Nghiên cứu biến Đổi di truyền các chủng g3 và g9 của vi rut rota tại việt nam 2011 2020

Nghiên cứu biến Đổi di truyền các chủng g3 và g9 của vi rut rota tại việt nam 2011 2020 Nghiên cứu biến Đổi di truyền các chủng g3 và g9 của vi rut rota tại việt nam 2011 2020

TỔNG QUAN

Đặc điểm vi rút học

1.1.1 Hình thái và cấu trúc

Hình thái: Vi rút có hình khối cầu 20 mặt, đường kính trung bình từ 65- 70nm, giống như một cái bánh xe có các gai ngắn

Hình 1 1: Ảnh chụp RV bằng kính hiển vi (Erskine Palmer, 1981)

Nucleocapsid của vi rút được tạo thành bởi ba vòng xoắn đồng tâm, bao gồm lớp capsid ngoài, capsid giữa và lớp capsid lõi có chứa đoạn ARN kép Mỗi protein cần thiết cho sự tồn tại và nhân lên của vi rút được mã hóa bởi một đoạn ARN kép Capsid của RV có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4, VP7, lớp giữa chứa protein cấu trúc VP6, lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3 Trong đó VP2 là protein bao quanh ARN (Hình 1.2)

Hình 1 2 Sơ đồ ba lớp capsid của RV (ViralZone, 2011)

Bộ gen của RV là ARN sợi đôi có 11 đoạn ký hiệu từ số 1 đến 11, có độ lớn khoảng 18,555bp Mỗi đoạn gen có kích thước từ 0,6-3,3 kb, mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc Trọng lượng 11 đoạn gen ước tính khoảng 10.10 3 – 14.10 3 kD Đoạn gen 11 mã hóa cho 2 protein từ 2 khung đọc mở (ORF) khác nhau

1.1.2 Các loại protein của RV

Vi rút Rota có chứa ít nhất 6 protein cấu trúc và 6 protein phi cấu trúc Đoạn gen số 4, 9 mã hóa cho các protein capsid lớp ngoài VP4 và VP7 Các gen số 1,2,3 và 6 lần lượt mã hóa cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6 Các gen còn lại mã hóa cho các protein không cấu trúc, là những protein do vi rút tạo ra khi xâm nhập tế bào

Bảng 1 1: Tóm tắt đặc điểm các gen và protein của RV (19) Đoạn gen

Protein Khối lượng phân tử (kDa/ số axit amin)

1 3302 VP1 125/1088 Lõi trong ARN polymerase phụ thuộc ARN, liên kết với ARN sợi đơn, tạo phức hợp với VP3

2 2690 VP2 102/881 Lõi trong Liên kết ARN, kích thích enzyme sao chép ARN

3 2591 VP3 88/835 Lõi trong Enzyme Guanylyl transferase xúc tác cho quá trình gắn mũ đầu 5’ của ARN trong quá trình cải biến trước dịch mã mARN, liên kết ARN sợi đơn, tạo phức hợp với VP1

Ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên trung hòa Chia thành 2 vùng gen VP5 và VP8

5 1611 NSP1 59/491 - Liên kết ARN sợi đơn

6 1356 VP6 45/397 Lớp trong Kháng nguyên đặc trưng nhóm

7 1104 NSP3 37/315 - Tăng cường hoạt tính mARN và ức chế tổng hợp protein trong tế bào vật chủ

Protein Khối lượng phân tử (kDa/ số axit amin)

8 1059 NSP2 35/317 - NTPase tham gia quá trình đóng gói vi rút và sao chép hệ gen

10 751 NSP4 20/175 - Độc tố ruột, vai trò trong quá trình hình thành hạt vi rút

22/198 - Liên kết ARN sợi đơn, protein kinase, tương tác với NSP2 và

NSP6 Tương tác với NSP5

Ba protein cấu trúc mang tính đặc hiệu kháng nguyên của RV là: VP4, VP6 và VP7: VP7 bản chất là một glycoprotein có vai trò là kháng nguyên trung hoà đặc hiệu cho typ huyết thanh G của RV (19) VP4 là kháng nguyên trung hòa và có đặc tính ngưng kết hồng cầu Protein này nhô ra như những cái gai, liên kết với các phân tử thụ thể bề mặt tế bào chủ để đưa vi rút vào tế bào VP4 bị enzyme protease

