Luận văn thạc sĩ Công nghệ vật liệu: Tổng hợp và nghiên cứu thực nghiệm "In vitro" thuỷ tinh y sinh 45S5

Các sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học đã được thương mại hóa và được su dụng như những vật liệu xương nhân tạo trong y khoa.. Thực nghiệm “*“in vitro’’ ngâm bột thủy tinh trong dung

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYEN NGỌC THY

TONG HỢP VA NGHIÊN CUU THUC NGHIEM

"IN VITRO" THUY TINH Y SINH 4585

Chuyên ngành : Công Nghệ Vật Liệu Vô Co

Mã số : 605290

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 12 năm 2015

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYEN NGỌC THY

TONG HỢP VA NGHIÊN CUU THUC NGHIEM

"IN VITRO" THUY TINH Y SINH 4585

Chuyên ngành : Công Nghệ Vật Liệu Vô Co

Mã số : 605290

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Xuân Vương

TP HO CHI MINH, tháng 12 năm 2015

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : cccccccesccsssssssscsssesescssecscscscscsescsescsssesssesssssees

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông cham bảo vệ luận văn thạc si)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CONG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THAC SY

Họ tên học viên: NGUYÊN NGỌC THY MSHV: 11030700

Ngày, tháng, năm sinh: 17 - 10 -1984 Noi sinh: Long An

Chuyên ngành: Công Nghệ Vật Liệu Vô Cơ Mã số : 605290

I TEN DE TÀI

TONG HỢP VÀ NGHIÊN CUU THUC NGHIEM "IN VITRO"

THUY TINH Y SINH 4585

H NHIỆM VU VA NOI DUNG

— Xử lý nguyên liệu cát trang Cam Ranh đạt hàm lượng SiO, trên 96%

— Tổng hợp thủy tinh bằng phương pháp nấu chảy trong lò điện đến 1450°C

— Phân tích XRD, XRF, FTIR, SEM để đánh giá chất lượng thủy tinh tổng hợp được

— Tiến hành thực nghiệm “ in vitro” bằng dung dịch SBF (Simulated Body Fluid) dé

đánh giá hoạt tính sinh học của thủy tinh y sinh

— Tiến hành thực nghiệm “ in vitro” băng thử độc tính tế bào để đánh giá hoạt tính sinhhọc của khối thủy tỉnh y sinh

—- Đánh giá tính chất co học của khối thuỷ tinh y sinh

HI NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 6/7/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 31/ 12/ 2015

Vv CÁN BO HƯỚNG DAN: TS Bùi Xuân Vương

LOI CAM ON

Đề hoàn thành luận văn nảy, em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến thầy TS Bùi XuânVương, người đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thực hiện và viết báo cáo này

Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Vật Liệu

Vô Co đã tận tình hộ trợ giúp đỡ kiến thức và điều kiện tốt dé em thực hiện luận văn này.Với kiến thức mà em đã học được trong thời gian qua chắc chắn sẽ rất có ích và giúp em

vững tin hơn trong hành trang tương lai, sự nghiệp của mình.

Chân thành cảm ơn các em sinh viên đã đồng hành cùng chị trong suốt thời gianqua với bao nhiêu khó khăn vấp phải trong quá trình thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn những người thân trong gia đình luôn quan tâm, chăm sóc, ủng hộ, động viên tôi trên bước đường mà tôi đã chọn.

Cuối cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô va các bạn déi dào sức khỏe, thành

công và hạnh phúc.

Xin chan thành cam on!

Tp Hồ Chi Minh, thang 12 năm 2015

Nguyễn Ngọc Thy

TÓM TAT LUẬN VAN

Thủy tinh hoạt tính sinh học (Bioactive glass) lần đầu được phát minh năm 1969

bởi nhà khoa học Larry Hench tai University of Florida and Imperial College London.

Thanh phan của những thủy tinh này gồm: SiO, CaO, PzOs, Na;O Hoạt tính sinh học củachúng là khả năng tạo một lớp Hydroxyapatite: Ca¡o(PO4)s(OH); trên bề mặt khi nhữngvật liệu này được ngâm trong dung dịch mô phỏng dịch thể người hay cây ghép trong cơthé người Lớp Hydroxyapatite là thành phan chính của khoáng xương, do vậy nó chophép những liên kết hóa học giữa miếng ghép nhân tạo và xương tự nhiên Nhờ sự cau taomới của lớp Hydroxyapatite những phan xương hỏng được phục hồi va thay thé Sau sựkhám phá của Larry Hench, nhiều hệ thủy tinh hoạt tính sinh hoc đã được nghiên cứu vàtổng hợp

Các sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học đã được thương mại hóa và được su

dụng như những vật liệu xương nhân tạo trong y khoa Vật liệu thủy tinh sinh học hiện

đang được nhập ngoại về các bệnh viện ở Việt Nam dùng để trám răng hay cay ghépxương trong phẫu thuật chỉnh hình Hầu như chưa có san phẩm nào được chế tạo trong

nước.

