Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường: Nghiên cứu các chất dược tính từ vi sinh vật nhằm nâng cao chất lượng dịch vụ cung cấp chủng giống và thương mại hóa sản phẩm

Xây dựng quy trình đánh giá hoạt độ uricase từ dịch nuôi cấy các chủng vi sinh vật a Xây dựng quy trình đánh giá hoạt độ uricase * Định tính khả năng sinh uricase trên đĩa thạch Chung vi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BAO CAO TONG KET

KET QUA THUC HIEN DE TAI KH&CN

CAP DAI HOC QUOC GIA

Tén dé tai: Nghiên cứu các chất dược tính từ vi sinh vật nhằm nâng cao chất lượng dịch vụ cung cấp chủng giống và thương mại hóa sản pham

Mã so dé tài:

Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Thị Thúy Vân

Hà Nội, 6/2024

PHAN I THONG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu các chat dược tính từ vi sinh vat nhằm nâng cao chất lượngdịch vụ cung câp chủng giông và thương mại hóa sản phâm

1.2 Mã số:

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

Họ và tên, học hàm, học vị | Tô chức công tác | Nội dung công việc tham gia

Chủ nhiệm, Phụ trách chung;

TS Phạm Thị Thúy Vân Viện VSV Tham gia thiệt kê thí nghiệm,

CNSH viết báo cáo và công bố khoa

học

| Thư ký khoa học; tham gia các

TS Hoàng Thị Lan Anh nội dung 1, 5 và 6; viết báo cáo

ThS Nguyễn Hữu Tuấn Dũng : » am gia các nội dung

TV; tham gia các nội dung 2, 3,

và 5

TS Trịnh Thành Trung

4 | TS Trịnh Thị Vân Anh

6 | ThS Nguyén Thi Anh Dao

TV; tham gia các nội dung 1, 3,

1.4 Don vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 6 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023

1.5.2 Gia hạn (nếu có): 12 tháng

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 6 năm 2022 đến tháng 6 năm 2024

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): không

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 1.000 triệu đồng

PHAN II TONG QUAN KET QUÁ NGHIÊN CỨU

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ đượcđăng trên tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm cácphần:

1 Đặt vấn đề

Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên (các chất chuyển hóa từ các sinh vật sống nhưthực vật, động vật và vi sinh vật) đóng một vai trò quan trọng trong đời sống cua con nBƯỜI.Ching da dang về cấu trúc, thành phần hóa học và có thé ứng dụng trong nhiều lĩnh vực củađời sống bao gồm cả trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe So với các chất hóa học tổng hợp

ưu điểm của các chất có nguồn gốc tự nhiên là sự an toàn, độ tin cậy và tính hiệu quả vềkinh tế Thực vật được xem là nguồn khai thác các chất có hoạt tính sinh học tiềm năng ứngdụng trong ngành dược Tuy nhiên điểm thắt nút mà ngành được phẩm gặp phải đó là cầnmột lượng lớn sinh khối đề tách chiết gây khó khăn về nguồn cung Phương án thay thế chủ

yếu nguồn nguyên liệu thực vật chính là vi sinh vật Vào đầu những năm 1900, khoảng 80%các loại thuốc có trên thị trường được tách chiết từ thực vật Sau này, việc Alexander

Fleming phát hiện ra penicillin từ Penicillium chrysogenum (tên cũ là P notatum) vào năm

1928 đã đánh dấu một bước chuyền đổi đáng kế nguồn khai thác các chất có hoạt tính sinh

học từ thực vật sang vi sinh vật.

Các bệnh không lây nhiễm như tim mạch, tiểu đường, ung thư là nguyên nhân gây tửvong hàng đầu trên thé giới (chiếm 74% số ca tử vong) Dé cải thiện sức khỏe cộng đồng,việc tìm kiếm các hợp chất sinh học mới, quan trọng trong phòng ngừa và điều trị luôn làmối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu và các sản phẩm tự nhiên được xem là giảipháp chính trong các phương pháp điều trị y tế Các hợp chat hóa học có nguồn gốc tự nhiên

chiếm trên 65% tổng số thuốc đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phâm Hoa Kỳ phê

duyệt Có khoảng 50.000 loại sản pham được phát hiện từ vi sinh vật và khoảng 10.000trong số đó có vai trò quan trọng trong điều trị Những sản phẩm này được sử dụng như chấtchống ung thư, kháng sinh, chất ức chế enzyme, hóa chất nông nghiệp, chống đông máu,hoạt mạch, chống viêm Trong đó, các chất ức chế như glycosidase, enzyme chuyên

angiotensin-converting, xanthine oxidase ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của

các nhà khoa học bởi tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng trong lĩnh vực y tế

1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.1 Dai tháo đường và chất ức chế glycosidase từ vi sinh vật

Dai tháo đường (PTD), còn gọi là tiêu đường, là hội chứng các rối loạn chuyển hóamãn tính, phức tạp được đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do tụy không sản xuất đủinsulin hoặc do cơ thê sử dụng insulin không hiệu quả hoặc cả hai (WHO, 2021) Các chất

ức chế ơ-glucosidase (a-glucosidase inhibitor, AGI) đã được chứng minh khả năng kiểmsoát đường huyết sau ăn và chính thức sử dụng dé điều tri DTD vào những năm 1990s Một

số chất ức chế glucosidase như acarbose và voglibose được tách chiết từ xạ khuẩn có thểkiểm soát hiệu quả lượng đường huyết sau khi ăn và đã được sử dụng trong lâm sàng trongđiều trị ĐTĐ Tuy nhiên, chúng cũng có một số tác dụng phụ chủ yếu ở đường tiêu hóa như

2

đầy hơi, co thắt ruột và đau bụng Vì vậy, việc tìm kiếm các AGI mới, có hiệu quả điều trị

và ít tác dụng phụ vẫn đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu So với thực vật, vi sinhvật được xem là nguồn có thé được sản xuất trên quy mô lớn một cách dé dàng hon (Shah et

al, 2018) Xa khuẩn đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được biết đến rộng rãi trong

việc sản xuất các chat ức chế glycosidase mới có giá trị Tuy nhiên, rất ít chủngStreptomyces song ở các hệ sinh thái thông thường có khả năng ức chế glycosidase mà hauhết chúng đều có nguồn gốc từ hệ sinh thái biển hoặc sống nội sinh

Ngoài xạ khuẩn, nhiều loài vi khuẩn cũng được báo cáo là có khả năng sản xuất cácchất ức chế glycosidase Frediansyah và cộng sự (2019) tìm thấy ở dịch chiết tế bào và dichnuôi cay của ba chủng vi khuẩn lactic (LAB) thuộc loài Lactobacillus pentosus phân lập từcây trứng cá Muntingia calabura L có hoạt tính ức chế a-glucosidase và a-amylase ở điềukiện in vitro Nghiên cứu của Gulnaz và cộng sự (2021) cũng cho thấy rang dịch chiết củaLactobacillus sakei Probio65 và Lactobacillus plantarum Probio-093 có hoạt tinh ức chế a-glucosidase và a-amylase Hai chủng Lactobacillus này có thé thay đổi sự đa dạng của hệ visinh vật đường ruột ở chuột mắc bệnh tiêu đường do chế độ ăn nhiều chất béo và Probio-

093 có tác dụng dang kế hơn tác dụng lên hệ vi sinh vật đường ruột Mười một chung vi

khuẩn Gram âm, sống nội sinh ở cây mãng cầu xiêm Annona muricafa đã cho thấy hoạt tính

ức chế a-amylase Trong đó, chủng DS21 có ty lệ ức chế đạt cao nhất là 72,22% (Pujiyanto

tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, não và thận, có liên quan đến 10 triệu ca tử vong mỗi

năm trên thế giới (Brouwers et al, 2021)

Hệ thống renin-angiotensin-aldosterone (RAAS) là một trong những hệ thống nội tiết

tố tiến hóa lâu đời nhất có vai trò cân bằng huyết áp và điện giải nội môi (Steckelings et al,

2009) Enzyme chuyền đổi angiotensin (ACE) đóng vai trò trung tâm trong RAAS Các loạithuốc tổng hợp như captopril có tác dụng ức chế hoạt động của ACE dẫn đến giãn mạchmáu và hạ huyết áp được sử dụng rộng rãi dé điều trị tăng huyết áp nhưng có một số tácdụng phụ thông thường hoặc hiếm gặp (Ahmad et al, 2023) Do đó, việc tìm kiếm các nguồn

tự nhiên có tác dụng phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp nhưng ít tác dụng phụ, an toàn vàhiệu quả vẫn đang được quan tâm nghiên cứu trong đó bao gồm các “thực phâm ức chếACE” (Xia et al, 2020) Một trong những loại thực pham ức chế ACE được nghiên cứunhiều nhất là các sản phẩm lên men sữa bởi nhóm LAB (Ghavami et al, 2020) Trong quátrình lên men, LAB thủy phân protein từ sữa, chủ yếu là casein tao ra các peptide nhỏ (a, B

và K-casein) có nhiều đặc tính có lợi trong đó bao gồm khả năng ức chế ACE (Martin et al,2019) Hoạt tính ức chế ACE của một peptide gồm 6 acid amin từ sữa lên men bằng

Lactococcus lactis DIBCA2 với giá trị ICso = 5 + 2 pg/ml (Nejati et al, 2013) Gan đây, Li

và cộng sự (2019) đã thu được sữa lên men có hoạt tính ức chế ACE mạnh bởi hai chủng L

3

helveticus KLDS.31 và L casei KLDS.105 Các peptide ức chế ACE đặc trưng nhất là Pro-Pro và Ile-Pro-Pro được tìm thấy trong sữa lên men Khoảng 20 nghiên cứu trên người

Val-đã được công bố về mối liên hệ giữa việc tiêu thụ các sản phẩm có chứa hai tripeptide nàyVỚI viéc giảm cả huyết áp tâm thu và tâm trương (Pihlanto et al, 2010)

Các phương pháp như đo quang phỏ, sắc ký lỏng lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện dimao quản huỳnh quang đã được phát triển để xác định hoạt tính ức chế ACE, trong đó đoquang phô va HPLC là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất Dựa trên việc cơ chất

hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL) bị ACE phân cắt thành acid hippuric (HA) và His-Leu,lượng HA sinh ra từ HHL có tương quan trực tiếp với hoạt độ của ACE được xác định băngcách đo độ hấp thụ ở bước sóng 228 nm (Belovic et al, 2013) hoặc bằng HPLC (Li et al,

2017).

1.3 Bệnh tăng acid uric máu, chất ức chê xanthine oxidase và uricase từ vi sinh vật

Tăng acid uric máu (hyperuricemia, HUA) là một bệnh chuyên hóa do cơ thé sản

xuất quá nhiều acid uric (UA) và/hoặc bai tiết UA kém ở người có chế độ ăn bình thường

Khi nồng độ UA lớn hơn 7,0 mg/dl ở nam giới và 5,7 mg/dl ở phụ nữ thì được coi là mắc

HUA (Michael et al, 2019) UA là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyên hóa purine

được sản xuất chủ yếu bởi gan và ruột (Jalal et al, 2013) Trong các bệnh liên quan đếnHUA, gut vẫn là bệnh phô biến nhất được biết đến với 5%—12% trường hợp HUA sẽ tiếntriển thành bệnh gút Xanthine oxidase (XO) là một enzyme đóng quan trọng của quá trình

dị hóa purine, xúc tác quá trình oxy hóa chuyền xanthine và hypoxanthine tạo ra UA Hiện

tại, phương pháp điều trị chính đối với HUA là giảm sự chuyển đổi của hypoxanthine vàxanthine thành UA bang cách ức chế sự biểu hiện của XO (Xue et al, 2023) Do các loạithuốc tổng hợp đang sử dụng để điều trị gout có nhiều tác dụng phụ nên việc tìm kiếm cácchất ức chế XO mới, ít tác dụng phụ và hiệu quả cũng đang được các nhà khoa học quan

tâm nghiên cứu Một số các chất ức chế XO đặc hiệu đã được tách chiết từ dịch nuôi caycủa các chủng vi khuân Alcaligenes aquamarinus No 655 va Bacillus cereus No A-73,

Agrobacteria aurantiacum N-81 106 (Batchu et al, 2018); Lactobacillus rhamnosus (Chen

et al 2016); Acetobacter pasteurianus AHUOI (Chen et al, 2018).

