÀO HepG2

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Công Hà

Họ tên sinh viên MSSV Nguyễn Tuấn Anh B2000739 Trần Trung Tấn B2000889 Võ Văn Thanh B2000890 Nguyễn Chí Bảo B2007878 Nguyễn Hoàng Huy B2007901 Huỳnh Thị Huỳnh Nhi B2007927

Cần Thơ, tháng 11 năm 2022

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 2

1 GIỚI THIỆU 2

2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3

2.1 HÓA CHẤT 3

2.2 CHUẨN BỊ BỘT MÌ KHÔNG BIẾN TÍNH GBR 4

2.3 BIẾN ĐỔI TINH BỘT TRONG GBR BẰNG CÁCH SỬ DỤNG MAse VÀ TẠO MGBRF 4

2.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT MGBRF ĐỐI VỚI HOẠT ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CHỐNG LẠI TẾ BÀO HepG2 4

2.5 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH GABA BẰNG HPLC 5

2.6 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH FA BẰNG HPLC 5

2.7 KHAI THÁC VÀ PHÂN TÍCH GORZ BẰNG HPLC 5

2.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 5

2.9 XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN ĐOẠN RDS, SDS VÀ RS CỦA MGBRF TRONG ỐNG NGHIỆM 6

2.10 PHÁT HIỆN CÁC BC CỦA GLYCOSIDE BẰNG TQD UPLC / MS 6

2.11 ẢNH HƯỞNG CỦA MGBRF TRÊN CHUỘT MẮC BỆNH TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2 6

2.12 THỬ NGHIỆM DUNG NẠP GLUCOSE (GT) Ở CHUỘT 7

2.13 KIỂM TRA CHỈ SỐ ĐƯỜNG HUYẾT (GI) Ở CHUỘT MẮC BỆNH TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2 7

2.14 PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG SINH HÓA VÀ CHỐNG OXY HÓA HUYẾT TƯƠNG 8

2.15 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 8

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

3.1 THỦY PHÂN BẰNG ENZYME TRÊN BỘT MÌ GBR 8

3.3 KHẢ NĂNG TIÊU HÓA TINH BỘT TRONG ỐNG NGHIỆM 13

3.4 THỬ NGHIỆM DUNG NẠP GLUCOSE IN VIVO (GT) Ở CHUỘT 14

3.5 TÁC ĐỘNG ĐẾN CHỈ SỐ ĐƯỜNG HUYẾT (GI) TRONG MÁU 15

3.6 PHÂN TÍCH SINH HÓA TRONG HUYẾT TƯƠNG 17

3.7 ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHỨC NĂNG GAN 19

4 PHẦN KẾT LUẬN 20

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mục đích của nghiên cứu này nhằm khám phá xem việc sử dụng maltogenic amylase (MAse) để biến đổi tinh bột trong bột gạo lứt nảy mầm có thể tăng cường tinh bột tiêu hóa chậm và giải phóng hàm lượng hợp chất hoạt tính sinh học (BCs) nhiều hơn hay không Để đạt được mục đích này, tinh bột được biến tính với bốn mức MAse (0 U, 133 U, 266 U và 399 U MAse / g bột) trong 1 giờ ở pH 5 và sau đó được sấy phun để tạo thành bột biến tính Các tác động sinh hóa của sản phẩm sau đó được tiếp cận ở chuột bình thường và chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2 trong 4 tuần Kết quả cho thấy khi tinh bột được biến tính bằng MAse 266 U / g, đã giảm đáng kể tinh bột tiêu hóa nhanh từ 61,56% xuống 22,35%, tăng tinh bột tiêu hóa chậm lên 33,09% trong khi tinh bột kháng là 2,92% tương ứng với mức tăng của axit γ-amino butyric đến 528,1±44,1 mg / L và 120,6±10,9 mg / L axit ferulic Chiết xuất từ bột mì biến tính cho thấy hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh đối với tế bào HepG2 (ức chế > 80%) Kết quả cho thấy những con chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2 được nuôi bằng sản phẩm đã được biến tính này có thể cải thiện tốt hơn sự ổn định của chỉ số đường huyết Ngoài ra, đánh giá mảng bám xơ vữa động mạch cũng hỗ trợ thêm cho những phát hiện này Kết quả chỉ ra rằng BCs giải phóng cặp đôi một cách đáng kể với những thay đổi về đặc tính tinh bột do MAse gây ra đã nâng cao hiệu quả của sản phẩm này đối với bệnh tiểu đường cũng như tác động tích cực đến hoạt động gây độc tế bào chống lại tế bào HepG2 (Nguyen et al., 2021)

