Nghiên Cứu Các Đặc Tính Ứng Dụng Của Vi Khuẩn Lactic Phân Lập Từ Lạp Xưởng Lên Men Truyền Thống Vùng Tây Bắc Việt Nam.pdf

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA deoxyribonucleic acid NA Nutrient agar môi trường thạch dinh dưỡng MRS de Man, Rogosa and Sharpe môi trường MRS PCR polymerase chain reaction phả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Thanh Huê

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN

LACTIC PHÂN LẬP TỪ LẠP XƯỞNG LÊN MEN

TRUYỀN THỐNG VÙNG TÂY BẮC VIỆT NAM

LUẬN VẶN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Thanh Huê

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN

LACTIC PHÂN LẬP TỪ LẠP XƯỞNG LÊN MEN

TRUYỀN THỐNG VÙNG TÂY BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VẶN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Thành Trung

PGS TS Trần Văn Tuấn

Hà Nội - 2022

Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Trần Văn Tuấn, Trưởng bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt đề tài

Em xin cảm ơn TS Hoàng Thị Lan Anh cùng các anh chị em tại Trung tâm nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia và phòng Vi sinh y học, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho em thực hiện đề tài này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn

Vi sinh vật học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, tất cả bạn bè, người thân, những người luôn kịp thời quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Học viên

Lê Thị Thanh Huê

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gene recA 36

Hình 2 Tần suất bắt gặp các loài LAB trong lạp xưởng lên men vùng Tây Bắc 37

Hình 3 Khả năng bám dính của LAB trên dòng tế bào HT-29 41

Hình 4 Hoạt tính kháng khuẩn của của các chủng LAB 42

Hình 5 Khả năng chống oxy hóa của các chủng LAB 44

Hình 6 Hình ảnh minh chứng sinh tyramine trong môi trường có chứa L-tyrosine của các chủng LAB 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Hệ thống phân loại vi khuẩn LAB 6

Bảng 2 Một số thực phẩm lên men ở châu Á 16

Bảng 3 Các cặp mồi và chu trình nhiệt sử dụng để khuếch đại gen recA 27

Bảng 4 Phân loại các loài vi khuẩn lactic trong lạp xưởng lên men 35

Bảng 5 Khả năng chịu pH thấp của các chủng vi khuẩn lactic 38

Bảng 6 Khả năng sống sót trong dịch mô phỏng đường tiêu hóa của các chủng LAB thử nghiệm 40

Bảng 7 Khả năng kháng khuẩn của các chủng LAB thử nghiệm đối với các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa 43

Bảng 8 Khả năng sinh β-galactosidase của LAB 45

Bảng 9 Đặc tính kỹ thuật của LAB 48

Bảng 10 Khả năng sinh các BA của LAB 49

Bảng 11 Khả năng kháng kháng sinh của LAB 51

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA deoxyribonucleic acid

NA Nutrient agar (môi trường thạch dinh dưỡng)

MRS de Man, Rogosa and Sharpe (môi trường MRS)

PCR polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại gene)

LAB lactic acid bacteria (vi khuẩn lactic)

CFS cell-free supernatant (dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào)

BA biogenic amine (amine sinh học)

AGP antibiotic growth promoter (tăng trưởng bằng sử dụng kháng sinh)

FDA US Food and Drug Administration (cơ quan quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ

EFSA European Food Safety Authority (cơ quan an toàn thực phẩm châu

Âu)

QPS The qualified presumption of safety (danh sách tiêu chuẩn an toàn)

WGS Whole genome sequencing (giải trình tự toàn bộ hệ gene)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 3

1.1.1 Lược sử nghiên cứu 3

1.1.2 Phương pháp phân loại 3

1.1.3 Hệ thống phân loại 5

1.2 Vi khuẩn lactic sử dụng trong probiotic 8

1.2.1 Định nghĩa probiotic 8

1.2.2 Cơ chế tác động có lợi của probiotic 9

1.2.3 Một số loài LAB có đặc tính probiotic đã được thương mại 11

1.2.3.1 Lactobacillus casei Shirota 11

1.2.3.2 Lactobacillus rhamnosus GG 12

1.2.3.3 Bifidobacterium lactis HN019 13

1.2.3.4 Lactobacillus gasseri LG21 14

1.2.3.5 Lactobacillus acidophilus NCFM 14

1.2.3.6 Lactobacillus plantarum CCFM8610 15

1.3 Vi khuẩn lactic trong lên men thực phẩm 15

1.3.1 Vi khuẩn lactic trong thực phẩm lên men tự nhiên 15

1.3.2 Vi khuẩn lactic trong sử dụng làm giống khởi động 19

1.3.3 Vai trò của LAB trong thịt lên men 20

1.3.3.1 Giảm hàm lượng nitrosamine 20

1.3.3.2 Tăng giá trị dinh dưỡng 20

1.3.3.3 Tạo hương vị và màu sắc 21

1.3.4 Tính an toàn của LAB trong sản phẩm thịt lên men 21

1.3.4.1 Sản sinh amine sinh học 21

1.3.4.2 Kháng kháng sinh 22

1.4 Khái quát về lên men lạp xưởng 22

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên vật liệu 24

2.1.1 Mẫu thực phẩm nghiên cứu 24

2.1.2 Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 24

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 25

2.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật giải trình tự 26

2.3.1 Phương pháp tách DNA 26

2.3.2 Phương pháp khuếch đại gen và giải trình tự gen dựng cây phân loại 26

2.4 Xác định đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic 27

2.4.1 Xác định khả năng chịu pH thấp 27

2.4.2 Xác định khả năng chịu dịch mô phỏng đường tiêu hóa 28

2.4.3 Xác định khả năng bám dính tế bào biểu mô ruột HT-29 29

2.4.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 30

2.4.5 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh 31

2.4.6 Xác định khả năng chống oxi hóa 31

2.4.7 Xác định khả năng sinh β-galactosidase 32

2.5 Xác định đặc tính kỹ thuật của vi khuẩn lactic 32

2.5.1 Xác định khả năng sinh khí của vi khuẩn 32

2.5.2 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và một số điều kiện lên men 32

2.5.3 Định lượng lactic acid 32

2.5.4 Xác định khả năng sinh amine gây độc 33

2.6 Xử lí số liệu thống kê 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 34

3.1.1 Phân lập 34

3.1.2 Định danh 34

3.2 Đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic 38

3.2.1 Khả năng chịu pH thấp 38

3.2.2 Khả năng sống sót trong dịch mô phỏng đường tiêu hóa 38

3.2.3 Khả năng bám dính tế bào biểu mô ruột HT-29 40

3.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn 41

3.2.5 Khả năng chống oxi hóa 44

3.2.6 Khả năng sinh β-galactosidase 45

3.3 Đặc tính kỹ thuật của vi khuẩn lactic 45

3.3.1 Xác định kiểu hình lên men 45

3.3.2 Xác định khả năng lên men sản phẩm 45

3.3.3 Xác định khả năng sinh lactic acid 46

3.4 Đặc tính an toàn của vi khuẩn lactic 49

3.4.1 Sinh các amine sinh học 49

3.4.2 Nhạy cảm kháng sinh 50

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

MỞ ĐẦU Lạp xưởng là một loại thịt lên men được sản xuất theo phương pháp truyền thống và trở thành một thành phần thiết yếu trong chế độ ăn uống của con người cũng như chiếm thị phần quan trọng của các sản phẩm thịt trên thị trường Tại mỗi vùng miền, sản phẩm lạp xưởng lên men thường có giá trị dinh dưỡng và hương vị đặc trưng riêng Các đặc trưng đó phụ thuộc nhiều vào thành phần nguyên liệu, điều kiện lên men, ủ chín và hệ vi sinh vật tự nhiên có trong nguyên liệu thô hoặc môi trường Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria; LAB) đóng một vai trò thiết yếu trong quá trình lên men lạp xưởng bằng cách ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

và vi khuẩn gây hư hỏng, biến đổi nguyên liệu thô và góp phần tạo hương vị, màu sắc và kết cấu của sản phẩm