Uricase (urate oxidase; EC 1.7.3.3) là một enzyme tham gia vào chuyền hóa purine,xúc tác quá trình chuyên đổi UA dang không tan thành allantoin dé tan Uricase được biểuhiện ở nhiều loại sinh vật bao gồm ca vi khuẩn, nam, thực vật và động vật (trừ con người).Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy hệ vi sinh vật đường ruột làm thay đôi đáng kể việctăng UA trên mô hình chuột (Pan et al, 2020) hoặc ở bệnh nhân mắc bệnh gut (Lin et al,2021) Do đó, đường tiêu hóa có thé là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn cho việc điều trịHUA thông qua việc sử dụng các chủng probiotic thông qua đường uống Điều này đã đượckiểm chứng thông qua các nghiên cứu in vivo trên mô hình chuột bị HUA gan đây vớiuricase từ vi sinh vật (Szczurek et al, 2017) hoặc các chủng vi khuẩn phân giải UA (Wu et

al, 2021) Cho đến nay, uricase đã được phát hiện ở vi khuẩn như Pseudomonas,

Arthrobacter, Microbacterium, Streptomyces, sSaccharopolyspora, Micrococcus,

Metabacillus va Bacillus (Pugin et al, 2022) Ở một số ít chủng lactobacilli, uricase có mặt

cả bên trong và bên ngoài tế bào (Handayani et al, 2018) Điều này đã thúc day nghiên cứu

4

sâu hơn về uricase ở các nhóm liên quan đến các chủng probiotic Hoạt tính uricase của vi

khuẩn có thé được đánh giá định tính thông qua việc quan sát khả năng phân giải UA khimôi trường nuôi cấy hoặc định lượng sự hình thành HạO› hoặc sự phân giải UA bằngphương pháp đo quang phô và sắc ký lỏng cao áp

2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về kha năng ức chế a-amylase và a-glucosidase từ vi sinh vật

Hoạt tính ức chế a-amylase và a-glucosidase của dịch chiết ethyl acetate ở nồng độ

500 pg/ml của 11 chủng vi khuẩn nội sinh ở cây Rhizophora stylosa thuộc các chỉ như

Bacillus, Streptomyces và Pseudomvibrio vào khoảng 31,4 + 3,1% đến 59,7 + 6,1% và 17,3+ 3,1% đến 54,5 + 6,1%, tương ứng (Tôn Thất Hữu Đạt & Phùng Thị Thúy Oanh, 2021).Trong một nghiên cứu khác, Tôn Thất Hữu Đạt và cộng sự (2022) đã phân tách được 5 hợpchat từ dịch chiết thô của chủng Bacillus sp RAR_M1_45 nội sinh ở cây đước Rhizophora

apiculata Blume có hoạt tính ức chế a-glucosidase với giá trị ICso từ 163,3 + 10,66 pg/mlđến 960,4 + 8,62 pg/ml và hoạt tính ức chế a-amylase với giá trị ICso từ 63,87 + 4,23 pg/mlđến 649,9 + 17,5 pg/ml Nguyễn Thi Trung và cộng sự (2022) đã phân lập được chủng xa

khuẩn Streptomyces costaricanus EBL.HB6 nội sinh ở cây cam Cao Phong, Hòa Bình.Ching này cho thấy hoạt tính ức chế a-glucosidase cao nhất đạt 68,98% trong số các chủng

xạ khuân đã phân lập Nguyễn Thị Hiền Trang và cộng sự (2021) trong quá trình sàng lọc

23 chủng vi sinh vật từ biển đã lựa chọn được chủng vi khuẩn Oceanimonas smirnovii có

hoạt tính ức chế a- glucosidase mạnh nhất với giá trị ICso là 13,89 ug/mI

Chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9161 bị đột biến có khả năng sản xuấtacarbose cao gấp 1,3 lần so với chủng hoang dai và sản lượng arcabose lên men đạt hiệu

xuất 10,48 g/l đã được Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2016) báo cáo Sau khi sàng lọc 20 chủng

xạ khuẩn hiếm thuộc chi Actinoplanes, chủng Actinoplanes hulinensis 1094 đã được báo

cáo có khả năng sinh acabose cao nhất với sản lượng 1,12 g/l Acarbose sau đó được tinh

sạch đạt hiệu suất 8,48%, độ tinh khiết 98% và đã được chứng minh có thể giảm đườnghuyết trên mô hình chuột tương tự Glucobay (Do Thi Tuyen et al, 2021)

Nguyễn Tiến Cường và cộng sự (2021) đã chọn lọc được chủng Bacillus subtilis YT

20 có khả năng sinh chất ức chế a-glucosidase Sau khi tối ưu hóa, dịch chiết ngoại bảo của

chủng này khả năng ức chế a-glucosidase tăng lên 91,5%, cao hơn 1,34 lần so với trước khitối ưu (68,1%) Sau khi tinh chế và phân tích khối phổ, chất ức chế được xác định là 1-

deoxynojirimycin.

Các nghiên cứu về khả năng ức chế XO và sinh uricase từ vi sinh vật

Can chiết ethyl acetate của 29 chủng vi khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn thuộc các

chi Bacillus, Micrococcus, Pseudovibrio, Pseudomonas và Ruegeria đã cho thay ty lệ ức

chế XO đạt 10,5-96,2% tại nồng độ 500 pg/ml (Phùng Thi Thùy Oanh và cs, 2020) Mườichủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ cây đước Rhizophora apiculata Blume ở Thừa ThiênHuế cũng cho thay hoạt tinh ức chế XO với giá trị ICso từ 54,57-94,36 ug/ml (Tôn Thất HữuĐạt & Phùng Thị Thùy Oanh, 2021).

Phạm Thanh Hà và cộng sự (2012) đã tiến hành đánh giá 50 chủng vi khuẩn phân lập

5

từ dat và đã tuyên chọn được chủng Pseudomonas putida CN3 có khả năng sản sinh uricase

với hoạt tính ngoại bảo ~ 0,85 U/ml và nội bảo ~ 0,45 U/ml trong môi trường dich thể chứa0,5% UA Ở thiết bị lên men 5 L, chủng vi khuẩn nay sinh uricase với hoạt độ 1,21 U/ml chỉ

sau 30 giờ (Phạm Thanh Hà và cs, 2013).

Các nghiên cứu về hoạt tinh ức chế ACE

Hiện tại chưa có các nghiên cứu đánh giá về hoạt tính ức chế ACE trên đối tượng là

vi sinh vật.

Trung tâm Nguôn gen Vi sinh vật Quốc gia (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ

sinh học hiện đang lưu giữ gần 10.000 nguồn gen vi sinh vật bản địa với nhiều tiềm năng

cho hướng nghiên cứu ứng dụng Hiện tại cơ sở dữ liệu của chủng giống tại VTCC đangđược quản lý bằng hệ thống phần mềm PACS (Pathogen Asset Control System) Bên cạnh

đó, một phần CSDL được liên kết và tự động cập nhật trên online catalogue của VTCC

(http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn) giúp các tổ chức/cá nhân có thể dé dàng tiếp cận được thôngtin về chủng giống Các nghiên cứu trước đây tại VTCC mới chỉ tập trung vào việc đánh giá

các đặc tinh probiotic của vi sinh vật; khả năng sinh các enzyme; hoạt tính kháng sinh củacác chủng vi sinh vật Nhiệm vụ này được triển khai sẽ giúp nâng cao giá trị các chủng visinh vật mà VTCC đang lưu giữ, làm nỗi bật đặc tính quý của chủng giống, các chủng sẽđược đưa lên online catalogue để các cơ quan nghiên cứu, các công ty, đơn vị khác có thểtiếp cận được dé dàng Qua đó thúc day hoạt động nghiên cứu và chuyền giao chủng giống,

tạo cơ hội đưa chủng giống có đặc tính quý tới các đơn vị nghiên cứu, các công ty có nhu

cầu nghiên cứu sâu hơn hướng tới việc sản xuất và thương mại hoá sản phẩm Điều đó vừagiúp don vị tăng cường tinh tự chủ thông qua các hoạt động chuyên giao và thương mại hoásản phẩm vừa đưa các chủng vi sinh vật bản địa quý vào phục vụ sức khoẻ cộng đồng

2 Mục tiêu

Mục tiêu chung:

- Sang lọc được một sé chủng vi sinh vat có hoạt tinh ức ché œ-amylase, œ-glucosidase,

angiotensin-converting enzyme (ACE), xanthine oxidase va có khả năng sinh uricase.

Muc tiéu cu thé:

- Xây dựng các quy trình đánh giá hoạt tính ức chế œ-amylase, œ-glucosidase, ACE,

xanthine oxidase; và sinh uricase từ vi sinh vật.

- Sang lọc 100 chủng vi khuẩn va xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Trung tam Nguồn gen

Vị sinh vật Quốc gia nhằm tìm ra các chủng có các hoạt tính sinh học nói trên

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu

3.1.1 Chúng giống

152 chủng vi sinh vật bao gồm 78 chủng xạ khuẩn, 12 chủng thuộc chi Bacillus va 62chủng LAB hiện đang lưu giữ ở -70°C tại VTCC Các thông tin chỉ tiết về nguồn gốc, phânloại được trình bày trong Phụ lục 1.

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường nuôi cấy được sử dụng gồm: Môi trường International Streptomyces

Project Medium 2 (ISP2), Luria Broth (LB); de Man, Rogosa and Sharpe (MRS); Nutrient

Broth (NB); Tryptic Soy Broth (TSB), Yeast Starch (YS) (g/l) được mua từ hang BD, Mỹ.

3.1.3 Hóa chất

- Các enzyme (a-amylase, a-glucosidase, angiotensin-converting enzyme, xanthine

oxidase), các chất chuẩn, hóa chất phản ứng khác như acarbose, acid hippuric, acid uric,allopurinol, xanthine, 4-nitrophenyl-B-D-glucopyranoside, 3,5-dinitrosalicylic acid,

hippuryl-L-histidyl-L-leucine được mua từ các hang Sigma, Merck, Fisher

- Hóa chat khác: đều đạt yêu cầu độ tinh khiết sử dung cho phân tích

3.1.4 Các máy móc, thiết bị và dụng cụ

- Máy đọc đĩa ELISA (Biotek, Mỹ), máy đo quang phổ (Beckman Coulter DU730, Mỹ), hệ

thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 (Agilent), cột Zorbax eclipse

XDB-C18; 4,6 x 250 mm và Zorbax SB-aq 883975-914; 4,6 x 150 mm và các máy móc thông thường của phòng thí nghiệm.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

Các chủng vi khuan/xa khuẩn được hoạt hóa từ -70°C trên đĩa môi trường thạch Sau

đó tiến hành nhân giống cấp 1 và 2 trên môi trường và điều kiện thích hợp trước khi tiễnhành thu dịch nuôi cấy dé đánh giá các hoạt tính

3.2.2 Xây dựng quy trình

3.2.2.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế a- amylase

* Định tính khả năng ức chế a-amylase trên đĩa thạch

30 pl acarbose trong dai nồng độ 0- 400 pg/ml được trộn với 30 pl ơ-amylase 2,5

U/ml, vortex nhẹ, sau đó ủ ở 37°C trong 10 phút 50 ul dung dich sau phản ứng được bom

vào lỗ trên đĩa thạch có chứa 0,5 % tinh bột tan và ủ ở 37°C qua đêm Bồ sung 2 ml dung

dịch Gram’s iodine vào đĩa thạch và rửa dưới nhẹ dưới vòi nước và quan sát kích thước

vòng sáng.

* Đánh giá khả năng ức chế a-amylase bằng phương pháp DNS

Hút 50 ul dung dịch acarbose vào ống eppendoft có chứa 50 pl ø-amylase và ủ hỗnhợp ở 37°C trong 10 phút Bồ sung tiếp 50 pl dung dich tinh bột tan 1% vào hỗn hợp và ủ ở

37°C trong 10 phút Sau đó b6 sung 100 wl dung dich DNS vào hỗn hợp và ủ 6 100°C trong

10 phút Cuối cùng bố sung thêm | ml nước Milli Q (MQ) và do mật độ quang (Optical

Density, OD) ở bước sóng 540 nm (Siddharth & Rai, 2019).

+ Chuan bị mẫu thử: Từ dung dịch acarbose gốc nồng độ 400 g/ml tiến hành phaloãng dé có được các nồng độ 200, 100, 50, 25, 12,5 và 6,25 pg/ml

+ Chuẩn bị mẫu đối chứng âm: mẫu có thành phần giống mẫu thử nhưng dung dịchacarbose được thay băng đệm sodium phosphate 0,1 M

Thực hiện phan ứng với dai nồng độ acarbose từ 6,25 đến 400 ug/ml với 4 nồng độ

ơ-amylase được khảo sát gồm 2,5; 5; 10 và 15 U/ml

7

Phan trăm ức chế a-amylase được xác định theo công thức:

a) Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế a-glucosidase

Trộn 50 pl đệm potassium phosphate 0,2 M (pH 6,8) với 20 pl dung dịch acarbose va

10 pl a-glucosidase, ủ ở 37°C trong 20 phút Bô sung thêm 20 ul co chat pNPG 1,5 mM va

ủ tiép ở 37°C trong 30 phút Thêm 50 pl NazCOs 0,1 M đê dừng phan ứng Do OD ở bước

sóng 405 nm (Chen et al, 2016).