1 GIỚI THIỆU

Cơm (Oryza sativaL.) là một trong những loại ngũ cốc quan trọng nhất và là lương thực chính cho hơn một nửa dân số thế giới (Ghosh et al., 2019) Tuy nhiên, dưới tác động của biến đổi khí hậu, nông nghiệp thế giới đã phải đối mặt với sự suy giảm nghiêm trọng trong thế kỷ này và các nước đang phát triển riêng lẻ phải đối mặt với sự sụt giảm thậm chí còn lớn hơn (Bhattacharya, 2019) Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc ăn liên tục gạo lứt nảy mầm (GBR) giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường ở những người khỏe mạnh (Ren et al., 2020) và bệnh nhân sống tự do bị suy giảm đường huyết lúc đói hoặc tiểu đường loại 2 (Hsu et al., 2008) Do đó, GBR được biết đến như một loại thực phẩm chức năng với các thành phần hoạt tính sinh học dồi dào, tăng đáng kể bao gồm axit γ-butyric (GABA), axit ferulic (FA), γ-oryzanol (GORZ) và một số axit phenolic (Cho & Lim, 2016) với tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người và hoạt tính gây độc tế bào tích cực chống lại tế bào ung thư biểu mô tuyến tế bào gan ở người (tế bào HepG2) (Imam & Ismail, 2013) Theo Balasubashini

et al (2003), FA có tác dụng hữu ích trong việc hạ huyết áp ở chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra Bên cạnh đó, GABA đã được báo cáo để điều chỉnh phản ứng miễn dịch bằng cách ức chế phản ứng của tế bào T CD4 + gây viêm, điều chỉnh độc tính tế bào của tế bào T CD8 + trong ống nghiệm và ức chế sự tự miễn dịch của tế bào và phản ứng viêm trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 (Tian et al., 2004) Usuki et al (2008) cũng phát hiện ra rằng acylated steryl glucoside (ASG) trong GBR có thể giúp kiểm soát lượng đường trong máu ở bệnh nhân tiểu đường bằng cách tăng mức độ của các enzym có lợi Theo đề xuất của Roohinejad et al (2010), tác dụng hạ huyết áp của GORZ một phần là do gốc sterol của nó, một phần được tách ra khỏi phần FA trong ruột non bởi cholesterol esterase Một số nghiên cứu

về sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm khác nhau từ GBR được thực hiện, chẳng

hạn như bột làm từ GBR, sản phẩm giống sữa chua (Cáceres et al., 2019; Lee et al., 2019) Tuy nhiên, Hiện vẫn chưa có báo cáo về tác dụng của sản phẩm đối với bệnh tiểu đường và tế bào HepG2 từ những nghiên cứu này GBR được coi là thực phẩm chức năng không chứa gluten nhờ đặc tính tiêu hóa và hấp thụ tốt (Lee et al., 2019) Mặc dù quá trình nảy mầm làm giảm lượng đường nhưng như chúng ta đều biết, tinh bột vẫn là thành phần chính chiếm 77,7% trong GBR (tính theo trọng lượng khô) (Moongngarm, 2011) Việc tiêu thụ lâu dài các sản phẩm tiêu hóa nhanh có thể góp phần thúc đẩy các bệnh ở người như tiểu đường loại 2, bệnh tim mạch và béo phì (Lovegrove et al., 2017) Do đó, một phương pháp xử lý mới là tinh bột biến tính đã xuất hiện để thu được các loại carbohydrate lành mạnh hơn như tinh bột tiêu hóa chậm (SDS), tinh bột kháng (RS) và tinh bột tiêu hóa nhanh (RDS) thông qua các ứng dụng của các enzym và kỹ thuật khác nhau - vật lý hoặc hóa học (Román et al., 2017) Để chế biến các sản phẩm chức năng từ GBR, cần có các nghiên cứu về tăng tỷ lệ tinh bột kháng từ GBR Đây là cơ sở để các hợp chất có hoạt tính sinh học phát huy tác dụng trong các sản phẩm chế biến

Biến đổi enzyme là phương pháp xanh và được mong muốn nhất vì nó có tính chọn lọc cơ chất và tính đặc hiệu của sản phẩm cao hơn, ít sản phẩm phụ có hại hơn (Román et al., 2017) Trong số một số enzym, amylase gây độc tố (MAses) (EC 3.2.1.133) đã thu hút được rất nhiều sự chú ý do các ứng dụng công nghiệp của chúng, bao gồm công nghiệp nướng và các ứng dụng chuyển hóa tinh bột như tác nhân chống bám đường để tăng thời hạn sử dụng, tổng hợp chất ngọt không gây ung thư, tổng hợp carbohydrate mới, và sự phát triển của các loại thuốc mới để điều trị bệnh béo phì, tăng lipid máu, sâu răng và bệnh tiểu đường, cũng như thay đổi tính chất lưu biến và tăng cường tính ổn định oxy hóa của nó (Bae et al., 2002; Haghighat-Kharazi et al., 2020) Một số tác giả đã báo cáo rằng việc sử dụng MAse để làm chậm quá trình tiêu hóa tinh bột hoặc bột thông qua cơ chế xúc tác bao gồm (i) tăng tỷ lệ chuỗi ngắn; (ii) ngày càng tăng lượng liên kết α, 1–6 cho các chuỗi nhỏ hơn và phân nhánh cao hơn giúp làm chậm quá trình tiêu hóa tinh bột; (iii) tăng hàm lượng isomaltooligosaccharide của prebiotic (Ao et al., 2007; Román et al., 2017) Do đó, nghiên cứu này đã khảo sát tác động của MAse đối với sự giải phóng MGBRF và BCs với những lợi ích sức khỏe có thể có trên chuột bình thường và tiểu đường được nuôi bằng chế độ ăn kiêng cũng như khả năng gây độc tế bào trên tế bào HepG2

