- Thân kính - Bàn kính cùng thước kẹp tiêu bản, nơi đặt tiêu bản lên quan sát, kẹp để giữ cố định tiêu bản - Nút chỉnh bàn kính: di chuyển bàn kính để tìm vị trí quan sát phù hợp - Ốc ch
Sử dụng kính hiển vi
Nguyên tắc
Kính hiển vi là một dụng cụ quang học dùng để quan sát những vật nhỏ bé mà mắt thường không thể thấy được Độ phóng đại của kính hiển vi là tích số của độ phóng đại của vật kính và thị kính.
Cấu tạo
1.2.1 Các bộ phận quang học
- Vật kính: quyết định khả năng nhìn rõ mẫu vật Trên vật kính có khắc độ phóng đại của vật kính (x4, x10, x40 và x100) Vật kính x100 thường sử dụng với dầu soi kính
- Thị kính: gắn ở đầu trên của ống kính Thị kính có cấu tạo đơn giản hơn vật kính Trên thị kính có độ phóng đại x5, x6, x10 hoặc x15
- Đèn chiếu sáng: nằm trên chân đế, làm nguồn sáng cho việc quang sát mẫu vật
1.2.2 Các bộ phận cơ học
- Ốc sơ cấp: chỉnh thô điều chỉnh tiêu cự phù hợp
- Ốc thứ cấp: chỉnh tinh (điều chỉnh tiêu cự nhỏ hơn chỉnh thô) điều chỉnh tiêu cự phù hợp
- Bàn kính cùng thước kẹp tiêu bản, nơi đặt tiêu bản lên quan sát, kẹp để giữ cố định tiêu bản
- Nút chỉnh bàn kính: di chuyển bàn kính để tìm vị trí quan sát phù hợp
- Ốc chỉnh tụ quang: điều chỉnh nguồn sáng
- Mâm xoay vật kính: mang các vật kính, dùng để chuyển đổi giữa các vật kính
Sử dụng
Để bảo vệ kính hiển vi và tiêu bản, khi dùng kính phải thận trọng, vặn ốc phải từ từ, nhẹ nhàng và tiến hành theo thứ tự sau:
- Cắm điện, bật công tắc Nhìn vào thị kính để điều chỉnh nguồn sáng điện chiếu để ánh sáng đều thị trường
- Quan sát mẫu vật với thị kính có độ phóng đại nhỏ trước (x4 hoặc x10) • Đặt tiêu bản lên bàn nâng và kẹp vào kẹp tiêu bản để cố định tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng
- Nhìn xuống tiêu bản (lame), vặn nhẹ ốc thứ cấp đến khi đầu vật kính gần chạm vào lame hay ngừng lại khi kính hiển vi có bộ phận cản an toàn
- Nhìn vào thị kính và vặn nhẹ ốc thứ cấp lên đến khi thấy rõ hình ảnh mẫu vật (nếu chưa thấy rõ có thể điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng đến khi nhìn thấy rõ)
- Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường Nhìn vào lame, vặn đầu xoay chuyển đến vật kính lớn hơn (x40) (nếu không đụng vào lame) Điều chỉnh ốc vi cấp đến khi nhìn rõ hình ảnh
Các lưu ý: Để bảo vệ kính hiển vi và tiêu bản, khi dùng kính phải thận trọng, vặn ốc phải từ từ, nhẹ nhàng và tiến hành theo thứ tự sau:
- Cắm điện, bật công tắc Nhìn vào thị kính để điều chỉnh nguồn sáng điện chiếu để ánh sáng đều thị trường
- Quan sát mẫu vật với thị kính có độ phóng đại nhỏ trước (x4 hoặc x10)
- Đặt tiêu bản lên bàn nâng và kẹp vào kẹp tiêu bản để cố định tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng
- Nhìn xuống tiêu bản (lame), vặn nhẹ ốc thứ cấp đến khi đầu vật kính gần chạm vào lame hay ngừng lại khi kính hiển vi có bộ phận cản an toàn
- Nhìn vào thị kính và vặn nhẹ ốc thứ cấp lên đến khi thấy rõ hình ảnh mẫu vật (nếu chưa thấy rõ có thể điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng đến khi nhìn thấy rõ)
- Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường Nhìn vào lame, vặn đầu xoay chuyển đến vật kính lớn hơn (x40) (nếu không đụng vào lame) Điều chỉnh ốc vi cấp đến khi nhìn rõ hình ảnh.
