Nghiên cứu Điều chế xúc tác giả sinh học trên cơ sở polyamidoamine dendrimer ghép hematin và Đánh giá khả năng thay thế enzyme horseradish peroxidase

Từ những kết quả của quá trình nghiên cứu, G2.0-He có thể được xem là một chất xúc tác giả enzyme HRP hiệu quả, có tiềm năng ứng dụng trong phân tích sinh hóa và chế tạo vật liệu y s

TỔNG QUAN

ENZYME HORSERADISH PEROXYDASE

1.1.1 Nguồn gốc và cấu tạo

Horseradish (Amoracia Rusticana) là một loại thảo mộc lâu năm được trồng ở các vùng ôn đới trên thế giới, cho giá trị ẩm thực chủ yếu ở phần rễ cây Đây cũng là một nguồn giàu peroxidase, một loại enzyme có chứa heme sử dụng hydrogen peroxide (H2O2) để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ [4]

HRP là chuỗi polypeptide đơn chứa bốn cầu nối disulfide Nó là một glycoprotein chứa 18% carbohydrate Thà iệu quả trong việc loại bỏ phổ rộng các hợp chất thơm (phenol, biphenol, anilin) với sự hiện diện của

Bước 1: Quá trình xúc tác có sự tương tác giữa Fe(III) của enzyme ở trạng thái nghỉ với H2O2, sau đó một phân tử nước được giải phóng với hai phần carbohydrate bao gồm galactose, arabinose, xyloza, fucose, mannose, mannosamine và galactosamine, tùy thuộc vào isozyme cụ thể 1.1.3 Ứng dụng

Enzym Horseradish Peroxidase (HRP) là một enzyme linh hoạt được áp dụng trong các ngành công nghiệp hóa học, môi trường, dược phẩm và công nghệ sinh học Horseradish peroxidase (HRP) được biết là có electron oxi hóa của heme sắt hình thành hợp chất A Hợp chất A có trạng thái oxy hóa cao gồm Fe(IV) oxoferryl và gốc cation porphyrin (Por.+ FeIV = O) [6]

Bước 2: Chuyển 2 electron đơn, làm cho hợp chất A được đưa về trạng thái nghỉ Việc giảm một electron đầu tiên của gốc cation porphyrin cần sự hiện diện của chất nền phenol hoặc dẫn xuất anilin để hình thành hợp chất

B (Fe(IV)=O) Việc giảm một electron thứ hai giúp đưa hợp chất B về trạng thái nghỉ [6]

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 5

HEMATIN

1.2.1 Nguồn gốc và cấu tạo

Hematin thu được thông qua sự phân hủy của hemoglobin là một hợp chất Fe (III) Mỗi hemoglobin gồm bốn đơn vị heme Một đơn vị heme chứa một vòng porphyrin và một nguyên tử Fe 2+ ở chính giữa liên kết bằng hai cộng hóa trị và hai liên kết phối trí

Hematin có cấu trúc tương tự như protoporphyrin sắt giả được tìm thấy trong HRP nên cũng có khả năng xúc tác phản ứng vòng với sự hiện diện của

Cơ chế xúc tác vòng của Hematin cũng tương tự cơ chế xúc tác của enzyme HRP Lõi Fe (III) là tác nhân xúc tác chính với sự hiện diện của H2O2.

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 6 Đầu tiên H2O2 oxi hóa hợp chất Fe(III) thành hợp chất Fe(IV + ) là hợp chất có khả năng oxi hóa cao nhất Sau đó, hợp chất Fe(IV + ) nhận e- từ vòng polymer để trở về trạng thái nghỉ ban đầu và bắt đầu một chuỗi xúc tác mới Polymer vòng mất 1e- trở thành R• có khả năng kết hợp với một gốc R• khác tạo thành chuỗi polymer [8].

DENDRIMER POLYAMIDOAMINE

1.3.1 Giới thiệu về dendrimer a) Khái ni ệ m và c ấ u trúc

Khái niệm dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào năm 1985 Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp là “Dendron”, có nghĩa là nhánh cây Đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực [9]

Dendrimer là các đại phân tử nano có tổ chức ba chiều, phân nhánh rất lớn (thường là 5000-500.000 g / mol), có dạng hình cầu, có nhiều tính chất ưu việt hơn polymer mạch thẳng, đã thể hiện một vai trò thiết yếu trong lĩnh vực nano mới nổi [10]

Cấu tạo dendrimer gồm 3 phần:

- Phần lõi (tâm hoặc core)

- Phần nhánh (có nhiệm vụ liên kết các nhóm bên ngoài với tâm, giữa các nhánh có nhiều khoảng không gian trống)

- Các nhóm bề mặt (nhóm anion, cation, nhớm trung tính, nhóm ưa nước hay kỵ nước) b) Tính ch ấ t:

Nhược điểm lớn nhất của các polymer thông thường là các phân tử có kích thước và khối lượng phân tử không đồng nhất dẫn đến độ đa phân tán cao Nguyên nhân là do trong quá trình tổng hợp các polymer mạch thẳng hay nhánh thì sự sắp xếp các nhánh xảy ra một cách ngẫu nhiên, không kiểm soát

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 7 được Với kích thước và khối lượng phân tử được kiểm soát một cách chặt chẽ trong suốt quá trình tổng hợp, thể hiện tính đơn phân tán, do đó Dendrimer thể hiện tính vượt trội hơn hẳn so với các loại polymer thông thường [11]