+ Chuan bị mẫu thử: Từ dung dịch acarbose gốc nồng độ 40 mg/l tiến hành pha loãng

đê có được các nông độ 20, 10, 5, 2,5, 1,25 va 0,625 mg/ml.

+ Chuẩn bị mẫu đối chứng âm: mẫu có thành phần giống mẫu thử nhưng dung dịch

acarbose được thay băng đệm potassium phosphate 0,2 M.

Thực hiện phản ứng với dai nồng độ acarbose từ 0,625 đến 40 mg/ml với 4 nồng độa-glucosidase được khảo sát gôm 0,25; 0,5; 1,0 và 2 U/ml.

- Tính toán kết quả: phan trăm ức chế a-glucosidase được xác định theo công thức

(Siddharth & Rai, 2019):

A,—A

% ức chế = ——— x 100

Áo

Trong đó: Ao: độ hap thụ của mẫu đối chứng âm; A1: độ hấp thụ của mẫu thử

3.2.2.3 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ACE

a) Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ACE

Chuẩn bị mẫu chuẩn HA: từ dung dịch stock HA 100 mM pha ra các nồng độ 0,05; 0,1;

0,15; 0,2; 0,25; 0,5 và 1 mM băng nước MQ.

Chuẩn bị mẫu thử HA

100 ul ACE 10 mU/ml được bổ sung vào ống eppendorf có chứa 50 pl đệm borate

0,1 M (pH 8,3) và 100 ul dung dịch HHL 2,5 mM U hon hợp phan ứng ở 37°C trong 60

phút Sau đó dừng phan ứng bang cách ủ ở 85°C trong 10 phút Mau được loc qua mang lọc

0,22 um trước khi chạy HPLC.

Lua chọn điều kiên chạy HPLC dé phân tách HA

- Chuẩn bị mẫu: mẫu chuẩn HA với nồng độ 1 mM

- Điều kiện 1: Tốc độ dong 1 ml/phút; Thẻ tích tiêm: 10 yl; Nhiệt độ cột: 28°C + 0,5; Thờigian chạy: 18 phút; Thành phan pha động: acetonitrile 75% (v/v) trong nước có chứa 0,1%

acid triflouroacetic; Chương trình chạy: chỉ sử dụng một dung môi pha động trong quá trình

chạy mẫu.

- Điều kiện 2: Các điều kiện tương tự điều kiện 1 chỉ khác về thành phần pha động (acidphosphoric 10 mM và methanol tinh khiết); Chương trình chạy gradient

Thâm định quy trình phân tích định lượng HA bằng HPLC (theo hướng dẫn của ICH, 2005)

- Khảo sát tính tương thích hệ thống: thực hiện trên một mẫu chuẩn HA 0,1 mM và tiêm lặpdung dịch chuẩn 6 lần Yêu cầu số đĩa lý thuyết N> 1250 đĩa; % RSD (n = 6) của diện tích

- Độ chính xác trung gian: cùng mẫu HA chuẩn nồng độ 0,2 mM được định lượng 6 lầnbăng phương pháp HPLC nhưng thực hiện bởi 2 nghiên cứu viên vào 2 ngày khác nhau.Yêu cầu % RSD cho hàm lượng HA phải không quá 2,0%

b) Ung dụng quy trình dé đánh giá hoạt tính ức chế ACE của các chủng LAB

- Hoạt tính ức chế ACE sẽ được tính theo công thức (Li et al, 2017):

Cs

% ức chế = (1 — ==.) X 100

Trong đó:

Cc: Lượng HA tạo thành của mẫu đối chứng: Cm: Lượng HA tạo thành của mẫu môi

trường; Cs: Lượng HA tạo thành của mẫu dịch nuôi cây

3.2.2.4 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế xanthine oxidase

a) Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế XO

Chuẩn bị mẫu chuẩn UA: từ dung dịch stock UA 400 pg/ml pha ra các nồng độ 12,5, 25, 50,

100, 200 pg/ml.

Chuẩn bị mẫu thứ UA

100 ul XO (60 pU/ml) được bổ sung vào ống eppendorf có chứa 100 yl đệm

Tris-HCI IN pH 7,5, ủ ở 37°C trong thời gian 10 phút Sau đó, bổ sung vào hỗn hop phản ứng 50

ul oxonic acid potassium salt 1 mM, 50 ul xanthine 10 mM và ủ ở 37°C trong 10 phút Sau

đó dừng phản ứng bang cách bổ sung 100 pl HCl 1N Mẫu được lọc qua màng lọc 0,22 um

trước khi chạy HPLC (Sigma, 2022).

Lua chọn điều kiên chạy HPLC dé phân tách UA

- Chuan bị mẫu: mẫu chuan UA với nồng độ 100 pg/ml

- Điều kiện 1: Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Thẻ tích tiêm: 15 pl; Nhiệt độ cột: 30°C; Thời gian

chạy: 16 phút; Thành phần pha động: H20; Chương trình chạy: chỉ sử dụng một dung môi

pha động trong quá trình chạy mẫu.

- Điều kiện 2: Các điều kiện tương tự điều kiện 1 chỉ khác về thành phần pha động là

KH2POsz 0,02 M (pH 2);

Tham định quy trình phân tích định lượng UA bang HPLC

- Khảo sát tính tương thích hệ thống: tiến hành tiêm 15 ul mau UA chuẩn có nồng độ 50ug/ml và tiêm lặp 6 lần vào hệ thống sắc ký với các thông đã cài đặt ở trên Yêu cầu số đĩa

lý thuyết N > 1250 đĩa; % RSD (n = 6) của diện tích peak < 2,0 %

- Tính đặc hiệu: Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuan UA nồng độ 50 pg/ml và tiêm lặp dungdịch chuẩn 6 lần; Mẫu thử: chuẩn bị 6 mẫu thử; Mẫu trang: đệm KH2POs Các mẫu đượctiêm 15 ul vào hệ thống sắc ký với các thông số cài đặt ở trên

- Khoảng tuyến tính: chạy HPLC với các mẫu chuan UA ở 6 nồng độ 12,5, 25, 50, 100, 200

và 400 pg/ml Lấy kết quả trung bình từ 3 lần đo dé vẽ đồ thị khảo sát độ tương quan giữanồng độ UA và diện tích đỉnh của mẫu UA chuẩn tương ứng và tính hệ số tương quan trongkhoảng giá trị 0,99 < R? < 1 Từ phương trình đường chuẩn UA, xác định giá trị LOD va

LOQ.

- Độ đúng: chuẩn bị 9 mẫu có nồng độ UA lý thuyết là 50 ug/ml, thêm 10%, 20%, 30%lượng UA chuẩn vào mẫu, mỗi nồng độ 3 mẫu và xác định lại nồng độ của UA chuẩn cótrong mẫu bằng cách tiêm 15 ul các dung dịch này vào hệ thống sắc ký Yêu cầu % tỷ lệphục hồi phải trong khoảng 80% - 110%

- Độ chính xác trung gian: cùng mẫu UA chuẩn nồng độ 50 ug/ml được định lượng 6 lầnbởi 2 nghiên cứu viên vào 2 ngày khác nhau Yêu cầu độ lệch chuân tương đối cho hàm

lượng UA phải không quá 2,0%.

b) Ung dụng quy trình dé đánh giá hoạt tinh ức chế XO của các ching vi khuẩn và xạ khuẩn

- Hoạt tính ức chế UA sẽ được tính theo công thức:

Cs Cc—Œm

% ức chế = (1 — X 100

Trong đó:

Cc: Lượng UA tạo thành của mẫu đối chứng: Cm: Lượng UA tạo thành của mẫu môi

trường; Cs: Lượng UA tạo thành của mẫu dịch nuôi cây

3.2.2.5 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt độ uricase từ dịch nuôi cấy các chủng vi sinh vật

a) Xây dựng quy trình đánh giá hoạt độ uricase

* Định tính khả năng sinh uricase trên đĩa thạch

Chung vi khuân hoặc xạ khuẩn được cấy trên môi trường NA (nhóm Bacillus), MRS

(nhóm LAB) và ISP2 (đôi với xa khuân) Nông độ UA bô sung vào môi trường đê cảm ứng

việc sinh uricase được khảo sat là 0,1; 0,3 và 0,5% Do kích thước vòng phân giải UA trên đĩa thạch đê đánh giá khả năng sinh uricase của các chủng kiêm tra (Yasiri et al, 2020).

* Đánh giá hoạt độ uricase từ dịch nuôi cấy các chung vi sinh vật

10

- Thành phan và điều kiện phản ứng: hút 20 wl mẫu dich nuôi cấy đã loại bỏ tế bào cho vào

ống eppendorf chứa 40 pl UA 1 mM và 940 ul đệm sodium borate 0,1 M (pH 8,5) DoOD2øsnm ngay sau khi trộn hỗn hợp phản ứng Sau đó tiếp tục ủ mẫu trước khi do OD lần 2sau khoảng thời gian phản ứng (Bisswanger et al, 2011) Môi trường nuôi cay (NB, MRS,

ISP2) được sử dụng làm đối chứng âm

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (25°C, 28°C và 37°C) và thời gian ủ hỗn hợp phản ứng(5, 10 và 20 phút) đến hoạt độ uricase trong dịch nuôi cay của một số chủng vi sinh vật đại

diện.

- Tính toán kết quả: hoạt độ uricase được xác định theo công thức (Pustake et al, 2019):

Hoạt độ uricase (U/ml) = [A295(¢0) ~ 4295(tx)] x 1,0 x Df

12,6 x 10 x 0,02

Trong đó:

A295: Độ hấp thụ của UA tại bước sóng 295 nm

t0, tx: mốc thời gian của các lần đo (phút)

1,0: tong thé tích phản ứng (ml); Df: hệ số pha loãng của mẫu12,6: hệ số hấp thụ mol của UA tại 295 nm

10: thời gian phản ứng (phút); 0,02: thé tích mau phản ứng (ml)

3.2.3 Xử lý số liệu

Các thí nghiệm nuôi cấy dé lay mẫu dịch nuôi nhằm đánh giá các hoạt tính được tiếnhành 3 lần độc lập nhau Các kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng giá trị Trungbình (mean) + độ lệch chuẩn (SD) Phan mềm GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Software,

Inc., San Diego, CA, USA) được sử dung dé xác định ICso va dựng đường ức chế của chất

chuẩn

4 Tổng kết kết quả nghiên cứu

4.1 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế ơ-amylase4.1.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế a-amylase

Kết quả khảo sát về nồng độ enzyme a-amylase sử dụng trong phản ứng cho thấy khinồng độ enzyme tăng khả năng ức chế enzyme của acarbose giảm do đó giá trị ICso củaacarbose tăng (Bảng 3.1 và Bảng 3.2, Phụ lục 2) Mức độ tương quan giữa nồng độ acarbose

và phan trăm ức chế mạnh (R7? = 0,97-0,98) Giá trị ICso của acarbose thấp nhất (25,07

ug/ml) đạt được khi sử dụng nồng độ enzyme là 2,5 U/ml Do vậy, nồng độ a-amylase 2,5

U/ml được lựa chon dé thực hiện phan ứng Hình 3.1 là đường ức chế ơ-amylase 2,5 U/mlcủa acarbose ở các nồng độ khác nhau (Phụ lục 2)

Sau khi lựa chọn được nồng độ ơ-amylase thích hợp để phản ứng là 2,5 U/ml, dải

nông độ arcabose từ 0- 400 pg/ml được thử nghiệm dé đánh giá khả năng ức chế a-amylase

trên đĩa thạch Kết quả cho thấy, khi nồng độ acarbose tăng lên, kích thước vòng phân giảicủa d-amylase cũng giảm dần (Hình 3.2, Phụ lục 2) Tuy nhiên, sự tương quan giữa đườngkính vòng phân giải và nồng độ acarbose không cao do đó khó so sánh mức độ ức chế a-

amylase giữa các mẫu dịch nuôi khác nhau nên phương pháp này được sử dụng như bước

11

sàng lọc đầu tiên trong quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế a-amylase, trước khi có bướcđịnh lượng bằng DNS.