2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 HÓA CHẤT

GABA, FA, GORZ, các enzym như MAse (Amylase, Maltogenic từ Bacillussp; công bố hoạt động ≥ 10.000 MANU / g sản phẩm; mã A2986), Invertase (Invertase từ men làm bánh (S.cerevisiae) - Hạng VII; hoạt độ enzym ≥ 300 đơn vị / mg sản phẩm; mã I4504), Arabinose (số sản phẩm W325501), và 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) được lấy từ Sigma-Aldrich Chemical Tất cả các dung môi được sử dụng trong các thí nghiệm, 4-dimethyl aminoazobenzene-4-sulfonyl chloride, 5-sulfosalicylic acid dihydrate là thuốc thử phân tích, hoặc loại HPLC và được mua từ Merck, Fisher và JTBaker-Mallinckrodt Baker Chemical Ngay lập tức, glucoseamylase (Attenuzyme® Core, glucan 1,4-alpha-glucosidase từ Aspergillus niger; hoạt động công bố 1.600 AGU / g chất lỏng), alpha-amylase (Termamyl® 120 L

từ một dòng biến đổi gen củaBacillus licheniformis) của Novozymes (Novozymes A / S) Sulforhodamine B (SRB) từ Sigma và các hóa chất khác có mức độ tinh khiết cho nghiên cứu do công ty cổ phần CEMACO cung cấp

2.2 CHUẨN BỊ BỘT MÌ KHÔNG BIẾN TÍNH GBR

Giống lúa IR 50,404 được tiếp nhận tại Viện Nghiên cứu Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Cần Thơ, Việt Nam và được bảo quản ở nhiệt độ 20±2°C) và tách hạt (Mini Paddy Husker, model STHU-35S, Satake) thành gạo lứt; sau đó, hạt gạo được ngâm trong dung dịch đệm có pH 4 (Na2HPO4.12H2O và axit xitric) và axit glutamic 0,6% và được ủ trong tủ ấm (Tủ ấm SANYO MCO-5AC) có năng suất tối đa 0,5 kg /

mẻ ở nhiệt độ 37°C với thời gian ủ 24 giờ Sau đó, GBR được làm khô ở 60°C trong 4 giờ và được nghiền thành bột, đóng gói và bảo quản tại -18°C để sử dụng trong các thí nghiệm

2.3 BIẾN ĐỔI TINH BỘT TRONG GBR BẰNG CÁCH SỬ DỤNG MAse VÀ TẠO MGBRF

Bột gốc GBR được cân trong Erlen và dung dịch đệm có pH = 5 trong mỗi bình (0,1M Disodium hydro phosphate dodecahydrate; 0,1M Citric acid monohydrate), được thêm vào để đạt được hỗn hợp 20% chất nền, và sau đó khuấy đều Các bình mẫu được đun nóng đến 80–85⁰C trong bể nước sôi ở 90–95⁰C để hồ hóa tinh bột Sau 20 phút, các mẫu được làm nguội và ủ trong nồi cách thủy ở 60°C Việc bổ sung các enzym vào Erlen được đánh dấu tương ứng với 0 U, 133 U, 266 U và 399 U MAse / g trọng lượng khô của bột mì dựa trên GBR, được thực hiện sau khi có sự cân bằng nhiệt giữa bên trong và bên ngoài Thời gian ủ là 0 và 1 giờ Sau đó, các mẫu được lọc qua vải màn để lấy các thành phần hòa tan và loại bỏ cặn trước khi phân tích, sau đó được bảo quản ở -18⁰C để phân tích thêm BCs và các chỉ số tiêu hóa của tinh bột Các mẫu còn lại được làm khô bằng Máy sấy phun (LabPlant-SD 06, Vương quốc Anh) để lấy MGBRF và sau đó được bảo quản tại -21°C trong tủ đông, Sanaky, Việt Nam

2.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT MGBRF ĐỐI VỚI HOẠT ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CHỐNG LẠI TẾ BÀO HepG2

Hoạt động gây độc tế bào chống lại tế bào HepG2 được thực hiện theo phương pháp của Skekan et al (1990) Tóm lại, MGBRF được chiết xuất với hai tỷ lệ với nước

là 1:5 và 1:10 (w / v) ở 60°C trong 15 phút Sau đó mẫu được trộn và ly tâm ở 16.000

g Phần nổi phía trên được lọc qua màng 0,2 μm trước khi xử lý bằng tế bào HepG2

Để kiểm tra hoạt động gây độc tế bào chống lại tế bào HepG2, 40µl mẫu được trộn với 60µl nước DI (C1), được pha loãng thành 5 lần (C2) (= C1 / 5), C3 (= C2 / 5) và C4 (= C3 / 5) và sau đó cho tất cả các mẫu vào giếng của đĩa 96 giếng (Corning, USA) chứa

tế bào HepG2 (6.000 tế bào / giếng) Hỗn hợp này được ủ trong 48 giờ bằng máy đọc đĩa ELISA (Bio-Rad) Sau 48 giờ, các tế bào được TCA cố định trong 1 giờ để dừng phản ứng, nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB) trong 30 phút ở 37°C, rửa 3 lần bằng axit axetic, và để khô ở nhiệt độ phòng Đọc kết quả OD ở bước sóng 515–540 nm trên máy đọc đĩa ELISA (Bio-Rad) Tỷ lệ phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử đã được xác định Để kiểm soát, TBUT (180µl) được sử dụng làm đối chứng cho ngày thứ 0 Ellipticine được sử dụng làm đối chứng tích cực với 4 mức (10