Tính tan của dendrimer phụ thuộc vào các thành phần cấu trúc Dendrimer với tâm và các nhóm bên ngoài là các nhóm ưa nước thì có khả năng tan được trong nước, nhưng với các dendrimer có tâm và các nhóm bên ngoài là các nhóm kỵ nước, ưa dầu thì chúng không có khả năng tan trong nước mà tan được trong các dung môi có tính dầu Độ dài của tâm liên quan đến hình dạng và tính ái dầu của dendrimer Nếu số nhóm -CH2 trong tâm phân tử càng nhiều sẽ làm tăng tính ái dầu Do đó, chúng ta có thể tổng hợp được dendrimer với khả năng hòa tan như mongmuốn bằng cách lựa chọn thành phần cấu trúc thích hợp [12]

Do dendrimer chứa các khoảng trống ở bên trong nên được sử dụng như một chất vận chuyển Các chất mà dendrimer có thể mang là thuốc, các đoạn ADN, các hormon, các chất xúc tác, … Đối với các dendrimer thế hệ thấp (G=0-2), phân tử dendrimer chưa có cấu trúc hình cầu rõ rệt nên chưa thể hiện tốt vai trò vận chuyển Từ thế hệ thứ ba (G ≥3) thì dạng hình cầu rõ rệt, các khoảng trống bên trong dendrimer bắt đầu có vai trò vận chuyển tốt hơn Tuy nhiên, đến các thế hệ cao hơn thì các nhóm bề mặt hầu như xếp khít nhau, làm cho khả năng vận chuyển bị hạn chế

Tính đa hóa trị của dendrimer do các nhóm bề mặt quyết định, các nhóm chức bề mặt có khả năng tương tác qua lại đa hóa trị với các phân tử xung quanh

Trong sinh học, phối tử đơn hóa trị rất khó kết nối.Vì vậy các dendrimer với khảnăng tương tác đa hóa trị rất có triển vọng sử dụng trong hóa sinh, dendrimer được sử dụng như chất mang trong nghiên cứu ảnh

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 8 hưởng của hoạt tính sinh học dung để trị bệnh đến cơ thể người Tính chất này còn cho phép tạo ra các copolymer có tính chất đặc biệt như độ nhớt, tính bền ứng dụng để tạo ra các vật liệu khác [11]

Phân tử dendrimer có kích thước và hình dạng rất khác so với polymer mạch thẳng hay nhánh khác Trong dung dịch chúng rất đa dạng có khi kết thành một chuỗi thẳng dài, có khi kết thành chùm hay có khi ở dạng đơn phân tử Kích thước phân tử của chúng thường khoảng vài chục đến vài trăm nanomet (nm) Vì thế dendrimer cũng được xem là vật liệu nano và Dendrimer có kích thước tương tự một số cấu trúc sinh học [11]

Hình 1 3 Kích thước PAMAM G3.0, G4.0, G5.0, phù hợp với kích thước của insulin (30 Å), Cytochrome C (40 Å) và hemoglobin (55 Å)

- Tính tương hợp sinh học Để có thể ứng dụng dendrimer như tác nhân sinh học, dendrimer phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:

 Không tạo sự miễn dịch

 Có khả năng thấm sinh học tức là có khả năng đi xuyên qua rào chắn sinh học (màng tế bào hoặc màng vi khuẩn, …)

 Có khả năng lưu thông trong hệ thống sinh học với thời gian cần thiết để có hoạt tính lâm sàn mong đợi

 Có thể định hướng tới những cấu trúc sinh học đặc biệt

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 9

Các tính chất sinh học của dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào kích thước của dendrimer và các nhóm chức trên bề mặt của chúng và ít phụ thuộc vào cấu trúc bên trong của dendrimer Với các nhóm chức bề mặt, dendrimer có thể được biến tính để tạo ra các tính chất sinh học đặc biệt [11] c) Các y ế u t ố ảnh hưở ng lên dendrimer:

- Ảnh hưởng của khối lượng phân tử lên dendrimer

Khi tăng thế hệ dendrimer, tức là tăng khối lượng phân tử của dendrimer, hình dạng của dendrimer được xác định bởi các yếu tố:

 Kích thước của monomer, kích thước monomer ngắn thì không gian thể tích của dendrimer nhỏ

 Độ dẻo của dendrons tăng

 Khả năng của các nhóm chức ngoài cùng tạo nội liên kết giữa chúng với nhau

Cấu trúc và hình dạng phân tử dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào độ pH Tại pH thấp (pH9) hiện tượng “nếp gấp ngược” xảy ra ở mức độ cao hơn do lực đẩy giữa các nhánh và giữa các nhóm chức ở bề mặt đều rất nhỏ, các phân tử bắt đầu co lại, có hình dạng như một khối cầu, nên các khoảng không gian rỗng bên trong giảm mạnh

Trong dung môi kém phân cực thì dendrimer co cuộn lại, do lúc này hình thành liên kết hydro giữa N của nhóm -NH2 bên ngoài và H của nhóm -NH- bên trong Trong dung môi phân cực thì các nhánh của dendrimer duỗi thẳng ra do tạo liên kết hydro giữa nhóm amine trong và ngoài phân tử hay giữa O (của -COO-) với H của dung môi

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 10

Hình 1 4 Cấu trúc không gian 3 chiều của dendrimer PAMAM G6.0 ở các điều kiện pH tăng dần

Nồng độ ion cao (nồng độ muối cao) có ảnh hưởng nhiều tới các dendrimer có điện tích sẽ bị co lại, tương tự với sự tăng pH hay dung môi ít phân cực

Nồng độ muối thấp, do lực đẩy giữa các đoạn dendrimer được tích điện, hình dạng dendrimer sẽ duỗi ra

Polyamidoamine (PAMAM), bài báo cáo về dendrimer lần đầu tiên (Tomalia và cộng sự, 1985), đã nhận được rất nhiều sự chú ý và được nghiên cứu sâu sắc trong