Trong dé tài này, chúng tôi nghiên cứu tổng hợp hệ thủy tinh hoạt tính sinh học45%S¡iO; — 24,5%CaO — 24,5%Na;O — 6%PzOs (theo % khối lượng) bằng phương phápnung nóng chảy tiền chất ở nhiệt độ cao Chúng tôi đã sử dụng một phần nguyên liệu làcát trắng rẻ tiền, sẵn có trong nước nhăm mục đích cung cấp SiO, cho hệ thủy tinh Cáttrăng sau khi xử lý loại bỏ tạp chất, cùng với một số nguyên liệu khác, được đưa vào lònau chảy ở 1450°C trong 2 giờ Thủy tinh nóng chảy được làm nguội nhanh bằng nước

Các phương pháp phân tích lý hóa hiện đại như XRF, XRD, FTIR va SEM được sử

dụng dé phân tích vật liệu Thực nghiệm “*“in vitro’’ ngâm bột thủy tinh trong dung dichgiả dịch thé người SBF (Simulated Body Fluid) được tiến hành dé kiểm tra hoạt tính sinhhọc của vật liệu tổng hợp (khả năng hình thành khoáng xương) Các kết quả phân tíchkhang định hoạt tính sinh học cua vật liệu thủy tinh qua sự hình thành lớp khoáng xương

Từ các kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của vật liệu thủy tinh, chúng tôi bước

dau đi giải thích và kiêm nghiệm cơ chê hoạt tính sinh học của vật liệu.

Một sô thông sô về cơ lý của vật liệu cũng được đánh giá.

Thử nghiệm độc tinh của thủy tinh trong môi trường nuôi cấy tế bao đang đượctiễn hành nhằm kiểm tra tinh tương thích sinh học của vật liệu tong hop./

Bioactive Glass (Bioactive glass) was first invented in 1969 by Larry Hench scientist at the University of Florida and Imperial College London The composition of the glass include: SiO2, CaO, P2Os5, Na¿O Their bioactivity is the ability to create a layer

of Hydroxyapatite: Ca¡o (PO4)¢ (OH) on the surface when these materials are soaked in

a solution simulating human or implanted in the human body Hydroxyapatite layer is the main component of bone mineral, thus allowing the chemical bonding between the bone graft with artificial and natural Because of new Hydroxyapatite layer, structure of the broken bone is restored and replaced After the discovery of Larry Hench, multiple bioactive glass has been studied and synthesized.

The Bioactive glass products has been commercialized and used as artificial bone materials in medicine Bioglass currently is being imported to the hospital for fillings bone or implants in orthopedic surgery in Vietnam Hardly any of the products

manufactured in the country.

In this thesis, we study to synthetic bioactive glass 45% SiO, 24.5% CaO 24.5% Na¿O - 6% P20s5 (wt%) by method for melting in high temperature material We have used a portion of materials are inexpensive white sand, available in the country aimed at providing SiO, glass system White sand after processing the removal of

-impurities, along with some other materials, are included in melting furnaces at 1450 ° C for 2 hours Melting glass is rapidly cooled by water.

The analytical modern method of as XRF, XRD, FTIR and SEM was used to analyze the material Experiments' in vitro " glass powder soaked in a Simulated solution

of human SBF (Simulated Body Fluid) was conducted to examine the biological activity

of the synthetic material (capable of forming bone mineral) The analysis results

confirmed bioactive glass material through the formation of new bone mineral layer on

the substrate surface after testing "in vitro ' The results of the evaluation of bioactive glass material, we initially go explain and tested mechanisms of biologically active material Some mechanical parameters of materials were also evaluated.

Toxicity tests of bioglass in the cell culture medium is being conducted to test the biological compatibility of synthetic materials /.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi và được sự

hướng dẫn khoa học của Ts Bùi Xuân Vương Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đềtài này là trung thực Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhậnxét, đánh giá được chính nhóm tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trongphân tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một sô nhận xét, đánh giá cũng như sô liệu của các tac giả khác, cơ quan tô chức khác đêu có trích dân và chú thích nguôn gôc.

Nêu phát hiện có bat kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình.

Tp Hồ Chi Minh, thang 12 năm 2015

Nguyễn Ngọc Thy

1.2.2 Ghép xương sử dụng Vật liệu y sinh xương nhân tạo

1.3 Vật liệu xương nhân tạo - Thủy tinh hoạt tinh sinh học PaOs 5

SiO,-Na,O0-CaO-1.3.1 Giới thiệu về thủy tinh

1.3.2 Thanh phân, cấu trúc và tính chất hóa học của Thủy tinh hoạt tính

sinh học

1.3.3 Thuy tinh sinh học 45S5

1.3.4 Tính chất hóa học của thủy tinh

1.3.5 Các phương pháp tông hợp thủy tinh hoạt tính sinh học

2 CHUONG 2 THUC NGHIEM

2.1 Quy trình tong hợp thủy tinh hoạt tính sinh học 45SiO, 24,5CaO

-2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.2.2 Quy trình tổng hợp dung dịch SBF 19