4.1.2 Quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế a-amylase từ dịch nuôi cấy của các chủng vi

sinh vật

Sau khi khảo sát và thử nghiệm, quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế ø-amylase từdịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật (cu thể nhóm xạ khuẩn và vi khuẩn) đã được xâydựng (Hình 3.3, Phụ lục 2) Quy trình được xây dựng có khả năng lặp lại (Bảng 3.3, Phụ lục

2).

4.1.3 Kết qua sàng lọc các chúng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế a-amylase

Sử dụng quy trình đã được xây dựng, 139 chủng vi sinh vật bao gồm xạ khuẩn và vikhuẩn đã được sàng lọc Kết quả sàng lọc trên đĩa thạch cho thấy, chỉ có 9/78 chủng xạkhuẩn thể hiện hoạt tính ức chế a-amylase, trong khi 61 chủng vi khuẩn không thê hiện hoạttính này Ảnh minh họa việc sảng lọc hoạt tính ức chế a-amylase của một sỐ chủng xạkhuẩn trên đĩa thạch có chứa tinh bột (Hình 3.4, Phụ lục 2) Khi đánh giá hoạt tính của 9chủng bằng phương pháp DNS, kết quả cho thấy 6/9 chủng có hoạt tính ức chế ơ-amylasemạnh trên 70% gồm các chủng Phytohabitans rumicis VTCC 41750, Streptomyces sp

VTCC 42000, S malaysiense VTCC 42003, Nonomuraea ceibae VTCC 42129, S ferralitis

VTCC 44088, S tendae VTCC 44380 (Bang 3.4, Phu luc 2).

Won và cộng sự (2021) khi tiến hành sàng loc 235 chung probiotic về các hoạt tínhchống tiểu đường và chống oxi hóa từ dịch nuôi cay và đã lựa chọn được 4 chủng LAB bao

gồm Lactiplantibacillus plantarum MG4229, MG4296, MG5025 va Lacticaseibacillusparacasei MG5012 có tỷ lệ ức chế a-amylase trên 85% Trước đó, Kim va cộng sự (2018)

cũng đã chứng minh chủng Lactiplantibacillus plantarum K10 phân lập từ kim chi có hoạt

tính ức chế a-amylase lên tới 94,6% Gần đây, Nguyen va cộng sự (2022) cũng đã đánh giá

hoạt tính ức chế a-amylase của 100 chủng vi khuẩn Kết quả cho thay có dịch nuôi cấy sau 4ngày của 7 chủng vi khuan có hoạt tinh ức chế enzyme này trong khoảng từ 47-89% Trong

đó, ba chủng là Bacillus cereus RB.DS.05, Pseudomonas aeruginosa TUNO3 và B.

atrophaeus H10 hoạt tinh ức chế enzyme dat cao nhất là 89% Nghiên cứu sâu hon, nhómtác giả đã nuôi cây chủng Pseudomonas aeruginosa TUN03 trong bình lên men 14 I và chất

ức chế enzyme được tạo thành với sản lượng cao 4200 U/ml chỉ trong 12 h Sau khi táchchiết và tinh sạch bằng HPLC, hợp chất đích chính có tên là hemi-pyocyanin (HPC) có khả

năng ức chế ơ-amylase tương tự acarbose đã được xác định bằng phương pháp khối phố và

cộng hưởng từ hạt nhân.

4.2 Xây dựng quy trình va sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế

ơ-ølucosidase

4.2.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế a-glucosidase

Kết quả khảo sát khả năng ức chế của acarbose khi sử dụng a-glucosidase ở các nồng

độ 1, 2 và 4 U/ml được trình bay ở Bảng 3.5 (Phụ lục 2) Khi nồng độ a-glucosidase tăng,

khả năng ức chế của acarbose giảm dẫn đến giá trị ICso của acarbose tăng Mức độ tương

quan giữa nồng độ acarbose và phan trăm ức chế mạnh (R? = 0,98-0,99) Giá trị ICso của

12

acarbose thấp nhất (3,92 mg/ml) đạt được khi sử dụng nồng độ enzyme là 1 U/ml (Bảng 3.6,Phụ lục 2) Hình 3.5 là đường cong ức chế a-glucosidase 1 U/ml của acarbose ở các nồng độ

2).

4.2.3 Kết qua sàng lọc các ching vi sinh vật có hoạt tinh ức chế a-glucosidase

Sử dụng quy trình được xây dựng, hoạt tính ức chế a-glucosidase của 139 chủng xakhuẩn và vi khuẩn đã được đánh giá Kết quả thu được cho thấy, 30/78 chủng xạ khuân cóhoạt tính ức chế a-glucosidase (Bảng 3.8, Phụ lục 2) Trong số 30 chủng, 6 chủng thé hiệnhoạt tinh ức chế a-glucosidase mạnh (>70%) gồm các chủng Phytohabitans rumicis VTCC

41750, Micromonospora fluostatini VTCC 42120, S sundarbansensis VTCC 44073, S cavourensis VTCC 44074, Micromonospora provocatoris VTCC 44094 và S showdoensis

VTCC 44395 Có 11/61 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus va LAB trình bày ở bảng 3.9,phụ lục 2 thể hiện hoạt tính ức chế ơ-glucosidase Trong đó 3 chủng là B licheniformis

VTCC 10378, B velezensis VTCC 11254 và B stercoris VTCC 11309 thé hiện hoạt tính ức

chế a-glucosidase trên 70% Đối với nhóm LAB, hau hết các chủng không có hoạt tính nàyhoặc có hoạt tính rất yêu (cao nhất đạt 6,03% đối với chung FE faecalis 6.16)

Từ 55 chủng xạ khuẩn phân lập từ biển Đỏ, Abdulkhair và cộng sự (2018) đã lựachọn được 7 chủng có hoạt tính ức chế ơ-glucosidase, trong đó chủng S coelicolor AD-7 cóhoạt tính ức chế enzyme cao hon các chủng còn lại nhưng chi đạt 4,2% Kumar & Rao

(2018) cũng đã lựa chọn được 3/47 chủng xạ khuẩn biển (SRBVITI, SRBVIT2 vàSRBVIT3) có hoạt tính ức chế a-glucosidase cao nhat nam trong khoang 82,34-94,61%

Won va cộng sự (2021) đã lựa chọn được 4/235 chung LAB bao gồm Lactiplantibacillus

plantarum MG4229, MG4296, MG5025 và Lacticaseibacillus paracasei MG5012 có tiềmnăng ức chế a-glucosidase đạt trên 75% Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Trung và cộng sự(2022) đã kiểm tra hoạt tính ức chế a-glucosidase của dịch nuôi cấy 6 chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp nội sinh ở cây cam Cao Phong, Hòa Bình đã lựa chọn được chủng

Streptomyces sp HBC6~2 có tỷ lệ ức chế enzyme cao nhất đạt 68,98%

4.3 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tính ức chế ACE

4.3.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ACE

Kết quả lựa chọn điều kiện chạy HPLC dé phan tach co chất HHL va san pham HA

cho thấy, khi chạy HPLC ở điều kiện 2 khả năng phân tách rõ mẫu HA va HHL trong hỗnhợp phan ứng Mẫu HA và HHL cho peak có thời gian lưu là 9,346 và 11,178 phút; số đĩa lý

thuyết là 90266 và 87740, tương ứng (Hình 3.7, Hình 3.8 và Bảng 3.10, Phụ lục 2)

Kết quả thâm định quy trình chạy HPLC dé định lượng HA cho thấy:

13

- Tính tương thích hệ thống: % RSD của thời gian lưu, điện tích đỉnh và số đĩa lý thuyết lần

lượt là 0,04%, 0,44% và 0,54% (<2,0 %) Số đĩa lý thuyết trung bình là 83848 ( > 1250 đĩa).Phương pháp đạt về tính tương thích hệ thống (Bảng 3.11, Phu lục 2)

- Tính đặc hiệu: Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử có peak HA tách hoàn toàn các peakkhác với thời gian lưu tương ứng là 9,310 và 9,320 Mẫu trăng không có peak ở vị trí này

Phương pháp đạt về tính đặc hiệu (Bảng 3.12, Hình 3.9, Phụ lục 2)

- Khoảng tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ HA trong khoảng nồng

độ từ 0,05 mM đến | mM và diện tích đỉnh có dạng y = 4374,3x + 6,2665 với Rˆ = 0,9999(Hình 3.10, Phụ lục 2) Như vậy, trong khoảng nồng độ HA từ 0,05 đến 1 mM có thé sửdụng phương trình đường chuẩn dé xác định nồng độ HA trong mau phản ứng Từ phương

trình đường chuẩn ở trên, giới hạn phát hiện và định lượng HA của quy trình tương ứng là

0,0019 và 0,0057 mM.

- Độ đúng: Kết quả cho thấy khi định lượng HA có ty lệ phục hồi từ 99,74-100,32% với %

RSD bằng 0,3% (<2%) Như vậy quy trình định lượng đạt về độ đúng (Bảng 3.14, Phụ lục

2).

- Độ chính xác trung gian: Giá trị nồng độ HA định lượng được giữa 2 nghiên cứu viên vào

2 thời điểm khác nhau cho kết quả tương đồng, cùng với giá trị % RSD dưới 2% cho thấyquy trình định lượng HA đảm bảo yêu cầu về độ chính xác (Bảng 3.15, Phụ lục 2)

4.3.2 Quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ACE từ dịch nuôi cấy của các chủng LAB

Sau khi khảo sát và thử nghiệm, quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ACE từ dịchnuôi cây của các chủng vi sinh vật (cụ thé là nhóm LAB) bằng phương pháp HPLC đã được

xây dựng (Hình 3.11, Phụ lục 2).

4.3.3 Kết qua sàng lọc các chủng LAB có hoạt tính ức ché ACE

Sử dụng quy trình đã được xây dựng, chúng tôi đã tiến hành đánh giá hoạt tính ức

chế ACE của 62 chủng LAB khi nuôi cấy trên môi trường skim milk 10% Kết quả cho thay17/62 chủng được kiểm tra có hoạt tính ACE Trong số đó, 06 chủng có hoạt tính ức chếACE mạnh (>70%) bao gồm E faecalis 8.17, 8.18, 8.24, 8.27 (100%); L rhamnosus SM3.4 va VTCC 12819 cho thấy hoạt tinh ức chế ACE mạnh (77,22% và 78,54%, tương ứng)(Bảng 3.16, Phụ lục 2) Hình 3.13 (Phụ lục 2) là sắc kí đồ minh họa của HA tạo thành ở cácmẫu dịch nuôi cấy khác nhau

Khi đánh giá hoạt tính ức chế ACE của sữa lên men bởi 13 chủng LAB thuộc cácloài L acidophilus, L helveticus va Lactococcus lactis với sự có mặt/không có mặt củaStreptococcus thermophilus cho thấy hoạt tinh ức chế ACE chỉ dưới 60% (Nielsen et al,2009) Hoat tinh tre ché ACE dao động từ 0-72% thu được khi lên men sữa bởi 25 chủng

LAB thuộc các loài Lactobacillus acidophilus, L casei, L helveticus, L jensenii, L reuteri,

L rhamnosus, L lactis sub lactis, L raffinolactis va Leuconostoc mesenteroides Cac hopchất có hoạt tinh ức chế ACE được xác định là các peptide từ B-casein (Pihlanto et al,2010) Chen và cộng sự (2014) đã đánh giá hoạt tinh ức chế ACE của 259 chủngLactobacillus helveticus phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống của Trung Quốc vàMông Cổ và đã chon được 37 chủng có hoạt tính ức chế ACE trên 50% Sữa lên men bởi

14

chủng H9 (IMAU60208) có hoạt tinh ức chế ACE in vitro cao nhất (86,4 + 1,5%) và thời

gian lên men tương đối ngắn (7,5 gid) Tương tự, Li và cộng sự (2017) da tién hanh sang

lọc hoạt tinh ức chế ACE từ 41 chung Lactobacillus casei có nguồn géc từ thực phẩm Kết quả cho thấy 22 chủng có hoạt tính ức chế ACE trên 60%, trong số đó có 2 chủngIMAU10408 và IMAU20411 có khả năng lên men sữa với hoạt tính ức chế ACE đạt 73,50

+ 1,45% và 69,79 + 0,62%, tương ứng.