Bảo quản kính hiển vi
Kính hiển vi phải được bảo quản ở nhiệt độ mát và khô ráo Cần đậy kỹ để tránh bụi bám vào vật kính và thị kính
Sử dụng kính hiển vi
- Đặt lên lame một giọt nước hoặc một giọt glycerine
- Đặt mẫu vật cần quan sát vào giọt nước/glycerine
- Đậy lamelle lên lame (hình vẽ)
- Quan sát dưới vật kính lần lượt x4, x10 và x40
Thực hành
Vật liệu tươi
Hóa chất
Thực hành quan sát
2.3.1 Tế bào động vật: Tế bào biểu mô miệng
Dùng tăm tre sạch cạo nhẹ lên niêm mạc miệng rồi nhúng đầu tăm vào một giọt Lugol trên 1 lame sạch Đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40 Kết quả
Hình 2 Tế bào biểu mô miệng
Tế bào động vật quan sát được gồm: mang tế bào, tế bào chất, nhân Các tế bào trên tiêu bản quan sát có hình dạng không đồng đều nhau do tế bào động vật không có vách tế bào
Các tế bào lấy từ niêm mạc miệng, là các tế bào đã chết nên đã teo tóp, một số vẫn còn giữ tương đối hình dạng tế bào và quan sát được nhân khi được nhuộm bằng dung dịch xanh methylene
2.3.2.1 Tế bào biểu bì vảy hành tím
Dùng dao lam tách vài mảnh biểu bì vảy củ hành tím, ngâm trong nước Chọn vài mảnh mỏng đặt trên lame trong một giọt nước, đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10 và x40
Hình 3 Tế bào biểu bì vảy hành 10x (trái) & 40 (phải)
Tế bào biểu bì vảy hành là tế bào thực vật, có vách tế bào cấu tạo chủ yếu bởi cellulose, màng tế bào, tế bào chất có màu và nhân lớn
Tế bào quan sát dưới kính hiển vi thấy có vách tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân Các tế bào do có các vách tế bào bao bọc nên hình dạng khá tương đồng Các tế bào có độ đậm nhạt không đồng đều do lượng sắc tố trong từng tế bào là khác nhau
2.3.2.2 Hạt tinh bột củ khoai tây
Cắt ngang củ khoai tây, dùng dao mũi mác cạo nhẹ lấy một ít trên bề mặt mặt cắt, hòa vào giọt nước cất chuẩn bị sẵn trên lame, đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi Kết quả
Hình 4 Hạt tinh bột khoai tây x10 (trái) & x40 (phải)
Hạt tinh bột quan sát dưới kính hiển viên có hình bầu dục, có lõm khuyết và các vân tăng trưởng đồng tâm trên bề mặt
Hạt tinh bột quan sát dưới kính hiển vi là bột lạp, có vai trò dữ trữ tinh bột cho tế bào, thường xuất hiện nhiều ở củ, quả và hạt
2.3.3 Tế bào vi sinh vật: Nấm men
Nhỏ một giọt canh trường nấm men lên lame Đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40
Hình 5 Tế bào nấm men x40
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kớch thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14 àm nờn phải được quan sỏt bằng vật kớnh x40 Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng amino acid và muối amon như nguồn nitơ Nấm men sinh sản bằng hình thức mọc chồi (vô tính) hay tạo thành các nang bào tử (hữu tính) Nấm men được ứng dụng trong công nghiệp chế biến như lên men rượu để sản xuất thức uống có cồn hay lên men bánh mì
MÀNG NGUYÊN SINH CHẤT
Tóm tắt lý thuyết
Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cấu tạo nên cơ thể sống Các thành phần chính của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất chứa các bào quan và nhân tế bào, đối với tế bào thực vật bên ngoài màng nguyên sinh chất còn được bao bọc bởi vách tế bào với thành phần chủ yếu là cellulose Màng nguyên sinh được cấu tạo chủ yếu gồm 2 lớp phospholipid với đầu ưa nước hướng ra ngoài, đầu kỵ nước hướng vào trong, trên màng còn có các protein, các kênh ion, receptor và một số cac thành phần khác Màng sinh chất đóng vai trò là một màng ngăn có chọn lọc, cho phép hoặc không cho phép các chất vận chuyển ra vào tế bào, giúp tế bào thực hiện trao đổi chất và duy trì các tính chất hóa lý của tế bào
Hình 6 Màng nguyên sinh chất
Thực hành
3.1 Hiện tượng co nguyên sinh
Dùng dao lam tách vài mảnh biểu bì vảy củ hành tím, ngâm trong nước
Chọn vài mảnh mỏng đặt trên lame trong một giọt nước, đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi Quan sát và vẽ hình Dùng giấy thấm rút nước dưới lamelle, nhỏ 1 –
2 giọt NaCl 8 % vào cạnh của lamelle Qua kính hiển vi, quan sát hiện tượng xảy ra trên mảnh biểu bì
Dùng giấy thấm rút dung dịch NaCl dưới lamelle, nhỏ 1 – 2 giọt nước cất vào một cạnh lamelle Qua kính hiển vi, quan sát hiện tượng xảy ra trên mảnh biểu bì
Hình 7 Tế bào biểu bì vảy hành nhỏ NaCl 8% Hình 8 Tế bào biểu bì vảy hành chưa nhỏ NaCl 8% Ở mẫu chưa nhỏ NaCl 8%, các tế bào ở hình dạng bình thường, đầy dịch tế bào và màng tế bào dính sát vào vách tế bào Ở mẫu nhỏ NaCl 8% các tế bào co lại, tạo ra các vết khuyết trắng khi nhìn qua kính hiển vi, vách tế bào và màng nguyên sinh tách rời nhau Đây là hiện tượng co nguyên sinh Khi rút hết NaCl 8% và thay bằng nước cất thì sau ít lâu tế bào căng trở lại, các lỗ khuyết biến mất, đây là hiện tượng phản co nguyên sinh
