Nghiên cứu hoạt tính cây xạ Đen Để Ức chế enzyme amylase tạo Đường khử, Ứng dụng trong Điều trị bệnh Đái tháo Đường

Chính vì vậy mà đề tài “ Nghiên cứu hoạt tính cây Xạ đen để ức chế enzyme amylase tạo đường khử , ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ’’ được thực hiện nhằm nghiên cứu thành phần hóa

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẦM

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CÂY XẠ ĐEN ĐỂ ỨC CHẾ

ENZYME AMYLASE TẠO ĐƯỜNG KHỬ, ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG.

Họ và tên sinh viên thực hiện: Vũ Đình Nam MSSV:19482191

Lớp:DHSH15A

Giảng viên hướng dẫn: Hồ Thiên Hoàng

MỤC LỤC

Tổng quan 4

Sự cần thiết của đề tài 11

Một số nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn 12

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

Mục tiêu nghiên cứu 13

Nội dung nghiên cứu 13

Nguyên liệu và phương pháp 14

Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 8

PHẦN CHUẨN BỊ CỦA HỌC VIÊN 10

Ý KIẾN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa các dân tộc ở châu Á đã biết sự dụng các loài cây cỏ, hoa, lá trong tựnhiên để chữa bệnh tật, Tuy nhiên, sự kết hợp hài hòa giữa các bài thuốc cây cỏchủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loài thảo dược

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết cảu con người vềcác loài thảo dược ngày càng rộng lnws hơn Việc nghiên cứu các thành phần hóahọc để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của cây thuốc chữa bệnh trở thành một lĩnh vựcthu hút được sự chú ý của giới khoa học

Ở nước ta, việc sự dụng cây cỏ chữa bệnh là rất phổ biến trong dân gian Mộttrong số đó là tác dụng chữa bệnh của cây xạ đen, tên khoa học là Celastrus hindsii

là loài thực vật thuộc họ Celastraceae Chúng được George Bentham miêu tả khoahọc đầu tiên năm 1851

Cây Xạ đen còn có các tên gọi là bách giải, đồng triều, bạch vạn hoa, cây dây gối(thuộc Chi dây gối), hay quả nâu, hoặc cây ung thư (dân tộc Mường, Việt Nam)

Xạ đen có tác dụng chữa bệnh như thông kinh, lợi tiểu, chữa ung nhọt và lở loét,phòng ngừa ung thư, tiêu viêm, mát gan mật, giúp cơ thể loại trừ độc tố TheoĐông y, cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều trịmụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch, tăng cường sức đề khángcủa cơ thể

Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của cây Xạ đen là từkinh nghiệm dân gian Những kinh nghiệm đó chưa được chứng minh rõ ràng bằng

các nghiên cứu Chính vì vậy mà đề tài “ Nghiên cứu hoạt tính cây Xạ đen để ức chế enzyme amylase tạo đường khử , ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ’’ được thực hiện nhằm nghiên cứu thành phần hóa học của cây Xạ đen ứng dụng

trong điều trị bệnh đái tháo đường

TỔNG QUAN

1.1 Cây xạ đen

Xạ đen trước đây được biết với tên khoa học là (Celastrus hindsii) là loài thực vậtthuộc họ Celastraceae Chúng được George Bentham miêu tả khoa học đầu tiênnăm 1851 Năm 2009, tên khoa học chính xác của xạ đen được xác định là Ethretiaasperula Zol And Mor, thuộc họ Vòi voi (Boraginaceae) Xạ đen thuộc loại câydây leo thân gỗ, nhánh cây buông ra leo bám dài, mọc thành búi, dễ trồng Cây bụicao 3-10 m, cành màu nâu xám, lúc non có lông, khi già nhẵn Lá đơn, mọc cáchcuống lá dài khoảng 1 cm, hơi vặn, phiến lá hình bầu duc, dài 10-12 cm, rộng 5-6

cm, gốc tròn hay hơi thuôn, mép nguyên hoăc khía răng cưa, chóp lá nhọn, nhẵn cả

2 măt hoặc mắt trên có lông ở các gân; gân bên 4-5 đôi, phủ lông cứng, dựng đứng.Cum hoa xim ở đỉnh cành, rông 4-6 cm, có lông Lá bắc hình dải đến hình ngọngiáo, dài 3-10 mm Hoa có cuống dài 2-2,5 mm; đài màu xanh, cao 1,5 mm, 5 thùyhình trứng, có lông Tràng màu trắng, dạng phễu, dài 3,5-4 mm, gốc rộng 1,5 mm,hình trứng hoặc hình tam giác, dài 2-2,5 mm, khi nở uốn cong gấp ra ngoài Nhi