(trong ruột) phân tách đặc hiệu tạo thành VP5* và VP8* để làm tăng hoạt tính gây nhiễm của vi rút vào tế bào chủ, chúng cũng xác định độc lực và typ huyết thanh P của vi rút VP6 có tính kháng nguyên cao và đặc hiệu loại RV Chúng được sử dụng trong các thử nghiệm phát hiện nhiễm RVA

Phân loại vi rút

1.2.1 Nhóm và phân nhóm của RV

Vi rút Rota gây bệnh ở người và động vật được chia thành 7 nhóm A, B, C,

D, E, F và G dựa vào tính kháng nguyên của VP6 Chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật Trong đó, nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em Nhóm B là nhóm duy nhất gây tiêu chảy ở người lớn và chỉ được phát hiện ở một số nước Châu Á Nhóm C cũng gây bệnh ở trẻ em nhưng cực kỳ hiếm gặp Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động vật

1.2.2 Các typ huyết thanh và phân loại theo VP4 và VP7

Gen VP6 được xác định là kháng nguyên quyết định nhóm và phân nhóm I hoặc II Typ huyết thanh của RV được đặc trưng bởi hai protein capsid lớp vỏ ngoài là VP4 và VP7, hai loại protein này được xác định bằng kỹ thuật trung hòa, sử dụng kháng huyết thanh tạo ra ở động vật Chủ yếu RV được phân loại dựa theo genotype Typ huyết thanh G đại diện cho VP7 và typ P đại diện cho VP4 Hiện tại có 36 typ huyết thanh G và 51 typ huyết thanh P (71, 101)

Trong các typ huyết thanh G, typ 1,2,3,4 và 9 là các typ chiếm đa số, còn lại các typ 5,6,7,8,10,12 chiếm thiểu số trong các typ gây bệnh ở người Trong các typ huyết thanh P, 8 typ P1A[8], P1B[4], P2A[6], P3[9], P4[10], P5A[3], P8[11] và P11[14] là các typ thường thấy ở người Kiểu gen G1P[8],G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] và tỷ lệ nhỏ G12P[8] hiện là kiểu gen quan trọng và phổ biến nhất được tìm thấy ở người (69, 72, 104) Tuy nhiên sự lưu hành của các chủng RV có sự khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau

1.2.3 Phân loại theo chùm gen

Hạn chế của hệ thống phân loại theo G/P chỉ dựa trên 2 gen (VP7 và VP4) mà bỏ qua 9 gen còn lại của RV Do đó, hệ thống này không cung cấp đầy đủ thông tin cần thiết để đánh giá tính đa dạng di truyền, động lực tiến hóa và các mối quan hệ giữa các chủng RV đồng lưu hành, đặc biệt là việc trao đổi các đoạn gen giữa các chủng vi rút

Sự tiến bộ trong công nghệ giải trình tự gen đã cho phép giải trình tự bộ gen đầy đủ thường gặp của các chủng RV Từ đó, tạo ra một hệ thống phân loại dựa trên trình tự hoàn chỉnh của mỗi phân đoạn trong bộ gen của vi rút Trong hệ thống phân loại này, các đoạn gen VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3- NSP4-NSP5/6 được kí hiệu bởi chữ viết tắt Gx-P[x] -Ix-Rx-Cx- Mx-AA-NA-TA- Ex-Hx (x = số Ả Rập> 1) Trên cơ sở hoàn thiện bộ gen RV có hai kiểu chùm gen chính không kể G và P gồm kiểu 1: I1-R1-C1-M1- A1-N1-T1-E1-H1 được gọi là Wa-like và kiểu 2: I2-R2-C2-M2-A2-N2- T2-E2-H2 hay DS-1-like đã được chứng minh trên toàn thế giới (44, 70, 75) Chủng RV Wa- like ở người được cho là có tổ tiên chung với các chủng RVA của lợn, trong khi các chủng giống DS-1 ở người được cho là có một số đoạn gen có tổ tiên chung với các chủng RVA ở bò (70) Chùm gen thứ 3 của con người, được gọi là AU-1- like (I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3- E3-H3) được cho là có nguồn gốc từ mèo hoặc chó (86)