Hiện tượng co nguyên sinh xảy ra khi tế bào nằm trong môi trường ưu trương (tức nồng độ chất tan bên ngoài môi trường cao hơn bên trong tế bào), theo nguyên lý thẩm thấu, nước từ trong tế bào đi ra ngoài môi trường để trung hòa lượng chất tan, tế bào mất nước và co lại
Hiện tượng phản co nguyên sinh xảy ra khi đặt tế bào từ môi trường ưu trương sang môi trường nhược trương (môi trường có nồng độ chất tan thấp hơn nồng độ chất tan trong tế bào), nước từ ngoài môi trường đi vào trong tế bào để trung hòa chất tan, tế bào hút nước nên trưởng nở lên
Dung dịch NaCl là dung dịch ưu trương đối, còn nước cất là dung dịch nhược trương đối với tế bào (nồng độ NaCl 0,9% là đẳng trương đối với tế bào)
3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ đến tính thấm của tế bào
Cắt củ dền thành 7 miếng đều nhau có kích thước 4 cm x 1 cm x 0,5 cm Cho các miếng củ dền vào becher và rửa dưới dòng nước chảy trong vài phút để lôi đi tất cả sắc tố từ những tế bào bị vỡ (dừng khi nước rửa không còn sắc tố), sau đó ngâm mẫu vào nước sạch
Ghi các ống nghiệm từ 1 → 7:
- Ống 1 - 6: 15 ml nước cất/ống
- Ống 7: 15 ml cồn tuyệt đối (đậy miệng ống nghiệm bằng nylon)
Xử lý nhiệt: xử lý nhiệt 5 miếng củ dền ở các nhiệt độ 40, 50, 70, 100 và - 10°C
Cách xử lý nhiệt: cho mỗi miếng củ dền vào một túi nylon nhỏ rồi nhúng vào nước có nhiệt độ chỉ định trong 10 phút Lưu ý: đuổi hết không khí trong túi để miếng củ dền ép sát vào túi nylon
Cho mẫu vào ống nghiệm: ngâm các miếng củ dền sau khi xử lý nhiệt vào các ống nghiệm đã đánh số:
- Ống 1: cho miếng củ dền không qua xử lý nhiệt (ống chuẩn)
- Ống 2: cho vào miếng dền đã xử lý ở 40°C
- Ống 3: cho vào miếng dền đã xử lý ở 50°C
- Ống 4: cho vào miếng dền đã xử lý ở 70°C
- Ống 5: cho vào miếng dền đã xử lý ở 100°C
- Ống 6: cho vào miếng dền đã xử lý ở - 10 o C
- Ống 7: cho miếng củ dền không qua xử lý nhiệt
Tất cả ống nghiệm đặt vào giá, để yên 15 phút Sau đó vớt bỏ miếng dền ra, lắc đều, so sánh màu của dung dịch trong các ống nghiệm và so với ống chuẩn
Hình 9 Các ống nghiệm từ 1 đến 7 (từ trái sang) Ống 1 2 3 4 5 6 7
Có thể thấy được ở các ống 1, 2, 3, 4, 5, 7 màu sắc của các dung dịch đậm dần Tức ở nhiệt độ càng cao, màng tế bào bị tổn thương càng nặng hơn, protein màng bị biến tính duỗi thẳng tạo lỗ hổng khiến các sắc tố tiết ra nhiều hơn khiến dung dịch đậm màu hơn Ở các ống 2 3, các protein đã xuất hiện tổn thương song vẫn chưa phải là quá lớn nên màu sắc không có sự thay đổi quá rõ rệt
12 Ở ống 7, do xử lý mẫu bằng cồn tuyệt đối, cồn hòa tan các thành phần kém phân cực hoặc không phân cực trên màng nên màng tế bào bị phá hủy, tổn thương nặng hơn hẳn các mẫu bị xử lý nhiệt nên có màu đậm nhất, mẫu củ dền ngâm trong cồn cũng bị teo nhỏ hơn các mẫu còn lại Ở ống 5, theo lý thuyết sẽ có màu hồng đậm nhưng do sắc tố betacyanin không bền nhiệt bị phân hủy chỉ còn lại carotenoid có màu cam Ống 6 có màu đậm hơn ống 1 một chút bởi dưới 0 o C nước trong tế bào bị đông lại thành tinh thể nhọn hai đầu đâm tổn thương màng tế bào, nếu để càng lâu tinh thể tạo càng nhiều thì mức độ tổn thương càng lớn, màu sẽ càng đậm
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TẾ BÀO
Carbohydrate
Polysaccharide (tinh bột, glycogen): là dạng carbohydrate dự trữ, trong đó tinh bột là carbohydrate dự trữ ở thực vật và glycogen ở động vật Có thể làm thí nghiệm nhận biết sự hiện diện của tinh bột và glycogen bằng thuốc thử Lugol, khi đó nếu có sự hiện diện của tinh bột Lugol từ màu nâu cam chuyển sang màu xanh tím, với sự hiện diện của glycogen cho màu đỏ nâu Các polysaccharide sẽ bị phân hủy thành các đơn phân là monosaccharide để làm nguồn tạo năng lượng cho các hoạt động của tế bào
Monosaccharide (loại đường khử): các phân tử đường đơn có mang nhóm C=O trong cấu trúc có khả năng thể hiện tính khử Có thể nhận biết sự có mặt của đường khử bằng dung dịch Fehling có gia nhiệt cách thủy, khi đó dung dịch có chứa đường khử sẽ xuất hiện kết tủa đỏ gạch hay vàng (do phản ứng đường đơn mang liên kết C=O khử
Cu 2+ trong Fehling thành Cu + , kết tủa thu được là Cu2O hay CuOH còn dựa vào nồng độ của dung dịch Fehling).
Lipid
Lipid hay chất béo tồn tại trong tế bào ở nhiều dạng khác nhau như triglyceride, glycolipid, phospholipid, Nhận biết Lipid bằng thuốc thử Soudan III cho màu cam.