Vi khuẩn lactic được công nhận là vi khuẩn an toàn (generally recognized as safe; GRAS), được con người sử dụng hàng ngàn năm qua trong các sản phẩm lên men truyền thống Nhóm vi khuẩn này có nhiều lợi ích cho sức khỏe Một số loài LAB đã được thương mại hóa dưới dạng thực phẩm chức năng trên thị trường Thông thường, LAB được phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống, được phân loại chính xác ở cấp độ loài và được sàng lọc các đặc tính có lợi cho sức khỏe trước khi sản xuất quy ở mô lớn tạo thành các sản phẩm thương mại Do đó, giống như các sản phẩm lên men khác, lạp xưởng được xem như là một nguồn nguyên liệu để phân lập và chọn lọc các LAB có tiềm năng làm probiotic

Lên men lạp xưởng bằng phương pháp truyền thống sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên đôi khi làm cho chất lượng sản phẩm không được như mong muốn hoặc không đồng đều nhau ở các mẻ lên men Để cải thiện vấn đề này, giống khởi động (starter culture) cho lạp xưởng đã được nghiên cứu gần đây, được đánh giá về chất lượng ổn định và độ an toàn Quá trình nghiên cứu tạo giống khởi động có thể được tiếp cận dựa trên việc lựa chọn các chủng LAB lợi khuẩn có sẵn trên thị trường hoặc các loài LAB chiếm ưu thế trong lạp xưởng sở hữu những đặc tính kỹ thuật mong muốn Mỗi sản phẩm lên men của từng vùng sẽ có thành phần LAB nhất định

để tạo nên đặc tính cảm quan điển hình cho sản phẩm Do đó, việc nghiên cứu thành

phần giống khởi động và các đặc tính kỹ thuật trong sản phẩm lên men ở từng vùng vẫn được quan tâm và nghiên cứu

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có lịch sử lâu đời về việc sử dụng nhiều loại thực phẩm lên men truyền thống Ở vùng Tây Bắc, lạp xưởng là một loại thịt lên men phổ biến được các dân tộc thiểu số sản xuất theo phương pháp truyền thống Lạp xưởng được chế biến bằng cách trộn đều thịt cùng với mỡ lợn băm nhỏ sau đó

bổ sung muối, gia vị, đường, rượu và các loại hạt như mắc khén (Zanthoxylum rhetsa) và dổi (Michelia tokinesis) Hỗn hợp được nhồi vào ruột non lợn đã làm sạch và lên men ở nhiệt độ thường Lạp xưởng Tây Bắc là món ăn truyền thống có hương vị riêng và độc đáo Nhằm tìm kiếm các chủng LAB bản địa mang các đặc tính sinh học quý và đặc tính kỹ thuật cùng với đó là nghiên cứu đa dạng của các loài vi khuẩn LAB trong lạp xưởng Tây Bắc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu các đặc tính ứng dụng của vi khuẩn lactic phân lập từ lạp xưởng lên men truyền thống vùng Tây Bắc Việt Nam” với mục đích sau:

- Đánh gia đa dạng thành phần loài LAB trong lạp xưởng lên men truyền thống vùng Tây Bắc Việt Nam

- Tìm hiểu đặc tính probiotic, đặc tính kỹ thuật và đặc tính an toàn của các chủng LAB phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1 Lược sử nghiên cứu

Mặc dù ngành vi sinh vật học mới phát triển trong khoảng 2 thế kỉ gần đây nhưng con người đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong suốt chiều dài lịch sử tiến hóa (khoảng hơn 10.000 năm) Năm 1857, Louis Pasteur đã phát hiện ra các vi khuẩn đóng vai trò chính trong lên men sữa và có khả năng sản xuất lactic acid Những phát hiện về vi khuẩn sống trong lên men acid lactic là cột mốc quan trọng trong lịch sử phát triển ngành vi sinh vật học

Với sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn, trong khoảng thời gian từ cuối thế kỷ XIX đến đầu thế kỷ XX, các nhà khoa học đã phát hiện và phân lập được nhiều loài vi khuẩn lactic quan trọng Năm 1873, Joseph Lister lần đầu tiên phân lập và nuôi cấy được chủng vi khuẩn làm chua sữa bò Chủng vi khuẩn thuần khiết này được đặt tên là Bacterium lactis (hiện nay là Lactococcus lactis) Năm

1899, Henry Tissier, một bác sĩ nhi khoa tại Viện Pasteur đã phân lập được một loại

vi khuẩn hình chữ Y, chiếm ưu thế trong phân của trẻ sơ sinh khỏe mạnh bú sữa mẹ

và đặt tên là Bacillus bifidus (hiện nay là Bifidobacterium bifidum) Năm 1905, nhà sinh lý học và vi trùng học người Bulgari là Stamen Grigoroff đã phân lập được Lactobacillus bulgaricus từ sữa đã lên men Orla-Jensen đã phân lập Lactobacillus casei trong phô mai vào năm 1916 Ông cũng là người đặt nền móng cho việc thiết lập hệ thống vi khuẩn lactic [42] Những thập kỉ sau đó, các nhà khoa học đã đẩy mạnh nghiên cứu về vi khuẩn lactic cũng như ứng dụng của chúng trong chế biến thực phẩm, lên men, y sinh và chăn nuôi

1.1.2 Phương pháp phân loại

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria; LAB) là một nhóm vi sinh vật quan trọng Tuy nhiên, LAB không có định nghĩa rõ ràng mà là một thuật ngữ chung cho nhiều loại vi khuẩn Gram dương, hình que hoặc hình cầu, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm tính, chuyển hóa carbohydrate tạo ra lactic acid, có khả năng sinh trưởng trong điều kiện vi hiếu khí và kỵ khí Một số loài chỉ có khả năng sinh

trưởng trong điều kiện kị khí bắt buộc LAB phân bố rộng rãi trong tự nhiên và được tìm thấy chủ yếu trong các môi trường giàu carbohydrate như thực vật, thực phẩm lên men hoặc bề mặt niêm mạc của người và động vật LAB là một phần của

hệ sinh thái vi sinh vật cư trú tự nhiên trong đường tiêu hóa, đường sinh dục của người và động vật với số lượng lớn và thành phần loài đa dạng [6]