2.2.3 Thực nghiệm Invitro ngam bột thủy tinh trong dung dịch SBF 21

2.3 Thực nghiệm kiểm tra tính độc của vật liệu trên tế bào 222.4 Phương pháp xác định độ xốp của vật liệu [29 30] 26

3 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP LÝ HÓA ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU 28

3.1 Phân tích huynh quang tia X (X-ray Flourescence XRF) [17] 283.2 Phân tích nhiễu xa tia X (XRD) [18-22] 303.3 Phân tích cau trúc băng phố hồng ngoại (FTIR) [22] 323.4 Quan sát bang kính hiền vi quét điện tử (SEM) [23] 34

3.5 Phương pháp phân tích nhiệt vi sai 35

3.6 Kiểm tra độ bền nén xuyên tâm 37

4 CHƯƠNG 4 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 384.1 Phân tích thành phan, cấu trúc và đặc điểm cơ lý của thủy tinh tổng hợp - 384.1.1 Phân tích cau trúc thủy tinh bằng XRD 384.1.2 Phân tích phố hong ngoại FTIR 404.1.3 Quan sát bằng Kính hiển vi điện tử quét SEM 414.2 Đánh giá hoạt tính sinh học qua sự hình thành khoáng xương trên bề mặt

thủy tinh sau thực nghiệm In vitro 42

4.2.1 Phân tích XRD 42

4.2.2 Kết quả phân tích quang phố hong ngoại FTIR 444.2.3 Kết quả kính hién vi điện tử quét SEM 464.2.4 Đánh giá cơ chế hoạt tính sinh học vật liệu thủy tỉnh 474.2.5 Đánh giá cơ chế hoạt tính sinh học 48

4.3 Độc tính của thủy tinh y sinh trên tế bào

4.4 Đánh gia một số đặc tính cơ ly của vật liệu thủy tinh

5 CHUONG 5: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO

lil

49

50 54 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.1: Giới thiệu một số hình ảnh sử dụng vật liệu xương và một số sản phẩm

Vat liGu NHAP 49) 01170Ẽ7Ẻ78.— 4

Hình 1.1.2: Một số hình ảnh ứng dụng của vật liệu Thủy tính hoạt tính sinh học 5Hình 1.1.3: Mặt cắt 2 chiều của (a) oxit SiO, và (b) thủy tinh siÏic - 6Hình 1.1.4: Các tứ diện SiO, liên kết với nhau qua đỉnh O trong mạng lưới thủy

001/0 7

Hình 1.1.5: Quá trình bẻ gãy liên kết Si-O-Si nhờ oxit CaO -. 5<: 7Hình 2.1: Hóa chat dùng trong thực nghiệm - 2-2 25 2+x+£++x+£xcxzxcxecxee IIHình 2.2: Cát trang nguyên liệu Cam Ranh ¿2-25 ++s+s£+x+£++x+zx+xzecxecxee IIHình 2.3: Cân phối liệu ¿- - ©- £ £ 2 SE+EEE£EEEEEEEEEEEEEEEEE11 212121211 cee 16Hình 2.4: Chén Pt đựng phối liệu nấu thủy tinh cccceccceseeesesseseeseseeseseeseeeesen l6Hình 2.5: Lò nau thủy tinh có thé đạt nhiệt độ 1600°C - 25552 scsc5+¿ l6Hình 2.6: Nấu thủy tinh ở nhiệt độ 1450°C -¿-¿- 552252 2x+2+tvEcrerxrrererrereee 17Hình 2.7: Gap chén Pt chứa thủy tinh nóng Chay - 5 + +52 s+c+cecxscscxee 17

Hình 2.8: Rot thủy tinh nóng chảy VÀO THƯỚC SG ng ngư 18

Hình 2.9: Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học thu được - -« «<< <5 18Hình 2.10: Nghién thủy tinh thành bột Min cecseseeseseeseseeseseesesseseeeseeeseeees 18Hình 2.11: Hóa chất tinh khiết dùng tong hop SBF c.ceeccessssesseseseseesesesseeeeseseesen 20Hình 2.12: Tong hợp dung dich SBF c.ccccccscsscssssessesessssessesessssessesessesesssseeseseeseeesen 21Hình 2.13: Điều chỉnh pH = 74 và nhiệt độ là 37 °C trong quá trình tổng hop SBF

Hình 2.18 Bình Pycnomet - 5 G5 E300 0 0 nọ re 27

Hình 3.1: Nguyên tắc của bức xạ huỳnh quang tia X - 552 s5 cs+cee 28

Hình 3.2: Máy đo phố nhiễu xạ tia X (XRD) 5-52 CS SE EEkkErkrkrkere 32Hình 3.3: Sơ đồ khối máy phân tích hong ngoại 252 2552 scxscszcee 33Hình 3.4: Máy phân tích pho hong ngoại FTIR - 22 225252 s+zz£ezxeesrxee 33Hình 3.5: Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - G9 HHnnHgngư 34Hình 3.6: Một số đường cong tiêu biểu của TG - DTA -5©-2 5+5: 36Hình 3.7: Thiết bị phân tích nhiệt vi sai LÝ JA G9 1 re, 36Hình 3.8: Phương pháp đo độ bền nén xuyên tâm 2- - 2 2 + 22s £zcxcceẻ 37