μg / ml, 2 μg / ml, 0,4 μg / ml và 0,08 μg / ml) 10% DMSO luôn được sử dụng như

một kiểm soát tiêu cực Mẫu được xác định là có tác dụng tích cực đối với hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào HepG2 khi mức độ ức chế cao hơn 50% mức độ ức chế của tế bào HepG2

2.5 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH GABA BẰNG HPLC

GABA được tách ra và phân tích theo phương pháp của Banchuen et al (2010) với những sửa đổi nhỏ Thêm 1 ml mẫu lỏng vào 9 ml nước khử ion trong Erlen, sau

đó lắc trong 90 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, 1 ml axit sulfosalicylic 3% (theo thể tích) được thêm vào, và hỗn hợp được ly tâm bằng máy ly tâm Hermle Labotechnik Z323K ở 6.000 g trong 10 phút Thêm 100 μl chất nổi phía trên, 100 μl 100 mM NaHCO3 và 100 μl 4 mM 4-dimetylaminoazobenzene-4-sulfonyl clorua (được hòa tan bằng dung môi axetonitril) vào Eppendorf, sau đó được xoáy Hỗn hợp được đun nóng

ở 70°C trong 20 phút để tạo dẫn xuất hiệu quả, sau đó, nó được làm nguội và thêm vào 0,5 ml etanol tuyệt đối trên đá và ly tâm ở 16,000 g và 4°C trong 5 phút Cuối cùng, phần nổi phía trên được phân tích trên HPLC (Shimadzu), với cột Ascentis® C18 HPLC, 25cm×4,6mm, 5µm (Supelco) HPLC được trang bị một máy dò UV-Vis (SPD-20A, Shimadzu) đặt ở bước sóng 465 nm Các pha động là đệm amoni axetat 25

mM chứa 0,1% axit axetic và axetonitril (26:74) được điều chỉnh ở tốc độ dòng 1 ml / phút với 10µl của thể tích tiêm và cột nhiệt độ tủ sấy ở 55°C GABA tinh khiết đã được sử dụng làm tiêu chuẩn hiệu chuẩn

2.6 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH FA BẰNG HPLC

Tổng hàm lượng FA được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như đã mô tả trước đây (Banchuen et al., 2010) Các mẫu (3 ml chất lỏng) được chiết bằng 10 ml NaOH 1 M và lắc trong 3 giờ ở điều kiện phòng sau đó được trung hòa bằng 5 ml HCl 2 M Hỗn hợp được chiết ba lần bằng 10 ml etyl axetat, mỗi lần trong 5 phút Sau đó, phần nổi phía trên được làm bay hơi ở 40°C trong chân không để loại bỏ etyl axetat Cặn được hòa tan trong 3 ml MeOH: DI (v / v = 1:1) và được phân tích trên hệ thống Shimadzu HPLC được trang bị đầu dò UV-Vis trên cột Ascentis® C18 HPLC, 25cm x 4,6mm, 5µm (Supelco) và được phát hiện ở bước sóng 320 nm và nhiệt

độ 40°C Các pha động là axit axetic (2,5% thể tích) và axetonitril (32:68) với tốc độ dòng 1 ml / phút FA tinh khiết được sử dụng làm tiêu chuẩn để hiệu chuẩn

2.7 KHAI THÁC VÀ PHÂN TÍCH GORZ BẰNG HPLC

Hàm lượng GORZ được xác định theo phương pháp của Cho et al (2012) 1 ml mẫu được chiết trong axeton: etanol (chứa 0,1% Butylated Hydroxy Toluen hoặc BHT) với tỷ lệ 9:1 (thể tích theo thể tích) Các hỗn hợp được lắc trong 90 phút ở nhiệt

độ phòng và được ly tâm ở 6.000 g ở 4C trong 5 phút Phần nổi phía trên được thu thập và phần còn lại được chiết hai lần nữa và phân tích trên HPLC (Shimadzu), với cột Ascentis® C18 HPLC, 25 cm×4,6 mm, 5µm (Supelco) HPLC được vận hành với máy dò UV-Vis đặt ở bước sóng 330 nm và lò cột nhiệt độ 35°C Các pha động là metanol: axetonitril: diclometan: axit axetic (50:44:3:3) và tốc độ dòng 1 ml / phút γ- Oryzanol được sử dụng làm chất chuẩn để hiệu chuẩn

2.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ

Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp của Cho et al (2000) Dịch thủy phân được lọc qua giấy lọc 1 ml dịch lọc được lấy và thêm vào 3 ml thuốc

thử DNS và đun nóng trong 5 phút trong nước sôi Độ hấp thụ màu được xác định bởi Phổ Multiskan ở bước sóng 540 nm Glucose tinh khiết được sử dụng để tính toán cho một đường chuẩn

2.9 XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN ĐOẠN RDS, SDS VÀ RS CỦA MGBRF TRONG ỐNG NGHIỆM

Đối với mục đích dinh dưỡng, tinh bột được chia thành tinh bột tiêu hóa nhanh (RDS), tinh bột tiêu hóa chậm (SDS) và tinh bột kháng (RS) dựa trên tốc độ và mức độ tiêu hóa của nó trong thử nghiệm Englyst in vitro (Englyst et al., 1992), với một số sửa đổi Dung dịch enzym đã được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng (cân 3 g pancreatin cho vào mỗi ống ly tâm sáu nắp vặn, thêm vào 20 ml nước cất, trộn đều, khuấy trong