Trước đây, việc định danh và phân loại LAB phần lớn dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và các đặc tính sinh lý, sinh hóa Tuy nhiên, những phương pháp phân loại truyền thống này không đủ để phân loại một chủng vi khuẩn

cụ thể bởi nhiều loài LAB có các đặc điểm về nhu cầu dinh dưỡng và sinh trưởng giống nhau Những bất cập trong việc phân loại LAB bằng công cụ kiểu hình là cơ

sở cho phát triển các phương pháp phân loại hiện đại khác, trong đó có phương pháp kiểu gene Kể từ những năm 1980, rất nhiều kỹ thuật phân tử khác nhau đã được áp dụng để mô tả vi khuẩn LAB Sinh học phân tử đã cung cấp một công cụ hữu hiệu để phát hiện, nhận dạng và mô tả đặc tính của các vi sinh vật được tìm thấy trong mẫu môi trường, thực phẩm và hệ sinh thái phức tạp Trong phân loại, giải trình tự gene 16S rRNA là một phương pháp phổ biến và hiệu quả để định danh

và nghiên cứu tiến hóa của vi khuẩn Bên cạnh các vùng bảo tồn cao, gene 16S rRNA còn chứa các vùng tương đối biến đổi Tính tương đồng của các vùng bảo tồn

là cơ sở để xác định quan hệ tiến hóa và vị trí phân loại của vi khuẩn Tuy nhiên, trình tự 16S rDNA chưa đủ chính xác để phân loại những loài có quan hệ gần gũi

Do đó, các gene mục tiêu khác ví dụ như ropB, rpoA, recA hoặc pheS cũng được sử dụng để phân biệt các loài LAB [50]

Trong nhiều năm qua, việc nghiên cứu và xác định vi khuẩn LAB trong sản phẩm thịt lên men truyền thống đạt được nhiều thành tựu thông qua nhiều cách tiếp cận như phân tích DNA đa hình (RAPD-PCR) [7], kỹ thuật dấu vân tay (DGGE, RADP) [19, 48], giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) hoặc đánh giá mức độ đa dạng của quần thể LAB trong các điều kiện sinh thái khác nhau bằng kỹ thuật metagenomic Mỗi công nghệ đều có ưu điểm, tính hữu ích và nhược điểm riêng Không có phương pháp duy nhất nào có thể cung cấp tất cả thông tin về sự khác

biệt giữa các loài Do đó, cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau để mô tả và phân loại chính xác các chủng LAB

1.1.3 Hệ thống phân loại

Hiện nay, LAB được xếp vào ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, phân loại dựa trên hình thái tế bào, cách thức lên men đường và phạm vi nhiệt độ sinh trưởng LAB được biết đến là nhóm vi khuẩn chuyển hóa carbohydrate từ môi trường bên ngoài để tạo ra lactic acid Quá trình này chia thành hai loại là lên men đồng hình và lên men dị hình Trong lên men đồng hình, LAB chuyển hóa carbohydrate thành sản phẩm duy nhất là lactic acid Lên men dị hình, ngoài tạo ra lactic acid, LAB còn sản sinh ra các sản phẩm phụ như khí CO2, ethanol, acid acetic,…vv Hệ thống phân loại vi khuẩn LAB cập nhật nhất được trình bày trong Bảng 1 (https://lpsn.dsmz.de) Trong đó, vi khuẩn lactic có giá trị khoa học cao với các ứng dụng quan trọng tập trung chủ yếu ở các chi Lactobacillus, Carnobacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Tetragonococcus, Aerococcus và Weissella [28] Trong số các chi kể trên, Lactobacillus có số lượng loài nhiều nhất (hơn 200 loài), chiếm số ưu nhiều nhất trong hệ sinh thái cũng như

là chi được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất Năm 2020, 261 loài thuộc chi Lactobacillus đã được sắp xếp lại thành 25 chi khác nhau bao gồm Lactobacillus (nhóm Lactobacillus delbrueckii), Paralactobacillus và 23 chi mới là Holzapfelia, Amylolactobacillus, Bombilactobacillus, Companilactobacillus, Lapidilactobacillus, Agrilactobacillus, Schleiferilactobacillus, Loigolactobacilus, Lacticaseibacillus, Latilactobacillus, Dellaglioa, Liquorilactobacillus, Ligilactobacillus, Lactiplantibacillus, Furfurilactobacillus, Paucilactobacillus, Limosilactobacillus, Fructilactobacillus, Acetilactobacillus, Apilactobacillus, Levilactobacillus, Secundilactobacillus và Lentilactobacillus [70]

Bảng 1 Hệ thống phân loại vi khuẩn LAB

II Aerococcaceae 1 Aerococcus

Hiện nay, LAB được Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration; FDA) xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn, được

sử dụng cho người và có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm Tương tự, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority; EFSA) đã công nhận nhiều loài LAB (thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus) nằm trong danh sách Tiêu chuẩn An toàn (The qualified presumption of safety; QPS), ngoại trừ nhóm Enterococci cần phải nghiên cứu và chứng minh không chứa các gene kháng kháng sinh điều trị cho người và động vật [43] Vi khuẩn lactic có khả năng chịu được pH thấp, chịu được nồng độ muối mật cao và sản xuất bacteriocin được sử dụng như probiotic trong hỗ trợ tiêu hóa và phòng ngừa các bệnh tiêu chảy Ngoài ra, các loài LAB có thể tồn tại trong

điều kiện đông lạnh, sấy khô hoặc xử lý nhiệt được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Pediococcus gây ra hư hỏng thực phẩm hoặc có khả năng gây bệnh (hội chứng Crohn) Chính vì vậy việc đánh giá khía cạnh an toàn dựa trên các yếu tố kháng kháng sinh và độc lực đối với nhiều loài cần được cần được chú trọng xem xét khi ứng dụng tạo ra các chế phẩm sinh học từ loài này

1.2.2 Cơ chế tác động có lợi của probiotic

Probiotic có nhiều tác dụng đối với vật chủ Các cơ chế hoạt động chính của

vi khuẩn giúp cải thiện khả năng bảo vệ niêm mạc của đường tiêu hóa và nâng cao

hệ miễn dịch bao gồm:

Sản xuất các hợp chất ức chế

Vi khuẩn lactic tạo ra nhiều chất kháng khuẩn bao gồm bacteriocin, acid hữu

cơ, hydrogen peroxide và một vài hợp chất khác

Bacteriocins

Bacteriocin là một nhóm các peptide kháng khuẩn được tổng hợp trong ribosome của cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương bao gồm LAB, hoạt động chủ yếu chống lại các sinh vật có quan hệ gần gũi Bacteriocin sản xuất từ LAB thường không gây độc tế bào, có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh và có các đặc tính có lợi khác, được ứng dụng rộng rãi trong y học, chế biến thực phẩm, nông nghiệp và nuôi trồng thủy hải sản

Bacteriocin từ LAB đang ngày càng được chú ý bởi hoạt động kháng khuẩn

in vitro và in vivo mạnh Việc sản sinh bacteriocin phụ thuộc nhiều vào chủng giống

vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy Khác với các chất kháng khuẩn truyền thống, bacteriocin có tính đặc hiệu cao, hướng đích tác động tới loài cụ thể và không gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh vật trong cùng hệ sinh thái Cơ chế hoạt động của bacteriocin là thông qua sự thẩm thấu và phá vỡ màng tế bào Việc tiêu diệt vi khuẩn phải trải qua ba bước chính: liên kết với màng vi khuẩn, bám dính trên màng

và hình thành các kênh xuyên màng Kết quả của sự hình thành các kênh này dẫn tới hình thành các lỗ rò rỉ vật chất bên trong tế bào, từ đó làm chết tế bào Ngoài ra,

các peptide kháng khuẩn phải vượt qua lớp lipopolysaccharide tích điện âm của vi khuẩn Gram âm hoặc lớp polysaccharide có tính acid của vi khuẩn Gram dương Do