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Enzyme HRP là một metalloenzyme đóng vai trò xúc tác quan trọng trong các phản ứng sinh hóa trong chẩn đoán lâm sàng (xác định glucose, uric, (Hình 1.7, A), điều chế polymer hay vật liệu y sinh (Hình 1.7, B-C), khử độc môi trường đất, chế tạo cảm biến sinh học [16] Enzyme HRP có tâm porphyrin thể hiện hoạt tính xúc tác thông qua quá trình khử peroxide trong sự hiện diện chất nền cho electron (các phenol, aniline) tạo ra gốc tự do trên chất nền để tham gia vào các phản ứng sinh hóa [17, 18]

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 15

Hình 1 6 Cấu trúc hematin (trái) và cấu trúc enzym HRP (phải)

Tuy nhiên, enzyme HRP cũng cho thấy một số khuyết điểm như hoạt tính bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ - nồng độ H2O2 và là một enzyme rất đắt tiền Nhiều nghiên cứu tăng độ ổn định của HRP hay tổng hợp xúc tác giả sinh học trên cơ sở hematin để thay thế [18-20] Bên cạnh đó, hematin là nguồn nguyên liệu phổ biến, cấu trúc của hematin khá giống với vòng porphyrin của HRP (Hình 1.7) Mặc dù là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, tuy nhiên hematin không tan trong nước nên không thể sử dụng thay thế enzyme HRP trong xúc tác phản ứng sinh hóa [2]

Hình 1 7 Một số ứng dụng của enzym HRP (A-B-C) và cơ chế xúc tác của

Carlos Regalado và cộng sự (Phytochemistry Reviews 2004) hay nhóm nghiên cứu của Debnath (Biochemical and Biophysical Research Communications 2007) đã đề xuất sử dụng nhiều loại chất hoạt động bề mặt

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 16 để cải thiện khả năng hòa tan trong nước hoặc phân tán enzyme trong dung môi hữu cơ [16, 21]

- Nhóm nghiên cứu của Morawsky cũng giới thiệu phương pháp gây đột biến sinh học của HRP bằng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, kết quả cho thấy enzyme HRP đột biến bền hơn với H2O2 cũng như ổn định được hoạt tính đến 70°C [22]

- Zakharova và cộng sự đã giới thiệu nhiều phương pháp biến tính hóa học vòng porphyrin hoặc phần protein trong enzyme HRP để tăng độ bền và hoạt tính Tuy nhiên kết quả thu được không được cải thiện đáng kể dù thực hiện nhiều phương pháp biến tính khác nhau [18]

Hình 1 8 Phản ứng quá trình ester hóa hematin với poly (ethylene glycol) [23]

- Bên cạnh các giải pháp để nâng hiệu quả ứng dụng của enzyme HRP, hướng nghiên cứu tổng hợp các xúc tác giả sinh học trên cơ sở hematin cũng giành được nhiều sự quan tâm Nagarazan và cộng sự đã tổng hợp dẫn xuất hòa tan hematin-polyethylene glycol và đánh giá khả năng thay thế vai trò của enzyme HRP làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp polymer dẫn polyanilin Kết quả cho thấy hematin-polyethylene glycol xúc tác cho phản ứng trên tuy nhiên nghiên cứu không thấy kết quả so sánh với hoạt tính của enzyme HRP [23]

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 17

- Cùng xu hướng nghiên cứu trên, Ryu và cộng sự cũng tổng hợp dẫn xuất chitosan-hematin để thay thế enzyme HRP trong tổng hợp hydrogel sinh học Kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan-hematin có độ ổn định cấu trúc và hoạt tính trong môi trường có H2O2 nồng độ cao trong cùng điều kiện với HRP Tuy nhiên trong nghiên cứu không thấy các tác giả đề cập đến hoạt tính so sánh với HRP khi ở môi trường có H2O2 nồng độ thấp hay rất thấp như trong các phản ứng điều chế in situ các gel sinh học [24]

Hình 1 9 Cấu trúc hóa học chitosan-hematin [24]

- Rafael và cộng sự đã nghiên cứu biến tính hematin trên điện cực carbon và đánh giá biểu hiện điện hóa của bề mặt điện cực biến tính nhằm định hướng ứng dụng thay thế enzyme peroxidase trong chế tạo cảm biến [20]

- Năm 2016, Kunkun và cộng sự biến tính carbon nano tube với hematin và ứng dụng làm xúc tác cho phản ứng oxi hóa aniline trong nước thải [25]

- Trên cơ sở điện cực biến tính hematin, nghiên cứu của Rafael chế tạo cảm biến phát hiện H2O2 ở nồng độ rất thấp-nanomol [26]

- Erica Pinchon và cộng sự cũng biến tính hematin trên điện cực carbon nanotube đa lớp Điện cực biến tính đã tăng độ chuyển electron cho quá trình oxi hóa cũng như tăng mật độ dòng của điện cực [27]

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 18

- Năm 2020, Shan Liu và cộng sự nghiên cứu việc loại bỏ những hợp chất Phenolic gây ô nhiễm môi trường bằng cách liên kết các enzyme HRP riêng lẻ Nghiên cứu đã cho thấy hiệu suất của enzym được nâng cao một cách đáng kể, bao gồm khả năng ổn định nhiệt, hiệu quả xúc tác, khả năng chịu đựng với môi trường và quan trọng nhất là sự phân hủy sinh học của các hợp chất phenolic