10 phút, sau đó ly tâm ở 6.000 g trong 10 phút) 15 ml phần nổi phía trên được lấy từ mỗi ống trong Erlen và trộn 6 ml hỗn hợp enzyme của α-amylase: glucoamylase tỷ lệ 1:1 ([Hỗn hợp enzyme] ≈ 200 AGU / ml), 4 ml invertase ([Invertase] ≈ 460 U / ml) Sau đó, dùng pipet hút 1 ml mỗi mẫu vào Vitro, thêm vào 5 ml arabinose 0,1%, và 10

ml kẹo cao su pepsin-gellan; Các ống vitro được đóng nắp, trộn kỹ và ngâm vào nồi cách thủy ở 37°C trong 30 phút với thêm 5 ml (natri axetat 0,1 M) Các ống này được ủ trong 30 phút ở 70°C và được làm nóng trong bể lên đến 100°C trong 10 phút Cuối cùng, làm mát 5 ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị trước đó được thêm vào, xoáy và ủ

ở 37°C trong 20 phút và 120 phút, sau đó 0,4 ml dịch thủy phân trong ống có dán nhãn chứa 8 ml etanol tuyệt đối được loại bỏ, tương ứng là phần G20 và G120 Sau đó, các ống được trộn xoáy và đặt trong nồi cách thủy sôi trong 30 phút, làm lạnh bằng nước

đá (0⁰C) trong 15 phút Hơn nữa, 10 ml KOH 7 M được thêm vào mỗi ống và giữ trong bể nước đá trong 30 phút Tiếp tục, 10 ml axit axetic 0,5 M được thêm vào, xoáy

và 1 ml phần nổi này được đưa vào Vitro khác có thêm 1 ml hỗn hợp enzym Cuối cùng, làm mát đến nhiệt độ phòng và pha loãng với 12 ml etanol tuyệt đối để thu được glucozơ tổng số (TG) Các giá trị của G20, G120 và TG được kết hợp để tính RDS, SDS và RS

2.10 PHÁT HIỆN CÁC BC CỦA GLYCOSIDE BẰNG TQD UPLC / MS

Tinh bột từ bột mì dựa trên GBR được biến tính ở điều kiện MAse tối ưu là 60°C trong 1 giờ với pH 5 như đã nêu ở trên Sau đó, mẫu được lắc, ly tâm ở 6.000 g trong 6 phút, và được lọc qua ống tiêm 0,2 μm trước khi tiêm vào hệ thống TQD UPLC / MS (Waters Corp) Điều kiện pha động của UPLC đối với GABA và FA là A: 100% metanol và B: nước Thể tích tiêm là 10 μl Thời gian lưu là 5 phút Cột ACQUITY UPLC CSH C18 1,7 μm, 2,1×50 mm từ Waters Đối với phân tích GORZ,cột là Luna

5 μm NH2100Å 2×150 mm từ Waters và thời gian lưu là 6 phút Các điều kiện khác giống như đối với GABA hoặc FA Để phát hiện BCs có bị biến đổi bởi glucose hoặc maltose hay không, phổ khối lượng được sử dụng để phát hiện trong khoảng 50 – 300

m / z So với các pic chuẩn của GABA và FA, tất cả các pic glycoside BCs đã được biến đổi đều xuất hiện trong khối phổ nếu chúng tồn tại

2.11 ẢNH HƯỞNG CỦA MGBRF TRÊN CHUỘT MẮC BỆNH TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2

42 con chuột mắc bệnh tiểu đường và chủng tộc Thụy Sĩ (IVAC, Việt Nam) tuổi

từ 6-8 tuần, trọng lượng lý tưởng 25–30 g dùng cho thí nghiệm được mua từ Viện

Pasteur Nha Trang, Việt Nam Những con chuột được nuôi trong một căn phòng được kiểm soát về môi trường (30–32°C, độ ẩm tương đối 65% –75%) và cho ăn libitum bổ sung với chế độ ăn kiêng (chất đạm thô: 23%; chất béo thô: 8%; chất xơ thô: 4%; độ ẩm: 10%) để duy trì sức khỏe Các mẫu tối ưu từ các thí nghiệm, điều tra những thay đổi trong BCs và kết quả in vivo, được sấy phun ở 160°C (LabPlant-SD06, Labplant

UK Ltd, Vương quốc Anh), với bơm nhu động: 485 ml / h và được bảo quản ở -18⁰C trong bao bì chân không PA Mỗi mẫu (450 mg / kg thể trọng) được hòa tan vào 5 ml nước sôi để cho chuột ăn Thành phần dinh dưỡng của các mẫu trong thí nghiệm này được thể hiện trong Bảng 1

Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng của các mẫu trong thí nghiệm

2.12 THỬ NGHIỆM DUNG NẠP GLUCOSE (GT) Ở CHUỘT

Các mẫu thử bao gồm glucose (Glu), sucrose (Suc), bột cơ bản GBR biến tính (MA-S) và không biến tính (NS) Thử nghiệm dung nạp glucose (GT) ở chuột được thực hiện bằng phương pháp của Dura et al (2016) Bốn con chuột đực, 6-8 tuần tuổi, trọng lượng lý tưởng 25-30g, được phép nhịn ăn trong 4 giờ, và mức đường huyết đã được xác định trước khi thử nghiệm Các mẫu (0,2 ml) được bơm trực tiếp vào thực quản, và đường huyết được xác định ở 0, 15, 30, 60 và 120 phút bằng ACCU Check Active (ROCHE)

