Nghiên cứu Đột biến và mức Độ biểu hiện gen egfr trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến Ở phổi tại bệnh viện Đa khoa tỉnh phú thọ

Nghiên cứu Đột biến và mức Độ biểu hiện gen egfr trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến Ở phổi tại bệnh viện Đa khoa tỉnh phú thọ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN VĂN HÕA

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH PHÖ THỌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN VĂN HÕA

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH PHÖ THỌ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Văn Hòa, học viên khóa 29 Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Quang Huy

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2023

Tác giả

Nguyễn Văn Hòa

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ Khoa Sinh học, phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học Tự nhiên;

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, các cán bộ đồng nghiệp đợn vị Vi sinh - Trung tâm xét nghiệm - Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Sinh học, các Thầy Cô bộ môn Hoá sinh và Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Nguyễn Văn Hòa

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Mục tiêu nghiên cứu: 3

2 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về ung thư phổi 4

1.1.1 Tình hình ung thư phổi trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam 5

1.2 Bệnh nguyên, bệnh sinh ung thư phổi 6

1.2.1 Bệnh nguyên ung thư phổi 6

1.2.2 Cơ chế phân tử bệnh 7

1.2.2.1 Tiếp xúc với các tác nhân sinh khối u 7

1.1.1.2 Tính nhạy cảm di truyền 7

1.3 Phân loại ung thư phổi 8

1.3.1 Ung thư phổi không tế bào nhỏ 9

1.3.2 Ung thư phổi tế bào nhỏ 9

1.4 Ung thư biểu mô tuyến của phổi 10

1.4.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến 10

1.4.2 Các biến đổi về gen trong ung thư phổi biểu mô tuyến 12

1.5 Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi 13

1.5.1 Cấu trúc và chức năng gen EGFR 13

1.5.2 Đột biến EGFR trong trong ung thư phổi 14

1.5.3 Một số phương pháp/kỹ thuật phát hiện đột biến gen EGFR và biểu hiện protein EGFR 19

1.5.4 Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi 20

1.5.5 Một số nghiên cứu về đột biến gen EGFR của bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến 21

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 25

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 25

2.2 Cỡ mẫu 26

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 26

2.4 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.5 Phương pháp nghiên cứu 28

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu: 29

2.5.2 Phương pháp xét nghiệm mô bệnh học và đánh giá mức độ biểu hiện protein EGFR trên màng tế bào 30

2.5.3 Phương pháp xác định đột biến EGFR bằng kỹ thuật giải trình tự gen 33

2.5.4 Xác định mối liên quan giữa đột biến gen EGFR với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng 34

2.5.5 Phương pháp sử lý số liệu 34

2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến 37

3.2 Tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển ở phổi 38

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư 38

3.2.2 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen 39

3.3 Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 46

3.3.1 Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 46

3.3.2 Biểu hiện protein EGFR 48

3.3.3 Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân 49

3.3.4 Mối liên quan giữa biểu hiện protein EGFR với đột biến gen EGFR 53

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu……… 30

Bảng 2.2: Đánh giá toàn trạng dựa theo tiêu chuẩn của WHO 2004 29

Bảng 3.1 Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Tỷ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR 44

Bảng 3.3 Tương quan giữa đột biến gen EGFR với các đặc điểm bệnh nhân 46

Bảng 3.4.Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh nhân 50

Bảng 3.5 Mức biểu hiện protein EGFR 52

Bảng 3.6 Tương quan giữa mức độ biểu hiện EGFR với đặc điểm bệnh nhân 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới năm

2020 ……… 5

Hình 1.2 Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2020 ………6

Hình 1.3 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến 11

Hình 1.4 Một số phân typ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 12

Hình 1.5 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR 14

Hình 1.6: Cấu trúc và sự hoạt hóa phân tử EGFR 16

Hình 1.7: Cấu trúc gen EGFR và các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với các thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR 17

Hình 2.1 Phương pháp hóa mô miễn dịch protein EGFR 32

Hình 3.1: Ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi GAPDH 38

Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các exon 18, 19, 20 và 21 gen EGFR trên gel agarose (BN: bệnh nhân; (-): mẫu đối chứng âm; giếng 1-4) 39

Hình 3.3: Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến L858R trên exon 21 của gen EGFR (mã số mẫu 115) 39

Hình 3.4: Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến L858R trên exon 21 của gen EGFR (mã số mẫu 85) 40

Hình 3.5 Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến xóa đoạn LREA trên exon 19 của gen EGFR (mã số mẫu 136) 41

Hình 3.6 Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến T790M trên exon 20 và đột biến L858R trên exon 21 gen EGFR của cùng một bệnh nhân (mã số mẫu 78) 41

Hình 3.7 Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến S768I và V769L trên exon 20 gen EGFR của cùng một bệnh nhân (mã số mẫu 114 và 125) 42

Hình 3.8 Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến G719S trên exon 18 của gen EGFR (mã số mẫu 03) 43

Hình 3.9: Ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến T790M trên exon 20 của bệnh nhân (mã số mẫu 48) 43

Hình 3.10 Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR 49

MỞ ĐẦU

Hiện nay trên toàn thế giới, bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim mạch để trở thành căn nguyên gây tử vong hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh cao và độ tuổi mắc bệnh ngày càng giảm [34] Với tốc độ phát triển dân số và sự gia tăng tuổi thọ như hiện nay thì ước tính đến năm 2050, thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu trường hợp ung thư mới mắc và khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm [34]; trong đó phải

kể đến ung thư phổi (UTP), căn nguyên gây tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu với thể ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm đến 85% các trường hợp

Những nghiên cứu thực hiện cho thấy việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị đã mang lại những lợi ích cho bệnh nhân mắc ung thư Các nhà khoa học có thể đánh giá một cách tổng quát sự tương tác gen, các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào và ảnh hưởng của các dòng thác tín hiệu trong tế bào đến quá trình tái bản, sao chép và phiên mã, từ đó tác động lên quá trình sinh trưởng, biệt hóa, di chuyển và chết theo chương trình của tế bào Với mỗi một biến đổi gen xảy ra đều có thể làm thay đổi sự cân bằng các hoạt động sống tế bào, biến một tế bào lành trở thành tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào Mặt khác, có những biến đổi gen lại khiến các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc đề kháng hơn với những tác nhân ngoại bào như tác nhân lý, hóa Trong đó, sự thay đổi tính đáp ứng của tế bào với các các thuốc điều trị ung thư là một ví dụ điển hình Đây là cơ sở khoa học để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gọi là liệu pháp điều trị ung thư đích (targeted cancer therapy) Ưu điểm của phương pháp này là liều điều trị thấp, đặc hiệu, ít độc hại và đặc biệt có hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng người bệnh được tăng cường và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân

Việc phân tích tình trạng các gen đóng vai trò chủ chốt trong quá trình phát sinh khối u thư giúp các bác sĩ lựa chọn pháp đồ điều trị phù hợp nhất để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho người bệnh Qua nhiều công trình nghiên cứu cũng như

sự kiểm duyệt khắt khe của các Tổ chức quản lý y dược uy tín trên thế giới Hoa Kì, EMEA-Liên Minh Châu Âu), liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ) đã

(FDA-chứng tỏ hiệu quả rất tốt trong việc điều trị cho các bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn cuối: kích thước các khối u giảm đáng kể, thời gian sống kéo dài hơn, chất lượng cuộc sống được cải thiện,… Tuy nhiên, mức độ đáp ứng với thuốc điều trị đích ở mỗi bệnh nhân UTPKTBN phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số gen, mà quan trọng nhất là gen EGFR Việc xác định đột biến gen EGFR hay sự tương tác protein

bị đột biến có ý nghĩa rất lớn giúp bác sĩ lựa chọn được phác đồ điều trị thích hợp