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Với tình hình nghiên cứu trong nước hiện nay chưa có các công bố liên quan đến biến tính và ứng dụng dẫn xuất của hematin Theo tìm hiểu của chúng tôi hiện chỉ có 1 nghiên cứu về phân lập enzyme HRP trong củ cải sau đó sử dụng xác định hàm lượng thủy ngân trong nước thải và một nghiên cứu sử dụng enzyme HRP biến tính lên hạt nano vàng định hướng chế tạo cảm biến trong xét nghiệm [28]

Hình 1 10 Một số dẫn xuất phenol tạo vật liệu y sinh đã được nghiên cứu với enzyme HRP

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 19

Trong những năm qua, nhóm nghiên cứu của Tôi và PGS.TS Trần Ngọc Quyển-Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã nghiên cứu tổng hợp nhiều dẫn xuất của dendrimer và sử dụng enzyme HRP làm xúc tác cho phản ứng điều chế nhiều loại vật liệu y sinh học tương hợp sinh học-giảm cấp sinh học từ các dẫn xuất phenolic chitosan, gelatin, heparin và dendrimer

Các hydrogel trên được ứng dụng khung nuôi cấy tế bào, gel chữa lành vết thương, gel dán mô sinh học, vật liệu hydrogel trong dẫn truyền thuốc và nanocomposite hydrogel trong tái tạo xương Các kết quả trên đã được công bố trên nhiều bài báo thuộc danh mục tạp chí ISI

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 20

THỰC NGHIỆM

HÓA CHẤT- DỤNG CỤ

Hematin(MW633,49g/mol),3,4-dihydroxyphenethylamine hydrochloride, horseradish peroxidase (HRP, 216 U.mg -1 ), guaiacol (C7H8O2, MW 124,14 g/mol) và 1,2,3-trihydroxybenzene (pyrogallol ) được mua từ Sigma-Aldrich (Mỹ) Dimethylsulfoxide (DMSO) được mua từ Merck Chemicals GmbH (Darmstadt, Đức) Hydrogen peroxide (H2O2), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3- ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, MW 191,71 g/mol) và N- hydroxysuccinimide (NHS) được mua từ Acros Organics (Mỹ) PAMAM dendrimer G2.0 và catecholic gelatin (Gel-Dop) được tổng hợp tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Tất cả các hóa chất khác đều thuộc loại phân tích Đối với nghiên cứu tế bào, tế bào nguyên bào sợi của người được mua từ ATCC (Mỹ) Môi trường nuôi cấy Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) glucose cao, huyết thanh bò thai (FBS), trypsin-EDTA (0,25%), và penicillin-streptomycin (10.000 U/mL) được mua từ Sigma-Aldrich (Singapore) Nước muối đệm photphat (PBS, 1x) được mua từ Gibco Các giếng nuôi cấy khác được đặt hàng từ Corning Các bình và đĩa nuôi cấy tế bào được đặt hàng từ Corning Xét nghiệm độc tính tế bào được thực hiện với xét nghiệm sulforhodamine B (SRB) (Ab235935) và xét nghiệm nhuộm kép Sống/Chết thông qua acridine cam (AO, Alfa Aesar, USA) và propidium iodide (PI, Sigma-Aldrich)

2.1.2 Thiết bị và Dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: ống đong 10ml; erlen 250ml; bình định mức 10ml, 25ml; bình cầu 1 cổ 100ml, 250ml; bình cầu 3 cổ 250 ml

- Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G (4 số lẻ)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cô quay chân không Buxchi Rotavapor R-200, Heating Bath B-490

- Thiết bị lọc hút chân không, thiết bị cung cấp nitơ, nhiệt kế

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 21

- Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO 3500-5000, 12000-14000

- Máy UV-VIS SHIMADZU UV-1800

- Máy đông khô FDU-1200 EYELA

- Quang phổ hồng ngoại Equinox 55 Bruker

THỰC NGHIỆM

2.2.1 Tổng hợp hệ PAMAM dendrimer-Hematin (G2.0-He)

PAMAM dendrimer G2.0-Hematin được điều chế bằng cách sử dụng chất gắn kết carbodiimide, phản ứng được mô tả trong sơ đồ 2.1 Đầu tiên, hematin

(100 mg, 0.16 mmol) được hòa tan trong 50 mL DMF, và G2.0 được hòa tan trong 50 mL methanol theo tỷ lệ mol (G2.0-He=1-1, G2.0-He=1-2) Một lượng dư EDC/NHS (tỷ lệ mol: hematin/EDC/NHS=1:2:2) được sử dụng để hoạt hóa nhóm carboxylic của hematin, các nhóm carboxylic này phản ứng với nhóm amine của PAMAM G2.0 Sau đó, nhỏ giọt hỗn hợp dung dịch hematin/EDC/NHS vào dung dịch G2.0, khuấy đều Phản ứng được giữ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, khí trơ và tránh ánh sáng Dung dịch phản ứng sau đó được thẩm tách với methanol bằng màng thẩm tách 1000 Daltons cho đến khi tạp chất được loại bỏ hoàn toàn Tiếp theo, methannol được loại bỏ bằng cô quay chân không ở 45°C Cuối cùng, hòa tan lại sản phẩm trong nước

DI và đông khô để thu được G2.0-He [29] Sản phẩm G2.0-He được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR và phổ hồng ngoại IR Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) được sử dụng để định lượng hematin đã gắn lên bề mặt PAMAM G2.0 Thông qua phổ hấp thụ của hematin, tỷ lệ gắn được xác định ở bước sóng 404 nm theo công thức:

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 22

Phổ tán xạ ánh sáng động học (DLS) được sử dụng để xác định kích thước động học và thế zeta của G2.0-He