đó, một số bacteriocin đã được ứng dụng làm chất bảo quản sinh học tự nhiên trong thực phẩm nhằm kiểm soát mầm bệnh vi sinh vật

Acid hữu cơ

Các acid hữu cơ bao gồm lactic acid, formic acid và các acid béo chuỗi ngắn được chứng minh là có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh LAB sinh lactic acid là sản phẩm chính từ quá trình lên men carbohydrate Acid hữu cơ sản sinh từ LAB tạo một môi trường không thuận lợi cho các vi khuẩn gây bệnh sinh trưởng, cụ thể là pH nội bào giảm từ đó đòi hỏi các vi khuẩn phải tiêu thụ ATP nhiều hơn dẫn đến cạn kiệt năng lượng tế bào Nghiên cứu của Wang và cs (2015) cho thấy nồng

độ 0,5% lactic acid có thể gây ức chế hoàn toàn sinh trưởng của mầm bệnh Salmonella spp., E coli và L monocytogenes [67]

Hydrogen peroxide (H2O2)

Một số loài LAB có thể tạo ra H2O2 có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh Hoạt động diệt khuẩn của H2O2 phụ thuộc vào nồng độ và các yếu

tố môi trường như pH và nhiệt độ Sgibnev và cs (2017) đã phát hiện ra rằng H2O2

được tạo ra bởi lợi khuẩn Lactobacilli giúp tăng độ nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh [61] Đồng thời, H2O2 kết hợp với các loài sinh kháng sinh khác giúp hoạt động ức chế sự phát triển của mầm bệnh diễn ra hiệu quả hơn

vi khuẩn gây bệnh Một số protein do Lactobacillus sản sinh ra đã được chứng minh

có hiệu quả thúc đẩy quá trình tăng tiết chất nhầy ruột, nhờ đó giúp tăng cường chức năng của hàng rào niêm mạc ruột chống lại các mầm bệnh bám vào [12] [32]

Điều hòa hệ thống miễn dịch của vật chủ

Probiotic được nghiên cứu là có ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch bẩm sinh

và hệ thống miễn dịch đáp ứng của vật chủ Chúng tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên các tế bào biểu mô, tế bào đuôi gai, đại thực bào và một vài tế bào lympho khác nhau Tác động này của LAB có thể loại bỏ các tế bào tiền ung thư ở vật chủ [63] Hơn nữa, LAB có đặc tính probiotic có khả năng kích thích tế bào lympho B sản xuất kháng thể IgA và tăng cường đáp ứng với vaccine Các báo cáo gần đây cũng cho thấy rằng, LAB tác động tích cực lên hệ hô hấp của vật chủ nhờ gia tăng IgA trong niêm mạc phế quản, từ đó ngăn ngừa và giảm mức độ nghiêm trọng của các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp [47]

Cải thiện khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng, chuyển đổi thức ăn

Khả năng tiêu hóa thức ăn phản ánh lượng thức ăn và dinh dưỡng được hấp thụ sử dụng cho quá trình sinh trưởng của động vật LAB có đặc tính probiotic giúp cải thiện khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng nhờ việc tạo ra các enzyme tiêu hóa như amylase, chitinase, lipase, phytase và protease Ngoài ra, LAB cũng có khả năng tạo ra các acid béo dễ bay hơi và vitamin B như riboflavin, biotin, vitamin B12 giúp tăng cường khả năng tiêu hóa của vật chủ [39, 57]

1.2.3 Một số loài LAB có đặc tính probiotic đã được thương mại

1.2.3.1 Lactobacillus casei Shirota

Năm 1930, tiến sĩ khoa học người Nhật Bản Minoru Shirota đã phân lập được chủng Lactobacillus casei từ sữa chua Xuất phát từ ý tưởng ban đầu là tìm ra một con đường sinh học để đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cùng với thuyết của Elie Metchnikoff về tuổi thọ khi sử dụng sữa chua, tiến sĩ đã lựa chọn chủng Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus sử dụng trong nghiên cứu của mình Tuy nhiên kết quả không mấy khả quan, chủng sữa chua Bulgari này không có khả năng chịu môi trường acid thấp (dạ dày) và muối mật cao (ruột non) trong đường tiêu hóa Sau đó, ông đã phân lập và lựa chọn được chủng vi khuẩn có khả năng

sinh lactic acid cao, có thể đi qua đường tiêu hóa, chịu được muối mật và đặt tên là Lactobacillus casei Shirota (LcS) [59]

Vào năm 1935, tiến sĩ Shirota đã phát triển một loại thức uống lên men từ sữa tách béo, sử dụng chủng LcS đã phân lập và đặt tên là Yakult Sản phẩm này đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa nhiễm trùng, ảnh hưởng tích cực đến các binh lính nhiễm Shigella Tác động lợi khuẩn của sữa chua Yakult cũng đã được đánh giá trên hệ vi khuẩn đường ruột của trẻ em từ 2-6 tuổi thông qua phân tích mẫu phân Các kết quả cho thấy uống Yakult trong 4 tuần làm tăng số lượng chủng có lợi Lactobacillus và Bifidobacterium, đồng thời làm giảm số lượng các tác nhân gây bệnh như Enterobacter và Enterococcus [62] Ngoài ra, Shimizu và cs (1964) đã báo cáo rằng uống Yakult có thể làm giảm sản xuất khí trong ruột Spanhaak và cs (1998) đã phát hiện ra LcS có thể ức chế hoạt động của β-glucuronidase (enzyme chuyển hóa tạo ra chất gây ung thư trong đường ruột con người)

Thức uống Yakult đã phát triển nhanh chóng, nhận nhiều phản hồi tích cực tại thị trường Nhật Bản nói riêng và thế giới nói chung Năm 1964, chi nhánh nước ngoài đầu tiên của Yakult được thành lập tại Đài Loan Kể từ đó, Yakult tiếp tục được phân phối và mở rộng thị trường tại hơn 32 quốc gia bao gồm Brazil, Thái Lan, Hàn Quốc, Mexico, Úc, Vương quốc Anh, Đức,…vv Đồng thời vào năm

2005, Viện nghiên cứu Tokyo tại Nhật Bản và Viện khoa học Yakult của Châu Âu tại Bỉ cũng được thành lập Đến 2013, chủng LcS đã được cơ quan FDA cấp giấy chứng nhận đạt an toàn GRAS sử dụng trong thực phẩm (GRAS Notice No 492) Hiện tại, trung bình khoảng 30 triệu chai Yakult được tiêu thụ mỗi ngày

nhiều nhất trên thế giới Năm 1990, sản phẩm men vi sinh đầu tiên được thương mại hóa có chứa LGG thuộc về công ty Gefilus, Phần Lan Cho đến nay, LGG đã được

sử dụng nhiều trong sữa lên men, men vi sinh, nước trái cây và thực phẩm bổ sung

LGG® là thương hiệu thương mại của công ty Valio, Phần Lan đã được đăng

kí và cấp bằng sáng chế Thực phẩm bổ sung Culturelle Digestive Health Probiotic cung cấp khoảng 10 tỷ lợi khuẩn LGG giúp hỗ trợ tiêu hóa, giảm khó tiêu, đầy bụng, giảm tiêu chảy và hỗ trợ hệ miễn dịch Sản phẩm được bào chế dưới dạng viên nang hoặc viên nhai, đáp ứng nhu cầu khác nhau cho từng đối tượng Bộ gen của LGG không bị biến đổi trong vòng 25 năm qua (https://www.chr-hansen.com )