để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho bệnh nhân

Một trong những phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi

di truyền của tế bào ung thư Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs

(Tyrosine Kinase Inhibitors) dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal

growth factor receptor) đang được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi Bên cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh có mối liên quan chặt chẽ giữa đột biến

gen EGFR với mức độ đáp ứng của các thuốc ức chế tyrosine kinase ở EGFR của khối u Các đột biến gen EGFR làm tăng ái lực của thuốc với EGFR của khối u, do

đó những bệnh nhân có đột biến gen EGFR thường đáp ứng tốt với các thuốc này Khoảng 40% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến gen EGFR Gần đây, các nghiên cứu tập trung nhiều vào đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư

phổi biểu mô tuyến, vì đây là đột biến phổ biến (khoảng 30 đến 64%) và là yếu tố

dự đoán tính đáp ứng với các thuốc ức chế tyrosine kinase [67] Để giúp cho các bác sỹ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và hiệu quả, cũng như góp phần

tiên lượng bệnh nhân được tốt hơn, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đột

biến và mức độ biểu hiện gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi tại bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ” với mục tiêu:

1 Mục tiêu nghiên cứu:

- Phân tích tỷ lệ đột biến của gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô

tuyển ở phổi tại bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ

- Đánh giá mức độ biểu hiện của protein EGFR và mối liên quan với đặc điểm bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển ở phổi

2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đột biến gen EGFR

ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến

- Tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư và xác định đột biến gen EGFR bằng

kỹ thuật giải trình tự gen

- Đánh giá mức độ biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

+ Xác định mức độ biểu hiện protein EGFR

+ Mối liên quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân

+ Mối liên quan giữa biểu hiện protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ung thư phổi

1.1.1 Tình hình ung thư phổi trên thế giới

Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới Theo thống kê của

Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư [24] Đây là loại ung thư phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số) Tỷ lệ mắc cao nhất là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100.000 người) và Đông Á (50,4/100.000 người) Tỷ

lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100.000 người) Ở phụ nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số) Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau

ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc

lá Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100.000 người) và Bắc Âu (23,7/100.000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100.000 người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100.000 người) [24]

Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm

2017, đã có thêm 225.500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư được phát hiện Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm quá 5 năm Theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015

có đến 155.800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư [52] Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư đại tràng cộng lại [52]

Các thống kê cho thấy, UTP phổ biến hơn ở nam giới Năm 2018, toàn thế giới ước tính có khoảng 1.377.500 ca UTP được phát hiện ở nam giới chiếm khoảng 66% tổng số ca UTP mới được phát hiện, tỷ lệ nam/nữ khoảng 1,94/1 [14] Tại các nước đang phát triển, tỷ lệ nam/nữ thường cao hơn con số trên, trong khi tại các nước phát triển, tỷ lệ UTP ở nữ có xu hướng ngày một tăng nhanh [14] Theo thống

kê của Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ, năm 2007, ước tính có khoảng 114.760 ca UTP

mới phát hiện ở nam giới và 98.620 ca UTP mới phát hiện ở nữ giới [33] Trong khi

đó, thống kê năm 2019, số ca UTP mới phát hiện ở nam giới là 116.440 và ở nữ là 111.710 Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ UTP mới phát hiện ở nữ giới đã xấp xỉ nam giới [69]

1.1.2 Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có khoảng 160.000 trường hợp mắc mới và có tới 115.000 người tử vong do ung thư Việt Nam xếp ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100.000 người Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam và nữ (sau ung thư gan) Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6.905 ca với tỉ lệ 29,3/100.000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23.667 trường hợp (14,4% tổng số

ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100.000 dân Dự báo, đến năm 2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23.000 ở nam giới và hơn 34.000 ở cả hai giới [24] Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 – 41,5/100.000 dân

và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100.000 dân [24]

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới

năm 2020 [32]

Hình 1.2 Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2020 [30].

1.2 Bệnh nguyên, bệnh sinh ung thư phổi

1.2.1 Bệnh nguyên ung thư phổi

Hút thuốc lá được coi là yếu tố nguy cơ chính gây nên UTP, khoảng 80- 85%

ca được chẩn đoán UTP trên thế giới có hút thuốc lá Mức độ tăng nguy cơ phụ thuộc vào: tuổi bắt đầu hút, số lượng thuốc hút và thời gian hút Nguy cơ UTP ở người hút thuốc lá cao gấp 10 lần so với người không hút thuốc Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, ngay cả những người không trực tiếp hút thuốc lá nhưng thường xuyên tiếp xúc với người hút thuốc (hút thuốc thụ động cũng có nguy cơ UTP rất cao [54, 59]

Mặc dù hút thuốc lá là căn nguyên hàng đầu gây UTP, vẫn có khoảng 15-20% những trường hợp UTP không có tiền sử hút thuốc lá được ghi nhận Những nguyên nhân khác được xác định có nguy cơ gây UTP bao gồm: ô nhiễm không khí, các bức xạ ion hóa, phơi nhiễm nghề nghiệp, virus, chế độ ăn, tiền sử mắc các bệnh phế quản phổi [54, 63]

Nhiều nghiên cứu về UTP ở người không hút thuốc lá đã được tiến hành, người ta ghi nhận những đặc điểm khác biệt về lâm sàng và sinh học của UTP giữa những người hút thuốc lá và không hút thuốc lá Nhiều biến đổi trong vật chất di truyền gen, NST đã được phát hiện ở những người UTP không hút thuốc, từ đó có thể giúp các nhà lâm sàng lựa chọn các phương pháp điều trị phù hợp Nhìn chung,

sự cải thiện về khả năng sống tốt hơn ở người UTP không hút thuốc và lợi thế điều trị rõ ràng đối với liệu pháp điều trị đích [63, 71, 73]

1.2.2 Cơ chế phân tử bệnh

Sự phát sinh, phát triển UTP diễn ra qua nhiều giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy cơ, sự đáp ứng của gen và quá trình tích lũy đột biến xảy ra trên các gen gây ung thư và gen áp chế ung thư với hậu quả làm mất cân bằng của hai hệ thống gen này [61]

1.2.2.1 Tiếp xúc với các tác nhân sinh khối u

Việc tiếp xúc với các yếu tố sinh khối u (trong môi trường và do nghề nghiệp) cùng với tính nhạy cảm về di truyền với các yếu tố này của người bệnh đều làm tăng nguy cơ phát sinh UTP của người đó Theo thống kê ở Hoa Kỳ, 90% các trường hợp UTP là do người bệnh có hút thuốc lá, còn lại 9-15% là tiếp xúc với các tác nhân sinh khối u khác trong môi trường làm việc Khói thuốc lá chứa hơn 300 hợp chất có hại cho sức khỏe, trong đó có hơn 40 chất là các tác nhân sinh khối u đã được chứng minh Các hydrocacbon đa vòng nhân thơm và nitrosamines gây tổn thương DNA ở mô hình thí nghiệm trên động vật; benzo-A-pyrine kích hoạt một số con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào như AKT cũng như làm tăng tần suất đột biến ở gen p53 và các gen ức chế khối u khác [79] Yếu tố nguy cơ do nghề nghiệp phổ biến nhất của UTP là phơi nhiễm a-mi-ăng Bên cạnh đó, nhiễm phóng xạ radon có liên quan đến 10% các trường hợp UTP, trong khi ô nhiễm không khí đóng vai trò chính trong khoảng 1-2% trường hợp [51] Ngoài ra, việc người bệnh đã có tiền căn bệnh phổi trước đó như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, xơ phổi nguyên phát hoặc lao phổi cũng làm tăng tỷ lệ phát sinh UTP Nguyên nhân có thể do những tổn thương gây độc tế bào tái diễn trong thời gian dài sẽ phá vỡ sự cân bằng di truyền trong tế bào