Hình 2 1 Tổng hợp hematin liên hợp dendrimers PAMAM G2.0

Quá trình tổng hợp Gel-Dop được thực hiện dựa theo quy trình của Fu và cộng sự [30] Đầu tiên, gelatin (2 g) được hòa tan trong 100 mL DI ở 50 °C, sau đó cho vào một lượng chính xác dung dịch dopamine Sau 30 phút, EDC (0.5 g, 0.00261 mol) và NHS (0.5 g, 0.00434 mol) được thêm vào hỗn hợp Dung dịch được điều chỉnh pH 5.5 bằng HCl loãng và khuấy đều suốt 24 h ở nhiệt độ phòng Dung dịch phản ứng được thẩm tách trong nước khoảng 3 ngày trước khi đông khô Cấu trúc của Gel-Dop được xác định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H NMR)

2.2.3 Hoạt tính xúc tác trên Pyrogallol

Hoạt tính xúc tác của G2.0-He ở pH 7.0 được xác định thông qua phản ứng oxi hóa pyrogallol sử dụng quang phổ UV-Vis Hỗn hợp chứa 700 mg/L pyrogallol, 50 mg/L G2.0-He, H2O, và H2O2 với tổng thể tích 3.5 mL được

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 23 cho vào ống cuvet [29] Nồng độ H2O2 được khảo sát từ 0.1 đến 100 mM [31] HRP (0.01 U/mL) được sử dụng để so sánh Sau 180s khi thêm H2O2, sự gia tăng độ hấp thu được ghi lại ở 420 nm và được sử dụng để tính toán hoạt tính xúc tác của G2.0-He và HRP ở những nồng độ H2O2 tương ứng [29] Hoạt tính xúc tác được biểu diễn dưới giá trị trung bình của 3 lần đo

2.2.4 Thử nghiệm khảo sát thời gian gel hóa

Trong nghiên cứu này, những nồng độ khác nhau của Gel-Dop và H2O2 được sử dụng để xác định điều kiện tối ưu cho thử nghiệm thời gian gel hóa của hydrogel Hydrogel được điều chế bằng cách hòa tan Gel-Dop và G2.0-He trong dung dịch pH 7, và thời gian gel hóa được tính từ khi cho H2O2 vào dung dịch cho đến khi dung dịch không chảy nữa Sau một quy trình thí nghiệm, nồng độ của Gel-Dop và H2O2 được giữ ở 10% và 12 mM, nồng độ của G2.0-He được khảo sát từ 0.2 đến 1.2 wt% Sau đó, nồng độ tối ưu sẽ được chọn để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 Đối với enzyme HRP, nồng độ được khảo sát từ 0.0002 đến 0.001 wt% trong dung dịch chứa 10 wt% Gel-Dop và 12 mM H2O2 [32] Mỗi điều kiện được thực hiện 3 lần, và dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD

2.2.5 Thử nghiệm độc tính tế bào Độc tính của hydrogels Gel-Dop xúc tác bởi G2.0-He được xác định bằng phương pháp gián tiếp, dựa theo phương pháp đã được mô tả bởi Zhang và cộng sự [3] Tế bào nguyên bào sợi người được cấy vào các đĩa 96-giếng với mật độ 2x10 4 tế bào/giếng Tế bào được ủ ở 37 o C, độ ẩm 90% và 5% CO2 Sau khi ủ 24 giờ để các tế bào được kết dính, một DMEM mởi hoàn toàn (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin) chứa các hydrogels (50%, 20% và 10% tương ứng với 0.5 mg/mL, 0.2 mg/mL và 0.1 mg/mL) được thêm vào, và các tế bào được ủ tiếp tục 4 giờ và 24 giờ Cùng với hydrogel Gel-Dop được chiết xuất, độc tính của G2.0-He (với cùng nồng độ trong quá trình hydrogel hóa) cũng như đệm (PBS 1x) được sử dụng để chiết xuất hydrogel cũng tham gia trong thí nghiệm này Các tế bào chưa được xử lý ủ với DMEM được dùng như mẫu so sánh, trong khi tế bào được nuôi cấy với doxorubicin (0.1 mM)

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 24 được xem như là đối chứng dương tính Tại mỗi thời điểm cho trước (4 giờ và

24 giờ), bộ SRB (Ab235935) được dùng cho mỗi giếng theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tỷ lệ phần trăm tế bào sống được tính toán dựa trên các tế bào không qua xử lý Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Chúng tôi cũng thực hiện một thử nghiệm độc tính tế bào khác để xác nhận bằng cách sử dụng thuốc nhuộm AO/PI Trong nghiên cứu này, các tế bào nguyên bào sợi được cấy trong đĩa cấy 35 mm Sau 24 giờ ủ với điều kiện tương đương thí nghiệm trước, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và môi trường nuôi cấy mới chứa các hydrogels (50% v/v), G2.0-He (100 ppm), và PBS 1x được cho vào mỗi đĩa cấy Những đĩa cấy này được ủ ở

37 o C, độ ẩm 90%, và 5% CO2 khoảng hơn 24 giờ Sau đó, 2 μL dung dịch (AO/PI) được thêm vào mỗi đĩa và được ủ khoảng 15 phút trong bể ủ CO2 PBS 1x được dùng để loại bỏ thuốc nhuộm tự do trong môi trường, và môi trường mới được thêm vào trước khi quan sát trên kính hiển vi Kính hiển vi đồng tiêu (Dragonfly, Oxford Instrument, England) được dùng để quan sát hình thái học và đánh giá các tế bào sống và chết thông qua dual channels (525 nm và 617 nm)

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 25

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA G2.0-HE VÀ GEL-DOP

3.1.1 Xác định cấu trúc của G2.0-He

Quá trình tổng hợp của G2.0-He được tiến hành thông qua sự liên hợp giữa các nhóm carboxylate của hematin và các nhóm amine của PAMAM G2.0 bằng EDC/NHS Cấu trúc của G2.0-He được xác nhận bằng phổ 1 H NMR và