Hình 3.9: Hình minh hoạ đo lực kéo Xuyên tâm 5 << ssssseerse 37

Hình 4.1: Giản đồ nhiễu xa tia X thủy tinh tong hợp so sánh với SiO, cau trúc mạng

"h5 38Hình 4.2: Phố hồng ngoại của thủy tinh tong hợp 555cc ccccsrcrerrreee 40Hình 4.3: Ảnh SEM của thủy tinh tổng hợp với độ phóng đại 700 lần, 5000 lân,

10000 lần và 20000 lần -c+- 52+ tt HH HH HH nà gà như 4IHình 4.4: Nhiễu xạ đỗ XRD bột thủy tinh ngâm trong SBF sau 3 ngày, 7 ngày và 21

I2) 42

Hình 4.5: Phố nhiễu xa XRD mẫu HA, thuỷ tinh vô định hình, composite thuỷ tinh

sinh học và HA, thuỷ tinh sinh học nam SBF sau 2Ï ngày -««<<<<<2 44

Hình 4.6: Phố héng ngoại của mẫu thủy tinh ngâm trong SBF sau 3 và 7 ngày 45Hình 4.7:Anh chụp SEM của mẫu ngâm SBF 3 ngày (trái) và 7 ngày (phải) 46Hình 4.8: Ảnh chụp SEM của mẫu ngâm SBF trong 21 ngày . - 47Hình 4.9: Phân tích nhiệt vi sai (DTA) của mẫu composite thuỷ tinh sinh học và HA

¬ ỐỐốỐốỐ.ỐốỐ.Ố 52

DANH MỤC BIEU DO

Biểu đồ 4.1: Biéu đồ thé hiện sự thay đổi của lực nén xuyên tâm, thành phan tỉ lệ

giữa HA và thuỷ tinh sinh học và nhiệt độ nung . - 5 511 + se 51

Biéu đồ 4.2: Biểu đồ tương quan giữa độ cứng xuyên tâm và phan trăm độ xóp 52

DANH MỤC BANG BIEU

Bảng 1.1: Chuỗi phản ứng trên bề mặt chung trong quá trình tham gia vào việc tạoliên kết giữa xương và tuy tinh hoạt tính sinh học [ Ï ] - 25-2 2s+s2£szez£scs¿ 9Bảng 2.1: Thanh phần mẫu cat do băng XRF.uecccsccscsesesesseseessseessseesesssseeesseeesseeess 12Bang 2.2: Thanh phan mẫu cát do băng XRF cccccccssssesseseeseseesessesssessessesesesseeeeseeess 13Bang 2.3: Thanh phan mẫu cát đo băng XRF.u cccccsescsssssssessesessesessesessesessesesseseesen 13Bảng 2.4: Nông độ các ion trong dd SBF (107 mOÌ/Ï) <<<-< <<<<<ssssss 19Bảng 2.5: Các hóa chất dùng tong hợp dung dịch SBE 2- 2 5525552: 20Bảng 4.1: Bảng thống kê giữa tỉ lệ HA và thuỷ tinh sinh học, nhiệt độ nung va độ

cứng xuyên tâm và mật dO XÔP 2G 2 1S HH re 50

VII

DANH MỤC VIET TAT

CT1: Mẫu cát trắng xử lý bằng qui trình 1

CT2: Mẫu cát trắng xử lý bằng qui trình 2

CT3: Mẫu cát trắng xử lý bằng qui trình 3

HA - Hydroxy Apatite

HCA - Hydroxy Carbonate Apatite

SBF - Simulated Body Fluid - Dung dich giả thé người

XRD - X-Ray Diffraction - Nhiéu xa tia X

XRF - X-Ray Flourescence - Huynh quang tia X

FTIR - Fourier Transformed Infrared - Phan tích pho hồng ngoại

SEM - Scanning Electron Microscope - Kinh hién vi dién tir quét

DTS - Diametral Tensile Strength - Độ bền nén xuyên tâm

OD - Optical density - Độ hap thu quang hoc

MITT - 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2 5-Diphenyltetrazolium Bromide

EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid

CHUONG 1 TONG QUAN VE VAT LIEU Y SINH XƯƠNG

NHAN TAO

1.1 Vật liệu y sinh

1.1.1 Khái niệm

Năm 1987, D.F Williams đưa ra khái niệm vật liệu y sinh và khái niệm này

được chấp nhận rộng rãi cho đến ngày nay Vat liệu y sinh là loại vat liệu có nguồnsốc tự nhiên hay nhân tạo, su dung dé thay thé hoặc thực hiện một chức năng sốngcủa cơ thé con người [1] Các vật liệu y sinh đã trở nên thân thuộc trong đời sống của

con người như: da nhân tạo, van tim nhân tạo, các loại chỉ khâu trong y học, răng giả, chan tay giả, mach máu nhân tạo, các vật liệu tram răng hay các vật liệu xương nhântạo dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, ghép xương