1.2.3.3 Bifidobacterium lactis HN019

Bifidobacterium lactis HN019 được phân lập bởi Trung tâm bảo tồn của Viện nghiên cứu bơ sữa New Zealand Chủng vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa như chịu acid, muối mật, có khả năng bám dính tế bào biểu

mô ruột [25] và có đặc tính điều hòa miễn dịch nổi trội [16, 49] B lactis HN019 cũng được phát hiện có tính ổn định tốt trong các sản phẩm bổ sung và đem lại hương vị thơm ngon cho sản phẩm lên men Hơn nữa, HN019 là một lựa chọn tốt cho phát triển sản phẩm chức năng synbiotic bởi khả năng sử dụng galacto-oligosaccharide [26] Trong chương trình “Article 13” của Liên minh Châu Âu, chủng vi khuẩn này đã được báo cáo về lợi ích bảo vệ sức khỏe hệ miễn dịch Nghiên cứu tính an toàn của chủng HN019 cho thấy chủng này không có các gen kháng kháng sinh và nhạy cảm với một số loại kháng sinh có hiệu quả điều trị lâm sàng Thử nghiệm độc tính LD50 trên chuột cũng không tìm thấy bất kỳ tác động tiêu cực nào [71]

Men vi sinh iFlora bao gồm 16 chủng lợi khuẩn trong đó chiếm phần lớn là chủng B lactis HN019, có tác dụng cân bằng hệ tiêu hóa và cải thiện hệ miễn dịch của người Sản phẩm cũng chứa các prebiotic hoạt động kết hợp với các chủng lợi khuẩn giúp duy trì sức khỏe của hệ vi khuẩn đường ruột, từ đó đẩy lùi một số bệnh liên quan đến đường tiêu hóa

1.2.3.4 Lactobacillus gasseri LG21

Helicobacter pylori (HP) là vi khuẩn cư trú trong dạ dày của người gây ra các vết viêm loét, nặng hơn có thể gây ung thư dạ dày Vi khuẩn HP có khả năng sinh urease xúc tác cho phản ứng tạo ra NH3 và CO2 nên có thể tồn tại trong môi trường acid thấp trong dạ dày Các nhà nghiên cứu tại công ty Meiji, Nhật Bản đã tiến hành các thí nghiệm in vivo và in vitro để lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với H pylori Kết quả cho thấy, 3 trong số 203 chủng Lactobacillus

là L gasseri LOL2716 (LG21), L gasseri No.6 và L dropsarius WB1004 (WB1004) có khả năng tồn tại trong môi trường acid dạ dày, bám dính với các tế bào biểu mô ruột và ức chế H pylori Các thử nghiệm trên chuột cũng được tiến hành Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng sử dụng LG21 và WB1004 bằng đường uống đã loại bỏ được H pylori Trong đó, chuột được điều trị bằng LG21 có nồng độ kháng thể IgG kháng H pylori thấp nhất Vì vậy, LG21 được chọn là vi khuẩn lactic có khả năng kháng H pylori Các thảo luận trên người lớn, trẻ em và các bệnh nhân nhiễm trùng không triệu chứng đã càng khẳng định được tác dụng của LG21 trong việc loại bỏ vi khuẩn H pylori [21, 24] Sản phẩm sữa chua có chứa LG21 có tên thương mại là Meiji Probio Yogurt LG21 do công ty Meiji phát triển hiện đang được ưa chuộng Theo thống kê năm 2020 có 8,2 triệu hộp sữa chua

đã được bán ra thị trường

1.2.3.5 Lactobacillus acidophilus NCFM

L acidophilus được phân lập bởi Cơ quan Vi sinh vật và Thực phẩm Bắc Carolina (US North Corolina Food Microbiology; NCFM), do đó chủng được đặt tên là NCFM [60] L acidophilus NCFM tồn tại chủ yếu trong ruột non và ức chế 80-90% vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm như Staphylococcus aureus, Salmonella, Escherichia coli, Clostridium perfringens bằng cách sản xuất acid hữu cơ (lactic acid và acetic acid) và các hợp chất kháng khuẩn [31] Chủng vi khuẩn này được công ty Danisco® đưa ra thị trường tiêu thụ Đây cũng là chủng L acidophilus đầu tiên được giải trình tự toàn bộ bộ gen [3] Việc nghiên cứu bộ gen của chủng đã xác

định được một số gen quan trọng liên quan đến quá trình sản xuất bacteriocin, quá trình chuyển hóa đường và khả năng bám dính vào tế bào biểu mô của vật chủ [30]

L acidophilus NCFM được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong nhiều thập

kỉ qua Năm 2011, Bộ Y tế Trung Quốc đã công bố L acidophilus có thể được sử dụng trong thực phẩm cho trẻ sơ sinh Ngoài ra, chủng cũng được thương mại hóa qua các sản phẩm bổ sung, được chứng minh có tính ổn định tốt và đem lại hương

vị thơm ngon cho các sản phẩm lên men Một số sản phẩm tiêu biểu có chứa L acidophilus trên thị trường như Howaru® Premium Probiotics được phân phối độc quyền bởi DuPontTM Danisco giúp cải thiện hệ tiêu hóa và hệ miễn dịch của người Viên nang Metagenics super Lactobacillus sản xuất bởi công ty Metagenics® cung cấp 1,5 tỷ lợi khuẩn sống bao gồm L acidophilus NCFM và Bifidobacterium lactis giúp tăng cường sức khỏe đường ruột

1.2.3.6 Lactobacillus plantarum CCFM8610

L plantarum CCFM8610 được nhóm nghiên cứu lợi khuẩn thuộc Đại học Giang Nam phân lập từ dưa chua truyền thống của Trung Quốc vào năm 2008 Các đặc tính lợi khuẩn của L plantarum CCFM8610 đã được đánh giá một cách có hệ thống trên cả mô hình phòng thí nghiệm và mô hình động vật Trên chuột, L plantarum CCFM8610 không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể và không có sự khác biệt về các chỉ số trong gan và thận với nhóm đối chứng Tính đến hiện tại, chưa có báo cáo nào về độc tính và tác dụng phụ của chủng vi khuẩn này Bột men

vi sinh tổng hợp có chứa L plantarum CCFM8610 có thể giảm táo bón, khó tiêu một cách hiệu quả Ngoài ra, các bệnh liên quan đến miễn dịch như chàm da, viêm

da cũng được cải thiện một cách rõ rệt khi sử dụng sản phẩm chứa chủng lợi khuẩn này