IR Phổ 1 H NMR của G2.0-He (Hình 3.1 (a)) xuất hiện những tín hiệu proton đặc trưng của PAMAM G2.0 tại 3.717 ppm (a) (-CH2-CH 2-NH-) và 2.837 ppm (b) (-CH2-CH 2-NH2-) (28) Phổ cho thấy tín hiệu tại 1.877 ppm thuộc proton của methyl trong cấu trúc của hematin [33] Hình 3.1 (b) cho thấy những đặc trưng tương quan của G2.0-He so với G2.0 và hematin, xác nhận sự liên hợp thành công của G2.0-He Phổ IR của G2.0-He (1-1) cho thấy những dao động vòng porphyrin của heme từ 1000 đến 1650 cm -1 Ngoài ra, dao động giãn vòng cùng với dao động uốn mặt phẳng C-H tại 1031 cm -1 và 1439 cm -1 Chế độ giãn C-N của amide III ở 1255 cm -1 , biến dạng của C-H và N-H tại 1384 cm -1 Dải Amide II phát sinh từ dao động kéo giãn C-N và uốn cong CHN ở 1544 cm -1 [31, 34] Đối với dải amine I, đặc trưng của hệ G2.0-He, dao động kéo giãn C=O chủ yếu được thể hiện ở 1651, 1661, và 1727 cm -1 Dao động kéo giãn của các nhóm methyl và methylene được thể hiện ở dãy số sóng từ 2800 đến 3100 cm -1 Ngoài ra, cấu trúc không đối xứng của OH kéo dài trong các nhóm carboxylate còn lại của hematin xuất hiện ở 3454 cm -1 [34] Bên cạnh đó, phổ IR của G2.0-He (1-2) cũng cho thấy sự tương quan với G2.0-He (1-1) Kết quả phổ 1 H NMR và IR chứng minh việc tổng hợp thành công PAMAM dendrimer G2.0-hematin

3.1.2 Xác định cấu trúc của Gel-Dop

Phổ 1 H NMR của Gel-Dop (Hình 3.1(c)) xuất hiện những tín hiệu vòng thơm đặc trưng của dopamine tại 6.822 ppm (a), 6.757 ppm (b), và 6.594 ppm (c) Các đỉnh tại 3.274 ppm (d) và 2.745 ppm (e) đặc trưng cho proton của (-C-

CH 2-) và (-CH 2-NH-) [35] Ngoài ra, phổ còn cho thấy các đỉnh cộng hưởng

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 26 của các proton thơm của phenylalanine và các proton đặc trưng khác của amino acid trong gelatin tại 7.340-7.406 ppm và các tín hiệu ở 0,9-4,6 ppm được gán cho các proton alkyl của gelatin [36] Những kết quả trên xác nhận sự liên hợp thành công của dopamine lên gelatin và do đó Gel-Dop có thể được sử dụng để điều chế hydrogels catecholic gelatin

Hình 3 1 Phổ 1 H NMR của G2.0-He (a); Phổ FT-IR của PAMAM G2.0, hematin, và G2.0-He (b); Phổ 1 H NMR của Gel-Dop (c)

Hình 3.2 (a) mô tả phổ UV-Vis của hematin (3 ppm), G2.0-He (1-1), và G2.0-He (1-2) trong DMSO với đỉnh hấp thụ tại 404 nm Do đó, tỷ lệ gắn của hematin được đo và tính toán tại đỉnh hấp thụ này Tỷ lệ gắn hematin của G2.0-He (1-1) đạt đến 86%, cao hơn 22% so với G2.0-He (1-2) (Hình 3.2 (b)); do đó, G2.0-He (1-1) được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của khả năng xúc tác khi so sánh với enzyme HRP trong việc tạo hydrogel catecholic gelatin Sự

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 27 khác nhau trong tỷ lệ gắn của G2.0-He (1-1) và G2.0-He (1-2) có thể được giải thích bởi sự ảnh hưởng của hiệu ứng không gian của hematin

Hình 3 2 Phổ UV-Vis của hematin và G2.0-He (a); Tỷ lệ gắn của G2.0-He(b)

Sự kết hợp giữa PAMAM G2.0 và hematin giúp cải thiện khả năng hòa tan của hematin vừa giảm độc tính của PAMAM G2.0 PAMAM G2.0 có nhiều nhóm amine trên bề mặt nên việc kết hợp với hematin trở nên dễ dàng và tăng cường khả năng hòa tan so với hematin nguyên chất Ngoài ra, việc hematin bao phủ trên bề mặt PAMAM G2.0 cũng góp phần giải quyết vấn đề vỡ màng tế bào gây ra bởi tính dương điện của các nhóm amine này Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát G2.0-He với 4 tỷ lệ mol (1-1, 1-2, 1-4, và 1-6) Kết quả cho thấy G2.0-He (1-1) và (1-2) hòa tan tốt, trong khi những tỷ lệ kia xuất hiện kết tủa Do đó, G2.0-He (1-1) và (1-2) được chọn cho những khảo sát tiếp theo Như được thể hiện trong hình 3.3, nhìn chung, càng nhiều hematin gắn lên PAMAM G2.0, độ phân bố kích thược hạt càng cao và thế zeta càng giảm Cụ thể, giá trị phân bố kích thước trung bình của PAMAM G2.0, G2.0-He (1-1) và (1-2) lần lượt là 7.5 ± 1.3 nm, 11.6 ± 1.7 nm, và 12.5 ± 2.9 nm, và giá trị thế zeta trung bình của chúng lần lượt là 35.4 mV, 32.5 mV, và 25.6 mV Dựa theo những kết quả trên, chúng tôi cho rằng sự gia tăng của hematin được gắn lên bề mặt của PAMAM G2.0 làm giảm số lượng nhóm amine và dẫn đến hiệu ứng không gian, theo đó, dẫn đến cân bằng điện tích và tăng kích thước hạt