4.4 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tính ức chế XO

4.4.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính ức chế XO

Kết quả lựa chọn điều kiện chạy HPLC dé phan tach co chat xanthine va san pham UAcho thấy, khi chạy HPLC ở điều kiện 2 kha năng phân tách rõ xanthine va UA trong hỗnhợp phản ứng Mẫu UA và xanthine cho peak có thời gian lưu là 6,556 và 10,360 phút; sốđĩa lý thuyết là 10280 và 2645, tương ứng (Hình 3.14, Hình 3.15 và Bảng 3.17, Phụ lục 2)

Kết quả thâm định quy trình chạy HPLC dé định lượng HA cho thấy:

- Tính tương thích hệ thống: Phan trăm độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và điệntích đỉnh đều đưới 2%, lần lượt là 0,25% và 0,53%) Số đĩa lý thuyết trung bình là 8073 (>

1250 đĩa) Các kết quả cho thấy quy trình này đã đạt yêu cầu về tính tương thích hệ thống(Bảng 3.18, Phụ lục 2).

- Tính đặc hiệu: Kết quả cho thấy, sắc ký đồ giữa mẫu thử và mẫu chuẩn cho peak sắc kýtương ứng với thời gian lưu (Bảng 3.19, Phụ lục 2) Trên sắc ký đồ cho thấy mẫu trắngkhông hiện peak tương ứng với peak của UA (Hình 3.16 A, Phụ lục 2) Mẫu UA chuẩn vàmẫu thử đều xuất hiện peak UA với thời gian lưu tương ứng là 6,646 và 6,640 phút (Hình3.16 B, C, Phụ lục 2) Do đó có thê kết luận quy trình đạt yêu cầu về tính đặc hiệu

- Khoảng tuyến tinh: Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = 32,201x + 94,573 với R?

= 0,9992 R? năm trong khoảng giới hạn 0,99 < R? < 1 cho thấy độ tương quan tuyến tínhcao giữa nồng độ UA và diện tích đỉnh trong khoảng nồng độ dưới 400 ug/ml Từ phươngtrình đường chuẩn UA, LOD và LOQ của quy trình tương ứng là 14,48 ug/ml và 43,87

ug/ml (Bảng 3.20, Hình 3.17, Phu luc 2).

- Độ đúng: Phần trăm RSD trong tất cả các lần thử đều đưới 2% và tỉ lệ hồi phục trung bìnhcủa quy trình đạt 96,42% nằm trong giới hạn cho phép 80% - 110% nên phương pháp nàyđạt yêu cầu về độ đúng (Bảng 3.21, Phụ lục 2)

- Độ chính xác trung gian: Giá tri nồng độ UA định lượng được giữa 2 nghiên cứu viên vào

2 thời điểm khác nhau cho kết quả tương đồng, cùng với giá trị % RSD dưới 2% cho thấyquy trình định lượng UA đảm bảo yêu cầu về độ chính xác (Bảng 3.22, Phụ lục 2)

4.4.2 Quy trình đánh giá hoạt tinh ức chế XO từ dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật

Sau khi khảo sát, đánh giá và thử nghiệm, quy trình đánh giá hoạt tính ức chế XO từ

dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng (Hình

3.18, Phụ lục 2).

4.4.3 Sang lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế XO

15

Sử dụng quy trình đã được xây dựng, hoạt tính ức chế XO của 139 chủng vi sinh vật

đã được đánh giá Kết quả thu được cho thấy, chỉ có 10/78 chủng xạ khuẩn có hoạt tính ứcchế XO với tỷ lệ ức chế dao động từ 0,25-45,98% Trong đó chủng S showdoensis VTCC

44395 cho thấy hoạt tính XOI đạt cao nhất là 45,98% (Bảng 3.23, Phụ lục 2)

Đối với nhóm vi khuẩn, kết quả cho thấy chỉ có 4/12 các chủng vi khuẩn thuộc chỉ

Bacillus có hoạt tính XOI yếu, dao động 0,51-2% Đối với nhóm LAB, 31/49 chủng cho

thấy có hoạt tính XOI dao động từ 0,56-37,59% Chung L gasseri VTCC 12867 và S

salivarius VTCC 12868 có hoạt tính XOI cao nhất, tương ứng đạt 37,59 và 37,05%, tiếp

theo đó là các chung Streptococcus gallolyticus subsp pasteurianus 8.20 (27,19%), L gasseri VTCC 12791 và VTCC 12792 (24,30% và 23,55%) (Bang 3.24, Phu lục 2) Hình

3.19 (Phụ lục 2) là sắc kí đồ minh họa UA tạo thành ở các mẫu khác nhau

Chen và cộng sự (2016) đã đánh giá hoạt tính ức chế XO bằng phương pháp quang

phô của 34 chủng LAB phân lập từ các nguồn khác nhau thu được hai chủng I21 và F73 cóhoạt tinh ức chế XO cao nhất đạt trên 40% Bằng phương pháp HPLC, chủng I21(Lactobacillus rhamnosus) có hoạt tính ức chế XO cao hơn F73, đạt cực đại chỉ sau 2 ngàylên men (27,39%) Bên cạnh đó, Chen và cộng sự (2018) đã công bố 7 chủng vi khuẩn thuộcchi Acetobacter và Gluconobacter có khả năng ức chế XO trên 30% Đặc biệt Acetobacterpasteurianus AHUOI cho thay khả năng ức chế XO lên tới 73,6% Ở xạ khuẩn, chỉ có duynhất một công bố về hợp chất 5-formyl uracil có khả năng ức chế mạnh XO được tách chiết

từ môi trường nuôi cây Streptomyces sp (Batchu et al, 2018)

Tại Việt Nam, Phùng Thị Thùy Oanh và cộng sự (2020) đã đánh giá hoạt tính ức chế

XO từ 129 mẫu cặn chiết ethyl aceate của dịch nuôi cấy các chủng vi sinh vật phân lập từrừng ngập mặn Quảng Trị và thu được 26 chủng có hoạt tính ức chế XO với tỷ lệ đạt 10,5 +2,4% - 96,2 + 5,6% tại nồng độ thử nghiệm 500 pg/ml

4.5 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chủng vỉ sinh vật có hoạt tính sinh uricase

4.5.1 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính sinh uricase

Nhằm sang lọc nhanh các chủng có khả năng sinh uricase trên đĩa thạch, UA được bổsung vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ khác nhau 0,1-0,5% Kết quả cho thấy việc bổsung UA với nồng độ 0,1% cho vòng phân giải rõ hơn (Hình 3.20, Phụ lục 2) Do vậy, nồng

độ 0,1% UA được lựa chọn dé bổ sung vào môi trường nuôi cây trong quá trình sàng lọc

Kết quả khảo sát nhằm lựa chọn nhiệt độ, thời gian ủ thích hợp cho phản ứng giữa

uricase trong dịch nuôi cấy với UA cho thấy nhiệt độ và thời gian thích hợp là 28°C và 10

phút (Bảng 3.25, Bảng 3.26, Phụ lục 2).

4.5.2 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt độ uricase

Sau khi khảo sát và thử nghiệm, quy trình đánh gia hoạt tính sinh uricase từ dịch nuôi

cấy của các chủng vi sinh vật dựa trên việc sàng lọc định tính trên đĩa thạch và xác địnhhoạt độ uricase được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 295 nm đã

được xây dựng (Hình 3.21, Phụ lục 2) Quy trình được xây dựng có khả năng lặp lại (Bảng 3.27, Phụ lục 2).

16

4.5.3 Sang lọc các chúng vi sinh vật có hoạt tính sinh uricase

Sử dụng quy trình đã xây dựng, khả năng sinh uricase của 139 chủng vi sinh vật đã

được đánh giá Kết quả sảng lọc định tính ban đầu cho thấy chỉ có 18/78 chủng xạ khuẩn,

12/12 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có vòng phân giải UA trên đĩa thạch Không cóchủng LAB nào cho thấy có vòng phân giải UA (Bảng 3.28, Bảng 3.29, Phụ lục 2) Hình

3.22 (Phu lục 2) là ảnh minh họa khả năng sinh uricase trên đĩa thạch có chứa UA của một

sỐ chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đại diện Kết quả xác định hoạt độ uricase của dịch nuôi caycho thấy, 4 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus là VTCC 10378, VTCC 10755, VTCC

910118, VTCC 10965 sinh uricase đạt trên 0,4 U/ml sau 48 h nuôi cấy trong môi trường NB(Bảng 3.30, Phụ lục 2) Hai chủng xạ khuẩn thuộc chỉ Streptomyces là VTCC 41942, VTCC

44090 sinh uricase với hoạt độ cao hơn 0,5 U/ml sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường ISP2

(Bảng 3.31, Phụ lục 2).

Jagadeesan và cộng sự (2019) đã phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn có khảnăng sinh các enzyme trong đó có uricase từ mẫu đất rừng ngập mặn tại Tamilnadu, Ấn Độ

và đã tuyển chọn được chủng P aeruginosa AROI với hoạt độ uricase cực đại dat 12,53

IU/ml khi nuôi cay trong môi trường MM-ASP Khả năng sinh uricase của chủng Bacillussubtilis SP6 cũng được Pustake và cộng sự (2019) nghiên cứu Ở điều kiện nuôi cấy tối ưu,sản lượng uricase tăng từ 1,2 U/ml lên 15,87 U/ml Handayani và cộng sự (2018) đã sang

lọc kha năng sinh uricase từ 13 chung probiotic thuộc nhóm LAB và lựa chọn được 3 chủng

Lactobacillus sp OL-5, L plantarum Mut-7 va L plantarum Dad-13 có hoạt tính uricase

nội bao cao và van duy trì được hoạt tính trong điều kiện mô phỏng dich da dày và tá trang

Pugin và cộng sự (2022) đã tối ưu phương pháp quang phô dé sàng lọc 319 chủng probioticthuộc danh sách đủ điều kiện an toàn (Qualified Presumption of Safety, QPS) của EFSA

sinh uricase từ dịch nuôi cấy (không cần loại bỏ tế bào) Tuy nhiên, nhóm tác giả không tìm

thấy chủng nào có hoạt tính uricase

Ở Việt Nam, Phạm Thanh Hà và cộng sự (2012) đã tiễn hành sảng lọc khả năng sinh

uricase trên đĩa thạch của 50 chủng vi khuẩn phân lập từ đất Chủng Pseudomonas putidaCN3 cho thay kha năng san sinh uricase ngoại bào và nội bào 0,85 U/ml và 0,45 U/ml trongmôi trường dich thé chứa 0,5% UA Kết quả cho thay chủng này có hoạt tính uricase ngoại

bao và ngoại bào tương ứng là 0,85 U/ml và 0,45 U/ml Ở thiết bị lên men 5 L, chủng vikhuẩn này sinh uricase với hoạt độ 1,21 U/ml sau 30 giờ (Pham Thanh Hà va cộng sự,

2013).

4.6 Cập nhật cơ sở dữ liệu của một số chủng vi sinh vật tiềm năng trên phần mềm

quản lý chủng giống va online catalogue

Sau khi sàng loc các đặc tính sinh học bao gồm kha năng ức chế các enzyme amylase, a-glucosidase, ACE va XO cũng như khả năng sinh uricase của các chủng xạ khuẩn

a-và vi khuẩn, chúng tôi lựa chọn được 18 chủng để cập nhật a-vào phần mềm PACS a-và đưa lên

online catalogue của VTCC tại dia chỉ http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn (Bang 3.32, Phụ lục 2).

Hồ sơ chủng giống được trình bày ở Phụ lục 3

17

5 Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

Đề tài đã hoàn thành các nội dung như đã đăng ký với một số các kết quả chính như

sau:

- Đã xây dựng được 05 quy trình đánh giá hoạt tính ức chế ơ-amylase, a-glucosidase,angiotensin-converting enzyme, xanthine oxidase và sinh uricase từ dịch nuôi cấy của 152chủng vi khuẩn và xạ khuẩn Quy trình phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, có khảnăng lặp lại.

- Đã lựa chon va cập nhật cơ sở dir liệu lên trang online catalog của VTCC tại địa chỉ

http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn của 18 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có các đặc tinh sinh học nhưkhả năng ức chê một sô enzyme cao như a-amylase, o-glucosidase, angiotensin-converting

enzyme, xanthine oxidase hoặc khả năng sinh uricase với hoạt độ cao.