1.1.2 Phân loại

L.L Hench dựa vào tương tác giữa vật liệu và môi trường co thé đã chia vật

liệu y sinh ra 2 loại chính là vat liệu hoạt tính sinh học và vật liệu tro sinh hoc [2] Vật

liệu hoạt tính sinh học là loại vật liệu khi cây chép trong cơ thể con người SẼ xay ra

các tương tác hóa học giữa vật liệu với mdi trường sống Đối với các vật liệu hoạt tính

sinh học có thể kế đến như: thủy tinh hoạt tính sinh hoc, hydroxyapatite hoặctricalcium silicate Vật liệu tro sinh hoc là vật liệu khi đưa vào cơ thé con người chúngkhông có bat cứ một tương tác hóa học nào với môi trường sống Một số vật liệu trosinh học điển hình đang được ứng dụng nhiều ngày nay như: van tim nhân tạo, cácthiết bị cay ghép trong cơ thé từ alumina hay zirconia

Ngoài ra theo chất liệu của vật liệu, cũng có thể phân loại vật liệu y sinhlàm bốn loại như: Vật liệu kim loại & hợp kim, vật liệu ceramic, các polymer, các vật

liệu có nguồn gôc tự nhiên.

1.2 Vật liệu y sinh xương nhân tạo

1.2.1 Sự ghép xương tự nhiên

Xương tự nhiên là vật liệu đầu tiên con người sử dụng cấy ghép xươnghỏng xương khuyết cho con người Theo bản chất của chủ thể cho và nhận, chúng ta

có thé phân loại ra bốn kiểu ghép như sau [3]:

- Ghép cùng gene (Isograft): là việc trao đổi miếng ghép xương giữa hai cơ thé giốngnhau hoàn toàn về di truyền Ghép cùng gene được thực hiện chỉ khi co thé cho va cothé nhận là những anh (chi) em sinh đôi

- Ghép xương tự thân (autograft): xương tự thân được lẫy ra từ một phan khác củachính cơ thể bệnh nhân (xương ở hông, xương hàm, xương sọ v.v ) để ghép vào nơithiếu xương Đây là vật liệu ghép xương tốt nhất bởi nó đã là một thành phần vốn cótrong cơ thể bệnh nhân Mặt trở ngại của ghép xương tự thân là bệnh nhân phải chịuthêm một lần phẫu thuật lẫy xương, phải chịu đau và thời gian lành thương dài hơn.Trong một số trường hợp, phần xương tự thân thu gom được không đủ cho chỗ cầnghép và bác sĩ vẫn cần phải dùng vật liệu ghép xương khác

- Ghép xương dong loại (allograft): là vật liệu được lay từ co quan người hién tặng

và được xử lý an toàn tuyệt đối cho việc ghép xương Sau xương tự thân thì xươngđồng loại là vật liệu ghép hiệu quả nhất bởi nó có nhiều đặc tính tương đồng vớixương tự thân Những thuận lợi của allograft là nó rất tốt, có săn, dồi dào về số lượng,không yêu cau phẫu thuật lần 2 và cực kỳ an toàn Dé đổi lay những ưu thé cho việc sử

dung allograft bệnh nhân sẽ phải chịu chi phí cao hon một chút.

- Ghép xương dị loại (xenograft): là một dạng xương nhân tạo có nguồn gốc từ độngvat, thực vật hoặc sợi tong hợp Loại vat liệu này có ưu thế về chỉ phí nhưng có hạnchế hơn nhiều về hiệu quả sử dụng so với allograft

1.2.2 Ghép xương sử dụng Vật liệu y sinh xương nhân tạo

Sự ghép hay thay thế xương sử dụng xượng tự nhiên gây ra những bất cậpnhư: lây lan virut gây bệnh từ người này sang người khác, gây đau đớn, gây ra sự giếthại động vật hoặc khó khăn do nguồn cung cấp, hiến tặng khan hiếm Vì những lý do

như trên, Bio-ceramics như các calcium phosphate, các thủy tinh hoạt tính sinh hochoặc các hỗn hợp ceramics đã và đang được nghiên cứu và sử dụng như những vật liệunhân tạo dùng dé cay ghép thay thế xương hay sử dụng trong kỹ thuật nha khoa như

trám răng, phục hình răng.

Có nhiều loại vật liệu y sinh xương nhân tạo khác nhau như: các vật liệu

calcium phosphate (tricalcium phosphate Ca3(PO,)2, hydroxyapatite Caio(POu)s(OH)› hay biphasic calcium phosphate), các vật liệu thủy tinh hoạt tinh sinh học (CaO - SiO,

- Na,O - P2Os ), các xi mang y sinh, vật liệu tricalcium silicate hay các kim loại tro nhu Ti, Ni.