1.1.1.2 Tính nhạy cảm di truyền

Trong những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã giúp khám phá ra tình trạng khuếch đại các gen sinh khối u và bất hoạt của các gen kiềm hãm khối u trong bệnh sinh UTPKTBN Phát hiện được xem là quan trọng nhất là những đột biến liên quan đến họ gen sinh khối u RAS Các gen này mã hóa cho một

loại protein nằm ở mặt trong của màng tế bào, có hoạt tính GTPase tham gia con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào Những nghiên cứu trên chuột cho thấy có mối liên quan giữa đột biến gen RAS và cơ chế phân tử bệnh UTPKTBN Những nghiên cứu trên người cho thấy sự kích hoạt gen RAS sẽ thúc đẩy tiến triển của khối u phổi, đặc biệt ở phân nhóm ung thư biểu mô tuyến trên bệnh nhân hút thuốc lá [57].Sau đột biến gen RAS, biến đổi di truyền quan trọng khác trong bệnh UTP là đột biến gen EGFR, gây rối loạn trong con đường dẫn truyền tín hiệu thông qua thụ thể yếu tố phát triển biểu bì EGFR Trong các tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR bị rối loạn bởi đột biến gen EGFR, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểu hiện quá mức protein EGFR [27]

Biến đổi di truyền tiếp theo là rối loạn hoạt hóa BRAF Protein BRAF với hoạt tính serine/threonine kinase tiếp nối con đường tín hiệu của KRAS trong tế bào Sự phosphoryl hóa BRAF hoạt hóa các gen MEK1 và MEK2 thúc đẩy phân bào và làm tăng khả năng sống sót của tế bào ung thư [45] Ngoài đột biến gen EGFR, KRAS và BRAF, các bất thường về di truyền khác có thể làm thay đổi liệu trình điều trị bệnh UTPKTBN còn có phức hợp chuyển vị liên quan đến hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể ALK (nhạy cảm với các tác nhân ức chế ALK), phức hợp chuyển vị ROS1, phức hợp chuyển vị RET, đột biến MEK và sự khuếch đại gen MET (mã hóa cho thụ thể yếu tố phát triển tế bào gan),

1.3 Phân loại ung thư phổi

Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [42]

Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng bệnh Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô, gọi là ung thư biểu mô Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi Để phục vụ cho mục đích điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC – Small Cell Lung Cancer) [36]

1.3.1 Ung thư phổi không tế bào nhỏ

Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó

ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào lớn [37]

Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường

hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [37] Ung thư biểu

mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [70] Đây cũng

là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [55]

Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng

25 – 30% số trường hợp ung thư phổi Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vảy,

là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi Ung thư biểu mô tế bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [35]

Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –

15% số trường hợp mắc ung thư phổi Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi Nó có xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống với ung thư phổi tế bào nhỏ [42]

1.3.2 Ung thư phổi tế bào nhỏ

Đặc điểm nổi bật của ung thư phổi tế bào nhỏ là các tế bào chứa dày đặc các hạt tiết thể dịch thần kinh đó là những túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, do

đó khối u loại này có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [58, 70] Đa

số trường hợp bệnh phát sinh ở đường dẫn khí lớn (phế quản chính và phế quản

thùy) Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh được phát hiện ở giai đoạn đã lan rộng và không thể tiến hành xạ trị ở một phạm vi đơn lẻ [37].

1.4 Ung thư biểu mô tuyến của phổi

1.4.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến

Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% số trường hợp ung thư phổi (Hình 1.3) Ung thư này thường bắt đầu ở những tế bào tiết thông thường như là tế bào tiết chất nhầy [29, 42] Ung thư biểu mô tuyến xảy ra ở những người đã từng hoặc đang hút thuốc, nhưng phổ biến nhất ở những người không hút thuốc Ngoài ra, ung thư biểu mô tuyến ở phổi phổ biến ở nữ giới hơn nam giới và hay gặp ở những người trẻ tuổi hơn những loại ung thư phổi khác [42] Ung thư biểu mô tuyến của phổi thường được tìm thấy ở phần bên ngoài của phổi Mặc dù có xu hướng phát triển chậm hơn so với những dạng ung thư phổi khác và khả năng phát hiện trước khi ung thư lan rộng nhưng nó lại rất khác nhau giữa các bệnh nhân Những bệnh nhân ung thư phổi tại chỗ (Adenocarcinoma in situ) thường có tiên lượng tốt hơn so với những loại ung thư phổi khác [29, 42]

Ung thư biểu mô tuyến ngoại vi ở phổi được cho là phát sinh từ các tổn thương tiền ung thư được gọi là tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau đó phát triển thành các tế bào ung thư phân chia quá mức không điển hình (Atipical Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH được coi là hình ảnh mô học đầu tiên trong quá trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.3) [32] AAH mang những biến đổi di tuyền và di truyền ngoại gen tương tự với những biến đổi được tìm thấy trong

ung thư tuyến của phổi kể cả đột biến KRAS, EGFR, TP53, mất đoạn dị hợp tử tại

cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, và biến đổi đi truyền

ngoại gen WNT [32] Từ các AAH sẽ tiếp tục hình thành ung thư biểu mô tuyến tại chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay còn được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần đầu tiên tiến tới giai đoạn tiền ung thư trước khi được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC) Đây được coi

là giai đoạn không xâm lấn của những tế bào ung thư tuyến tân sản nhưng chúng thể hiện sự tăng kích thước và hình thái tế bào không điển hình Giai đoạn tiếp theo của

ung thư là sự hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive Adenocarcinoma), được định nghĩa là một ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước nhỏ hơn 3 cm) với thành phần chủ yếu là tổn thương lepidic và xâm lấn nhỏ hơn 5mm tại một vị trí Sau đó khối u chuyển sang quá trình xâm lấn (Invasive Carcinoma) mặc dù các yếu tố không xâm lấn có thể tồn tại ở các cạnh của các khối

u [34]

Hình 1.3 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến [32]

Hiện nay, ung thư biểu mô tuyến chiếm vị trí hàng đầu trong các typ ung thư phổi Nghiên cứu của Montezuma D (2013) [49] trên 325 bệnh nhân ung thư phổi nguyên phát cho tỷ lệ ung thư phổi biểu mô tuyến là 44,7% Người ta cũng nhận thấy có sự chuyển đổi về tần suất các typ mô học của ung thư phổi Những năm đầu thế kỷ 20, typ ung thư phổi biểu mô vảy chiếm > 50%, ung thư phổi biểu mô tuyến khoảng 30%, còn lại là các typ khác Đến đầu thế kỷ 21, tỷ lệ typ ung thư phổi biểu

mô vảy và ung thư phổi biểu mô tuyến gần tương đương nhau (khoảng 40%) và đến thời điểm hiện tại, tỷ lệ ung thư phổi biểu mô tuyến chiếm khoảng 50% tổng số các trường hợp ung thư phổi