Kiểu gen G và P được sử dụng trong hệ thống phân loại theo bộ gen đầy đủ giống như mô tả trong hệ thống phân loại G/P Cho đến nay, có ít nhất 8 kiểu gen đã được xác định cho 9 đoạn gen (gọi là các đoạn gen bên trong) của các chủng RV (Bảng 1.2) Giải trình tự bộ gen đầy đủ cho thấy các gen bên trong của các chủng

RV người là G1P[8], G3P[8], G4P[8] và G9P[8] hầu hết thuộc kiểu gen 1 Đa số các gen bên trong là kiểu 1 hoặc 2 Những vi rút có các gen bên trong là kiểu gen 1 được gọi là vi rút nhóm 1 Trình tự các gen bên trong của vi rút G2P[4] ở người thường thuộc kiểu gen 2 Các vi rút có chùm gen bên trong như vậy được gọi là vi rút nhóm 2 Trình tự bộ gen của các chủng RV từ động vật hiếm khi có chùm gen

7 thuần chủng kiểu 1 hoặc 2 Điều này cho thấy rằng các vi rút có chùm gen kiểu 1 hoặc 2 phù hợp để nhân lên ở người Phân tích phát sinh chủng loài đã cho thấy có mối quan hệ tiến hóa xa giữa nhóm gen 1 ở RV người và RV lợn và giữa nhóm gen

2 của RV người và RV bò Nhiều kiểu gen 1 của RV người là G1P[8], G3P[8], G4P[8] và G9P[8] liên quan với một sổ RV của lợn (ví dụ: OSU) và kiểu gen 2 của

RV người là G2P[4] có liên quan với một số RV bò (ví dụ, WC3)

Bảng 1 2 Phân loại các chủng vi rút từ người, động vật và vắc xin theo chùm gen

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

Các chủng không phổ biến

Đặc điểm di truyền của RV

Các kiểu gen phổ biến của RV trên người

Các kiểu gen G phổ biến nhất ở người là G1, G2, G3, G4 và G9 chiếm đến hơn 90% trong số các chủng lưu hành Kiểu gen P ở người chủ yếu gồm 3 loại: P[4], P[6] và P[8], trong đó kiểu gen P[8] và P[4] chiếm hơn 90% các ca tiêu chảy do RV Kiểu gen P[4] thường kết hợp G2 tạo chủng G2P[4], trong khi P[8] đi với tất cả các kiểu gen G P[6] được tìm thấy ở những chủng có kiểu gen G1 đến G4 Hiện tại, 6 kiểu gen chính (G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] và G12P[8]) chiếm khoảng 90% tổng số nhiễm RV ở người ở nhiều khu vực trên toàn thế giới

(18, 88, 113) Tại Việt Nam cũng có sự thay đổi về các chủng lưu hành: G1P[8] là kiểu gen G/P phổ biến nhất những năm 2012-2014, từ 2015 tỷ lệ chủng G1P[8] giảm đáng kể thay vào đó là sự xuất hiện các chủng G3P[8], G8P[8] (Hình 1.3) Đã có những khác biệt lớn về sự phân bố kiểu gen trong suốt thời gian nghiên cứu Tỷ lệ lưu hành G1P[8] giảm mạnh từ 69,9% năm 2013 xuống 0% năm 2018, trong khi tỷ lệ xuất hiện G3P[8] tăng từ 8,1% năm 2013 lên mức cao nhất 60,7% năm 2017 và sau đó giảm xuống 41,2% năm 2018 Tỷ lệ lưu hành G8P[8] tăng từ 0% năm

2013 lên mức cao nhất 47,2% năm 2016 và sau đó giảm xuống 23,9% năm 2018

Tỷ lệ nhiễm G2P[4] tăng từ 15,5% năm 2013 lên 37,4% năm 2014, giảm 0,4% vào năm 2016 và sau đó tăng lên 16,3% vào năm 2018 (115)

Hình 1 3 Phân bố kiểu gen G và P phân lập được từ mẫu RV dương tính ở trẻ em

0,15 theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Mẫu bệnh phẩm được ppha loãng với tỷ lệ 1:4 trong dung dịch PBS 1X khử trùng, ly tâm với tốc độ 8000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4 o C và thu dịch nổi ARN vi rút được tách chiết bằng hệ thống máy tách chiết tự động QIAcube HT sử dụng kit tách chiết Cador Pathogen 96 Qiacube HT Kit (Qiagen, Hilden, Đức) hoặc sử dụng kit không tự động QIAamp Viral RNA minikit (Qiagen, Hilden, Đức)