Protein
Protein chiếm số lượng lớn nhất trong tế bào, hiện diện trên cấu trúc màng tế bào, trong cấu trúc của enzyme, Là đại phân tử với các đơn phân cấu thành là các amino acid bởi liên kết peptide Phản ứng để nhận biết protein điển hình là phản ứng màu Biuret cho dung dịch màu tím Điều kiện diễn ra phản ứng là chuỗi protein phải có ít nhất từ 3 phân tử trở lên mới có thể quan sát sự thay đổi màu
Vật liệu, hóa chất
Vật liệu tươi: Khoai tây, đậu xanh ngâm nước, mầm đậu xanh, đậu trắng ngâm nước, sữa tươi, lòng trắng trứng, cà rốt
Hóa chất: Fehling, Lugol, Suodan III, NaOH 30%, CuSO4 5%, cồn 20%, H2SO4
Nghiền 1 mẫu khoai tây nhỏ với 10 ml nước cất, loại bỏ bã bằng vải lọc Cho dịch dưới lọc vào 1 ống nghiệm (ống 1) và nhỏ vào 1 giọt Lugol Lắc đều Cho vào 1 ống nghiệm khác (ống 2) 10 ml nước cất, nhỏ vào 1 giọt Lugol, lắc đều Quan sát và ghi nhận hiện tượng
Hình 10 Ống 1 (trái) và ống 2 (phải) Ở ống 1 có chứa tinh bột, dung dịch chuyển sang màu xanh tím Trong khoai tây có chứa tinh bột Tinh bột có cấu trúc chứa amylose dạng lò xo xoắn và amylopectin dạng mạch nhánh
Hình 11 Thành phần cấu tạo tinh bột
Dung dịch Lugol hay nước Iod là dung dịch gồm Iod 0.3% trong KI 3%, có tồn tại ion triiodine (I3 - ) tồn tại dưới dạng đường thẳng, ion đi vào cấu trúc xoắn của amylose tạo phức có màu xanh tím
Hình 12 Phức chất tinh bột - I3-
Ly trích đường tan: giã nát 20 cây mầm đậu xanh trong cối Thêm vào 20 ml nước, cà đều Để lắng 10 phút, lọc qua vải lọc Làm tương tự với 20 hột đậu xanh đã ngâm nước trong 1 giờ
Trắc nghiệm đường khử: Chuẩn bị 3 ống nghiệm: Ống nghiệm Dung dịch
Fehling (mL) Nước cất (mL)
Dịch lọc từ mầm đậu xanh (mL)
Dịch lọc từ hạt đậu xanh
3 3 - - 3 Đặt cả ba ống vào cốc nước sôi khoảng 5 phút, quan sát hiện tượng
Hình 13 Ống 1 (trái), Ống 3 (giữa) và ống 2 (phải)
Kết quả quan sát được thấy ở ống 1 không có phản ứng xảy ra Ở ống 2 có xuất hiện kết tủa nâu, chứng tỏ có sự hiện diện của đường khử, màu của phản ứng giữa thuốc thử Fehling và đường khử có thể dao động từ đỏ sang vàng tùy
17 vào nồng độ của thuốc thử được pha chế Đường đơn mang liên kết C=O khử Cu 2+ trong Fehling thành Cu + , kết tủa thu được là Cu2O hay CuOH còn dựa vào nồng độ của dung dịch Fehling Vì mầm đậu xanh đang trong thời gian nảy mầm, tinh bột dữ trữ có trong hạt bắt đầu được biến đổi thành đường đơn để làm nguồn sản sinh năng lượng đảm bảo cho sự nảy mầm Ống 3 dung dịch chuyển sang màu xanh đậm, tức vẫn có sự diễn ra phản ứng giữa thuốc thử và đường nhưng rất ít Do trong giai đoạn hạt, đa phần carbohydrate vẫn đang nằm ở giai đoạn dự trữ, khi được ngâm trong 1h hạt sẽ được kích thích nảy mầm, bắt đầu có sự phân cắt tinh bột thành đường đơn, nên lượng đường khử lấy được từ dịch lọc rất ít, phản ứng khó quan sát Dung dịch chuyển sang màu xanh đậm do bên trong dịch cũng như dung dịch Fehling còn các thành phần khác, chẳng hạn protein trong hạt sẽ có phản ứng Biuret với kiềm và CuSO4 trong thuốc thử nên có màu tím làm đậm màu dung dịch
Cắt 1 lát cà rốt mỏng, đặt trên lame trong 1 giọt Lugol, đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi Sau đó dùng giấy thấm thấm khô dung dịch Lugol, nhỏ 1 giọt H2SO4
75 % vào một cạnh của lamelle để acid ngấm vào lát cà rốt Quan sát lại màu sắc vách tế bào
Hình 14 Mặt cắt thịt quả cà rốt nhỏ Lugol (trái) & có nhỏ thêm H2SO4l (phải)
Ban đầu khi nhỏ Lugol không có hiện tượng xảy ra Sau khi thấm hết Lugol và nhỏ thêm H2SO4 thì rìa của mẫu bắt đầu bắt màu với Lugol chuyển sang màu xanh
Do vách tế bào có cấu tạo chủ yếu từ cellulose có dạng mạch thẳng nên không có phản ứng đặc trung như tinh bột với Iod nên không có hiện tượng Khi thêm H2SO4 thành cellulose bị thủy phân thành oligosaccharide có thể có phản ứng với Iod nên phía rìa có màu xanh tím
Cắt 1 lát mỏng ngang hột đậu phọng đã ngâm nước, đặt trên lame trong 1 giọt soudan III Sau 15 phút rửa qua bằng cồn 20 % Quan sát lát đậu phọng dưới kính hiển vi trong 1 giọt nước Nhận xét vị trí các giọt dầu trong tế bào
Hình 15 Giọt dầu từ lát mỏng đậu phộng được nhuộm Soudan III
Quan sát bằng kính hiển vi thấy các giọt màu cam chính là lipid từ hạt đậu phộng bị nhuộm bởi thuốc thử Soudan III
Trong hạt đậu phộng lipid tồn tại ở nhiều dạng như phospholipid, triglyceride, diglyceride Soudan III tác dung với lipid hay triglyceride tạo thành màu đỏ cam Soudan III là một loại Lysochrome hòa tan tốt tròn chất béo và chỉ dính vào duy nhất chất béo, do đó nó dụng để xác định sự hiện diện của lipid