1.3 Vi khuẩn lactic trong lên men thực phẩm

1.3.1 Vi khuẩn lactic trong thực phẩm lên men tự nhiên

Các sản phẩm lên men đã hình thành và phát triển cùng với sự phát triển của

xã hội loài người Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng quá trình lên men để bảo quản thực phẩm và tạo ra những sản phẩm được biến đổi về hương vị, kết cấu cho

phù hợp với khẩu vị vùng miền Thực phẩm lên men là thực phẩm hoặc đồ uống được chế biến từ nguồn nguyên liệu sẵn có theo phương thức lên men của vi sinh vật nhằm biến đổi các thành phần nguyên liệu ban đầu thông qua hoạt động của enzyme [40] thành loại thực phẩm có thể ăn được và phù hợp với khẩu vị của dân tộc đó Những thực phẩm này chủ yếu là sản phẩm của quá trình lên men truyền thống và tự phát với nhiều ưu điểm Việc chế biến và tiêu thụ các sản phẩm lên men truyền thống này phụ thuộc nhiều vào sự có sẵn của nguồn nguyên liệu ban đầu theo thời tiết, mùa vụ và vị trí địa lý, lịch sử, văn hóa của các nhóm người Quá trình lên men sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu đa dạng như động vật (thịt, cá và sữa) và thực vật (rau, củ, quả và hạt) Bên cạnh đó, các gia vị như tỏi, ớt, tiêu,…vv cũng được bổ sung nhằm tạo các hương vị riêng Nhờ vậy, mỗi vùng miền khác nhau có các phương cách chế biến và sản xuất khác nhau để tạo ra những sản phẩm lên men đặc trưng cho mỗi vùng miền đó

Bảng 2 Một số thực phẩm lên men ở châu Á [54]

Hàn Quốc, Nhật Bản

Lb cellobiosus,

Lb plantarum

Streptococcus sp

Rau, củ lên men

các loại rau củ, muối

P cerevisiae

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men Các vi sinh vật phổ biến trong lên men bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Trong số các vi khuẩn, Lactobacillus đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa carbohydrate thành lactic acid Ngoài ra, Acetobacter (chủ yếu tham gia vào quá trình lên men của trái cây, rau củ) và Bacillus (lên men các loại hạt đậu) cũng được

sử dụng rộng rãi Sự kết hợp giữa thực phẩm và vi khuẩn đã tạo ra hàng nghìn loại thực phẩm và đồ uống lên men khác nhau Các vi sinh vật này có thể có sẵn trong gia vị bổ sung, trong nguyên liệu, trong vật dụng chế biến hoặc ở ngoài môi trường

Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men khá phức tạp Một số quá trình lên men chỉ chứa một vài loài chiếm ưu thế Bên cạnh đó, có những quá trình lên men đòi hỏi sự kết hợp của nhiều loài vi sinh để tạo ra được sản phẩm cuối cùng Trong một số loại thực phẩm, sự thay đổi nhỏ về thành phần và số lượng loài tham gia vào quá trình lên men cũng có thể dẫn đến sự thay đổi về chất lượng, tính cảm quan của sản phẩm Do đó, một hệ vi sinh vật ổn định giúp làm tăng tính nhất quán của sản phẩm từ đó hình thành một sản phẩm có chất lượng cao

Việt Nam là một nước nông nghiệp có nghề trồng lúa và đánh bắt thủy hải sản là những nghề quan trọng đem lại nhiều lợi ích cho phát triển kinh tế xã hội Thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam có lịch sử lâu đời và là cách thức bảo quản các sản phẩm nông nghiệp và thủy sản Các loại thực phẩm này được phân thành 2 nhóm: thực phẩm lên men trong thời gian ngắn và thực phẩm lên men trong thời gian dài Thực phẩm được lên men ngắn hạn thường có vị chua, được dùng để

ăn trực tiếp, thời gian sử dụng ngắn và bảo quản ở nhiệt độ 4-8 oC Thực phẩm được lên men trong thời gian dài thường có hàm lượng muối NaCl cao để ngăn ngừa vi sinh vật tạp nhiễm Hầu hết các loại thực phẩm lên men của Đông Á nói chung và của Việt Nam nói riêng là các sản phẩm không có nguồn gốc từ sữa, bao gồm nhiều loại nguyên liệu thô như ngũ cốc, đậu nành, trái cây, rau củ quả, các loại cá và hải sản khác nhau Nhiều loại rau như bắp cải, giá đỗ, cà tím, măng, hành lá, dưa chuột…vv có thể được sử dụng để lên men Các loại thảo mộc và gia vị như tỏi, tiêu, gừng, ớt thường được sử dụng làm nguyên liệu phụ Nhiệt độ lên men phần lớn

phụ thuộc vào môi trường tự nhiên, có thể được kiểm soát bằng cách để thực phẩm dưới ánh nắng mặt trời hoặc trong bóng râm tùy thuộc vào từng quy trình truyền thống Ngoại trừ sản xuất rượu có men giống khởi động, hầu hết các quá trình lên men khác đều diễn ra tự phát và do các vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu hoặc từ môi trường xung quanh tiến hành Sản xuất thực phẩm bằng phương pháp lên men truyền thống vẫn chủ yếu ở quy mô nhỏ, quy mô hộ gia đình- tiểu thủ công nghiệp Mặc dù cuộc cách mạng công nghiệp trong ngành thực phẩm đang diễn ra mạnh mẽ nhưng lên men thực phẩm truyền thống vẫn tồn tại lâu dài tại nhiều vùng làng quê Việt Nam với 54 dân tộc anh em, mỗi dân tộc có ngôn ngữ và văn hóa riêng nên sản phẩm lên men truyền thống vô cùng đa dạng nghiên cứu về các quy trình lên men truyền thống giúp chúng ta bảo tồn, cải tiến và nâng cao chất lượng sản phẩm 1.3.2 Vi khuẩn lactic trong sử dụng làm giống khởi động

Ngoài phương pháp lên men tự nhiên, thực phẩm cũng được lên men nhờ bổ sung các men khởi động được gọi là lên men phụ thuộc vào nuôi cấy Phương thức chính để quá trình lên men được diễn ra là bổ sung “backslopping” Tại đó, một lượng nhỏ sản phẩm của mẻ lên men thành công trước được thêm vào mẻ lên men này từ đó giúp quá trình lên men xảy ra có định hướng, nhanh hơn và tạo thành phẩm chất lượng hơn Một số sản phẩm như natto, kefir và kombucha được lên men theo phương thức trên [53] Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số điểm hạn chế nhất định Sản phẩm phụ thuộc phần lớn vào “backslopping” của mẻ trước để lên men nên việc kiểm soát chất lượng của giống khởi động khá phức tạp Các men giống khởi động lấy theo cách này có chứa thành phần hỗn hợp không xác định của các chủng loài vi sinh vật khác nhau Vì vậy, sản phẩm tạo ra sẽ có hương vị, kết cấu khác nhau ít nhiều theo từng mẻ

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, quá trình sản xuất các thực phẩm lên men cũng dần được công nghiệp hóa và tự động hóa Sản phẩm sản xuất với số lượng lớn, việc kiểm soát được thực hiện trên toàn quy mô nên việc sử dụng men giống khởi động thương mại là một phần không thể thiếu trong quá trình sản xuất thành công bất kì sản phẩm lên men nào Men giống khởi động bao gồm một hay

nhiều chủng (loài ưu thế trong sản phẩm lên men truyền thống) đã qua sàng lọc, tuyển chọn và thương mại sản xuất trong điều kiện có kiểm soát Số lượng thành phần loài, tỷ lệ phối trộn trong men giống khởi động được nghiên cứu rõ ràng nhằm duy trì các đặc tính mong muốn của sản phẩm [13] Chính vì vậy, quá trình lên men diễn ra có định hướng, ổn định và hiệu suất được cải thiện hơn nhiều so với các chủng tự nhiên Việc sử dụng men giống khởi động có chọn lọc trong lên men thực phẩm cần được quan tâm và đẩy mạnh hơn nữa