Tại Việt Nam, ung thư phổi biểu mô tuyến đang có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây Nghiên cứu của Lê Tuấn Anh (2012) [1] trên 60 bệnh nhân

ung thư phổi không tế bào nhỏ cho thấy tỷ lệ ung thư phổi biểu mô tuyến nhiều nhất

là 55,4% Theo Phạm Văn Thái (2015) [9], nghiên cứu trên 81 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ cho thấy tỷ lệ ung thư phổi biểu mô tuyến là 76,6% Nghiên cứu của Lê Hoàn (2010) và Nguyễn Minh Hải (2010) thì tỷ lệ lần lượt là 65,2% và 53,0% [6]

Hình 1.4 Một số phân typ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

(A) ung thư biểu mô tuyến nhú (HE x 100); (B) ung thư biểu mô tuyến vi nhú (HE x 400); (C) ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (HE x 400); (D) ung thư biểu mô

tuyến dạng chùm nang (HE x 200) [42]

1.4.2 Các biến đổi về gen trong ung thư phổi biểu mô tuyến

Trong thời gian qua nhờ tiến bộ trong kỹ thuật phân tử đã cung cấp những kiến thức mới trong lĩnh vực sinh học liên quan sinh bệnh học của ung thư phổi biểu

mô tuyến Nghiên cứu đã thấy có những bất thường phân tử trong ung thư phổi biểu

mô tuyến bao gồm đột biến các gen điều hòa tăng trưởng quan trọng: K- Ras, EGFR, B-RAF, MEK - 1, HER2, MET, EML - 4- ALK, NKX2.1 và sự bất hoạt các gen ức chế sự tăng trưởng: TP53, PTEN, p16, LKB - 1 [10] Các gen đột biến thường gặp trong ung thư phổi biểu mô tuyến được kể đến:

Gen EGFR

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor - EGFR), thuộc dòng thụ thể yếu tố tăng trưởng ErbB EGFR có liên quan đến sự điều hòa nhiều chức năng ung thư như: sự tăng sinh, sống sót và biệt hóa tế bào, sự tạo mới mạch, sự xâm lấn và di căn

Hiện tượng mất điều hòa EGFR là phổ biến ở một loạt phân nhóm ung thư bao gồm cả ung thư phổi không tế bào nhỏ, tại đó người ta nhận thấy biểu hiện quá mức protein EGFR lên tới 62% [66]. Ngoài biểu lộ quá mức protein, EGFR thường

bị đột biến khoảng 10 - 40% của ung thư phổi biểu mô tuyến [80]

1.5 Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi

1.5.1 Cấu trúc và chức năng gen EGFR

EGFR nằm trong họ thụ thể yếu tố phát triển biểu bì bao gồm HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 và HER-4 trong phân lớp thụ thể Tyrosine Kinase (Tyrosine Kinase Receptor) Protein EGFR là một glycoprotein màng có kích thước

170 kDa với cấu trúc gồm 3 phần chính là: Phần gắn phối tử ở ngoài màng, phần protein xuyên màng và phần bên trong tế bào chất với vùng hoạt hóa Tyrosine

Kinase được mã hóa bởi gen EGFR nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể 7 (7p12) gồm 28 exon EGFR chứa một số yếu tố lặp lại, bao gồm SINE và LINE, và một

vùng giàu (TGG/A) trong intron 15, và 2 vùng lặp lại CA trong intron 27, đặc biệt exon 1 rất giàu trình tự GC [20] EGFR có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, chết theo chương trình, di động, xâm nhập, sửa chữa và tương tác giữa tế bào với tế bào Khi phân tử EGFR kết hợp với phối tử chúng sẽ thực hiện quá trình nhị trùng hợp (homo/heterodimeration) và hoạt hóa phân tử EGFR qua đó kích hoạt hai con đường truyền tín hiệu chính của tế bào là con đường qua PI3K/AKT/m-TOR và RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 làm cho tế bào tăng phân chia, tăng khả năng sống sót và chống lại quá trình chết theo chương trình [50]

Hình 1.5 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR [50].

Con đường MAPK RAS-RAF-MEK-ERK có thể là con đường quan trọng

nhất liên quan đến phản ứng sinh học của EGFR, trong đó có gen RAS và RAF là các

tác nhân tiền gây ung thư (Hình 1.5) Mục tiêu chính trong liệu pháp điều trị ung thư là MEK MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) tương tác với hơn 100 cơ chất để khởi đầu một loạt các phản ứng sinh lý và bệnh lý, bao gồm tăng trưởng, biệt hóa, di cư

và ức chế chết theo chương trình [58] Hệ thống dẫn truyền tín hiệu PI3K-AKT-mTOR kiểm soát sự trao đổi chất, tăng sinh, kích thước tế bào, sự sống còn và tính di động của

tế bào Trong ung thư, con đường này thường được kích hoạt ở trạng thái tăng hoạt động do tạo ra đột biến đối với các thành viên tham gia vào con đường, chẳng hạn như

EGFR, PI3K, AKT; ngược lại con đường này có thể giảm biểu hiện của gen ức chế

khối u PTEN, từ đó ức chế hoạt động của PI3K Con đường PI3K-AKT-mTOR cũng

rối loạn trong bệnh tiểu đường, tự kỷ và lão hóa [22]

1.5.2 Đột biến EGFR trong trong ung thư phổi

EGFR là nhóm thụ thể mang hoạt tính tyrosine kinase được phát hiện đầu

tiên bởi Carpenter và cộng sự năm 1978 Họ protein EGFR được mã hóa bởi gen

cùng tên nằm trên NST số 7, bao gồm 4 thành viên: EGFR (HER1/ErbB1), HER2

(ErbB2), HER3 (ErbB3) và HER4 (ErbB4) Các protein này có vai trò quan trọng

trong việc điều hòa các quá trình sinh trưởng, phát triển, trao đổi chất và sinh lý của tế bào Phân tử EGFR gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một vùng xuyên màng đặc hiệu và một vùng nội bào Phần ngoài màng của EGFR có trọng lượng khoảng 100 kDa có hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của EGFR Vùng xuyên màng trọng lượng nhỏ chỉ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng Phần trong tế bào có trọng lượng khoảng

60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự

phosphoryl hóa của EGFR [38]

Hoạt tính tyrosine nội bào của EGFR được hoạt hóa khi EGFR liên kết với các phối tử như yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF), Amphiregulin,… Ngay sau khi được hoạt hóa, vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/ kt, sự tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình, tín hiệu Ras/mitogen-activated protein kinase, và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã [38, 43]

Trong tế bào bình thường, sự hoạt hóa của EGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan trọng của tế bào như quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào Tuy nhiên,

sự hoạt hóa quá mức do đột biến của gen EGFR có thể dẫn đến tăng sinh bất

thường cũng như sự chuyển dạng tế bào Quan trọng hơn nữa, những rối loạn hoạt động của EGFR do đột biến có thể dẫn đến bệnh lý ác tính Đột biến xảy ra tại các exon 18- 21 khiến cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt hóa không

phụ thuộc vào chất truyền tín hiệu Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất

sớm và có tỷ lệ khá cao trong UTPKTBN, chiếm khoảng 60% trong các nghiên cứu trên quần th người châu Á

Hình 1.6: Cấu trúc và sự hoạt hóa phân tử EGFR (a) Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR);

(b) Sự hoạt hóa của EGFR khi gắn kết phối tử [38]