Ngày nay những vat liệu xương nhân tạo như Hydroxyapatite (HA), Calcium Phosphate (TCP), Bioglasses, Glass Inomer Cement (GIC) hay Consil Dental

Tri-đã trở nên thân thuộc với con người và được thương mại hóa (Hình 1.1).

Chan (le Clie Cre Cie ieee Lew fore

Hình 1.1.1: Giới thiệu một số hình anh sử dụng vật liệu xương và một sỐ

sản phầm vật liệu nhập ngoại

1.3 Vật liệu xương nhân tạo - Thuy tỉnh hoạt tính sinh học Na;O-CaO- PO;

SiO,-1.3.1 Giới thiệu về thủy tinh

Trong các vật liệu y sinh dùng dé cây ghép xương, Thủy tinh hoạt tính sinhhọc được khám phá bởi nhà bác học L.L Hench năm 1969 [2] Thành phần chính củacác thủy tinh này gồm các oxit CaO, SiOs, P„Os, NazO Tuy vậy các oxit này khôngton tại độc lập trong cầu trúc thủy tinh mà liên kết không trật tự với nhau tạo thànhmạng câu trúc vô định hình của thủy tinh Hoạt tinh sinh hoc cua các vat liệu thủy tinhnày chính là khả năng hình thành một lớp khoáng Hydroxyapatite (HA) mới trên bềmặt khi chúng được ngâm trong một dung dịch sinh lý người hoặc cấy ghép trực tiếptrong cơ thé người Lớp khoáng Hydroxyapatite (HA) giống hệt với thành phan vô cocủa xương người, do vậy nó chính là cầu nối gắn kết giữa miếng ghép từ vật liệu thủy

tinh và xương tự nhiên [2.4].

Hình 1.1.2: Một số hình ảnh ứng dụng của vật liệu Thủy tính hoạt tính sinh học

1.3.2 Thành phan, cấu trúc và tính chất hóa học của Thúy tỉnh hoạt

tính sinh học

a Cấu trúc của Thủy tinh

Thủy tinh là một vật liệu vô định hình Thủy tinh có cau trúc không gian bachiều (2D) như vật liệu cầu trúc mạng tinh thể nhưng cau trúc vi mô của nó chỉ tổn tại

sự sắp xếp trật tự ở khoảng cách ngắn [5] [6] [7][8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]

So sánh cau trúc của oxit SiO, riêng rẽ và cau trúc của mạng thủy tinh chứaSiO, chúng ta có thé nhận thay rang cả hai trường hop mỗi một nguyên tử Si đều liênkết với 4 nguyên tử O tạo nên những tứ diện SiOz, mỗi tứ diện này được coi như mộtviên gạch cơ bản xây dựng nên mạng lưới cau trúc của cả hai vật liệu Tuy vậy oxitSiO, riêng rẽ có cầu trúc trật tự tuần hoàn còn mạng lưới cầu trúc của thủy tinh thìkhông có trật tự cỗ định [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]

b Thanh phan của thủy tinh

Thuy tinh là một vật liệu có mạng cau trúc vô định hình, trong đó các oxitcau tạo nên mạng lưới thủy tinh liên kết với nhau qua các liên kết cộng hóa trị như Si-

O, P-O hay các liên kết ion của ion Ca“*, Na” với O” Chúng ta có thé phân biệt badạng oxit cau tạo nên mang lưới thủy tinh [12] [13] [14] [15]

Oxit cầu tạo nên mang lưới thủy tinh:thong thường là oxit SiO, ngoài racòn có oxit B.O3, POs, GeO> [rong mạng lưới câu trúc thủy tinh, các oxit nay cautạo dưới dang tứ diện hoặc tam diện cơ ban SiO4, BOy, BOs, PO/” Những tứ diện haytam diện cơ bản này liên kết với nhau qua đỉnh O của chúng tạo nên mạng lưới không

gian của thủy tinh như trong hình 1.3 Nguyên tử oxy ở đỉnh gắn kết các tứ diện hay

tam diện với nhau được gọi là các oxy băc câu.

Hình 1.1.4: Các tứ diện SiO¿ liên kết với nhau qua đỉnh O trong mạng lưới thủy tỉnh

Oxit làm nên cấu trúc không trát tự cua thủy tinh: như CaO, Na;O Khithêm các oxit trên vào quá trình tổng hợp thủy tinh, các cation của chúng có lực húttĩnh điện với các nguyên tử oxy bắc cau và làm gãy các mối liên kết giữa các tứ diện

hay tam diện với nhau như trong hình 1.4 Như vậy các oxit trên có nhiệm vụ phá hủy

các cầu trúc trật tự của mạng tinh thé SiO, dé hình thành nên loại cau trúc đặc biệt củathủy tinh, cau trúc vô định hình