- Đã công bố được 01 bài báo trên tạp chí trong nước, đào tạo 01 học viên cao học theohướng của đề tài và có 01 đơn đăng kí sáng chế được chấp nhận đơn hợp lệ

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tóm tắt tiếng Việt

Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên và các dẫn xuất của chúng là nguồn quan trọngnhất cho việc phát triển các loại thuốc mới Chúng da dang về cau trúc, thành phần hóa học

và có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống trong đó có chăm sóc và bảo vệ sức

khỏe Vào đầu những năm 1900, khoảng 80% các loại thuốc có trên thị trường được táchchiết từ thực vật Khi Alexander Fleming phát hiện ra penicillin từ Penicillium notatum vào

năm 1928 đã đánh dau một bước chuyên đổi đáng kể nguồn khai thác các chất có hoạt tínhsinh hoc từ thực vật sang vi sinh vật Các bệnh không lây nhiễm như tim mạch, tiểu đường,ung thư, hô hấp mãn tính và các bệnh khác là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế

gidi Dé cải thiện sức khỏe cộng đồng, việc tìm kiếm các hợp chất sinh học mới, quan trọng

trong phòng ngừa và điều trị luôn là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu và cácsản phẩm tự nhiên, đặc biệt các sản phẩm từ vi sinh vật như chất chống ung thư, kháng sinh,chất ức chế enzyme, chống viêm được xem là giải pháp chính trong các phương phápđiều trị y tế

Trong đề tài này, chúng tôi đã xây dựng được 05 quy trình đánh giá hoạt tính ức chế

a-amylase, o-glucosidase, angiotensin-converting enzyme, xanthine oxidase và sinh uricase

từ dich nuôi cây của 152 chủng vi khuẩn va xa khuẩn có trong bộ sưu tập chủng giống đang

được lưu giữ tại Trung tâm Nguồn gen VI sinh vật Quốc gia (VTCC) thuộc Viện Vi sinh vật

và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN Sau quá trình sàng lọc và đánh giá, 18 chủng vi khuẩn

và xạ khuẩn có các hoạt tính nói trên đã được cập nhật cơ sở dữ liệu lên trang online catalogcủa VTCC, IMBT tại địa chỉ http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn để các cơ quan nghiên cứu, cáccông ty, đơn vị khác có thê tiếp cận được Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần thúcđây hoạt động nghiên cứu và chia sẻ chủng giống, tạo cơ hội đưa chủng giống có đặc tính

quý tới các đơn vị nghiên cứu, các công ty có nhu cầu nghiên cứu sâu hơn hướng tới việc

sản xuất và thương mại hoá sản phẩm

Tóm tắt tiếng Anh

18

Natural products and their derivatives are essential for developing new drugs They are diverse in structure and chemical compositions and can be applied in many areas of life,

including health care and protection In the early 1900s, about 80% of the drugs on the

market were extracted from plants In 1928, Alexander Fleming discovered penicillin from Penicillium chrysogenum (former P notatum), which significantly changed the source of biologically active substances from plants to microorganisms Non-communicable diseases (NCDs) such as cardiovascular disease, diabetes, cancer, chronic respiratory disease, and others are the leading causes of death in the world To improve public health, exploitation of new, critical biological compounds in NCD prevention and treatment is always the top concern of researchers, and natural products, especially natural products from microorganisms such as anti-cancer agents, antibiotics, enzyme inhibitors, anti- inflammatory agents are considered the leading solution in medical treatments.

In this project, we have developed five procedures to evaluate the inhibitory activity

of a-amylase, œ-øglucosidase, angiotensin-converting enzyme, xanthine oxidase, and uricase production from the culture medium of 152 strains of bacteria and actinomycetes that belongs to culture collection of Vietnam Type Culture Collection (VTCC), Institute of

Microbiology and Biotechnology, VNU Hanoi After the screening and evaluation, 18

strains of bacteria and actinomycetes with the above activities have been updated in the database on the online catalog of VTCC and IMBT at http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn so that research institutes, companies, and others can access it The project's research results will contribute to promoting research and sharing of strains, creating opportunities to bring

strains with valuable characteristics to research institutes and companies that need more

in-depth research in the direction of research to the production and commercialization of

products.

Tài liêu tham khảo

Abdulkhar WM, Abdel-All WS, Bahy RH (2018) Genetic improvement of antidiabetic

alpha-glucosidase inhibitor producing streptomyces sp Int J Pharm Pharm Sci, 10 (5): 77-84.

Ahmad H, Khan H, Haque S, Ahmad S, Srivastava N, Khan A (2023) Angiotensin-converting

enzyme and hypertension: a systemic analysis of various ACE inhibitors, their side effects, and bioactive peptides as a putative therapy for hypertension J Renin Angiotensin

Aldosterone Syst, 2023: 7890188.

Batchu UR, Surapaneni JR (2018) Exploration of microorganisms as a potential source of xanthine

oxidase inhibitors: an updated review Int J Pharm Sci, 10 (12): 1+.

Belovic MM, Ilic N, Horecki AT, Sumic Z (2013) Selection of conditions for

angiotensin-converting enzyme inhibition assay: influence of sample preparation and buffer Food Feed Res, 40: 11-16.

Bisswanger H (2011) Practical enzymology John Wiley & Sons, 359 pp

Brouwers S, Sudano I, Kokubo Y, Sulalca EM (2021) Arterial hypertension Lancet, 398: 249-261.

Chen Z, Hao J, Wang L, Wang Y, Kong F, Zhu W (2016) New a-glucosidase inhibitors from

marine algae-derived Streptomyces sp OUCMDZ-3434 Sci Rep, 29 (6): 20004.

19

Chen SJ, Chen YL, Hsu HY, Wann SY (2016) Novel strains of Lactobacillus rhamnosus and its

metabolites for use in inhibiting xanthine oxidase and treating gout US2016/0051602AD.

Chen SJ, Chen YL, Hsu HY, Wann SY (2018a) Novel acetobacter and gluconobacter strains and

their metabolites for use in inhibiting xanthine oxidase US2016/0051596A1Ghavami A,

Ziaei R, Moradi S, Sharifi S, Reza Moravejolahkami A, Ghaffari S, Irandoost P, Khorvash F, Mokariyamchi, A, Nattagh-Eshtivani E (2020) Potential of favorable effects of probiotics

fermented milk supplementation on blood pressure: A systematic review and meta-analysis.

Int J Food Prop, 23: 1925-1940.

Chen Y, Liu W, Xue J, Yang J, Chen X, Shao Y, Kwok LY, Bilige M, Mang L, Zhang H (2014)

Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of Lactobacillus helveticus strains from

traditional fermented dairy foods and antihypertensive effect of fermented milk of strain H9 J Dairy Sci, 97(11): 6680-6692.

Nguyễn Tiến Cường, Lê Thanh Hoàng, Mai Văn Hiền, Hoàng Thị Yến, Nguyễn Thị Trung, Đào

Thị Mai Anh, Nguyễn Mạnh Cường, Đỗ Thị Tuyên (2021) Optimization and purification of

a-glucosidase inhibitor from Bacillus subtilis YT20 isolated in Vietnam Vietnam J Sci Technol, 59: 179-188.

Ton That Huu Dat, Le Canh Viet Cuong, Dao Viet Ha, Phung Thi Thuy Oanh, Nguyen Phuc Khanh

Nhi, Hoang Le Tuan Anh, Phan Tu Quy, Thanh Q Bui, Nguyen Thanh Triet, Nguyen Thi Ai

Nhung (2022) The study on biological activity and molecular docking of secondary metabolites from Bacillus sp isolated from the mangrove plant Rhizophora apiculata Blume Reg Stud Mar Sci, 55: 102583.

Ton That Huu Dat, Phung Thi Thuy Oanh (2021) 7n vitro antioxidant, a-amylase and ơ-glucosidase

inhibitory activities of endophytic bacteria from the roots of the mangrove plant Rhizophora

stylosa Griffith Academia J Biol, 43 (3): 125-135.

Frediansyah A, Nurhayati R, Sholihah J (2019) Lactobacillus pentosus isolated from Muntingia

calabura shows inhibition activity toward alpha-glucosidase and alpha-amylase in intra and

extracellular level JOP Conf Ser: Earth Environ Sci, 251: 012045 Gulnaz A, Nadeem J, Han JH, Lew LC, Son JD, Park YH, et al (2021) Lactobacillus SPS in

reducing the risk of diabetes in high-fat diet-induced diabetic mice by modulating the gut

microbiome and inhibiting key digestive enzymes associated with diabetes Biology (Basel),

10: 348.

Phạm Thanh Hà, Tran Dinh Man, Tran Thi Hoa (2012) Phân lập, tuyển chọn và xác định hoạt tính

của vi khuẩn sinh tong hợp enzyme uricase Tap chi sinh học, 34(4): 473-478.

Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mắn, Trần Thị Hoa (2013) Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện nuôi cay va

lên men chủng vi khuan Pseudomonas putida đề thu nhận enzyme uricase Tap chi Khoa hoc

và Công nghé, 51: 709-718.

Handayani I, Utami T, Hidayat C, Rahayu ES (2018) Screening of lactic acid bacteria producing

uricase and stability assessment in simulated gastrointestinal conditions Int Food Res J, 25:

1661-1667.

ICH (International Conference on Harmonization) (2005) Guidance on validation of analytical

procedures: text and methodology, 2-15.

Jalal DI, Chonchol M, Chen W, Targher G (2013) Uric acid as a target of therapy in CKD Am J

Kidney Dis, 61: 134-146.

20

Jagadeesan Y, Meenakshisundaram S, Alagar Boopathy LR, Mookandi VPS, Balaiah A (2019)

Combinatorial approach for screening and assessment of multiple therapeutic enzymes from marine isolate Pseudomonas aeruginosa AROI RSC Adv, 9 (30): 16989-17001.

Kim S, Huang E, Park S, Holzapfel W, Lim SD (2018) Physiological characteristics and

anti-obesity efect of Lactobacillus plantarum K10 Korean J Food Sci Anim Resour, 38: 554-569.

Kumar SRS, Rao KVB (2018) Efficacy of alpha glucosidase inhibitor from marine Actinobacterium

in the control of postprandial hyperglycaemia in Streptozotocin (STZ) induced diabetic male

albino Wister rats Iran J Pharm Res, 17: 202-214.

Li C, Kwok LY, Mi Z, Bala J, Xue J, Yang J, Ma Y, Zhang H, Chen Y (2017) Characterization of

the angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of fermented milks produced with Lactobacillus casei J Dairy Sci, 100 (12): 9495-9507.

Li J, Zhao J, Wang X, Qayum A, Hussain MA, Liang G, Hou J, Jiang Z, Li A (2019) Novel

angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides from fermented bovine milk started by Lactobacillus helveticus KLDS.31 and Lactobacillus casei KLDS.105: purification,

identification, and interaction mechanisms Front Microbiol, 10: 2643.

Lin S, Zhang T, Zhu L, Pang K, Lu S, Liao X, et al (2021) Characteristic dysbiosis in gout and the

impact of a uric acid-lowering treatment, febuxostat on the gut microbiota J Genet Genomics, 48: 781-791.

Martin M, Deussen A(2019) Effects of natural peptides from food proteins on angiotensin

converting enzyme activity and hypertension Crit Rev Food Sci Nutr, 59: 1264-1283.

Michael CX, Yokose C, Rai SK, Pillinger MH, Choi HK (2019) Contemporary prevalence of gout

and hyperuricemia in the United States and decadal trends: the national health and nutrition

examination Survey, 2007-2016 Arthritis & Rheumatology, 71(6): 991-999.

Nielsen MS, Martinussen T, Flambard B, Sgrensen KI, Otte J (2009) Peptide profiles and

angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity of fermented milk products: Effects of bacterial strain, fermentation pH, and storage time Int Dairy J, 19:155—165.

Nejati F, Rizzello CG, Di Cagno R, Sheikh-Zeinoddin M, Diviccaro A, Minervini F, et al (2013)

Manufacture of a functional fermented milk enriched of angiotensin-I converting enzyme

(ACE)-inhibitory peptides and gamma-amino butyric acid (GABA) Lwt Food Sci Technol, 51: 183-189.

Nguyen TH, Wang SL, Nguyen AD, Doan MD, Tran TN, Doan CT, Nguyen VB (2022) Novel

a-Amylase inhibitor hemi-pyocyanin produced by microbial conversion of chitinous discards.

Mar Drugs, 20: 283.

Phùng Thị Thùy Oanh, Hoàng Lê Tuấn Anh, Tôn That Hữu Dat (2020) Phân lập một số chủng vi

khuân có hoạt tính kháng sinh và ức chế enzym xanthine oxidase từ đất rừng ngập mặn Gio

Linh, Quang Tri Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, 358-363

Pan L, Han P, Ma S, Peng R, Wang C, Kong W, et al (2020) Abnormal metabolism of gut

microbiota reveals the possible molecular mechanism of nephropathy induced by

hyperuricemia Acta Pharm Sin B, 10: 249-261.

Pihlanto A, Virtanen T, Korhonen H (2010) Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory

activity and antihypertensive effect of fermented milk Int Dairy J, 20 (1): 3-10.