Tất cả các đột biến gây hoạt hóa EGFR đều thuộc vùng bám adenosine triphosphate (ATP) của thụ thể tyrosine kinase, cũng đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase [62, 66]. Đột biến gen EGFR

thuộc bốn exon mã hóa vùng tyrosine kinase (exon 18- 21) có tác dụng tăng sự nhạy cảm của khối u hoặc giúp kháng lại thuốc ức chế EGFR tyrosine kinase Những đột biến này được chia làm ba nhóm, trong đó các đột biến quyết định tính nhạy cảm của khối u với thuốc ức chế tyrosine kinase chủ yếu thuộc hai

nhóm I và II (Hình 1.6)

Hình 1.7: Cấu trúc gen EGFR và các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp

ứng với các thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR [66]

- Nhóm I: gồm các đột biến mất đoạn nhỏ ở exon 19, phổ biến nhất là kiểu đột biến mất acid amin vị trí 747-leucine tới acid amin vị trí 749-acid glutamic (đột biến LREA) Dạng đột biến này chiếm khoảng 45% tổng số các đột biến của gen

EGFR

- Nhóm II: gồm các đột biến thay thế một nucleotide làm thay đổi acid amin

ở exon 18 và 21 Đột biến điểm thường gặp nhất là đột biến ở exon 21 thay arginine bằng leucine tại codon 858 (đột biến L858R) Đột biến L858R chiếm khoảng 41%

tổng số các đột biến gen EGFR Một số đột biến khác thuộc nhóm II như đột biến

thay thế glycine ở vị trí 719 (G719) thành serine, alanine hoặc cysteine chiếm 4%; một số đột biến vô nghĩa khác chiếm 6%

- Nhóm III: gồm các đột biến lặp đoạn và thêm đoạn tại exon 20, những đột biến này chiếm khoảng 5% tổng số các đột biến gen EGFR

Những nghiên cứu về đột biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN đã ghi

nhận một số đặc trưng sau đây: chiếm tỷ lệ cao ở nhóm người không hút thuốc lá;

ưu thế hơn ở nhóm ung thư biểu mô tuyến so với các tổn thương mô bệnh học khác của UTPKTBN; nữ giới gặp nhiều hơn so với nam giới, và ở nhóm bệnh nhân Đ ng

Á gặp tỷ lệ cao hơn so với các chủng tộc khác [54, 66]

Cho đến nay, đã có nhiều bằng chứng cho thấy trạng thái cân bằng “tắt - mở” của hoạt tính tyrosine - kinase - EGFR bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi đột biến gen Những phân tích động học đã chứng minh đột biến làm tăng hệ số phân ly của ATP với EGFR và giảm hệ số phân ly của các thuốc EGFR TKI so với khi thụ thể ở trạng thái bình thường Những đột biến này khiến EGFR giảm mạnh ái lực với ATP, giúp các thuốc EGFR TKI không phải cạnh tranh tại vị trí tương tác với thụ thể, thụ thể trở nên nhạy cảm đặc biệt với các thuốc này [66]

Trong số các dạng đột biến gen EGFR, đột biến xóa đoạn exon 19 và đột biến điểm L858R chiếm tới gần 90%, được gọi là đột biến hoạt hóa cổ điển Các đột biến gen EGFR cổ điển thường xảy ra ở những phân nhóm đặc hiệu như các BN có

mô bệnh học là ung thư biểu mô tuyến, không hút thuốc, những người thuộc chủng tộc Đông Á và thường là nữ giới Nghiên cứu của Shigematsu H (2006) [68] cho

thấy có 54% những người không bao giờ hút thuốc có đột biến gen EGFR, trong khi

đó chỉ có 16% những người hút thuốc có đột biến gen EGFR Tần số cao của đột biến gen EGFR gặp ở người không bao giờ hút thuốc cũng phù hợp ở các nhóm dân tộc và địa dư khác nhau Nghiên cứu IPASS (2011) ở châu Á ghi nhận tỷ lệ đột biến gen EGFR là 59,7% trên BN ung thư phổi biểu mô tuyến Ngoài ra các số liệu thống

kê cho thấy có sự khác biệt về kết quả đáp ứng thuốc giữa các nhóm BN mang các dạng đột biến gen EGFR khác nhau Những BN có đột biến ở exon 19 và 21 thường đáp ứng rất tốt với các thuốc EGFR TKI [41] Hơn nữa BN mang đột biến xóa đoạn exon 19 có tỷ lệ đáp ứng thuốc cao hơn và có thời gian sống dài hơn khi được điều trị với liệu pháp ức chế EGFR tyrosine kinase so với BN đột biến điểm ở exon 21 Tuy nhiên những trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến gen EGFR

được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib sẽ phát triển khả năng kháng các thuốc EGFR TKI Khoảng trên 50% BN ung thư phổi không tế bào nhỏ được xác định kháng thuốc liên quan tới đột biến kháng thuốc T790M, do sự thay thế threonine bằng methionin ở vị trí acid amin 790 tại exon 20 [12, 16].

1.5.3 Một số phương pháp/kỹ thuật phát hiện đột biến gen EGFR và biểu hiện

protein EGFR

Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định

sự biểu lộ protein EGFR trên màng tế bào, cũng như phát hiện đột biến gen EGFR,

dựa trên cơ sở tỷ lệ tế bào ung thư trong mô phân tích

1.5.3.1 Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch

Trong những năm gần đây, hóa mô miễn dịch được sử dụng thường quy trong các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh Đây là phương pháp nhuộm đặc biệt giúp chẩn đoán phân biệt các khối u, xác định kiểu hình các loại ung thư thông qua việc đánh giá sự biểu lộ các dấu ấn phân tử, trong đó có việc phát hiện sự biểu lộ protein EGFR

Nhuộm hóa mô miễn dịch là phương pháp phát hiện gián tiếp sự bộc lộ quá mức của protein EGFR mã hóa bởi các gen EGFR đột biến trên màng tế bào Kỹ thuật xác định sự hiện diện và vị trí của kháng nguyên trong các thành phần tế bào như bào tương, màng và nhân tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học thông qua việc xác định sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể

Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, rẻ tiền, tuy nhiên độ chính xác không phải tuyệt đối Một nghiên cứu của Brevet (2010) [15] về độ nhạy của hóa

mô miễn dịch phát hiện đột biến gen EGFR exon 19 có độ nhạy là 76-95%

1.5.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp

Đây là phương pháp thường được sử dụng để xác định các đột biến gen trong ung thư Tuy nhiên, để đảm bảo cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao thì mật độ tế bào ung thư trong mô phân tích > 30% DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô ung thư được sử dụng để khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các exon 18 - 21 của gen EGFR Sản phẩm DNA sau khi tinh sạch được đưa vào

giải trình tự trực tiếp và đối chiếu với trình tự của gen EGFR hoang dại trên gen bank để phát hiện đột biến [7].