2.5.1 Thao tác Đặt 1 lát cắt dày hột đậu trắng đã ngâm nước lên lame Nhỏ 2 giọt CuSO4 5 % và đậy lại bằng lamelle Sau 30 phút dở lamelle lên, rửa lát cắt lại nhiều lần với nước cất Dùng giấy thấm hút khô nước và nhỏ lên 1 giọt NaOH 30 % Quan sát màu xuất hiện trên lát cắt (không sử dụng kính hiển vi)
Hình 16 Lát cắt dày hạt đậu trắng
Trên bề mặt cắt có xuất hiện màu tím Những mặt không cắt được bao bọc bởi cutin nên CuSO4 không thể ngấm vào nên không có màu tím
Màu tím trong kết quả chứng minh sự có mặt của protein do phản ứng Biuret Phản ứng Biuret dung để nhận diện protein nhờ sự có mặt của liên kết peptide Ion Cu 2+ liên kết với nguyên tố N trong liên kết peptide ( -CO – NH-) trong môi trường kiềm tạo thành phức có màu tím đặc trưng
- Ống 3: 5 ml dung dịch lòng trắng trứng
Cho vào mỗi ống 5 giọt CuSO4 5%, sau 5 phút tiếp tục cho thêm 2 giọt NaOH Lắc nhẹ và quan sát
Hình 17 Kết quả các ống nghiệm từ 1 đến 3
21 Ở ống 1 xuất hiện kết tủa Cu(OH)2 bởi phản ứng:
CuSO4 + NaOH → Cu(OH)2 +Na2SO4 Ở ống 2 và 3 có xuất hiện màu tím đặc trưng, tức có sự hiện diện của protein Tuy nhiên ở ống 3 chứa lòng trắng trứng có màu tím đậm rõ rệt so với ống 2 chứa sữa tươi, từ đó có thể kết luận rằng hàm lượng protein trong mẫu lòng trắng trứng lớn hơn trong mẫu sữa tươi Phản ứng ngoài dùng để nhận biết sự có mặt của protein (định tính) còn có thể dùng để đánh giá nồng độ protein (định lượng) thông qua độ đậm nhạt của màu tím trong kết quả, theo định luật Lambert – Beer, độ đậm của màu tím tỉ lệ thuận với nồng độ protein
ENZYMES
Vật liệu và hóa chất
Vật liệu tươi: Đậu xanh lên mầm, dứa, lòng trắng trứng chín
Hóa chất: thuốc thử Lugol, dung dịch tinh bột tinh bột 0,2%, Toluene, dung dịch đệm pH 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Tiến hành
2.1 Tác dụng của enzyme Bromelin lên protein trứng
Cắt nhỏ miếng thơm, nghiền trong cối với 20 ml nước cất, vắt nước qua vải lọc lấy
20 ml, nước trích này chứa enzyme bromelin Chia đều vào 2 ống nghiệm Một ống để ở nhiệt độ phòng, ống còn lại được đun cách thủy sôi 20 phút, xong để nguội Cho vào mỗi ống nghiệm 1 khối vuông lòng trắng trứng đã luộc chín, mỗi cạnh 3 mm Thêm vài giọt toluene vào mỗi ống Đậy kín với nylon, lắc nhẹ, đều Sau 2 ngày khảo sát trạng thái khối lòng trắng trứng ở 2 ống nghiệm
Hình 19 Mẫu gia nhiệt (trái) & mẫu không gia nhiệt (phải)
Mẫu gia nhiệt, khối lòng trắng trứng không bị phân hủy, vẫn giữ nguyên hình dạng ban đầu Mẫu không gia nhiệt, khối lòng trắng trứng bị phan hủy nhỏ, sau 2 ngày mềm và nát thành các mảnh vụn
Trong dịch chiết quả dứa chứa enzyme bromelin là một protease có khả năng phân cắt các liên kết peptide của phân tử protein thành các đoạn peptide Ở nhiệt độ cao, cấu trúc của các protein cấu tạo nên enzyme bị biến tính, mất đi cấu trúc không gian nên mất đi hoạt tính, không phân cắt được khối lòng trắng trứng Ở
24 mẫu không gia nhiệt tính năng này không bị mất đi do đó khối lòng trắng trứng trong mẫu này bị phân cắt và trở nên mềm nát
2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên enzyme Amylase
Giã nát 20 hột đậu xanh lên mầm, thêm vào 20 ml nước, dùng chày cà đều trong cối Lọc, chứa trong ống nghiệm Chất lọc chứa enzyme amylase Chuẩn bị 4 ống nghiệm ghi số 1, 2, 3, 4 Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột Xử lý nhiệt:
Sau 10 phút, thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch có chứa amylase trong khi vẫn tiếp tục để các ống ở nhiệt độ thí nghiệm trong 15 phút Sau đó, lấy các ống nghiệm để vào giá (lưu ý: đặt ống 4 vào 1 ly nước để làm nguội) Dùng thuốc thử Lugol (1 giọt) trắc nghiệm sự có mặt của tinh bột trong các ống nghiệm
Hình 20 Ống 1 đến 4 (từ trái sang phải) Ống 1 2 3 4
Enzyme Amylase hoạt động tốt ở khoảng 50 o C chính vì thế ở ống 3, tinh bột bị phân giải thành glucose, lượng tinh bột còn rất ít (hoặc bị phân giải hết) nên thuốc thử Lugol không làm đổi màu dung dịch Ở ống 2 cũng là khoảng nhiệt độ cho phép enzyme hoạt động bình thường Ở ống 1, nhiệt độ quá thấp so với nhiệt độ hoạt động bình thường của enzyme nên tinh bột vẫn còn nguyên trong ống, thuốc thử Lugol sẽ cho màu xanh tím đặc trưng Ở ống 4, dưới tác dụng của nhiệt độ, enzyme bị biến tính nên mất đi chức năng, tinh bột không được phân cắt nên vẫn cho màu xanh tím
Hình 21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Amylase
