Ly trích sắc tố:
Giã 3g lá xanh trong một cối sạch và khô. Thêm vào 20 ml acetone, cà đều. Lọc qua giấy lọc, dịch lọc hứng vào một ống nghiệm sạch và khô, đậy nút kín. Quan sát màu của dung dịch dưới ánh sáng truyền suốt và ánh sáng phản xạ.
36
Hình 31. Màu của dung dịch ly trích qua ánh sáng
Dưới ánh sáng truyền suốt, dung dịch có màu xanh lục, dưới ánh sáng phản xạ, dung dịch có màu đỏ do hiện tượng phát huỳnh quang diệp lục.
Khi tiếp nhận năng lượng ánh sáng, electron trong phân tử bị kích thích nhảy lên mức năng lượng cao hơn, chuyển sang trạng thái bị kích thích. Sau khi rời khỏi quỹ đạo ban đầu trong thời gian ngắn, electron trở về quỹ đạo cũ, năng lượng kích thích chuyển thành nhiệt và kích thích các phân tử diệp lục khác phát ánh sáng huỳnh quang.
Sắc ký
Chuẩn bị giấy sắc ký, thực hiện đường gốc:
Cắt một mẫu giấy sắc ký 10 x 10 cm. Dùng bút chì kẻ nhẹ một đường thẳng song song 1 cạnh cách bìa khoảng 1 cm. Cuốn tờ giấy thành ống, giữ bằng 2 kim bấm ở hai đầu ống, 2 mép giấy không chồng lên nhau.
Đổ dung dịch sắc tố trích ly ở trên vào hộp petri. Đặt đầu ống giấy có đường vạch bút chì vào dung dịch. Do mao dẫn, dịch sắc tố thấm lên thành ống giấy. Khi dịch sắc tố vừa chạm vạch bút chì, lập tức lấy ra, sấy khô bằng máy sắy tóc hoặc đặt trước quạt máy. Khi vệt sắc tố đã thật khô, lại nhúng đầu ống giấy vào dung dịch sắc tố trong đĩa Petri, đợi đến khi mực sắc tố ngấm chạm vạch bút chì, lấy ra sấy khô lại. Cho đầu ống giấy tẩm sắc tố như vậy tổng cộng 4 lần. Sau khi lần tẩm cuối cùng đã khô hẳn, ta có
“đường gốc (vạch gốc)” của tờ sắc ký chứa hỗn hợp cần phân tích.
37 Triển khai sắc ký
Dung môi di chuyển: chuẩn bị 30 ml dung môi di chuyển theo tỷ lệ: 9 phần ether dầu hỏa + 1 phần benzene. Cho dung môi này vào một đĩa Petri.
Đặt ống giấy sắc ký (với đường gốc thật khô) vào đĩa Petri chứa dung môi di chuyển, mặt thoáng của dung môi phải thấp hơn vạch bút chì (giới hạn trên của đường gốc) vài mm. Dùng ly thủy tinh úp kín toàn bộ đĩa dung môi và ống sắc ký để tạo một khí quyển bên trong bão hòa dung môi.
Do mao quản, dung môi ngấm lên dần trên tờ sắc ký. Đợi đến khi dung môi ngấm lên đến cách cạnh của tờ giấy khoảng 2 cm thì lấy tờ giấy ra, đánh dấu vị trí mức ngấm của dung môi và sấy khô. Đánh số “vạch gốc” là 0, vạch dung môi cao nhất là 10. Chia khoảng di chuyển của dung môi 2 thành 10 băng, đánh số băng từ 1 đến 10. Xác định vị trí từng loại sắc tố đã tách rời nhau trên tờ sắc ký. Tính Rf.
2.1.2. Kết quả
Hình 32. Kết qua sau khi chạy sắc ký
Dựa trên lý thuyết ta có mức độ phân cực của các sắc tố:
38 Chlorophyll b > Chlorophyll a > Xanthophyll > Carontene
Giá trị Rf của các thành phần trong dung dịch ly trích (theo lý thuyết)
Sắc tố Vệt màu Rf
Carotene Vàng cam 1
Xanthophyll Vàng 0.8
Chlorophyll a Xanh lục 0.67
Chlorophyll b Xanh ô liu 0.53
Giá trị Rf của các thành phần trong dung dịch ly trích (theo kết quả TN)
Sắc tố Vệt màu Rf
Carotene Vàng cam 0.97
Xanthophyll Vàng 0.86
Chlorophyll a Xanh lục 0.62
Chlorophyll b Xanh ô liu 0.49
Từ kết quả quan sát thấy, ta có thể nhận xét độ phân cực của các sắc tố:
Chlorophyll b > Chlorophyll a > Xanthophyll > Carontene. Do dung môi ether dầu hỏa + benzene là dung môi không phân cực nên các sắc tố càng ít phân cực thì sẽ càng được dung môi kéo đi lên cao trên tờ giấy sắc kí, ngược lại các sắc tố phân cực hơn sẽ bị giữ bởi giấy thấm do giấy có bản chất là cellulose cũng có tính phân cực, do đó các thành phần khác nhau sẽ đi đến các vị trí khác nhau trên giấy sắc kí. Kết quả thu được đi từ điểm gốc lên sẽ tương ứng dưới cùng là Clorophyll b → Chlorophyll a → Xanthophyll → Carontene.