1.5.3.3 Kỹ thuật EGFR Stripassay

EGFR Stripassay là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến và công nghệ lai đầu dò đặc hiệu, để phát hiện các đột biến Trong đó, nguyên

lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase Một phân tử DNA được khuếch đại hoàn chỉnh khi đầu dò 3’của mồi

và sợi khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’của mồi không bổ sung với sợi khuôn thì phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó chiếm một tỷ lệ rất nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA [75]

Kỹ thuật EGFR Stripassay cho phép phát hiện 16 đột biến có liên quan đến mức độ đáp ứng thuốc của gen EGFR: G719A, G719C và G719S (Exon 18); 10 dạng đột biến xóa đoạn/thêm đoạn thường gặp ở exon 19; T790M (Exon 20); L858R và L861Q (Exon 21)

1.5.3.4 Kỹ thuật Scorpions - Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS)

Scopion ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpion trong phản ứng Real time PCR, để phát hiện các đột biến Nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử DNA, khi một đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn, phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến, ngay cả trong trường hợp alen đột biến

đó, chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn DNA Kỹ thuật Scorpion ARMS

cho phép phát hiện được 29 dạng đột biến của gen EGFR [10]

1.5.4 Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi

Biểu hiện protein có liên quan mật thiết đến sự methyl hóa và khuếch đại gen

EGFR [41, 48] Methyl hóa làm giảm sự biểu hiện protein trong khi khuếch đại gen

lại tăng cường mức độ biểu hiện [48, 65] Mức độ biểu hiện protein được chia thành các cấp độ khác nhau từ 0 đến 3+ tùy thuộc vào cường độ và tỷ lệ phần trăm tế bào

có sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt [50] Phương pháp xác định mức độ biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào phổ biến nhất hiện nay là hóa mô miễn dịch, sử dụng những kháng thể kháng EGFR đặc hiệu kết hợp với hệ enzyme – cơ chất tạo mầu đặc trưng có thể quan sát bằng kính hiển vi quang học [41] Khoảng 60 – 80% trường hợp ung thư biểu mô tuyến của phổi có sự biểu hiện protein EGFR, trong đó

sự biểu hiện quá mức EGFR chiếm khoảng 35 – 50% [41, 65] Sự biểu hiện EGFR cũng phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh Có đến 50% trường hợp bệnh nhân ở giai đoạn III có sự biểu hiện quá mức EGFR trong khi đó tỷ lệ này ở giai đoạn I và II lần lượt là 20% và 25% Sự biểu hiện quá mức EGFR cũng đi kèm với tiên lượng xấu cho bệnh nhân, thể hiện ở việc tăng nguy cơ xâm lấn hoặc di căn; trong khi sự ức chế biểu hiện EGFR dẫn đến giảm sự phân chia tế bào ung thư, sự

di cư, hình thành mạch máu và quá trình apoptosis trong các khối u thể rắn [65, 78].Biểu hiện EGFR trong tế bào ung thư được kiểm soát chặt chẽ, tuy nhiên cơ chế kiểm soát chưa được nghiên cứu đầy đủ Điều hòa di truyền ngoại gen là cơ chế sinh học mà gen được biểu hiện hay bị kìm hãm thông qua quá trình methyl hóa DNA, biến đổi Histone và miRNA, trong đó phổ biến và tập trung nhiều hơn cả là methyl hóa DNA Nghiên cứu về trạng thái methyl hóa vùng promoter liên quan đến biểu hiện protein EGFR tạo điều kiện cho sự phát triển các dấu ấn sinh học hữu ích trong thử nghiệm lâm sàng [78]

1.5.5 Một số nghiên cứu về đột biến gen EGFR của bệnh nhân ung thư phổi

biểu mô tuyến

1.5.5.1 Nghiên cứu về tỷ lệ và các loại đột biến gen EGFR

Cho tới nay đã có nhiều các công bố trong nước về tỷ lệ đột biến gen EGFR

và tỷ lệ của các vị trí đột biến từ exon 18 đến exon 21 Nguyễn Minh Hà (2014), áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS xác định đột biến gen EGFR trên

120 mẫu mô ung thư phổi không tế bào nhỏ, được tỷ lệ là 50,8%, trong đó đột biến xóa đoạn LREA tại exon 19 và đột biến điểm L858R chiếm tỷ lệ cao nhất là 44,3%

và 37,7%; 9 loại đột biến khác chiếm tỷ lệ thấp hơn [5] Theo nghiên cứu của

Hoàng Anh Vũ (2014)) trên 332 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã phát hiện tỷ lệ đột biến gen EGFR là 40,7% Đột biến xảy ra nhiều nhất ở exon 19 (19%) tiếp đến là exon 21 (16,9%), mỗi exon 18 và 20 cùng xuất hiện đột biến với tỷ lệ 3,6% Đột biến thường gặp ở bệnh nhân nữ (48,9%) nhiều hơn nam (35%) [11].

Các nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi được quan tâm vì đột biến này liên quan tới đáp ứng trong điều trị với các thuốc TKI và tiên lượng của bệnh nhân Nghiên cứu của Riely G J (2006) nhận thấy bệnh nhân đột biến exon 19 có thời gian sống trung bình dài hơn exon 21 (34 tháng so với 8 tháng, p = 0,01) [56]

Nguyễn Minh Hà (2012) so sánh hiệu quả sau 3 tháng của liệu pháp EGFR TKI ở hai nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có và không có đột biến gen EGFR cho thấy tỷ lệ đáp ứng tương ứng của hai nhóm là 60% và 16,7% [4].Như vậy, xét nghiệm đột biến gen EGFR trong ung thư phổi biểu mô tuyến có giá trị trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, tiên lượng và dự báo thời gian sống thêm cho bệnh nhân

1.5.5.2 Nghiên cứu về mối liên quan giữa lâm sàng, cận lâm sàng và đột biến gen EGFR

* Liên quan về sắc tộc, giới tính và tiền sử hút thuốc:

Đột biến EGFR thường gặp ở nữ giới nhiều hơn nam giới (38% so với 10%)

và những người không hút thuốc gặp nhiều hơn người từng hút thuốc (54% so với 16%) [68] Theo Sasaki H (2005) tình trạng đột biến gen EGFR tương quan đáng

kể với giới tính, hút thuốc lá và các phân nhóm bệnh lý của ung thư phổi [60].Nghiên cứu IPASS (2011) cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến ở nữ lên tới 76,7% và ở bệnh nhân không hút thuốc là 92,7% [25] Cai X (2014) phân tích đột biến gen EGFR trên 76 bệnh nhân ung thư phổi cũng cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nữ cao hơn ở nam với tỷ lệ tương ứng là 61,1% và 25,0% [17]

Nghiên cứu PIONEER (2014) trên bệnh nhân châu Á cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nữ cao hơn so với nam (61,1% so với 44%), bệnh nhân không hút

thuốc có tỷ lệ đột biến gen EGFR cao hơn bệnh nhân đã từng hút thuốc (60,7% so với 43,2%) Tình trạng đột biến gen EGFR dương tính gặp phổ biến hơn ở những bệnh nhân có tiền sử hút thuốc với số gói - năm: từ 0 - < 10 (57,9%); 10 - < 20 (45,9%); 20 - < 30 (45,8%) Tình trạng đột biến gen EGFR âm tính phổ biến hơn ở những bệnh nhân có tiền sử hút thuốc với số gói - năm: 30 - < 40 (73,6%); 20 - < 30 (54,2%); 10 - < 20 (54,1%) Số gói/năm nổi lên như là một yếu tố có ý nghĩa thống

kê (p < 0,001) [67]

* Liên quan với giai đoạn bệnh

Nghiên cứu về lâm sàng của đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, Riely G.J (2006) nhận thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở giai đoạn I: 23%, giai đoạn II: 3%, giai đoạn III: 17% và giai đoạn IV: 57% [56] Về mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen EGFR với giai đoạn bệnh: kết quả nghiên cứu PIONEER (2014) nhận thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nhóm bệnh nhân giai đoạn

IV là 53,5%; giai đoạn IIIB là 43,2% và giai đoạn còn lại là 48,6% [67]

* Liên quan đột biến gen EGFR với mô bệnh học, hình ảnh tổn thương trên chụp CLVT phổi và chỉ số maxSUV trên PET/CT