2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt động của Amylase
Chuẩn bị 6 ống nghiệm ghi số 1, 2, 3, 4, 5, 6 Cho vào mỗi ống:
- 1 ml đệm pH theo thức tự đánh số
- 2 ml dung dịch chứa Amylase Đặt ở nhiệt độ phòng trong 7 phút Sau đó, dùng thuốc thử Lugol (1 giọt) trắc nghiệm sự có mặt của tinh bột trong các ống nghiệm
Thuốc thử Lugol được nhỏ vào các ống nghiệm CÙNG LÚC
Lắc đều và đọc kết quả NGAY LẬP TỨC
Dựa vào kết quả thấy được, Amylase hoạt động tốt ở pH khoảng 7 – 8 Đây cũng là khoảng hoạt động tối ưu của enzyme Ở khoảng pH từ 3 – 4, môi trường có tính acid cao ức chế hoạt động của ezyme Ở khoảng pH 5 – 6 do môi trường đã bớt đi tính acid nên hoạt tính của enzyme cũng tăng dần theo Ở khoảng pH 7 – 8 enzyme hoạt động được tối ưu và phân giải hầu hết tinh bột có trong ống nên thuốc thử Lugol không cho màu xanh tím, độ đậm màu của dung dịch thể hiện cho lượng tinh bột còn lại trong ống, qua đó phản ánh hoạt tính của enzyme ở các pH khác nhau
Hình 23 Hoạt tính của Amylase theo pH
HÔ HẤP
Nguyên liệu và hóa chất
Vật liệu tươi: Cà rốt, khoai tây, nấm men, hạt đậu xanh lên mầm
Hóa chất: Xanh methylene 0,1%, Resin gaiac 2%, Ba(OH)2 bão hòa, dầu thực vật,
Cho vào ống nghiệm (φ 30 mm) thứ nhất những lát cà rốt dày 2 – 3 mm, tránh chồng lên nhau Cho dung dịch xanh methylene vào ống nghiệm ngập quá những lát cà rốt khoảng 1 cm Đổ 1 lớp dầu khoảng 0,5 cm lên bề mặt xanh methylene Ống nghiệm thứ
2 làm tương tự nhưng không có cà rốt (ống đối chứng) và đặt cả 2 ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày Ghi nhận hiện tượng xảy ra So sánh sự khác biệt giữa 2 ống
Hình 24 Ống 1 (trái) & ống 2 (phải)
Dung dịch xanh methylene ở ống 1 bị mất màu, dung dịch trong ống 2 không xảy ra hiện tượng
Xanh methylene là thuốc thử có tính oxy hóa, khi tác dụng với chất có tính khử sẽ trở thành không màu Ở đây chất khử là enzyme Dehyrogenase Dehydrogenase là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa pyruvate thành Acetyl – CoA, đồng thời chuyển H+ cho chất nhận điện tử (thường là NAD+ hay NADP+) Với sự có mặt của enzyme Dehydrogenase, dung dịch xanh methylene bị khử thành không màu (trở thành chất nhận H+ thay cho NAD+), chứng tỏ trong mẫu có khối cà rốt có enzyme Dehydrogenase
Cắt 1 lát mỏng khoai tây (ngang qua chồi) Nhỏ lên lát khoai tây (ở vị trí chồi) 1 giọt resin gaiac Quan sát hiện tượng Làm tương tự với lát khoai tây thứ 2 sau khi đã được đặt trong nước sôi 5 phút
Hình 25 Mẫu gia nhiệt Hình 26 Mẫu không gia nhiệt
Resin gaiac tạo màu xanh với các tác nhân oxy hóa Khi chồi khoai tây hô hấp, O2 trở thành chất nhận electron cuối cùng và bị khử thành H2O2, H2O2 làm resin gaiac chuyển sang màu xanh Ở mẫu không gia nhiệt, enzyme Oxidase vẫn giữ nguyên hoạt tính, O2 bị khử thành
H2O2 , resin được xúc tác bởi H2O2 chuyển thành màu xanh Ở mẫu gia nhiệt enzyme bị bất hoạt nên không có hiện tượng này
Nghiền 10 g khoai tây trong cối (không cần gọt vỏ) Thêm 20 ml nước cất, dùng chày nghiền đều và lọc qua vải lọc Chia đều chất chiết vào 2 ống nghiệm (φ 18 mm) Ống 1 để ở nhiệt độ phòng, ống 2 đặt trong nước sôi trong 10 phút rồi chuyển sang ly chứa nước lạnh để làm nguội nhanh Cho vào mỗi ống nghiệm 2 ml H2O2 Quan sát hiện tượng xảy ra
Hình 27 Ống 1 (phải) và ống 2 (trái) Ở ống 1 có hiện tượng sủi bọt mạnh mẽ, trong khi ống 2 không có hiện tượng Ở ống 1 enzyme vẫn còn hoạt tính nên H2O2 được phân giải thành oxy và nước, ở ống 2 do nhiệt độ làm biến tính protein cấu tạo nên enzyme do đó enzyme không thể phân giải H2O2 nên không có hiện tượng
Cho vào erlen 60 hạt đậu xanh nảy mầm Đậy nút cao su có mang ống thủy tinh và phễu Bít kín đầu còn lại của ống thủy tinh hình chữ U và phễu bằng bông gòn thấm nước để CO2 không thoát ra ngoài Để yên hệ thống trong 120 phút Sau thời gian trên, bỏ bông gòn và nhanh chóng cho đầu ống thủy tinh vào ngập trong ống nghiệm có chứa Ba(OH)2 Để quan sát nhanh hơn có thể đổ nước vào erlen qua phễu thủy tinh để đẩy khí CO2 từ erlen sang ống nghiệm Quan sát và giải thích hiện tượng
Hình 28 Ống nghiệm vẩn đục
Các hạt đậu xanh trong giai đoạn nảy mầm có hoạt động hô hấp mạnh mẽ nhằm tạo năng lượng để mầm phát triển thành cây con Quá trình hô hấp sinh ra nhiệt và khí
CO2 Khí CO2 tác dụng với Ba(OH)2 sinh ra kết tủa làm đục dung dịch trong ống nghiệm
- Ống 1: 20 ml dung dịch glucose 2% và 20 ml nước cất
- Ống 2: 20 ml dung dịch glucose 2% và 20 ml canh trường nấm men
- Ống 3: 20 ml nước cất và 20 ml canh trường nấm men