21

Pujiyanto S, Resdiani M, RaharJa B, Ferniah RS (2018) ơ-Amylase inhibitor activity of endophytic

bacteria isolated from Annona muricata L J Phys, 1025: 012085.

Pugin B, Pliiss S, Mujezinovic D, Nielsen RC, Lacroix C (2022) Optimized UV-spectrophotometric

assay to screen bacterial uricase activity using whole cell suspension Front Microbiol, 13:

853735.

Pustake SO, Bhagwat PK, Dandge PB (2019) Statistical media optimization for the production of

clinical uricase from Bacillus subtilis strain SP6 Heliyon, 5: e01756.

Siddharth S, Rai VR (2019) Isolation and characterization of bioactive compounds with

antibacterial, antioxidant and enzyme inhibitory activities from marine-derived rare actinobacteria, Nocardiopsis sp SCA21 Microb Pathog, 137:103.

Shah B, Sartaj L, Ali F, Shah A, Khan T (2018) Plant extracts are the potential inhibitors of

a-amylase: a review MOJ Bioequiv Bioavailab, 5: 270-273.

Steckelings UM, Rompe F, Kaschina E, Unger T (2009) The evolving story of the RAAS in

hypertension, diabetes and CV disease—moving from macrovascular to microvascular targets Fundam Clin Pharmacol, 23: 693-703.

Szczurek P, Mosiichuk N, WoliñskI J, Yatsenko T, Grujic D, Lozinska L, et al (2017) Oral uricase

eliminates blood uric acid in the hyperuricemic pig model PLoS One 12: e0179195.

Nguyen Thi Hien Trang, Doris Ying Ying Tang, Kit Wayne Chew, Nguyen Thi Linh, Le Thanh

Hoang, Nguyen Tien Cuong, Hoang Thi Yen, Nguyen Thi Thao, Nguyen Thi Trung, Pau

Loke Show, Do Thi Tuyen (2021) Discovery of a-glucosidase inhibitors from marine

microorganisms: optimization of culture conditions and medium composition Mol Biotechnol, 63: 1004-1015.

Nguyen Thi Trung, Nguyen Thi Thao, Phan Thi Hong Thao, Tran Thanh Tuan, Pham Duy Nam, Le

Thanh Hoang, Do Thi Tuyen (2022) Isolation, selection and evaluation of a-glucosidase

inhibitory activity from endophytic Streptomyces sp isolated from Citrus myrtifolia cultivar

in Hoa Binh, Vietnam Vietnam J Biotechnol 20(4): 693-704.

Do Thi Tuyen, Nguyen The Duong, Le Thanh Hoang (2016) Mutagenesis development of

actinoplanes sp KCTC 9161 by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and screening for acarbose production Vietnam J Biotechnol, 14: 753-760

Do Thi Tuyen, Guo Yong Yew, Nguyen Tien Cuong, Le Thanh Hoang, Hoang Thi Yen, Phan Thi

Hong Thao, Nguyen Thi Thao, Nguyen Sy Le Thanh, Nguyen Thi Hien Trang, Nguyen Thi

Trung, Ruqayya Afridi, Dao Thi Mai Anh, Pau Loke Show (2021) Selection, purification, and evaluation of acarbose—an a-glucosidase inhibitor from Actinoplanes sp Chemosphere, 265: 129167.

WHO (2021) Classification of diabetes mellitus https://www.who.int/westernpacific/health

topics/diabetes.

Won GY, Choi SI, Park NY, Kim JE, Kang CH, Kim GH (2021) In vitro antidiabetic, antioxidant

activity, and probiotic activities of Lactiplantibacillus plantarum and Lacticaseibacillus

paracasei strains Curr Microbiol, 78: 3181-3191.

Wu Y, Ye Z, Feng P, Li R, Chen X, Tian X, et al (2021) Limosilactobacillus fermentum JL-3

isolated from “Jiangshui” ameliorates hyperuricemia by degrading uric acid Gut Microbes,

13: 1-18.

22

Xia Y, Yu J, Xu W (2020) Purification and characterization of angiotensin-I-converting enzyme

inhibitory peptides isolated from whey proteins of milk fermented with Lactobacillus plantarum QS670 J Dairy Sci, 103: 4919-4928.

Xue H, Xu M, Gong D, Zhang G (2023) Mechanism of flavonoids inhibiting xanthine oxidase and

alleviating hyperuricemia from structure—activity relationship and animal experiments: A review Food Front, 4(4): 1643-1665.

Yasiri A, Seubsasana S (2020) Isolation of bile salt hydrolase and uricase producing Lactobacillus

brevis SF121 from Pak Sian Dong (fermented spider plant) for using as probiotics J Pure Appl Microbiol, 14(3):1715—1722.

PHAN III SAN PHAM, CONG BO VA KET QUA ĐÀO TAO CUA DE TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

rr) Tênsản Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

phẩm Đăng ký Đạt được

I | Quy trình 05 quy trình đánh giá hoạt tính ức | 05 quy trình đánh giá hoạt tính ức

chế a-amylase, ơ-glucosidase,|chế œ-amylase, œ-glucosidase,

angiotensin converting enzyme | angiotensin converting enzyme

(ACE), xanthine oxidase, va sinh | (ACE), xanthine oxidase, va sinh

uricase uricase

- Được nghiệm thu ở cấp cơ sở - Được nghiệm thu ở cấp cơ sở

- Phù hợp với điều kiện phòng thí | - Phù hợp với điều kiện phòng thí

nghiệm, có khả năng lặp lại nghiệm, có khả năng lặp lại

2 |Chủng vi| 10 chủng vi khuân hoặc xạ khuân | 18 chủng vi khuẩn hoặc xạ khuân

sinh vật có hoạt tính cao Thông tin dược | có hoạt tính cao Thông tin dược

tính của các chủng được cập nhập | tính của các chủng được cập nhập

lên online catalogue lên online catalogue

3.2 Hình thức, cấp độ công bố kết qua

Ghi địa chỉ và Đánh

TT Sản phẩm Tình trạng | cảm ơn sự tài trợ giá

của DHQGHN chung đúng quy định

1 Đăng ký sở hữu trí tuệ (sáng chế)

1.1} Chung vi khuẩn Lacticaseibacillus | Chap nhận Đạt

rhamnosus SM 4.3 (VTCC 12819) | đơn

phân lập từ mau sữa bò Ba Vi có kha

năng phòng chống bệnh tim mạch

2 |Bài báo trên các tạp chí khoa hoc của DHQGHN, tap chí khoa học chuyên

ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

23

2.1 Nguyen Viet Ha, Pham Thi Thuy

Van, Hoang Thi Lan Anh, Trinh

3 | Đăng ký sở hữu trí tuệ (sáng chế) 01 01

4 | Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus

5 _|Số lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của 01 01

DHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quôc gia

hoặc báo cáo khoa học đăng trong ky yêu hội nghị

quôc tê (việt băng tiêng Anh)

6 | Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo

đặt hàng của đơn vi sử dụng

7 | Kết quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch

định chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

8 | Đảo tao/hé trợ đào tạo NCS

9 | Đào tạo thạc sĩ 0 01

PHAN V TINH HÌNH SU DỤNG KINH PHI

TT Nội dung chi Kinh phi Kinh phi Ghi

được duyệt thực hiện chú

(triệu đồng) (triệu đồng)

A_ (Chi phí trực tiếp

1 Nhân công lao động khoa học 426.378.400 | 221.354.300

24

guyên vật liệu, năng lượng

Dịch vụ thuê ngoài

II măng

các chất có hoạt tính ức chế các enzyme để tìm ra chất mới có ý nghĩa ứng dụng Đề tài đã

phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính ức chế enzyme cao thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm

Bên cạnh đó một số hoạt tính mới, chưa được nghiên cứu nhiều như hoạt tính ức chế

xanthine oxidase hoặc ức chế enzyme chuyển angiotensin được tìm thấy trên các chủng

probiotic có thể giúp định hướng cho việc phát triển các sản phẩm lên men có chức năng

mới, hỗ trợ sức khỏe cho con người trong thời gian tới

Hà Nội ngày tháng năm 2024

Đơn vị chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

PHỤ LỤC 1

Danh sách 78 chủng xạ khuẩn sử dung dé sang lọc các hoạt tính

Nguôn gốc STT | Mã VTCC Tên khoa học Địa điểm phân lập

1 41651 Nocardiopsis crassaminis Cửa Sòi Rạp, Tp HCM Đất

2 41669 N crassaminis Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

3 41750 Phytohabitans rumicis Cửa Soi Rap, Tp HCM La

4 41935 Streptomyces neopeptinius Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

5 41936 | S nigra Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

6 41937 S xylanilyticus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Đất

7 41938 S calvus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

8 | 41939 Meo! —— Cửa Sòi Rạp, Tp HCM pat

9 41940 Myceligenerans indicum Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

10 41942 | S botrytidirepellens Cửa Soi Rạp, Tp HCM Đất

11 41996 S pluricolorescens Cua Soi Rap, Tp HCM La

12 41997 S bauhiniae Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

13 41998 S malaysiense Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

14 41999 S xylanilyticus Cua Soi Rap, Tp HCM La

15 42000 Streptomyces sp Cửa Soi Rap, Tp HCM La

16 42001 S daghestanicus Cua Soi Rap, Tp HCM La

17 42003 S malaysiense Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

18 42004 S albogriseolus Cua Soi Rap, Tp HCM La

19 42018 S nigra Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

20 42020 | S nigra Ctra Soi Rap, Tp HCM Dat

21 42022 S quinglenensis Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

22 42023 Actinomadura geliboluensis Cửa Soi Rap, Tp HCM Dat

23 42120 Micromonospora fluostatini | Cua Soi Rap, Tp HCM La

24 42126 Actinoplanes deccanensis Cua Soi Rap, Tp HCM La

25 42129 Nonomuraea ceibae Cửa Soi Rap, Tp HCM La

26 42130 Actinoplanes rectilineatus Cua Soi Rap, Tp HCM La

27 42171 S viridochromogenes Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

28 42172 S parvulus Cửa Soi Rap, Tp HCM Đất

29 42173 | S apingens Cửa Soi Rạp, Tp HCM Đất

30 42174 |N.akebiae Cửa Sòi Rạp, Tp HCM Đất

31 42178 S racemochromogenes Cửa Soi Rạp, Tp HCM Đất

32 42179 S bambusae Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

33 42181 Nocardiopsis crassaminis Cửa Soi Rap, Tp HCM Dat

34 42182 S pseudogriseolus Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

35 42184 S griseoincarnatus Cửa Soi Rap, Tp HCM Đất

36 42185 S puniciscabiei Cửa Soi Rap, Tp HCM Đất

37 44037 S cirratus Cua Soi Rap, Tp HCM La

38 44038 S chartreusis Cửa Soi Rap, Tp HCM Lá

39 44039 S morookaense Cua Soi Rap, Tp HCM La

40 44040 S zaomyceticus Cửa Soi Rap, Tp HCM La

41 44050 Kitasatospora phosalacinea Cửa Soi Rạp, Tp HCM La

42 44051 Pseudonocardia oroxyli Cua Soi Rap, Tp HCM La

43 44053 Saccharothrix espanaensis Cửa Soi Rap, Tp HCM La

44 44054 S zaomyceticus Cua Soi Rạp, Tp HCM La

45 44055 S asenjonii Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

46 44056 S malaysiense Cửa Sòi Rap, Tp HCM La

47 44057 S mauvecolor Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

48 44072 S kunmingensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM La

49 44073 S sundarbansensis Cửa Soi Rap, Tp HCM Lá

50 44074 S cavourensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

51 44085 S nigra Của Soi Rạp, Tp HCM Lá

52 44086 S kunmingensis Cua Soi Rap, Tp HCM La

53 44087 S albidoflavus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

54 44088 S ferralitis Của Soi Rạp, Tp HCM La

55 44089 S griseoincarnatus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

56 44090 S violaceorectus Cua Soi Rap, Tp HCM La

57 44091 S filipinensis Cua Soi Rap, Tp HCM La

58 44092 S mauvecolor Cửa Soi Rap, Tp HCM La

59 44093 S levis Của Soi Rạp, Tp HCM Lá

60 | 44004 | Micromonospora Cửa Soi Rap, Tp HCM Lá

provocatoris

61 44095 S violaceorectus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

62 44096 S roseofulvus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Lá

63 44283 S nigra Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

64 44378 S pilosus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

65 44379 S showdoensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

66 44380 S tendae Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

67 44382 S showdoensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

68 44389 S zaomyceticus Cửa Soi Rap, Tp HCM Dat

69 44390 | S cirratus Cửa Soi Rap, Tp HCM Dat

70 44391 Actinomadura geliboluensis | Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