Oxy bắc cau 7

‘“) - ˆ ° ˆ

x! Oxy không bắc cau

Các oxi trung gian: các oxit nay vừa có thê tham gia vào việc hình thành mạng lưới không gian của thủy tinh như các oxit SiOs, B›O» vừa tham gia vào việc

bẻ gay các oxy bac câu làm mật câu trúc trật tự của mạng lưới Một sô oxit điên hình như: Al,O3, ZnO, TiO2, PbO

1.3.3 Thuy tinh sinh học 45SS

Thuy tinh hoạt tính sinh học 45S5, một trong những công thức quan trọng

nhất, bao gồm SiO2, Na2O, CaO và P205 Giáo sư Larry Hench phát triển Bioglasstại Dai học Florida vào cuối năm 1960 Ông đã được thử thách bởi một sĩ quan quânđội MASH dé phat triển một loại vat liệu để giúp tai tạo xương, như nhiều cựu chiếnbinh chiến tranh Việt Nam phải chịu đựng nặng từ ton thuong xuong, nhu vay ma hauhết trong số họ bị thương trong cách nay bị mat chân tay của ho

Thành phan ban dau được cho do khoảng Eutectic [9] Tên 45S5 nghĩa thủytinh với 45% trọng lượng của SiO2 và 5: 1 tỷ lệ CaO để P2O5 Tỷ lệ Ca / P thấp sẽkhông tạo liên kết xương [10]

Hoạt tính sinh học cao là lợi thế chính của Bioglass, mô đun Young là

30-35 GPa, rất gan VỚI VO Xương, ma có thể là một lợi thế cho việc cây chép xương

Việc sử dụng phẫu thuật thành công đầu tiên của Bioglass 45S5 là thay théxương nhỏ trong tai giữa, như là một điều trị điếc dẫn truyền Lợi thế của 45S5 làkhông có xu hướng hình thành mô xơ Các ứng dụng khác đang ở trong tế bào hình

nón đê cây vào xương hàm sau nhô răng.

1.3.4 Tính chất hóa học của thủy tỉnh

Thủy tinh tương đối trơ về mặt hóa học, phản ứng hóa học quan trọng của

thủy tinh là phản ứng với dung dịch axit Flohydric (HF) do sự phá hủy oxit SiO:

SiO + 4HF = Sify + 2H¿O

Thuy tinh hoạt tính sinh học hay con gọi la thuỷ tinh y sinh là loại vat liệu

tiềm năng được sử dụng trong cay ghép y tế Thuy tinh y sinh có tính hoạt tính sinhhọc, được dùng dé khôi phục và dan dan thay thé xương trong môi trường sinh hoc

Phan ứng Bioglass với môi trường sinh hoc bao gồm hai giai đoạn chính

Một là sự hình thành của một lớp Hydroxycarbonate Apatit (HCA) một cách nhanh

chóng và nhạy với các thành phan của vật liệuthứ hai là sự phát triển tế bào xương

bên trong Việc cây thuỷ tinh sinh học vào bên trong một cơ thể sinh học sẽ xấy ra rấtnhiều phản ứng với những vi cau trúc nhạy cảm liên quan đến hoạt động sinh học củaxương Phản ứng bề mặt được tóm tắt trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1: Chuỗi phản ứng trên bề mặt chung trong quá trình tham gia vào

việc tạo liên kêt giữa xương va tuỷ tinh hoạt tính sinh học [1]

Bé mặt thuỷ tính hoạt tính sinh học

| Trao đổi ion kiềm với ion H+ từ dịch co thé 1

| Kết nối hoà tan và tạothànhlênkOHO —- 2 Tạo polymer SilieagelS-OHSI i tstst—CS~S 3

, | Hap thuCa+PO4+CO3vé6dinhhinn = 4 lỆ Trang

2 |TaoléptinhthéHCA 5 thai

(Thoi E==r======n========================== ———=============== phản

10_ | Hap thu sinh hoá cua tác nhân phát trién trên lop HCA |6

gian, ứng

giò) 20 Tác động của đại thực bào 7 bề

| Tân công củatêbào gốc 8 mat Những tbào gốc khác w IPháramanglưới O7 10

Tang nhanh vaphattriénxuong = ttst—CS~S 12

1.3.5 Cac phương pháp tong hop thúy tinh hoạt tính sinh học

Thủy tinh hoạt tính sinh học có thé tong hợp bằng hai phương pháp chính:

a Phương pháp sol-gel

Để tổng hợp các thủy tinh hoạt tinh sinh hoc là phương pháp sol-gel.Phương pháp tổng hop này không trải qua quá trình nau nóng chảy thủy tinh mà đượcthực hiện băng một chuỗi các phản ứng hóa học trong dung dịch dé thủy phân các tiền

9

chất thành các hạt sol sau đó để ngưng tụ sang trạng thái gel Gel được xử lý nhiệt để

tạo thành thủy tỉnh ở dạng bột.