Đánh giá mối liên quan giữa chỉ số maxSUV đo bằng PET/CT và đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn IV, Lee S.Y (2015) [39]nhận thấy giá trị maxSUV thấp hơn trong các trường hợp ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn IV có đột biến gen EGFR

* Liên quan với mức độ biểu lộ protein EGFR

Một số nghiên cứu ở trong và ngoài nước cũng đề cập tới mối liên quan giữa đột biến gen EGFR và mức độ biểu lộ protein EGFR Hứa Thị Ngọc Hà (2014), tiến hành nghiên cứu đối chiếu kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch và giải trình tự gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ, phát hiện tỷ lệ đột biến gen EGFR là 54,2% và 36,1% có biểu lộ quá mức protein EGFR Các trường hợp biểu lộ quá mức protein EGFR sẽ có đột biến gen EGFR cao gấp 3,5 lần những trường hợp có biểu hiện protein EGFR thấp Có 21% không đột biến gen EGFR nhưng có biểu hiện protein EGFR cao [3] Italiano A (2006) nghiên cứu so sánh EGFR ở u

nguyên phát và vị trí di căn ở 30 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng hóa

mô miễn dịch thấy biểu lộ protein EGFR là 66,7% ở khối u nguyên phát và 53,3% ở

vị trí di căn Đáp ứng điều trị tốt hơn ở những bệnh nhân không hút thuốc, nữ giới,

có typ mô bệnh học là ung thư phổi biểu mô tuyến và người Đông Á [31]

Các nghiên cứu cho đến nay đều đưa ra kết luận là nếu kết hợp nhiều yếu

tố như chủng tộc, tuổi, giới, tình trạng hút thuốc, tổn thương trên phim chụp CLVT phổi, SUVmax trên PET/CT, hóa mô miễn dịch biểu lộ protein EGFR sẽ làm tăng khả năng dự báo tình trạng đột biến gen EGFR trên lâm sàng, điều này góp phần tăng hiệu quả điều trị của ung thư phổi biểu mô tuyến Do vậy, đề tài của chúng tôi được tiến hành với mong muốn tìm ra tỷ lệ đột biến EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến được điều trị tại bệnh viện Đa khoa Phú Thọ và bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 140 bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến điều trị nội trú tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ từ 10/2020 đến 10/2022

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

+ Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định ung thư phổi biểu mô tuyến bằng xét nghiệm mô bệnh học, tế bào học

+ Bệnh phẩm được thu thập bằng các phương pháp sau: sinh thiết xuyên thành ngực, nội soi phế quản ống mềm, sinh thiết hạch ngoại vi, dịch màng phổi, mẫu mô khối u sau phẫu thuật

+ Các BN được làm xét nghiệm đột biến gen EGFR và nhuộm HMMD phát

hiện biểu lộ protein EGFR

+ Bệnh nhân trên ≥ 18 tuổi

+ Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ

- Không có đủ các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân trước đó đã điều trị hóa chất, xạ trị và điều trị đích

- Bệnh nhân mắc các bệnh ung thư khác ngoài phổi và các bệnh lý tự miễn: lupus, viêm đa cơ tiến triển, đái tháo đường týp I

Vật liệu nghiên cứu: 140 mẫu bệnh phẩm đúc paraffin từ bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi được Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ cung cấp trong thời gian từ năm 2020 đến 2022 Mẫu được lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn: Bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến có nguồn gốc

từ phổi được chẩn đoán bằng mô bệnh học dựa trên phương pháp nhuộm H&E (Hematoxiline và Eosine) và chẩn đoán loại trừ là khối u di căn từ cơ quan khác đến bằng nhuộm hóa mô miễn dịch Năm (05) mẫu mô phổi lành được thu thập từ vùng

mô cách khối u 5 – 7 cm Đặc điểm về mô bênh học của từng mẫu bệnh phẩm được xác định và phân loại bởi các chuyên gia giải phẫu bệnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ Thông tin lâm sàng và

chẩn đoán của bệnh nhân đƣợc tiến hành thu thập tại các khoa lâm sàng - Bệnh viện

đa khoa tỉnh Phú Thọ đƣợc trình bày trong (phụ lục 1)

2.2 Cỡ mẫu

- Cỡ mẫu đƣợc tính theo công thức

2

2 ) 2 / 1 (

) 1 (

d

p p

Z là hệ số tin cậy, ở mức xác suất 95%, Z = 1,96

p là tỷ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thƣ phổi biểu mô tuyến,

p=0,642 dựa theo kết quả của nghiên cứu PIONEER [67]

d là độ chính xác mong muốn, d = 0,08

Áp dụng công thức trên cỡ mẫu lý thuyết cần là 138 bệnh nhân

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập đƣợc 140 bệnh nhân

- Chọn bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn nghiên cứu cho đến khi đủ số lƣợng bệnh nhân theo ƣớc định cỡ mẫu

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

* Thiết bị và dụng cụ:

+ Tủ lạnh âm sâu (-20oC, -80oC)

+ Lò vi sóng

+ Máy ly tâm để bàn, máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5424R)

+ Máy ủ nhiệt kèm lắc rung (Eppendorf Thermomixer comfort)

+ Máy định lƣợng DNA huỳnh quang (Qubit® 2.0 Fluorometer)

+ Máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự động Benchmark XT

+ Hệ thống điện di, máng đổ gel, lƣợc tạo giếng

+ Máy soi và chụp ảnh tự động gel agarose đã điện di

+ Máy đo quang phổ

+ Bể ủ nhiệt

+ Buồng hút

+ Máy PCR

+ Pipettor, pipette tip, polypropylene tube (10µL, 200µL, 1000µL)

+ Phương tiện để đọc và phân tích kết quả trên kính hiển vi quang học Carl Zeissxioscope 40 với các vật kính có độ phóng đại 5x, 10x, 20x, 40x và 100x, kèm camera AxioCam, có kết nối với máy tính để phân tích kết quả, chụp ảnh và lưu dữ liệu

* Hóa chất chính:

+ Hóa chất tách chiết DNA từ mô UTP

+ Dung dịch xylene, ethanol 100%

+ Kit tách DNA từ mô FFPE (QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Cat No 157015287), Reliaprep TM Blood gDNA Miniprep (Promega, Cat No A5081))

+ Kit định lượng DNA theo nguyên tắc huỳnh quang (Qubit™ dsDNA HS, Molecular Probes, ReliaprepTM Blood gDNA Miniprep, Promega)

+ Kit xác định đột biến gen EGFR (EGFR StripAssay®, ViennaLab)

+ Các kháng thể kháng EGFR là các kháng thể đơn dòng EGFR SP84 được sản xuất bởi hãng Cell Marquer (Mỹ); dung dịch bộc lộ kháng nguyên Nồng độ pha loãng kháng thể và quy trình nhuộm theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với từng loại kháng thể Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gen Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Kích thước (bp)

EGFR

N_000007.14

EGFR UnF ggt tgg gtt tgt aag ttt gt 150 [40] EGFR UnR ata aac aac aat aac ccc ca 150 [40] EGFR Me F1 ttt atg cgt cgt ttt att ttc gtc 495 [51] EGFR MeR1 cgg tcg ttt cgg agg gtc gta tcg 150 [51] EGFR MeF2 tgt ttt tcg cgt ttc ggt tcg cgc 158 [65] EGFR MeR2 cgt cta aac gac gac gcc gcc g 150 [65]

2.4 Sơ đồ nghiên cứu

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang và tiến cứu, thông tin bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu được sự cho phép của bệnh nhân và Bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ

Kết luận 1

Phân tích tỷ lệ đột biến của gen

EGFR trên bệnh nhân ung thư

biểu mô tuyển ở phổi

Kết luận 2

Đánh giá mức độ biểu hiện của

gen EGFR và mối liên quan giữa

đột biến với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến

- - Vị trí đột biến (exon 18-exon 21)

Thu thập thông tin nghiên cứu:

- Tuổi, giới, tiền sử hút thuốc, giai đoạn bệnh, di căn…

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu:

Các bệnh nhân sẽ được khai thác các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng theo mẫu bệnh án nghiên cứu (phụ lục 2), bao gồm:

Các thông tin chung:

- Tuổi, giới tính, dân tộc, địa chỉ

Các đặc điểm lâm sàng

- Các triệu chứng hô hấp: ho, khạc đờm, ho ra máu, đau ngực, khó thở

- Các triệu chứng toàn thân: mệt mỏi, gầy sút cân, hạch ngoại vi

- Đánh giá điểm thể trạng theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới năm

2004

Bảng 2.2: Đánh giá toàn trạng dựa theo tiêu chuẩn của WHO 2004

Bậc 0 (PS0) Hoạt động bình thường

Bậc 1 (PS1) Mệt, hoạt động bị hạn chế ít

Bậc 2 (PS2) Nằm tại giường dưới 50% thời gian ban ngày

Bậc 3 (PS3) Nằm tại giường trên 50% thời gian ban ngày

- Các hội chứng cận ung thư

- Tiền sử gia đình: ông, bà, bố, mẹ, anh, chị, em, con mắc UTP

- Tiền sử bản thân:

+ Hút thuốc lá, thuốc lào

+ Ảnh hưởng của môi trường, tiếp xúc chất độc hại

+ Tiền sử có các bệnh đồng mắc: bệnh lý hô hấp (bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, hen, lao phổi, ); bệnh tim mạch tăng huyết áp, bệnh mạch vành, rối loạn nhịp tim); các rối loạn chuyển hóa

Các đặc điểm cận lâm sàng:

- Mô tả vị trí, kích thước, số lượng và các đặc điểm hình thái, tính chất xâm lấn của u trên hình ảnh XQ lồng ngực tiêu chuẩn và hình ảnh chụp cắt lớp vi tính lồng ngực có tiêm thuốc cản quang

- Kết quả chẩn đoán mô bệnh học: áp dụng theo hệ thống phân loại mô bệnh học của WHO năm 2015 cho các khối u phổi, màng phổi [81] (phụ lục 4)

- Chẩn đoán giai đoạn TNM: Bệnh nhân có thể được chụp PET-CT hoặc cộng hưởng từ toàn thân hoặc tối thiểu là cộng hưởng từ não, xạ hình xương toàn thân và siêu âm ổ bụng để đánh giá các tổn thương di căn xa trong ung thư phổi Đánh giá giai đoạn ung thư dựa vào hệ thống phân loại TNM cho UTP lần thứ 8 năm 2018 [21] (phụ lục 5)

2.5.2 Phương pháp xét nghiệm mô bệnh học và đánh giá mức độ biểu hiện protein EGFR trên màng tế bào

Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch mô lành:

- Các tiêu bản dùng để nhuộm hóa mô miễn dịch được cắt từ chính bệnh phẩm đúc trong khối nến paraffin đã được nhuộm HE trước đó, nhuộm bằng máy nhuộm hóa mô miễn dịch Bench Mark Ultra, Ventana (Roche)

- Các bước chuẩn bị:

+ Cắt 3 - 4 µm bằng máy cắt HM325 (Microm, Đức) trên lam tích điện dương (Hydrophilic Slide/BioSB - Mỹ) để khô 37oC qua đêm Với các trường hợp không có chứng dương nội sinh, cắt ghép thêm chứng dương tùy theo loại kháng thể

+ Khởi động máy, tạo protocol cho từng kháng thể, lựa chọn UtralView DAB Detection Kit hoặc OptiView DAB Detection Kit (theo từng kháng thể, theo khuyến các của nhà sản xuất) để hiển thị các bước xử lý tương ứng với bộ kit

- Quy trình nhuộm máy BenchMark Ultra (Ventana) bao gồm:

+ Loại bỏ paraffin

+ Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch Cell conditioning 1 trong 64 phút + Ủ kháng thể trong 16 phút

+ Nhuộm nhân với Hematoxylin trong vòng 4 phút Để phát hiện màu, sử dụng kit UltraView Unveral DAB Sau đó, lam được rửa sạch trong nước với chất tẩy nhẹ, làm trong bằng xylen và gắn lamen

+ Luôn có tiêu bản chứng âm, chứng dương trong mỗi đợt chạy máy Tiêu bản chứng âm (trong quá trình nhuộm bỏ qua giai đoạn kháng thể thứ nhất) và chứng dương (tiêu bản mô đã biết chắc chắn là dương tính)

Đánh giá kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch

- Âm tính: chỉ có màu xanh của nhân; Dương tính: màu vàng nâu

* Ghi chú: Sử dụng toàn bộ các kháng thể và hóa chất của Hãng Dako Cytomation, Đan mạch Nồng độ pha kháng thể và quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với mỗi loại kháng thể và được cài đặt bởi chuyên gia vận hành máy Ventana (Roche)

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch protein EGFR

Sự biểu hiện của protein EGFR được xác định thông qua phương pháp

nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng EGFR (CONFIRM anti-EGFR – 5B7) trên hệ thống tự động Benchmark XT và bộ kit phát hiện Ultra View Universal DAB Detection Kit (Roche - Gemany) Trong phương pháp hóa mô miễn dịch (hình 2.1) phát hiện sự biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào, protein được coi như một kháng nguyên bề bặt và được gắn được hiệu với kháng thể thứ nhất CONFIRM anti – EGFR – 5B7 Sau đó phức hệ kháng nguyên – kháng thể tiếp tục được gắn với kháng thể thứ 2 hai là kháng thể kháng với kháng thể thứ nhất Phần chuỗi nặng của kháng thể thứ hai được gắn với peroxidase (HPR – horseradish peroxidase) Cuối cùng cơ chất DAB (3, 3 – diaminobenzidine) trong bộ kit phát hiện được đưa vào phức hệ kháng nguyên – kháng thể Enzyme peroxidase gắn với kháng thể thứ hai sẽ phân hủy DAB để tạo ra kết tủa có màu nâu và có thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học (hình 2.1) Kết quả biểu hiện protein EGFR được đánh giá gián tiếp thông qua số lượng tế bào bắt màu cũng như cường độ bắt màu DAB của màng tế bào Sự biểu hiện EGFR được đánh giá thông qua 4 cấp độ: Không có sự biểu hiện protein (0); biểu hiện yếu (1+); biểu hiện vừa (2+); biểu hiện mạnh (3+) với trên 10% tế bào có sự biểu hiện protein trên bề mặt Trong đó mức

độ 0 và 1+ được coi là âm tính, mức độ 2+ và 3+ được coi là dương tính đối với sự biểu hiện protein [77]

Hình 2.1 Phương pháp hóa mô miễn dịch protein EGFR [74]

- Một số trường hợp nhuộm HE thường quy mà không xác định được ung thư phổi biểu mô tuyến, khi đó phải sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

để giúp phân biệt bản chất, nguồn gốc tế bào, mô u Các mẫu mô dương tính với marker : NapsinA, TTF1, CK7 qua nhuộm hóa mô miễn dịch, được chẩn đoán là ung thư phổi không tế bào nhỏ xu hướng biệt hóa tuyến