Dùng bóng bóng cao su đậy kín miệng ống nghiệm Quan sát hiện tượng sau 120 phút
Hình 29 Ống 2 (trái), ống 1 (phải), ống 3 (giữa)
Sau thời gian thí nghiệm, bong bóng ở ống 2 có khí làm căng phình, 2 ống còn lại không có hiện tượng
Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) có hình thức hô hấp kị khí là chủ yếu, với nguồn nguyên liệu là đường glucose, nấm men thực hiện hô hấp kị khí tạo sản phẩm là rượu ethylic và khí CO2, chính khí CO2 làm căng bong bóng Ống 1 chỉ chứa glucose và nước, không chứa vi khuẩn nên không xảy ra sự hô hấp Ống 3 chỉ chứ nấm men mà không chưa nguyên liệu là đường glucose nên cũng không xảy ra sự hô hấp
Hình 30 Quá trình hô hấp kị khí ở nấm men
QUANG HỢP
Tóm tắt lí thuyết
Thực vật hay các sinh vật tự dưỡng có khả năng sử dụng ánh sáng mặt trời và khí
CO2 từ môi trường để tổng hợp nên các chất hữu cơ nuôi sống cơ thể, đặc trưng nhất trong số đó là tổng hợp đường Quá trình trên được gọi là quang hợp Quang hợp xuất hiện ở thực vật và một số nguyên sinh động vật tự dưỡng khác nhờ có hệ thống sắc tố quang hợp, điển hình là diệp lục tố, ở các loại bậc thấp có các loại diệp lục tố a, b, c, d, còn ở sinh vật bậc cao hơn chỉ có diệp lục tố a và b Ngoài diệp lục tố còn có các sắc tố quang hợp khác đóng vai trò hỗ trợ và bảo vệ cho diệp lục tố như Caroteinoid ( carotene, xanthophyll) hay ở một số thực vật dưới nước có Phycobilin
Quang hợp được chia thành 2 giai đoạn: pha sáng và pha tối
Pha sáng diễn ra ở màng thylakoid, khi có ánh sáng mặt trời, là quá trình diệp lục tố nhận năng lượng ánh sáng mặt trời để tạo ra năng lượng ATP và NADPH để sử dụng cho pha tối, đồng thời oxy hóa nước sinh ra oxy Pha sáng gồm các giai đoạn:
- Quang lí và quang hóa khởi nguyên
- Chuỗi vận chuyển điện tử (vòng và không vòng)
Pha tối diễn ra trong điều kiện không cần ánh sáng, trong chất nền Stroma Là quá trình cố địn Carbon, sử dụng nguyên liệu CO2 và các sản phẩm của pha sáng để tổng hợp đường Pha tối diễn ra theo 1 trong 3 con đường C3, C4 hoặc CAM
Xác định sắc tố quang hợp bằng phương pháp sắc kí giấy:
Phương pháp sắc kí được ứng dung để tách hỗn hợp thành các thành phần của nó Hỗn hợp được hòa tan trong một dung môi (pha động), dung môi này mang các thành
35 phần trong hỗn hợp đi qua một loại giấy thấm (pha tĩnh) Do chứa các thành phần khác nhau, có ái lực với pha tĩnh khác nhau nên các thành phần này bị pha tĩnh giữ lại ở các vị trí khác nhau, do đó chúng bị tách nhau ra, thể hiên các màu sắc khác nhau trên giấy thấm Các sắc tố tan tôt trong nước ( có tính phân cực) sẽ bị giấy thấm giữ lại tốt hơn, trong khi đó các sắc tố tan tốt trong dung môi sẽ được dung môi kéo đi xa hơn Vị trí sắc tố trên tờ giấy được biểu thị bằng trị số Rf
Tiến hành
1 Vật liệu và hóa chất
Vật liệu tươi: Lá tươi, lá đã che tối 1 phần (2 – 3 ngày), cây thủy sinh, nhánh cây nhỏ
Hóa chất: Acetone, Ether dầu hỏa, Benzene, thuốc thử Lugol, cồn 70 độ, Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa
2.1 Phân tích thành phần sắc tố lá cây bằng phương pháp sắc ký
Giã 3g lá xanh trong một cối sạch và khô Thêm vào 20 ml acetone, cà đều Lọc qua giấy lọc, dịch lọc hứng vào một ống nghiệm sạch và khô, đậy nút kín Quan sát màu của dung dịch dưới ánh sáng truyền suốt và ánh sáng phản xạ
Hình 31 Màu của dung dịch ly trích qua ánh sáng
Dưới ánh sáng truyền suốt, dung dịch có màu xanh lục, dưới ánh sáng phản xạ, dung dịch có màu đỏ do hiện tượng phát huỳnh quang diệp lục
Khi tiếp nhận năng lượng ánh sáng, electron trong phân tử bị kích thích nhảy lên mức năng lượng cao hơn, chuyển sang trạng thái bị kích thích Sau khi rời khỏi quỹ đạo ban đầu trong thời gian ngắn, electron trở về quỹ đạo cũ, năng lượng kích thích chuyển thành nhiệt và kích thích các phân tử diệp lục khác phát ánh sáng huỳnh quang
Chuẩn bị giấy sắc ký, thực hiện đường gốc:
Cắt một mẫu giấy sắc ký 10 x 10 cm Dùng bút chì kẻ nhẹ một đường thẳng song song 1 cạnh cách bìa khoảng 1 cm Cuốn tờ giấy thành ống, giữ bằng 2 kim bấm ở hai đầu ống, 2 mép giấy không chồng lên nhau Đổ dung dịch sắc tố trích ly ở trên vào hộp petri Đặt đầu ống giấy có đường vạch bút chì vào dung dịch Do mao dẫn, dịch sắc tố thấm lên thành ống giấy Khi dịch sắc tố vừa chạm vạch bút chì, lập tức lấy ra, sấy khô bằng máy sắy tóc hoặc đặt trước quạt máy Khi vệt sắc tố đã thật khô, lại nhúng đầu ống giấy vào dung dịch sắc tố trong đĩa Petri, đợi đến khi mực sắc tố ngấm chạm vạch bút chì, lấy ra sấy khô lại Cho đầu ống giấy tẩm sắc tố như vậy tổng cộng 4 lần Sau khi lần tẩm cuối cùng đã khô hẳn, ta có