71 44392 S salinarius Cua Soi Rạp, Tp HCM Dat

72 44393 S roseofulvus Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

73 44395 S showdoensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

74 44458 | S puniceus Ctra Soi Rap, Tp HCM Dat

75 44459 S filamentosus Cửa Soi Rap, Tp HCM Dat

76 44464 S nigra Cua Soi Rap, Tp HCM Dat

77 44465 S amritsarensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

78 44466 S ziwulingensis Cửa Soi Rạp, Tp HCM Dat

Danh sách 12 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sử dung dé sàng lọc

STT | Mã VTCC Tên khoa học Địa điểm are phan

1 10987 Bacillus amyloliquefaciens Hai Phong Rong sun

2 11027 B amyloliquefaciens Ha Noi Dat

7 12795 | B licheniformis Nam Từ Liêm, Hà Nội Đất

8 910118 B licheniformis Gia Lam, Ha Noi Dat

9 10963 B subtilis Hai Phong Rong sun

10 10965 B velezensis Hai Phong Rong sun

Vuon Quoc gia Bach ,

11 11309 B stercoris Ma, Hà a Thiên Hu 4 Dat

12 12316 B subtilis Quang Binh Dat

Danh sách 62 ching LAB sử dung dé sang loc các hoạt tinh

STT Ma VTCCiki Tén khoa hoc Dia diém Nguôn gốc

hiệu riêng phân lập

1 12791 Lactobacillus gasseri Thanh Trì, Hà Nội Sữa mẹ

2 12792 L gasseri Thanh Trì, Hà Nội Phân trẻ em

3 12819 ae ng - " Ba Vì, Hà Nội Sữa bò

4 12867 L gasseri Thanh Trì, Hà Nội Phân trẻ em

5 12868 S salivarius Thanh Trì, Hà Nội Phân trẻ em

6 6.1 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

7 6.2 L johnsonii Ha Nội Dich âm dao

8 6.3 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

9 6.4 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

10 6.5 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

11 6.6 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

12 6.7 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

13 6.12 Enterococcus faecalis Đông Anh, Ha Nội Phân trẻ em

14 6.16 E faecalis Đông Anh, Ha Nội Phan tré em

15 8.1 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

16 82 Streptococcus gallolyticus Hà Nội Dịch âm đạo

subsp pasteurianus

17 8.3 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

18 84 S gallolyticus subsp Hà Nội Dịch âm đạo

pasteurianus

19 8.5 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

20 8.6 L johnsonii Hà Nội Dịch âm đạo

21 8.10 L gasseri Thanh Tri, Hà Nội Sữa me

22 8.11 L gasseri Thanh Tri, Hà Nội Stra me

23 8.12 L gasseri Thanh Tri, Ha Noi Stra me

24 8.14 L gasseri Thanh Tri, Hà Nội Phan tré em

25 8.15 5: gallolyticus subsp Thanh Tri, Hà Nội Phan tré em

pasteurianus

26 8.16 5 gallolyticus subsp Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

pasteurianus

27 8.17 E faecalis Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

28 8.18 E faecalis Thanh Tri, Hà Nội Phân trẻ em

29 gig | © Salloiyticus subsp Thanh Trì, Hà Nội Phân trẻ em

32 8.22 L gasseri Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

33 8.23 L gasseri Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

34 8.24 E faecalis Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

35 8.25 S: gallolyticus subsp Thanh Tri, Ha Noi Phan tré em

pasteurianus

36 8.27 E faecalis Thanh Trì, Hà Nội Sữa mẹ

37 12.8 S salivarius Thanh Tri, Hà Nội Sita me

38 12.14 L crispatus Thanh Trì, Hà Nội Sữa mẹ

39 13.1 L crispatus Hà Nội Dịch âm đạo

40 13.2 L crispatus Hà Nội Dịch âm đạo

41 13.3 L crispatus Hà Nội Dịch âm đạo

42 13.4 L crispatus Hà Nội Dịch âm đạo

43 13.5 L crispatus Hà Nội Dịch âm đạo

44 13.6 S salivarius Nam Từ Liêm, Hà Nội Sữa mẹ

45 13.9 S salivarius Nam Từ Liêm, Hà Nội Sữa mẹ

46 13.19 | Salloiyticus subsp Nam Từ Liêm, Hà Nội | Phan tré em

pasteurianus

47 13.11 E faecalis Nam Từ Liêm, Ha Nội Phân trẻ em

48 13.12 | Pimosilactobacillus reuteri | tam Từ Liêm, Hà Nội | Phân tré em

subsp kinnaridis

49 13.13 | 8allolyticus subsp Nam Từ Liêm, Hà Nội | Phân tré em

pasteurianus

50 13.14 E faecalis Nam Từ Liêm, Ha Nội Phân trẻ em

5L | NTM0205 | “40/496/2acHis Thanh Hóa Nem chua

paracasei

52 NTM 0301 | paracasei Thanh Hóa Nem chua

53 | NTM0504 | Lacticaseibacillus Thanh Héa Nem chua

rhamnosus

54 NTM 1004 | LZ rhamnosus Thanh Hóa Nem chua

55 TBM 6 L paracasei Bac Giang Tuong ban

56 TBM 8 L paracasei Bac Giang Tuong ban

57 TBM 15 | L paracasei Bac Giang Tuong ban

58 TBM 27 L paracasei Bac Giang Tuong ban

59 NKM 5.4 | paracasei Khanh Hoa Nem chua

60 NKM 8.6 _ | L paracasei Khanh Hoa Nem chua

61 SM 2.2 L paracasei Ba Vi, Ha Nội Stra bo

62 SM 3.4 L rhamnosus Ba Vi, Hà Nội Sữa bò

4.1 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chúng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế ơ-amylase

PHỤ LỤC 2

Bang 3.1 Khả năng ức chế ơ-amylase của acarbose tại các nồng độ khác nhau

C (ug/ml) Phân trăm ức chế (%)

2,5 U/ml 5 U/ml 10 U/ml 15 U/ml

Hình 3.2 Hình minh họa khả năng ức chế a-amylase của acarbose ở các nồng độ khác nhau

(0- 400 ug/ml) trên đĩa thạch

Quy trình xác định hoạt tính ức chê o-amylase từ dịch nuôi cây của các chủng vi sinh

vat (cụ thê nhóm xạ khuân và vi khuân) gôm các bước sau:

Bước |: Trộn mẫu với a-amylase 2,5 U/ml

- Mẫu thí nghiệm: trộn mẫu dich nuôi cấy đã loại bỏ tế bào vi sinh vật với a-amylase 2,5 U/ml

(mẫu thí nghiệm), sau đó ủ ở 37°C trong 10 phút.

- Mẫu đối chứng âm: làm tương tự mẫu thí nghiệm, chỉ thay dịch nuôi cấy bằng dung dịch

đệm phosphate 0,1 M pH 6,9.

- Mẫu đối chứng dương: làm tương tự mẫu thí nghiệm nhưng thay dịch nuôi cấy bằng dung

dịch acarbose 400 pg/ml.

Bước 2: Nhỏ mẫu vào đĩa thạch đục lỗ

- Nhỏ 50 yl mẫu sau khi ủ ở bước 1 vào các giếng trên đĩa thạch chứa 0,5% tinh bột tan và ủ

ở 37°C qua đêm.

Bước 3: Nhuộm đĩa và đọc kết quả

- Bồ sung 2 ml dung dịch Gram’s iodine vào đĩa thạch và rửa dưới nhẹ dưới vòi nước.

- Do đường kính vòng sáng

Đường kính vòng sáng xung quanh lỗ được tính bằng công thức:

Đường kính (mm) = D - 6

Trong đó: D là đường kính vòng sáng (mm); 6: đường kính lỗ được tạo (mm)

Mau có hoạt tính ức chế a-amylase sẽ tạo vòng sáng nhỏ và mờ hơn mẫu đối chứng âm

(-) hoặc gân tương đương với đôi chứng dương Trong trường hợp kêt quả nhuộm đĩa cho thây chủng có hoạt tính ức chê o-amylase thì tiêp tục làm các bước định lượng băng DNS như các bước dưới đây.

Bước 4: Tron mẫu với a-amylase 2,5 U/ml

- Mẫu thí nghiệm: hút dịch nuôi cấy vào ống eppendorf có chứa a-amylase 2,5 U/ml và ủ ở

Bước 5: Bồ sung tỉnh bột tan 1%

- Bồ sung dung dich tinh bột tan vào hỗn hợp phản ứng ở bước 4 Lắc đều và ủ hỗn hợp ở

Bước 8: Hoạt tính ức chế a-amylase

Phần trăm ức chế a-amylase được xác định theo công thức (Siddharth & Rai, 2019)

Ag — (A, o — (Ay 2)—A

% ức chế = 100

0

Trong đó: Ao: độ hấp thụ của mẫu đối chứng âm

Ai: độ hap thụ của mẫu thí nghiệm Aa: độ hấp thụ của mẫu kiểm tra

So sánh % ức chế của mẫu thí nghiệm với đối chứng dương nếu % ức chế của mẫu thí nghiệm <50% thì chủng được xem là có hoạt tính yếu; 50-70%- hoạt tính trung bình; >70%-

hoạt tính mạnh.

Nhỏ mẫu vao đĩa thạch duc 16 (ủ 37°C qua đếm)

G)

Ching không thé hiện hoạt tinh ức chế Ching có hoạt tinh ức chế a-amylase

a-amylase trên đĩa thạch trên đĩa thạch

Trộn mẫu với a-amylase 2,5 U/ml

Hoạt tinh ức chế o-amylase

Hình 3.3 Quy trình xác định hoạt tính ức chế ơ-amylase từ dịch nuôi cấy các chủng

vi khuẩn va xạ khuẩn

4

* Danh gia kha năng lặp lại của quy trình

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, giá trị phần trăm ức chế trung bình của acarbose thu được

ở hai ngày khác nhau là tương đồng nhau, tương ứng là 50,73 và 50,94% Giá trị % RSD của hai lần thực hiện là 0,72% và 0,6% (<2%) đã cho thấy quy trình đảm bảo về khả năng lặp lại Bang 3.3 Phần trăm ức chế a-amylase 2,5 U/ml của acarbose nồng độ 25 ug/ml của các lần

lặp độc lập ở hai ngày khác nhau

% RSD 0,72 0,60

Hình 3.4 Sang loc hoạt tinh ức chế a-amylase trên đĩa thạch có chứa tinh bột

Ghi chu: DC+: acarbose 400 ug/ml; ĐC-: dém phosphate 0,1 M; I: môi trường ISP2, Y: môi

trường YS; 1-13: dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn kiểm tra

Bảng 3.4 Hoạt tinh ức chê a-amylase của 9 chủng xạ khuân nuôi trên các môi trường

khác nhau

Mã Môi ,

ê Đĩa thạch % ức chê STT VTCC Tên khoa học trường ia thạc % ức chê

4.2 Xây dựng quy trình và sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tinh ức chế

Quy trình xác định hoạt tinh ức chê a-glucosidase từ dịch nuôi cây của các chủng vi sinh vật (cụ thê nhóm xạ khuân và vi khuân) gôm các bước sau:

Bước 1: Tron mẫu với đệm phosphate và a-glucosidase 1 U/ml

- Mau thí nghiệm: hút dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào vi sinh vật vào đĩa 96 giếng Bồ sung

dung dịch đệm potassium phosphate và dung dich a-glucosidase 1 U/ml vào giếng đã tra mẫu

Bước 2: Bồ sung cơ chất pNPG

- Bồ sung dung dich cơ chất pNPG 1,5 mM vào giếng chứa hỗn hợp phản ứng ở bước 1

- Tiếp tục ủ đĩa ở tủ 37°C trong 30 phút

Bước 3: Dừng phản ứng bang NaaCO:

- Bồ sung NaazCO¿ 0,1M dé dừng phan ứng

Bước 4: Do mẫu ở bước sóng 405 nm

- Đặt đĩa 96 giếng vào máy đọc đĩa ELISA

- Chọn bước sóng 405 nm

- Đọc kết quả

Bước 5: Tính hoạt tính ức chế a-glucosidase

Phan trăm ức chế enzym a-glucosidase được xác định theo công thức (Siddharth & Rai, 2019):

Áo - Ái

Ao Trong đó: Ao: độ hap thụ của mau đối chứng âm; Aj: độ hap thụ của mau thí nghiệm

x 100

% ức chế =

So sánh % ức chế của mẫu thí nghiệm với đối chứng dương, nếu % ức chế của mẫu thí nghiệm

<50%- hoạt tính yếu; 50-70%- hoạt tính trung bình; >70%- hoạt tính mạnh.