34 Định typ G/P của RV Định typ G

Hệ mồi được sử dụng trong nghiên cứu này để định typ G dựa trên nghiên cứu của Yoshiki Fujii và cộng sự năm 2019 (24, 30) ARN sau khi tách chiết được sử dụng cho phản ứng nested RT-PCR định typ G với bộ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR (QiaGen, Hilden, Đức) Trước phản ứng, các mẫu ARN được biến tính ở 65°C trong 5 phút Phản ứng phiên mã ngược ban đầu được thực hiện ở 50°C trong 30 phút và bất hoạt enzyme phiên mã ngược ở 95°C trong 15 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ khuếch đại (1 phút ở 94°C, 30 giây ở 50°C, 1 phút ở 72°C ), với thời gian kéo dài cuối cùng là 10 phút ở 72°C trên máy PCR Các sản phẩm PCR đầu tiên được pha loãng 10 lần với nước không có DNase / RNase và 4 μL dung dịch đã pha loãng được sử dụng cho phản ứng PCR thứ hai Phản ứng PCR thứ hai được thực hiện bởi enzyme GoTaq Green Master Mix 2X (Promega, Madison, Hoa Kỳ) với mồi thứ hai (5pmol mỗi mồi) Bước biến tính ban đầu ở 95°C trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ khuếch đại (30 giây ở 95°C, 30 giây ở 50°C, 60 giây ở 72°C), với thời gian kéo dài cuối cùng là 10 phút ở 72°C Các amplicon được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2% với RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Thang ADN 100 bp (New England BioLabs, Massachusetts, Hoa Kỳ) được sử dụng làm thang chuẩn để ước tính kích thước sản phẩm PCR Các chủng có kích thước sản phẩm trên gel lần lượt theo bảng 2.1

Bảng 2 1 Bộ mồi và kích thước sản phẩm PCR cho kiểu gen VP7 (30)

Phản ứng Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Vị trí trên gen

Kích thước sản phẩm (bp)

*Một số ký hiệu sử dụng cho các Nucleotit suy biến đã được sử dụng (R = A hoặc

Hệ mồi sử dụng để định typ P dựa trên nghiên cứu của Esonavà cộng sự năm 2015 (24) ARN sau khi tách chiết được sử dụng cho phản ứng One-step RT-PCR đa mồi định typ P với bộ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR (QiaGen, Hilden, Đức) Trước phản ứng, các mẫu ARN được biến tính ở 65°C trong 5 phút

Phản ứng phiên mã ngược ban đầu được thực hiện ở 50°C trong 30 phút và bất hoạt enzyme phiên mã ngược ở 95°C trong 15 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ khuếch đại

(30 giây ở 94°C, 30 giây ở 50°C, 45 giây ở 72°C ), với thời gian kéo dài cuối cùng là 7 phút ở 72°C trên máy PCR Các amplicon được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2% với RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Thang ADN 100 bp (New England BioLabs, Massachusetts, Hoa Kỳ) được sử dụng làm thang chuẩn để ước tính kích thước sản phẩm PCR Các chủng có kích thước sản phẩm trên gel lần lượt theo bảng 2.2

Bảng 2 2 Bộ mồi và kích thước sản phẩm PCR cho kiểu gen VP4 (24)

STT Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Vị trí trên gen

Kích thước sản phẩm (bp)