2.13 KIỂM TRA CHỈ SỐ ĐƯỜNG HUYẾT (GI) Ở CHUỘT MẮC BỆNH TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2

Mỗi chuồng có ba con, và chúng được chia thành sáu nhóm: NS (bình thường, không mắc bệnh tiểu đường loại 2, được nuôi bằng phương pháp sấy phun không biến đổi), MA (loại 2 không bị tiểu đường được nuôi bằng chế độ ăn thay đổi), T2D-NS (loại 2 nhóm bệnh tiểu đường được cho ăn với chế độ ăn uống không thay đổi), T2D-

MA (nhóm bệnh tiểu đường loại 2 được cho ăn với chế độ ăn uống thay đổi),

T2D-NS-M (nhóm bệnh tiểu đường loại 2 được nuôi bằng chế độ ăn khô phun không thay đổi

và metformin), và T2D-MA-M (nhóm bệnh tiểu đường loại 2 được nuôi bằng chế độ

ăn đã được điều chỉnh và metformin)

Những con chuột trong nhóm sử dụng metformin được dùng thuốc hạ đường huyết (viên nén Glucophage 500 mg, 300 mg / kg BW) và bơm 0,2 ml trực tiếp vào thực quản sau 2 giờ sử dụng mẫu thử Việc cho ăn kéo dài trong bốn tuần và kết quả được ghi lại hàng tuần Các mẫu và thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng 4 × Thiết kế 4 ô vuông Latinh Kết quả ghi lại và đơn vị đường huyết được tính toán theo trang web của Trung tâm Tiểu đường Joslin, Hoa Kỳ (Truy cập ngày 30 tháng 10 năm 2019)

2.14 PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG SINH HÓA VÀ CHỐNG OXY HÓA HUYẾT TƯƠNG

Cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), Cholesterol Lipoprotein Mật độ Cao (HDL-C), Cholesterol lipoprotein Mật độ thấp (LDL-C), alanin aminotransferase (ALT), aspartat transaminase (AST) trong máu, malondialdehyde (MDA), glutathione reductase (GSH) trong chất đồng nhất ở gan được xác định bằng phương pháp enzym

sử dụng máy phân tích tự động Ams Ellipse tương ứng (AMS, Ý)

2.15 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn và tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong ba lần Dữ liệu được tính toán trung bình và độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel 2010 Dữ liệu được phân tích thống kê cho ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV (Phiên bản 15.2.11, Statgraphic Technologies, Inc.) Kiểm định LSD với mức ý nghĩa 5% (P≤ 05) được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 THỦY PHÂN BẰNG ENZYME TRÊN BỘT MÌ GBR

Hình 1 Hàm lượng đường khử được tạo ra ở sự khác biệt nồng độ của MAse

Sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị được biểu thị bằng các chữ cái khác nhau (P<.05) N: Mẫu đối chứng không phải là MAase, M1: GBR được sửa đổi bởi 133 U MAse / g trọng lượng khô của bột làm từ GBR, M2: GBR được sửa đổi bởi 266 MAse / g trọng lượng khô của bột làm từ GBR, M3: GBR đã được sửa đổi bằng 399 MAse / g trọng lượng khô của bột mì làm từ GBR

Kết quả trong Hình 1 cho thấy hàm lượng đường khử tăng tuyến tính với nồng độ enzym MAse, đạt đỉnh 278,42 g / L ở 266 U MAse / g trọng lượng khô của bột làm từ GBR, và giảm xuống 246,25 g / L ở mức 399 U MAse / g trọng lượng khô của bột làm

từ GBR (Hình 1)

Kết quả chỉ ra rằng enzyme MAse cho kết quả tốt nhất là 266 U MAse / g trọng lượng khô của bột mì dựa trên GBR trong các điều kiện của thí nghiệm này Nó phù hợp với lý thuyết động học của enzym, khi nồng độ của enzym tăng lên thì hoạt tính xúc tác của nó cũng tăng theo Tuy nhiên, ngưỡng tới hạn của nồng độ tiếp tục tăng lên, ngược lại hoạt độ giảm Bởi vì dịch thủy phân được giải phóng ức chế hoạt động của enzym, sự lớn lên của nồng độ các chất hòa tan trong môi trường thủy phân làm giảm tính linh hoạt của enzym hoặc ở nồng độ quá mức của dự trữ enzym đã tự ức chế MAses thủy phân các liên kết α-1,4-glucosidic của tinh bột từ đầu nonreducing và các dẫn xuất của nó thành maltose khử chuỗi chiều dài của polyme Nó phân cắt các chuỗi mạch thẳng liên kết α-1,4 của amylose và amylopectin, sau đó là phản ứng transglycosyl để tạo ra các chuỗi nhánh liên kết α-1,6 mới (Ao et al., 2007) MAse cũng thể hiện hoạt động transglycosyl hóa cao thông qua việc hình thành các liên kết glycosidic khác nhau như α-1,6 tạo ra oligosaccharide phân nhánh (Le et al., 2009) Các enzyme MAse thủy phân các loại carbohydrate khác nhau như tinh bột, cyclomaltodextrins và pullulan để tạo ra maltose, glucose và panose Bên cạnh đó, nó cũng có thể chuyển các monosaccharid hoặc disaccharid là sản phẩm của quá trình thủy phân đến các thụ thể khác như D-glucose, maltose, cellobiose và lactose (Bae et al., 2002) Theo Cho et al (2000), một đơn vị hoạt động của enzyme được định nghĩa