̣5mm, dài 3,5- 4 mm, đính cách gốc ống tràng khoảng 1 mm, bao phấn dài khoảng

1 mm, hình mũi tên .Bầu gần hình cầu Vòi nhuy ̣ dài 4-4,5 mm, xẻ 2 nhánh dài 1

mm Quả hạch, màu vàng cam đến đỏ , đường kính 7-8 mm, lúc chín mở thành bốnhạch, mỗi hạch chứa 1 hạt Ra hoa vào tháng 3-5, ra quả tháng 8 - 12 Là loạidược liệu phân bố nhiều ở Trung Quốc và các nước như Việt Nam, Ấn Độ,Myanma,… Tại Việt Nam, xạ đen phân bố ở các tỉnh như Hòa Bình, Hà Nam,Ninh Bình,…

Nằm trong họ xạ còn có cây xạ trắng, xạ vàng, xạ lai, vì vậy người ta thường dễnhầm lẫn các cây thuộc họ xạ với nhau Tuy nhiên, xạ vàng và xạ đen là hai loạiphổ biến nhất được dùng để làm dược liệu

Cây xạ đen: Cây tươi có lá dày và màu tím xanh, thân cây đậm màu Sau khi phơikhô, lá cây bị nát nhưng không giòn, có mùi thơm nhẹ, thân cây chuyển sang màuđen và có mùi thơm

Cây xạ vàng: Cây tương có lá mỏng và màu xanh, mép lá không có răng cưa Sau khi phơi khô, lá cây rất dễ bị nát và giòn, thân cây chuyển sang màu trắng, không

có mùi thơm

Cây xạ đen có thành phần hóa học gồm những polyphenol (axit lithospermic và axit lithospermic B, axit rosmarinic, kaempferol 3-rutinoside, rutin); sesquiterpene

và triterpene; các nhóm hợp chất khác như axit amin, quinone, flavonoid, tanin,

là những chất chống oxi hóa rất tốt Polyphenol làm chậm quá trình hấp thụ

glucose thông qua ức chế α-amylase và α-glucosidase là những enzym quan trọng trong quá trình tiêu hóa carbohydrate

1.2 Enzyme Amylase

Amylase là một hệ enzyme có cả ở thực vật và động vật Enzyme amylase thuộcnhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong cácpolysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen vàdextrin thành glucose, maltose và dextrin Các Enzyme Amylase có trong nước bọt( còn gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mần,nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từmiệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy ( còn gọi làamylopsin) Amylase là Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y tế

và nhiều lĩnh vực khác đặt biệt là ngành công nghiệp thực phẩm

Hiện nay, có 6 loại Enyme Amylase được xếp vào 2 nhóm Endoamylase( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )

α-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)amylase ( α – 1,4-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)glucan 4-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1) glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1).

Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside của cơ chất một cáchngẫu nhiên, α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khảnăng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn :

+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủyphân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( α-dertrin ), độ nhớt của hồ tinhbột giảm nhanh các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh

+ Giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủyphân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bịthủy phân rát chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dướitác dụng của của α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharidegồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylosethành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1 )

+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polygucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và

maltose, Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa

13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy amylase lên amylopectin cũng xảy

ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-amylase lên amylopectin cũng xảy 1-amylase lên amylopectin cũng xảy 6-amylase lên amylopectin cũng xảy glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dùg có chịu tác dụng lâu dài thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên( 72% maltose và 19% glucose ) còn có

dertrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng củaα-amylase, tinh bột có thểchuyển thành maltoterose,maltose, glucose và dertrinphân tử thấp Tuy nhiên,thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dertrin phân tử thấpkhông cho màu với iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylasenày là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa

Đặc tính α-amylaseamylase

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc trưng riêng, α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các acid glutamic và aspartic chiếm ¼ tổng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:

+ α-amylase có ít methionine và khoảng 7-10 gốc cysteine.

+ Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir

1956 ; Fisher , Stein, 1960 )

+ Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline α-amylase là một metaloenzyme Một phân tử α-amylase đều có chứa 1-30nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham giavào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động củaenzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi

bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động enzyme phân giải protein.Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năngthủy phân cơ chất , α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme Tất cả amylaseđều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu, Ag, Hg và hầu hết α-amylase khábền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain,…

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị tổn thương.Sản phẩm cuối cùng của thuỷ phân amylase là glucose và maltose.

α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1-6 glucoside của amylopectin,nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh Đây là một cấutrúc phân tử tinh bột do enzyme α-amylase phân cắt tạo thành tới hạn phân nhán Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác động của amylase nấm sợichủ yếu là maltose và maltotriose Nồng độ α-amylase của VSV tương đối lớn cóthể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-amylase của nấmmốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%

Điều kiện hoạt dộng của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giốngnhau, pH cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4.0 - 4.8 Theo số liệu củaLiphis, pH cho hoạt động của dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từAsp.oryee trong vùng 5.6 - 6.2

Nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũngkhông đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy đối với tác động nhiệt Nhiệt độcủa nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C( Kozimina, 1991)

Trong dung dịch đệm pH= 4.7, α-amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác độngnhiệt cao, thậm chí ở 40°C trong 3 giờ hoạt lực dertrin hóa của nó chỉ còn 22-29%,hoạt lực đường hóa còn 27-85% Ở 50% trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này

bị vô hoạt hoàn toàn( Miller và cộng sự)

Oligo 1,6-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)glucosidase( dertrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Eyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, panose và cácdextrin tới hạn thành đường Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời cũng cótrong các hạt nảy mầm( đại mạch, thóc nảy mầm)

Enzyme pullulanase (α-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)dextrin6-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)glucosidase)(EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thủy phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan vàcác dextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnhhưởng lớn đến sự tác động của enzyme Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6glucoside bị bao quanh từ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủyphân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm 2 gốc maltose nối nhau bằng liên kếtα-1,6 glucoside

α-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)glucosidase hay maltase ( α-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)D,glucoside-amylase ( α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)glucohydrolase)(EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột

Maltase và glucozyltranferase là một enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu

Động vật, thực vật và vi khuẩn sử dụng enzyme này trong các con đường phân giải tinh bột khác nhau α-glucosidase được chia thành ba nhóm theo tính đặc hiệu của cơ chất Nhóm I là các enzym chọn lọc các cơ chất không đồng nhất như sucrose và aryl α-glucosides Nhóm II và III là các enzym chọn lọc các cơ chất đồng nhất như maltose, mặc dù các enzym trong nhóm II có tính chọn lọc cao đối với các cơ chất chuỗi dài Dựa trên trình tự axit amin của chúng, các α-glucosidase thuộc họ glycosyl hydrolase 13 và 31 Các enzym trong họ 13 có (β/α) miền xúc tác gấp 8 thùng A và hai miền bổ sung được đánh dấu là B và C Cyclodextrin glucanotransferase , α-amylase và các enzyme khác cũng thuộc họ glycosyl

hydrolase 13; do đó, nhóm này được phân loại thành các phân họ

Hơn hai mươi trình tự axit amin hoàn chỉnh đã được báo cáo cho các

α-glucosidase Saccharomyces cerevisiae α-glucosidase cho thấy sự tương đồng cao với Bacillus cereus α-glucosidase trong trình tự axit amin Trình tự axit amin được bảo tồn của họ α-glucosidase I và II, được xác định theo cấu trúc chính của chúng, được làm rõ trong nghiên cứu của Chiba

Exoamylase

Enzyme β-amylaseAmylase ( β-amylase 1,4-amylaseglucan-amylasemaltohydrolase ) (EC 3.2.1.2)

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong cáchạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4-glucantrong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầukhông khử của mạch Maltose được hình thành do sự xúc tác của β-Amylase cócấu hình β

γ-amylaseamylase( glucoamylase hay γ-amylase1,4-amylaseglucan-amylaseglucohydrolase )( EC 3.2.1.3).

Glucoamylase có khả nằng thủy phân liên kết 1-4, lẫn 1-6 glucoside, ngoài ra còn

có khả năng thủy phân các liên kết 1-2 và 1-3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,amylopectin,dertrin,… thành glucose mà không cần sự than gia của các loạiamylase khác

Bệnh đái tháo đường.