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 28

Hình 3 3 Sự phân bố kích thước hạt và thế zeta: PAMAM G2.0 (a), G2.0-He

HOẠT TÍNH XÚC TÁC GIẢ SINH HỌC G2.0-HE

Hoạt tính xúc tác giả HRP của G2.0-He được khảo sát thông qua quá trình oxi hóa pyrogallol khi so sánh với HRP trong môi trường có H2O2 Các bước sóng của quá trình oxi hóa pyrogallol xúc tác bởi G2.0-He/H2O2 và HRP/H2O2 trong dung dịch đệm sinh lý pH 7.4 gần như không thể phân biệt được Phổ của phản ứng oxi hóa pyrogallol với sự có mặt của G2.0-He/H2O2 cho thấy sự

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 29 xuất hiện của đỉnh hấp thụ tại 420 nm ứng với đỉnh đặc trưng của sản phẩm oxi hóa của pyrogallol [37] (Hình 3.4), điều này xác định G2.0-He có đặc tính peroxidase

Hình 3 4 Độ hấp thụ của G2.0-He (1-1) (a), G2.0-He (1-2) (b), và HRP (c), và hoạt tính tương đối của G2.0-He (1-1), G2.0-He (1-2) và HRP (d) đối với phản ứng oxi hóa pyrogallol với nồng độ H2O2 từ 2 đến 100 mM

Sự thay đổi độ hấp thu phụ thuộc vào nồng độ H2O2 của G2.0-He và enzyme HRP cũng được khảo sát Như được thể hiện trong Hình 3.4 (a) và (b), độ hấp thu của dung dịch pyrogallol/G2.0-He/H2O2 tại 420 nm tăng với sự gia tăng của nồng độ H2O2 Đối với enzyme HRP, độ hấp thụ của quá trình oxi hóa pyrogallol bị chia thành 2 đoạn theo sự thay đổi nồng độ H2O2 Giá trị độ hấp thu đặc trưng của purpurogallin tại 420 nm tăng khi nồng độ H2O2 tăng từ

2 đến 100 mM (Hình 3.4(c)) Tuy nhiên, khi nồng độ của H2O2 trong dung dịch pyrogallol/enzyme HRP đạt 30 mM thì tín hiệu của sản phẩm oxi hóa pyrogallol giảm đi Mức độ của phản ứng oxi hóa cũng giảm đi khi nồng độ

H2O2 tăng đến 100 mM Sự so sánh hoạt tính xúc tác của G2.0-He và enzyme HRP theo H2O2 được biểu diễn trong Hình 3.4 (d) Hoạt tính xúc tác của

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 30 enzyme HRP tăng từ 82% đến 100% khi tăng nồng độ H2O2 từ 2 đến 10 mM, và giảm mạnh khi nồng độ H2O2 lớn hơn 10 mM Những kết quả này cho thấy enzyme HRP trở nên bất hoạt khi nồng độ H2O2 tăng đến 30 mM, điều này nhất quán với các nghiên cứu trước đây [31, 38] G2.0-He được phát hiện có độ ổn định vượt trội trong H2O2 với nồng độ trải dài từ 2 đến 100 mM Hoạt tính xúc tác tăng từ 19% trong 2 mM H2O2 đến 85% trong 10 mM H2O2 sau đó đạt đến 100% trong 100 mM H2O2 Lý do cho đặc tính này có thể xuất phát từ tính chất nội tại của phân tử hematin Do đó, G2.0-He có thể được sử dụng trong rất nhiều ứng dụng nhờ tính ổn định cao của nó.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN GEL HÓA

Gel-Dop là một phenol polymer có thể được liên kết ngang bởi các hệ HRP/H2O2 hoặc G2.0-He/H2O2 Như kết quả giả định của các hệ này, các phenol gốc tự do sẽ được tạo ra và sẽ kết đôi với nhau tại các vị trí C-C hoặc C-O, và liên kết ngang sẽ được hình thành giữa các chuỗi polymer (Hình 3.5 (a)) Hình 3.5 (a) cho thấy hình ảnh của dung dịch Gel-Dop/G2.0-He trước và sau khi gel hóa trong ống nghiệm Trước khi thêm vào chất xúc tác (HRP hay G2.0-He), dung dịch vẫn ở trạng thái lỏng và chảy khi bị lắc Sau khi ủ với xúc tác, dung dịch chuyển sang trạng thái gel Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác, quá trình gel hóa Gel-Dop với sự thay đổi nồng độ của HRP và G2.0-He (1-1) được khảo sát Kết quả chỉ ra rằng tốc độ gel hóa tăng với sự gia tăng của nồng độ xúc tác Đối với enzyme HRP, thời gian để gel hóa dung dịch chứa 10 wt% Gel-Dop là 271 giây khi dùng 12 mM H2O2 và 0.0002% HRP Thời gian gel hóa giảm từ 217 ± 8s đến 15 ± 2s khi tăng nồng độ HRP lên đến 0.001% (Hình 3.5(b)) Giống với HRP, sự gia tăng nồng độ của G2.0-He từ 0.03 đến 0.12 wt% làm giảm thời gian gel hóa từ 695 ± 28s đến 45 ± 8s (Hình 3.5(c)), trong đó, thời gian gel hóa giảm nhanh trong giai đoạn đầu (khi nồng độ G2.0-He từ 0.03 đến 0.09 wt%) và giảm nhẹ khi nồng độ G2.0-He (1-1) tăng đến 1.2 wt%, như được thể hiện trong Hình 3.5 (c) Tuy nhiên, với cùng nồng độ tác nhân xúc tác tại 12 mM H2O2, quá trình gel hóa Gel-Dop với xúc tác G2.0-He tốn nhiều thời gian hơn so với enzyme HRP Để đạt được khả năng xúc tác tương tự