1 VP4uF TGG YTT CVC TCA TTT ATA GAC

2 P[4]-R5 GCA TYC CTA CAA GTC TAT

3 P[6]-R2 ACC ATC GAG TAC TGG YTC

4 P[8]-R2 GYG GTT CAA YAG CAA CKA CT 350-330 339

5 P [9]-4T-1 TGA GAC ATG CAA TTG GAC 402-385 391

6 P[10]-5T-1 ATC ATA GTT AGT AGT CGG 594-575 583

*Một số ký hiệu sử dụng cho các Nucleotit suy biến đã được sử dụng (R = A hoặc

Quy trình giải trình tự bằng phương pháp NGS

ARN sau khi tách chiết được xử lý loại bỏ ADN bằng kit DNase I (New England Biolabs, Massachusetts, Hoa Kỳ) ở 37 o C trong 30 phút Tủa ARN với dung dịch LiCl 2M trong 16h ở 4 o C Sau khi tủa, ly tâm 12000rpm trong 30 phút ở 4 o C để thu dịch nổi và tinh sạch ARN bằng hạt từ Agencourt RNAClean XP Beads (Beckman Coulter, California, Hoa Kỳ) Nồng độ ARN đưa vào thư viện thuộc khoảng 5-1000ng Bộ sinh phẩm Ultra II RNA library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, Massachusetts, Hoa Kỳ) và NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs, Massachusetts Hoa Kỳ) được sử dụng để tạo ra các phân đoạn thư viện có độ dài khoảng 300bp đã gắn mã adaptor theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thư viện được tinh sạch bằng các hạt từ AMPure XP (Beckman Coulter, California, Hoa Kỳ Các phân đoạn thư viện được chạy phân tích trên hệ thống máy MiSeq sequencer (Illumina, California, Hoa Kỳ) với bộ sinh phẩm MiSeq v2 (300cycles) kèm theo

Quy trình phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Các trình tự nucleotit của các gen VP7, VP4, NSP4 được sử dụng phần mềm Geneious Prime (Biomatters, Hoa Kỳ) (https://www.geneious.com/download/) để sắp xếp, so sánh với trình tự nucleotit các chủng vắc xin 116E, Rotateq WI79-4, WI78-8, Rotarix RIX441 Từ đó cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phương pháp Maximum likelihood tree với mô hình tham số Kimura-2 và số lượng bootstrap là 1000 trên phần mềm MEGAX (https://www.megasoftware.net/) Các trình tự nucleotit của các gen trong cùng một phân loại dòng RV được tham khảo trên ngân hàng NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Các biến đổi nucleotit trên các vùng epitope của các chủng G3 và G9 được xác định bằng phương pháp multiple alignment trên phầm mềm Geneious Prime (Biomatters, Hoa Kỳ) (https://www.geneious.com/download/)

Dữ liệu điều tra thông tin ca bệnh, mẫu bệnh phẩm và kết quả xét nghiệm mẫu RV, kết quả định typ GP đều được nhập và lưu trên phầm mền quản lý dữ liệu Epi Info 7 (CDC, Hoa Kỳ) (https://www.cdc.gov/epiinfo/support/downloads.html)

Các phân tích về tỷ lệ lưu hành các chủng RV được phân tích trên phần mềm SPSS

22 (IBM, Hoa Kỳ) (https://www.ibm.com/products/spss-statistics)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tỷ lệ lưu hành các kiểu gen G của RV tại Nam Định và Thừa Thiên Huế (2016-2020)

3.1.1 Tỷ lệ lưu hành các kiểu gen G của RV (2016-2020)

Bảng 3.1 thể hiện tỷ lệ lưu hành các kiểu gen G của RV từ năm 2016-2020, có tổng số 1715 mẫu RV dương tính được chọn chạy định type G/P Kết quả cho thấy các chủng RV phân bố chủ yếu gồm G1, G2, G3, G4, G8, G9 Trong đó chủng G9 chiếm tỷ lệ cao nhất 36,56% (627/1715), tiếp đến là G8 chiếm 17,66% (303/1715) và G3 chiếm 20,12% (345/1715)

Bảng 3 1: Phân bố kiểu gen G của RV (2016-2020)

*: G khác: bao gồm bội nhiễm các chủng với kiểu gen G khác nhau như G[1,3,8,9] và chủng chưa xác định được kiểu gen

3.1.2 Sự phân bố các chủng G3, G9 theo thời gian từ 2016-2020

Có 345/1715 mẫu được định type là chủng G3 bao gồm equine-like G3 (eG3) và human G3 (hG3) Tỷ lệ lưu hành chủng G3 giảm dần từ năm 2016 đến năm 2021 Kiểu gen eG3 chiếm ưu thế vào 6/2016-5/2017 (27,2%); 6/2018-5/2019 (13,6%); từ 06/2019 đến nay tỷ lệ chủng này giảm còn dưới 6,2% Từ 06/2017- 5/2019 tỷ lệ lưu hành chủng hG3 cao hơn eG3 lần lượt là 13,4% và 15% Sau 06/2019, tỷ lệ chủng hG3 cũng giảm còn dưới 5% (Hình 3.1)

Hình 3 1 Phân bố chủng G3 và G9 ở Nam Định và TT Huế theo thời gian

Có 627/1715 mẫu được định type là chủng G9 chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong các kiểu gen Dựa vào hình 3.1 ta thấy có sự thay đổi rõ rệt về tỷ lệ phân bố chủng

G9 qua các năm Năm 2016-2018, chủng G9 chiếm ưu thế 57,4%-55,8% nhưng đến giai đoạn những năm 2019 chủng G9 giảm mạnh chỉ còn 34,9% năm 2020 tỷ lệ mang chủng G9 giảm dưới 6% (Hình 3.1).