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một rối loạn chuyển hóa có đặc điểm chính là glucose trong máu tăng cao, do thiếu insulin tuyệt đối hoặc tương đối và/hoặc giảmchức năng của insulin Tình trạng tăng glucose huyết kéo dài sẽ đưa đến các biến chứng ở mạch máu lớn và mạch máu nhỏ Insulin là một hormon do tuyến tụy tạngtiết ra Sau khi ăn, glucose được hấp thu từ ruột vào máu, kích thích tuyến tụy tiết insulin, insulin sẽ giúp đưa glucose vào tế bào cơ và tế bào mỡ, ngoài ra sẽ ngăn sựsản xuất glucose từ gan và sự tân sinh đường trong gan Khi nhịn đói, cơ thể vẫn cần glucose để duy trì hoạt động của các cơ quan, gan sẽ sản xuất glucose từ 2 nguồn: thủy phân glycogen dự trữ ở gan thành glucose để đưa vào máu và sự tân sinh đường Sự tân sinh đường tại gan là sự tổng hợp và sản xuất glucose từ các chất có nguồn gốc từ chất đạm và mỡ Hoạt động sinh lý bình thường này giúp chonồng độ glucose huyết duy trì ở mức vừa đủ, không quá cao sau khi ăn, không quá

thấp khi nhịn đói Trong bệnh Đái tháo đường, cơ thể không còn insulin hoặc có insulin nhưng hormon này không thực hiện được các tác dụng sinh lý kể trên, nói cách khác cơ thể không còn nhạy cảm với insulin hoặc đề kháng với tác dụng của insulin Tuy nhiên còn nhiều cơ chế khác góp phần gây ra tăng glucose huyết: như tăng tiết glucagon (hormon có tác dụng tăng glucose huyết do tụy chế tiết), giảm tiết các hormon incretin ở ruột (incretin có nhiều tác dụng như giúp tụy tăng tiết insulin, giảm tiết glucagon, làm chậm sự chuyển thức ăn từ dạ dày xuống ruột, tác dụng trên não làm giảm sự thèm ăn), tăng tái hấp thu glucose tại thận.

SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay, bệnh đái tháo đường týp II đang ở mức báo động trên toàn thế giới Cónhiều nguyên nhân khác nhau gây ra bệnh này và được chia thành các yếu tố rủi ro

có thể thay đổi được, chẳng hạn như lượng calo nạp vào tăng lên, lối sống ít vậnđộng và căng thẳng, và các yếu tố rủi ro không thể thay đổi được, chẳng hạn như ditruyền và tuổi tác Các khía cạnh kinh tế xã hội và văn hóa khác nhau gây ra thừacân và béo phì, do đó dẫn đến tăng nguy cơ phát triển bệnh Bệnh tiểu đường loại

II là kết quả của tình trạng kháng insulin và phổ biến hơn bệnh tiểu đường loại I,

do cơ thể tiết không đủ insulin Ngoài ra, 5–15% phụ nữ mang thai bị đái tháođường thai kỳ, bệnh chỉ xảy ra trong thai kỳ Vào năm 2021, theo báo cáo có 537triệu người mắc bệnh này và hơn 90% các trường hợp mắc bệnh tiểu đường là loại

II Người ta dự đoán rằng con số này sẽ đạt 783 triệu vào năm 2045 [ 4 ] Để kiểm

soát bệnh tiểu đường loại II, có những phương pháp không dùng thuốc bao gồmchế độ ăn uống và tập thể dục hợp lý, trong khi phương pháp dùng thuốc bao gồmthuốc hoặc insulin Tuy nhiên, liệu pháp dược lý có thể gây ra tác dụng phụ vềđường tiêu hóa và tốn kém đáng kể cho bệnh nhân; do đó, một cách tiếp cận khác

là cần thiết [ 5 ] Việc sử dụng các loại thực vật có chứa các chất phức tạp, có hoạt

tính sinh học khác nhau và ít tác dụng phụ hơn, là một trong những hướng tiếp cận

được đề xuất gần đây [6] Việc điều chỉnh mức đường huyết sau ăn có thể đạt được

bằng cách ức chế α-amylase và α-glucosidase, vì chúng là những enzym chủ chốt

trong quá trình tiêu hóa tinh bột [ 7 ] Các dược phẩm như acarbose và voglibose