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 31

HRP thì cần phải dùng một lượng G2.0-He cao hơn (trên 0.07% v/v) Bởi vì hoạt tính xúc tác của G2.0-He cũng phụ thuộc vào nồng độ H2O2 nên ảnh hưởng của H2O2 lên quá trình gel hóa Gel-Dop tiếp tục được khảo sát Như mong đợi, thời gian gel hóa giảm từ 150 ± 12s đến 55 ± 4s khi nồng độ H2O2 tăng từ 3 đến 12 mM, thời gian gel hóa nhanh nhất trong thí nghiệm này là khi nồng độ H2O2 khoảng 30 mM (Hình 3.5 (d))

Hình 3 5 Mô tả quá trình hình thành hydrogel Gel-Dop Ảnh chụp của dung dịch Gel-Dop/G2.0-He trước và sau khi gel hóa (a) Thời gian gel hóa xúc tác bởi HRP theo hàm của nồng độ enzyme (b) và bởi G2.0-He (1-1) theo sự thay đổi nồng độ của G2.0-He (1-1) (c) và H2O2 (d)

Theo những nghiên cứu trước [31, 38], một lượng H2O2 cao hơn (trên

30 mM) được sử dụng để đẩy mạnh hoạt tính xúc tác của hematin Việc sử dụng lượng H2O2 cao hơn để kiểm soát thời gian gel hóa của phenol polymer như Gel-Dop mang lại nhiều rủi ro đáng kể đến sự sống của tế bào, theo đó, dẫn đến hạn chế việc sử dụng rỗng rãi của hematin trong hydrogel sinh học

[39] Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc kiểm soát thời gian gel hóa bằng cách điều chỉnh nồng độ H2O2, thời gian gel hóa cũng có thể được kiểm soát bởi nồng độ G2.0-He Nồng độ tối đa của hematin trong cùng nghiên cứu là

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 32 khoảng 0.08% w/w, trong nghiên cứu này, nồng độ của G2.0-He có thể lên đến 1.2 wt% Do đó, những phát hiện của chúng tôi đã chứng minh ứng dụng của hematin như giả enzyme HRP trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong hydrogel hóa sinh học.

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TẾ BÀO

Hình 3 6 Đánh giá độc tính tế bào của việc tạo lập hoặc hình thành hydrogel

Gel-Dop thông qua G2.0-He trong điều kiện H2O2

(a) Khả năng tồn tại (% với nuôi cấy tế bào trong DMEM) của các tế bào nguyên bào sợi của người được ủ với các nồng độ khác nhau của chiết xuất Gel-Dop hydrogel, G2.0-He, đối chứng dương tính (doxorubicin 0,1 mM) và PBS 1x bằng cách sử dụng các mẫu đã chuẩn bị cho 4 h và 24 h

(b) Hình ảnh huỳnh quang của tế bào nguyên bào sợi của người được nuôi cấy với G2.0-He, môi trường chiết xuất 50% Gel-Dop, và PBS 1x trong

24 giờ Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM của ba kết quả lặp lại độc lập ** p < 0.01 Để chứng minh ứng dụng tiềm năng của hydrogel Gel-Dop với sự trợ giúp của G2.0-He như là một scaffold cho nghiên cứu tế bào, độc tính của Gel-Dop được kiểm tra trên tế bào nguyên bào sợi người bằng thử nghiệm SBR và thử nghiệm nhuộm sống/chết Tế bào nguyên bào sợi người được ủ với nhiều nồng độ khác nhau của hydrogel (10%, 20%, và 50%), và độc tính của chúng sau đó được so sánh với G2.0-He, mẫu đối chứng (doxurobicin, 0.1

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 33 mM), và PBS 1x (một dung dịch được dùng để chiết xuất hydrogel lần đầu tiên) Sau 4 giờ đầu tiên của quá trình nuôi cấy với đối chứng, số lượng của các tế bào sống sót giảm xuống một nửa khi so sánh với các tế bào không qua xử lý, khoảng 53.39 ± 6.01% (Hình 3.6 (a)) Khi thời gian nuôi cấy kéo dài, số lượng tế bào nguyên bào sợi được nuôi cấy với doxorubicin giảm xuống 12.14 ± 2.66% Ngược lại, không có sự khác biệt đáng kể về % khả năng sống sót của tế bào với hydrogel Gel-Dop (10%, 20%, và 50% v/v), G2.0-He, và PBS 1x (Hình 3.6(a)); mức độ sống sót của các tế bào nguyên bào sợi khoảng 90% đối với những tế bào không qua xử lý sau 4 giờ hay 24 giờ nuôi cấy (p > 0.01) Tương tự, dữ liệu từ thử nghiệm nhuộm với AO/PI phù hợp với thử nghiệm SBR (Hình 3.6 (b)) Các tế bào nguyên bào sợi còn sống (các tế bào xanh lá cây, > 90%), và một tín hiệu huỳnh quang màu đỏ không đáng kể (tế bào chết) được quan sát thấy trong 50% hydrogel được chiết xuất, G2.0-He và PBS 1x Nhìn chung, quá trình gel hóa Gel-Dop xúc tác bởi G2.0-He hầu như không gây tác động bất lợi lên sự sống của tế bào, điều này cho thấy tiềm năng sử dụng của nó như một scaffold trong ứng dụng tái tạo mô

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm 34