Kết quả giải trình tự hệ gen các mẫu đại diện chủng G3 và G9

Bảng 3 2: Kết quả phân loại các mẫu đại diện chủng G3 dựa trên hệ gen

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

RVA/Human- wt/VNM/TB60038/2010/

5 20133013-0/2013/G3P[8] G3 P[8] I1 R1 C1 M1 A1 N1 T1 E1 không giải được trình tự

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

(A1/A2*: kết hợp hai kiểu gen trên cùng 1 đoạn gen của 1 mẫu Kết quả cũng đồng thời cho thấy các sự kết hợp như: A1/A3; T1/T3; M1/M2; E2/E6; H1/H6…) Để hiểu rõ hơn về sự biến đổi di truyền của chủng G3, 34 mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên để giải trình tự gen thế hệ mới Ta thấy các chủng G3 cho 2 kiểu phân bố chùm gen chính: 17/34 (50%) mẫu cho kết quả thuộc kiểu gen Wa-like: G3-P[8]-

I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1 và 13/34 (38,2%) mẫu thuộc kiểu gen DS1-like:

G3-P[8]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2 Ngoài ra còn có các kiểu phân bố chùm gen không phổ biến khác như: G3-P [9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3; G3-P[9]-

G3-P[25]-I5-R1-C1-M1-A2/8-N1-T1/2-E1-H1 Trên đoạn gen NSP4 sau khi giải trình tự gen cho kết quả 05/34 mẫu có sự tổ hợp hai kiểu gen E2 và E6 chiếm tỷ lệ

14,7% Sự tổ hợp gen này thuộc các mẫu thuộc kiểu gen DS1-like: G3-P[8]-I2-R2-

Bảng 3 3: Kết quả phân loại các mẫu đại diện chủng G9 dựa trên hệ gen

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

Kiểu gen VP7 VP4 VP6 VP1 VP2 VP3 NSP1 NSP2 NSP3 NSP4 NSP5

Bảng 3.3 thể hiện kết quả giải trình tự gen các chủng G9 Có 16/17 (94,1%) mẫu thuộc kiểu gen Wa-like: G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1 1/17 mẫu có chùm gen thuộc kiểu DS1-like: G9-P[8]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2 chiếm tỷ lệ 5,9% Trên đoạn gen NSP4 của mẫu VE17426 có sự tổ hợp hai kiểu gen E2 và E6 trên cùng mẫu

Phân tích đa dạng di truyền của các chủng G3

Hình 3.2 thể hiện cây phát sinh chủng loại của các chủng G3 trên gen VP7, chúng được chia thành 3 lineage chính (I-III) Lineage I bao gồm các mẫu equine-like G3 (eG3) có nguồn gốc từ người và từ ngựa và các động vật khác như chó Lineage III chỉ chứa các chủng G3 của người và động vật khác như bò, lợn, mèo (3) Sự khác biệt giữa 2 lineage I và III là 19%-20% 10/34 (29,41%) mẫu thuộc lineage I, gần giống với các mẫu tìm thấy ở Thái Lan và chúng có 99,7%-100% tỷ lệ tương đồng Các mẫu ở lineage I không có sự thay đổi đáng kể từ 2017-2020 (trình tự nucleotit và axit amin thay đổi tương ứng là 0,4%-0,9%) 24/34 (70,59%) mẫu thuộc lineage III và gần giống với các chủng ở Trung Quốc, Nhật Bản…với tỷ lệ tương đồng 99%–99,8%; các mẫu ở lineage III không có sự thay đổi đáng kể từ năm 2011-2019 (trình tự nucleotit và axit amin thay đổi tưng ứng là 0,9%-2,2%)

Hình 3 2 Cây phát sinh chủng loại của các biến thể chủng G3 dựa trên trình tự gen VP7 Các mẫu in đậm là các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu này Mẫu màu đỏ in nghiên là mẫu thuộc chủng vắc xin Các giá trị bootstrap