Để tạo ra một men giống khởi động, các vi khuẩn LAB cần được nghiên cứu, xem xét và tuyển chọn kĩ lưỡng Các khía cạnh an toàn của LAB cần nghiên cứu bao gồm nguồn gốc, khả năng sinh độc tố, khả năng tan máu, tính nhạy cảm kháng sinh, khả năng chuyển gen và tác dụng phụ (gây nhiễm trùng toàn thân hoặc kích thích miễn dịch quá mức ở những người nhạy cảm) Ngoài ra, các đặc tính chức năng liên quan đến khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa, khả năng sống sót trong

pH thấp, tính kị nước, điều hòa miễn dịch và tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Thêm vào đó, các đặc tính kỹ thuật liên quan đến sinh trưởng trong nhiệt độ, pH, nồng độ muối khác nhau, khả năng chuyển hóa (khử amin arginin, thủy phân esculin và sản xuất acetoin) cũng được quan tâm

1.3.3 Vai trò của LAB trong thịt lên men

1.3.3.1 Giảm hàm lượng nitrosamine

Trong quá trình chế biến và lên men các sản phẩm thịt, các chất tạo màu có chứa nitrate hoặc nitrite thường được bổ sung để tạo sản phẩm có màu đỏ hồng bắt mắt Tuy nhiên, hai thành phần này khi được thêm vào sẽ kết hợp với dimethylamine có trong thịt sống để tạo ra chất gây ung thư là dimethylnitrosamine Quá trình lên men của LAB sản sinh ra nhiều acid hữu cơ, giúp khử nitrite và giảm thiểu hình thành dimethylnitrosamine

1.3.3.2 Tăng giá trị dinh dưỡng

Trong quá trình lên men, LAB có thể tạo ra các enzyme thủy phân khác nhau giúp chuyển hóa protein, chất béo, các đại phân tử thành amino acid, peptide,…cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thụ sản phẩm Ngoài ra, LAB có thể sản xuất một số

vitamin như folate, vitamin B12, vitamin K2 và riboflavin,…mà con người không thể tự tổng hợp được

1.3.3.3 Tạo hương vị và màu sắc

Trong quá trình sinh trưởng, LAB sản sinh các acid hữu cơ như lactic acid, propionic acid hoặc acetic acid làm giảm pH môi trường Khi pH môi trường giảm, hoạt động phân giải protein thành peptide và amino acid được kích thích từ đó tạo nên hương vị cho sản phẩm Ngoài ra, các acid hữu cơ này tương tác với ketone và rượu tạo ra trong quá trình lên men cũng giúp cải thiện mùi vị cho thịt lên men [68] Bên cạnh đó, hoạt động catalase của một số LAB chuyển hóa H2O2 thành H2O và

O2 giúp tăng tính cảm quan của sản phẩm Đây là một đặc tính kỹ thuật đáng lưu ý khi lựa chọn giống khởi động

1.3.4 Tính an toàn của LAB trong sản phẩm thịt lên men

Tính an toàn và đặc tính kỹ thuật của hệ vi sinh vật bản địa có vai trò và ý nghĩa to lớn để cải thiện công nghệ lựa chọn giống khởi động và sản xuất các sản phẩm thịt lên men Mặc dù LAB đã được sử dụng để sản xuất thực phẩm và sản phẩm bổ trợ sức khỏe cho con người nhưng hàm lượng amin sinh học (biogenic amine; BA) và các yếu tố lây truyền kháng kháng sinh là một trong những yếu tố đáng lo ngại khi sử dụng sản phẩm thịt lên men

1.3.4.1 Sản sinh amine sinh học

Trong khi lên men thịt, LAB sinh trưởng tạo ra lactic acid và phân giải protein tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản sinh BA Một lượng lớn protein cùng với hoạt động phân giải chúng được tìm thấy trong quá trình làm chín sản phẩm đã cung cấp tiền chất cho phản ứng decarboxylase[37] Sự có mặt của các BA trong thực phẩm như tyramine, agmatine, histamine, cadaverine, putrescine, phenethylamine,…là mối lo ngại cho sức khỏe con người bởi việc tiêu thụ chúng có thể gây độc [64] Hàm lượng BA trong sản phẩm thịt lên men phụ thuộc vào thành phần vi sinh vật, điều kiện lên men và vi khuẩn giống khởi động L curvatus và nhiều loài thuộc chi Enterococci được phát hiện có khả năng sinh BA nhiều nhất Trong khi đó, L sakei và L plantarum là những loài phù hợp được lựa chọn làm

làm giống khởi động bởi khả năng sinh BA thấp Việc lựa chọn giống khởi động sinh trưởng tốt, acid hóa nhanh và không có hoạt động decarboxylase có thể ngăn chặn các vi sinh vật có khả năng sinh BA, dẫn đến thành phẩm cuối cùng an toàn và chất lượng hơn [18]

1.3.4.2 Kháng kháng sinh

Sự xuất hiện và lây lan của các vi khuẩn kháng kháng sinh đang là mối lo ngại lớn cho sức khỏe cộng đồng LAB đã được nghiên cứu là nhóm vi khuẩn có thể chuyển gene kháng kháng sinh sang vi khuẩn cộng sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh nhờ

cơ chế chuyển gene ngang [23] Các báo cáo trước đó đã chỉ ra rằng ngay cả khi không có áp lực chọn lọc thì các yếu tố di truyền quyết định tính kháng kháng sinh

có thể được truyền với tần suất cao trong hệ vi sinh vật khi lên men Chuỗi thức ăn

đã được công nhận là một trong những con đường chính lan truyền vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh với quần thể người và động vật EFSA (2010) đã kết luận rằng vi khuẩn được đưa vào chuỗi thức ăn có chủ đích (ví dụ: giống khởi động) có thể chứa các khả năng tiềm tàng do chúng mang gene kháng kháng sinh Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn giống khởi động là một việc làm cần thiết để tạo ra sản phẩm lên men

có hương vị riêng và độc đáo Đây cũng là món ăn mang nhiều ý nghĩa truyền thống Theo quan niệm Á Đông, màu đỏ tượng trưng cho sự may mắn Vì thế trong mâm cỗ Tết Việt không thể thiếu được sắc đỏ, trong đó màu đỏ hồng tươi của lạp xưởng mang ý nghĩa may mắn Ngoài ra, kiểu dáng nối với nhau của từng khúc lạp xưởng thể hiện mong ước giàu sang và sung túc Lạp xưởng Tây Bắc ngày càng được ưa chuộng bởi màu sắc bắt mắt, hương vị thơm ngon đặc trưng và đem lại nhiều giá trị dinh dưỡng

1.4.2 Phương pháp sản xuất lạp xưởng

Nguyên liệu chính để làm nên món lạp xưởng là thịt lợn và lòng non Các nguyên liệu được thái nhỏ sau đó ướp với các loại gia vị như muối, đường, gừng, tỏi, tiêu, ớt,… cho thấm đều Lạp xưởng nổi tiếng ở vùng cao Tây Bắc, đặc biệt là dân tộc Tày tại miền núi phía bắc tỉnh Bắc Kạn bởi có sự có mặt của các nguyên liệu đặc biệt như hạt Dổi (Michelia tokinesis), Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa) và rượu ngô lên men Đây cũng là những nguyên liệu hình thành nên mùi vị, hương vị đặc trưng cho món lạp xưởng Tây Bắc Hỗn hợp sau đó được nhồi vào lòng non đã làm sạch, dùng dây buộc thành từng đoạn khoảng 10-20 cm Lạp xưởng được hong phơi nắng gió khoảng 3-4 ngày rồi treo trên gác bếp cho đến khi khô Quá trình lên men và chín của sản phẩm diễn ra trong vài tuần ở nhiệt độ môi trường Nếu treo trên gác bếp, lạp xưởng có thể bảo quản được quanh năm