là lượng enzyme tạo ra đường khử tương đương với một đơn vị thay đổi Để cải thiện

sự biến đổi bằng MAse, một số nghiên cứu với xử lý kết hợp enzym trên bột ngô đùn (mức glucose và dextrin cao hơn đã đạt được khi mẫu được xử lý bằng máy đùn), 300

U enzym phân nhánh / g bột (BE) và 7 U của maltogenic α-amylase / g flour (MAse) đã được sử dụng để đạt được mức độ sửa đổi cao hơn (Ao et al., 2007; Román et al., 2017) Một báo cáo khác về tinh bột biến tính từ bột sắn để tạo ra tinh bột kháng amyloly, và sản phẩm phản ứng enzyme phân nhánh (1.000 U / g tinh bột) được tiếp tục xử lý bằng maltogenic amylase (1.000 U / g tinh bột) (Le et al., 2009) Rõ ràng rằng đường khử là sản phẩm của MAse, nó cũng là nguyên liệu cho bước điều chỉnh tiếp theo của MAse để tạo ra các chuỗi nhánh liên kết α-1,6 mới

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA MAse LÊN CÁC HỢP CHẤT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HOẠT ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CHỐNG LẠI TẾ BÀO HepG2

Bảng 2 Sự thay đổi của GABA, axit ferulic, hàm lượng γ-oryzanol theo nồng độ enzym trong bột GBR được biến đổi bởi MAse

Ghi chú: Sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trong cùng một cột được biểu thị bằng các chữ

cái khác nhau (P<.05) N: Kiểm soát mẫu không được sử dụng MAse, M1: GBR được sửa đổi bởi 2.657,01 U của MAse, M2: GBR được sửa đổi bởi 5.314,01 U của MAse, M3: GBR được sửa đổi bởi 7.972,02 U của MAse

Kết quả trong Bảng 2 cho thấy hàm lượng GABA và FA trong các mẫu sử dụng enzym cao hơn so với mẫu đối chứng không sử dụng enzym Hàm lượng của các hợp chất này thay đổi theo nồng độ enzyme và có sự khác biệt đáng kể (P<.05) Các thành phần tăng cùng nhau bằng cách tăng hoạt động MAse ở mức 266 U MAse / g trọng lượng khô của bột dựa trên GBR, cả hai đều có mức cao nhất với 528,1 mg / L GABA

và 120,6 mg / L FA nhưng giảm nhẹ ở mức 399 U MAse / g trọng lượng khô của bột GBR Vì vậy, khi sử dụng enzyme MAse để sửa đổi bột cơ bản GBR cho thấy có tác động tích cực đến khả năng giải phóng các hợp chất chức năng của nó Trong nghiên cứu này, bột mì dựa trên GBR đã được MASe sử dụng làm nguyên liệu để sửa đổi Sau phản ứng enzyme, hỗn hợp được lọc bằng vải màn để lấy các thành phần hòa tan cũng như loại bỏ thành phần không tan trong nước hoặc chất rắn Vì vậy, hầu hết các loại tinh bột không biến tính và ít biến đổi vì các thành phần không hòa tan được giữ trong phần thành phần không hòa tan này trong khi giải phóng protein cũng như các hợp chất hoạt tính sinh học thành phần hòa tan Sau đó, nó được sử dụng để sấy phun

để tạo ra MGBRF Kết quả là, có sự gia tăng protein và các hợp chất hoạt tính sinh học trong MGBRF so với bột sấy phun không biến tính như trong Bảng 1 Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về việc sử dụng enzym thủy phân để phá vỡ nguyên liệu thô ở các liên kết ban đầu, do đó giúp giải phóng các thành phần khác cũng như các hợp chất chức năng thành phần hòa tan (Hammed et al., 2013; Liu et al., 2017; Nkhata et al., 2018) Một nghiên cứu về các hợp chất phenolic trong gạo trắng, gạo lứt và GBR báo cáo rằng FA liên kết không hòa tan và hòa tan trong GBR lần lượt là 163,9 mg / kg và 2,8 mg / kg bột Đây là hợp chất phenolic chính và là hợp chất phenolic không hòa tan phổ biến nhất tồn tại ở dạng liên kết tự do, hòa tan và liên kết không hòa tan Hầu hết các hợp chất này liên kết với polysaccharid chứa glucose, arabinose, xylose, galactose, rhamnose, và mannose tồn dư trong thành tế bào (Tian et al., 2005)