“đường gốc (vạch gốc)” của tờ sắc ký chứa hỗn hợp cần phân tích
Dung môi di chuyển: chuẩn bị 30 ml dung môi di chuyển theo tỷ lệ: 9 phần ether dầu hỏa + 1 phần benzene Cho dung môi này vào một đĩa Petri Đặt ống giấy sắc ký (với đường gốc thật khô) vào đĩa Petri chứa dung môi di chuyển, mặt thoáng của dung môi phải thấp hơn vạch bút chì (giới hạn trên của đường gốc) vài mm Dùng ly thủy tinh úp kín toàn bộ đĩa dung môi và ống sắc ký để tạo một khí quyển bên trong bão hòa dung môi
Do mao quản, dung môi ngấm lên dần trên tờ sắc ký Đợi đến khi dung môi ngấm lên đến cách cạnh của tờ giấy khoảng 2 cm thì lấy tờ giấy ra, đánh dấu vị trí mức ngấm của dung môi và sấy khô Đánh số “vạch gốc” là 0, vạch dung môi cao nhất là 10 Chia khoảng di chuyển của dung môi 2 thành 10 băng, đánh số băng từ 1 đến 10 Xác định vị trí từng loại sắc tố đã tách rời nhau trên tờ sắc ký Tính Rf
Hình 32 Kết qua sau khi chạy sắc ký
Dựa trên lý thuyết ta có mức độ phân cực của các sắc tố:
Giá trị Rf của các thành phần trong dung dịch ly trích (theo lý thuyết)
Sắc tố Vệt màu Rf
Giá trị Rf của các thành phần trong dung dịch ly trích (theo kết quả TN)
Sắc tố Vệt màu Rf
Từ kết quả quan sát thấy, ta có thể nhận xét độ phân cực của các sắc tố:
Chlorophyll b > Chlorophyll a > Xanthophyll > Carontene Do dung môi ether dầu hỏa + benzene là dung môi không phân cực nên các sắc tố càng ít phân cực thì sẽ càng được dung môi kéo đi lên cao trên tờ giấy sắc kí, ngược lại các sắc tố phân cực hơn sẽ bị giữ bởi giấy thấm do giấy có bản chất là cellulose cũng có tính phân cực, do đó các thành phần khác nhau sẽ đi đến các vị trí khác nhau trên giấy sắc kí Kết quả thu được đi từ điểm gốc lên sẽ tương ứng dưới cùng là Clorophyll b → Chlorophyll a → Xanthophyll → Carontene
2.2 Chứng minh hoạt động thải O 2 trong quá trình quang hợp
2.2.1 Thao tác Úp ngược một cái phễu trên vài cọng rong trong một chậu nước (lưu ý: mặt cắt của cọng rong hướng về cuống phễu) Úp lên cuống phễu một ống nghiệm nhỏ chứa đầy
39 nước (xem hình) Đặt hệ thống dưới ánh sáng mặt trời hoặc nguồn sáng mạnh Quan sát sự thoát bọt khí từ vết cắt của cọng rong Sau 45 phút, lấy ngón tay bịt miệng ống nghiệm, dốc ngược lên và đưa một đầu diêm gần tàn đến miệng ống nghiệm Ghi nhận hiện tượng
Sau 1h, thấy xuất hiện bọt khí ở phần đáy úp ngược của ống nghiệm, đó là khí oxy được sinh ra trong quá trình quang hợp của cây thủy sinh Để chứng mình đó là khí Oxy có thể dùm que đóm vừa tắt đặt tiếp xúc với khí, que đóm sẽ bùng cháy trở lại vì khí Oxy duy trì sự cháy Tuy nhiên do thời gian thí nghiệm ngắn nên lượng khí sinh ra ít, không đủ để làm thao tác chứng minh
Phương trình quang hợp tổng quát:
2.3 Chứng minh tinh bột là sản phẩm của quang hợp
Dùng giấy đen che tối một phần lá (đang ở trên cây) trong 2 ngày (hình) Ngắt lá, dùng kẹp chuyển lá vào một ống nghiệm có chứa cồn 70 o C trong một cốc chứa nước đang sôi và đun cho đến khi lá mất màu xanh
Rửa lá bằng nước và trải lá lên đĩa petri Cho dung dịch lugol lên lá, lắc để lá nhuộm màu đều Dùng giấy thấm hút hết dung dịch Lugol thừa Ghi nhận hiện tượng và giải thích
Hình 34 Mẫu lá sau khi nhuộm bằng thuốc thử Lugol
Tại phần lá không bị che có màu tím đen, phần lá bị che sáng không có màu
Dùng cồn để tẩy hết diệp lục trong lá Phần lá không bị che sáng vẫn thực hiên quang hợp bình thường nên trong đó vẫn có sự hiện diện của tinh bột, và Lugol chứa ion triiodine sẽ tạo phức với tinh bột tạo ra màu xanh tím (được giải thích ở các thí nghiệm trước), do ảnh hưởng của các sắc tố còn lại trong lá khiến màu nhìn thấy là màu đen
Phần lá bị che sáng không tổng hợp được tinh bột do không nhận được ánh sáng, tinh bột sẵn có trong phần đó cũng bị phân giải đi mất nên khi cho thuốc thử không có hiện tượng hóa màu tím đen
2.4 Chứng minh hoạt động quang hợp sử dụng CO 2
Chuẩn bị 2 chai thủy tinh có đánh số:
2.4.1 Thổi khí vào cả 2 bình và nút kín bằng nút cao su, bơm vào chai 1 10ml dung dịch Ba(OH)2 bão hòa; bình 2 10ml nước cất
Hình 35 Chai 1(trái) và chai 2 (phải)
Chai 1 có hiện tượng vẩn đục, chai 2 không có hiện tượng CO2 có trong bình tạo kết tủa với Ba(OH)2 làm vẩn đục dung dịch
2.4.2 Cho vào chai số 2 một nhánh cây còn tươi Thổi vào cả 2 chai rồi đậy kín nắp Để cả 2 chai dưới nguồn sáng mạnh Sau 90 phút, dùng kim tiêm bơm vào mỗi chai