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Mẫu thực phẩm nghiên cứu

Mẫu lạp xưởng truyền thống được thu thập tại chợ truyền thống thuộc các tỉnh Lạng Sơn, Cao Bằng và Sơn La vùng Tây Bắc Việt Nam Mẫu sau đó được vận chuyển ở nhiệt độ thường về phòng thí nghiệm để tiến hành nghiên cứu

2.1.2 Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Lacticaseibacillus casei Shirota (LcS) phân lập từ sản phẩm sữa lên men Yakult (Bình Dương, Việt Nam) được sử dụng như đối chứng dương trong các thí nghiệm xác định đặc tính probiotic

Các chủng vi khuẩn lactic trong nghiên cứu được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng 7 chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh đường tiêu hóa hoặc gây bệnh qua thực phẩm Staphylococcus aureus VTCC 12275, Listeria monocytogenes VTCC

70147, Escherichia coli VTCC 12272, Salmonella enterica VTCC 70080, Aeromonas dhakensis VTCC 70106, Vibrio vunifcus VTCC 70092 và Campylobacter jejuni VTCC 70176 Các chủng vi khuẩn kiểm định này được nhận

từ Trung tâm nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia (Vietnam Type Culture Collection; VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội (VNU)

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

de Man Rogosa Sharp; MRS (BD, Mỹ)

Müller-Hinton; MH (BD, Mỹ)

Nutrient agar; NA (BD, Mỹ)

Nutrient broth; NB (BD, Mỹ)

Blood Agar Base +5% Sheep Blood (MELAB,

Môi trường nuôi cấy tế bào

Dulbecco’s modification of Eagle medium; DMEM (Corning, Mỹ)

Streptomycin/Penicilin 100X (Gibco, Mỹ)

Fetal Bovine Serum; FBS (Gibco, Mỹ)

Trypsin/EDTA Solution (Corning, Mỹ)

Triton X100 (Merck, Đức)

Hóa chất cho tách chiết DNA

Lysis buffer: 100 mM Tris HCl, 100 mM Na2EDTA, 1.5 M NaCl, 1% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH 8,0

Chloroform: isoamyl alcohol; CI 49:1

SDS 20%

Lysozyme (50 mg/mL)

Proteinase K (10 mg/mL)

Hóa chất cho thử nghiệm

Pepsin (Sigma-Aldrich, USA)

Bile salt (Biobasic, Canada)

Pancreatin (Sigma-Aldrich, USA)

Các hóa chất sử dụng đều có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu

và phân tích

Thiết bị

Các thiết bị chuyên dùng cho nuôi cấy vi sinh vật bao gồm: tủ cấy an toàn sinh học (Thermo, Đức); tủ nuôi cấy kị khí (Bactrox, Mỹ); máy ly tâm (Eppendorf, Đức); máy PCR (Eppendorf, Đức); kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức); máy đo mật độ quang (Beckman Coulter, Mỹ)….vv

2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Từ các mẫu lạp xưởng, 10 gram mẫu mỗi loại được dầm nhuyễn trong 90 mL NaCl 0,85% (w/v) Sau khi đồng nhất, mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp

100 µL dịch pha loãng được hút và trải trên đĩa môi trường thạch MRS Các đĩa được ủ ở 37°C trong điều kiện kị khí Sau 2-3 ngày ủ, các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái, màu sắc khác nhau được lựa chọn Sau đó, các chủng được nhuộm Gram

và thử phản ứng catalase Các chủng Gram dương và phản ứng catalase âm tính được nghi ngờ là vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn này được được lưu giữ ở -

80°C trong môi trường dịch thể MRS chứa 20% glycerol sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Đồng thời, 100 µL dịch pha loãng trên cũng được cấy trải trên đĩa môi trường NA nhằm phân lập và xác định số lượng các loài vi khuẩn hiếu khí dị dưỡng Sau 3 ngày ủ ở 37°C, các khuẩn lạc khác biệt về màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt được cấy ria sang các đĩa môi trường thạch NA khác và lưu giữ ở -80°C trong môi trường dịch thể NB bổ sung 20% glycerol

2.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật giải trình tự

2.3.1 Phương pháp tách DNA

Các chủng nghi ngờ là vi khuẩn lactic được nuôi trong môi trường thạch MRS ở 37°C Sau 1-2 ngày nuôi cấy, sinh khối tế bào được thu bằng tăm bông vào ống 1,5 mL chứa 500 µL nước sạch Sinh khối được ly tâm 8000 rpm trong 10 phút, phần cặn tế bào được hòa vào được hòa vào 200 µL lysis buffer (100 mM Tris HCl,

100 mM Na2EDTA, 1,5 mM NaCl, pH 8.0) Dung dịch tế bào được vortex đều trước khi bổ sung 10 µL lysozyme (50 mg/mL) và 10 µL proteinase K (10 mg/mL)

và ủ ở 37°C trong 30 phút Sau thời gian ủ, 60 µL SDS 20% được bổ sung và ủ ở 65°C trong 2 giờ, cứ 20-30 phút đảo nhẹ ống một lần DNA vi khuẩn được tách bằng phương pháp chloroform: isoamyl alcohol (49:1), sau đó được tủa bằng isoproanol trong 1 giờ ở -20°C DNA được rửa lại 2-3 lần bằng 70% ethanol lạnh,

để khô ở 37°C sau đó được hòa lại vào 50 µL nước MQ và được giữ ở -4°C

2.3.2 Phương pháp khuếch đại gen và giải trình tự gen dựng cây phân loại

Vi khuẩn được định danh dựa trên trình tự gen 16S rRNA DNA tổng số được tách và sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (Polymerase Chain Reaction-PCR) sử dụng cặp mồi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1525R (5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3') Phản ứng PCR được tiến hành theo chu trình nhiệt như sau: 95°C trong 5 phút; 35 chu kì cho 95°C trong 30 giây, 55°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút và giai đoạn kéo dài ở 72°C trong 45 giây Sản phẩm của phản ứng được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kích thước của đoạn gen khuếch đại

Sản phẩm khuếch đại 16S rDNA của các chủng thuần khiết (1500 bp) được giải trình tự bằng phương pháp Sanger (First Base Laboratories, Malaysia) Trình tự gen được phân tích và so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài liên quan hiện được công bố trên cơ sở dữ liệu EzTaxon (http://eztaxone.ezbiocloud.net/) Kết quả giải trình tự 16S rDNA được sử dụng để xây dựng cây phân loại dựa trên phương pháp thống kê Neigbor-Joining (NJ) trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên

1000 phép so sánh đa chiều

Ngoài ra, DNA tổng số cũng được dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen recA Các cặp mồi đặc hiệu cho gen và chu trình nhiệt tương ứng được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3 Các cặp mồi và chu trình nhiệt sử dụng để khuếch đại gen recA

tham khảo

Chu trình nhiệt 94°C 3 phút; (94°C 30 giây, 56°C 10 giây,

72°C 30 giây) với 30 chu kỳ; 72°C 5 phút;