Ngoài ra, GORZ, chủ yếu bao gồm các este của axit ferulic (axit hydroxycinnamic) với phytosterol không được phát hiện trong tất cả các mẫu thử nghiệm (dịch lọc) mặc dù được phát hiện trong các mẫu rắn (mẫu thử nghiệm) (Lerma-Garcia et al , 2009) Nhà sản xuất có thông tin rằng độ tan trong nước của GABA là 103,1 g / L ở 20°C; nó hòa tan tốt trong nước và không có dữ liệu sẵn có của

trans-FA và GORZ Mặt khác, Kaukovirta-Norja et al (2004) báo cáo rằng việc ngâm và nảy mầm của ngũ cốc có thể tạo ra các enzym để phá vỡ thành tế bào bao quanh nhiều hợp chất và sau đó các axit phenolic tự do và axit phenolic liên kết có thể được giải phóng Hơn nữa, nghiên cứu của Hammed et al (2013) chỉ ra rằng quá trình thủy phân bằng enzym có thể tăng cường giải phóng các hợp chất sinh học từ nguyên liệu thô

Do đó, FA được phát hiện khi quá trình thủy phân bằng enzym hoặc enzym phức hợp giải phóng phenol và quá trình thủy phân các phenol liên kết với đường, axit béo và các phân tử protein sẽ giải phóng tối đa phenol (Liu et al., 2017) Bên cạnh đó, Uraji et

al (2013) đã thành công trong việc tăng cường sản xuất enzyme FA từ cám gạo đã khử chất béo với sự kết hợp của ba xylanase, một α-l- arabinofuranosidase, và một acetyl xylan esterase từ Streptomyces spp Sự kết hợp enzyme này cũng có ảnh hưởng đến việc sản xuất FA từ các sinh khối khác, chẳng hạn như cám gạo thô, cám lúa mì và lõi ngô Hơn nữa, quá trình thủy phân bằng enzym để chiết FA từ cám lúa mì đã được tối

ưu hóa dần dần bằng cách xử lý trước bằng enzym với alcalase và termamyl, và quá trình thủy phân bằng enzym cuối cùng với chiết xuất pentopan và feruloyl esterase cho năng suất cao hơn so với điều kiện không xử lý (Ferri et al., 2020)

Bảng 3 Phát hiện các BC của glycoside sau khi biến tính bằng MAse sử dụng TQD UPLC / MS

Ghi chú: Kiểm soát mẫu (N), M2: GBR được sửa đổi bởi 266 MAse / g trọng lượng khô của

bột mì dựa trên GBR

Bảng 4 Hoạt động gây độc tế bào của chiết xuất bột mì dựa trên GBR chống lại tế bào HepG2

Ghi chú: MA-S: Chiết xuất bột gạo lứt nảy mầm biến tính; NS: Mẫu đối chứng (Bột gạo lứt

nảy mầm không biến tính)

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ MAse đến khả năng tinh bột tiêu hóa trong ống nghiệm

Sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị trong cùng một hàm lượng tinh bột đã tiêu hóa (RDS hoặc SDS hoặc RS) được biểu thị bằng các chữ cái khác nhau như a, b và c (P<.05) N: Mẫu đối chứng không phải là MAase, M1: GBR được sửa đổi bởi 133 U MAse / g trọng lượng khô của bột làm từ GBR, M2: GBR được sửa đổi bởi 266 MAse / g trọng lượng khô của bột làm từ GBR, M3: GBR đã được sửa đổi bằng 399 MAse / g trọng lượng khô của bột mì.

Kết quả trong Bảng 3 cho thấy không có BCs glycoside nào được phát hiện sau khi sửa đổi bằng MAse Kết quả này chỉ ra rằng BCs giải phóng từ việc sửa đổi không thay đổi bất kỳ đặc tính chức năng nào Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng MAse có khả năng làm biến tính một số hợp chất, thông qua liên kết mới với một thụ thể khác, giúp chúng tăng cường khả năng hòa tan hoặc hoạt tính của chúng (Bae et al., 2002; Cho et al., 2000; Li et al., 2004 ) Do đó, để tăng một số thành phần trong nghiên cứu này, các mẫu thí nghiệm được phân tích trên TQD UPLC / MS và kết quả cho thấy không có bất kỳ sự biến đổi hoặc thay đổi nào trong các hợp chất chức năng trên (Bảng 3) Do đó, kết quả làm tăng hàm lượng GABA và FA trong nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu sử dụng enzym để thủy phân liên kết nhằm tăng cường giải phóng các hợp chất chức năng Đối với GORZ, kết quả trong Bảng 4 chỉ ra rằng dịch chiết từ mẫu M (MA-S) ức chế tốt sự phát triển của tế bào ung thư HepG2, đạt trên 50% cả hai mẫu sửa đổi, lên đến 81,73% ở tỷ lệ 1:5 và 68,33% ở tỷ lệ 1:10 (w / v) mẫu tương ứng Trong khi các mẫu chiết xuất từ bột mì không biến tính (NS) không cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HepG2 (chỉ ức chế 30,69%) Kết quả chỉ ra rằng mẫu càng loãng thì hoạt tính ức chế ở cả hai mẫu càng giảm Việc kiểm soát tích cực ellipticine cũng ổn định trong thí nghiệm GBR được biết đến như một loại thực phẩm chức năng với các thành phần hoạt tính sinh học dồi dào, tăng đáng kể bao gồm axit γ-butyric (GABA), axit ferulic (FA), γ-oryzanol (GORZ), và một số axit phenolic có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người và hoạt động gây độc tế bào tích cực chống lại tế bào ung thư biểu mô tế bào gan ở người (tế bào HepG2) (Imam & Ismail, 2013) Sau khi sửa đổi bởi MAse, không có glycoside BCs