Phương pháp này có ưu điểm là tong hợp vật liệu ở nhiệt độ thấp, vật liệu

có độ tinh khiết cao, vật liệu thu được dễ tạo mẫu theo các hình dáng khác nhau phùhợp với chi tiết ghép mà không cần sử dụng thêm một chất bồ trợ nào

b Phương pháp nung nóng chảy

Là nau nóng chảy các tiền chất vô cơ ở nhiệt độ cao khoảng 1400°C sau đólàm nguội thủy tinh trong không khí hay trong nước Thủy tinh dạng khối được nghiền

theo các kích thước hạt khác nhau tùy theo mục đích sử dụng.

Ưu điểm của phương pháp này là có thé tong hop được chính xác thủy tinh vớithành phan mong muốn, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao, thời gian nhanh và cóthể làm chủ được các tham số kỹ thuật trong quá trình tổng hợp Thuỷ tinh nung nóngchảy bao gồm nén khuôn rồi nung kết khối thường có đặc tính phù hợp với xương tựnhiên và có chức năng cấu trúc định hương như xương tự nhiên hon.Chi tiết củaphương pháp này được trình bày trong chương tiếp theo

Với mục đích chế tạo và sử dụng thành công các vật liệu xương nhân tao tạiViệt nam trong tương lai nhằm thay thế sản phẩm nhập ngoại Từng bước tiếp cận vànghiên cứu dé tìm ra những quy trình tong hợp phù hop Đề tài rất quan tâm tới nhómcác thủy tinh hoạt tinh sinh học (Bioglasses) vì những tính chất đặc biệt của chúngcũng như khả năng có thể tổng hợp được các vật liệu này trong nước

Trong đề tài nghiên cứu này, chế tạo vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học từcác nguồn nguyên liệu phổ biến trong đó có cát trang chứa hàm lượng SiO, 95% là

mục tiéu cân đạt đến.

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Quy trình tổng hợp thủy tỉnh hoạt tính sinh học 45SiO;

-24,5CaO - 24,5Na,0 - 6P;O;

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Các hóa chất có độ tinh khiết trên 99% được mua từ hãng Sigma-Aldrich:

Cát trắng Cam Ranh với hàm lượng SiO cao nhưng cũng có lẫn nhiều tạpchất không cần thiết là nguyên liệu pho bién và rẻ tiền được sử dụng để cung cap SiO,trong thành phan của thủy tinh Cát trang được xử lý bằng các quy trình hóa học nhằmloại bỏ các thành phan tap chat

Hình 2.1: Hóa chất dùng trong thực nghiệm Hình 2.2: Cát trắng nguyên liệu Cam Ranh

2.1.3 Quy trình thực nghiệm

a Xử lý loại bỏ tạp chất từ cát trang bang phương pháp hóa hoc

Cát trang Cam Ranh là nguồn cung cấp SiO cho thủy tinh, tuy vậy cát cólẫn nhiều tạp chất như các oxit kim loại, các kim loại nặng như Cu, Pb, Mn Vi tínhchất hóa học đặc biệt của SiO, là chỉ phản ứng hóa học với axit HF nên để loại các tạpchất từ cát nên phương pháp sử dụng là các axit có tính oxy hóa mạnh

Cát trăng được rửa sạch băng nước, nghiên nhỏ mịn và rửa lại băng nước cat Bột cát nghiên min được phơi khô cho hệt hơi nước Tiêp theo đó bột cát được xử

lý hóa chất dé loại bỏ tạp chất theo ba quy trình sau:

Quy trình 1: Xử lý sơ loại băng axit HCI 1,2M (nhiệt độ thường, ngâm cátvào hồn hợp axit, thường xuyên khấy trộn trong 24 giò), sau đó xử lý tiếp băng băngaxit HCI 6M có đun sôi trong 24 giờ để tăng hiệu quả loại bỏ tạp chất do hiệu ứng củanhiệt độ Kết quả phân tích thành phần cát sau xử lý được xuất ra từ máy phân tích tán

xạ huỳnh quang tia X (XRF) như sau, kèm theo phụ luc 1:

Bang 2.1: Thành phần mau cát đo bang XRF

Thanh phan %

SiO, 95,1 FezOa 0/769

CozOa 0,250

WO; 3,92

Quy trình 2: Xử lý sơ loại băng HCI 1,2M (nhiệt độ thường , ngâm cát vàohon hợp axit, thường xuyên khay trộn trong 24 gid), sau đó ngâm trong hỗn hợp axit

cực mạnh là nước cường thủy 3HCI + IHNO3 (đun nóng cách thuỷ ) trong 8 giờ

nhăm loại bỏ tối đa tạp chất Kết quả phân tích thành phan cát sau xử lý được xuất ra

từ máy phân tích tán xạ huỳnh quang tia X (XRF) như sau, kèm theo phụ lục 2:

Bảng 2.2: Thành phần mẫu cát đo băng XRF

Thành phần %

ALO; 0,161

SiO, 98 2 CaO 0.0351 TiO, 0.291

huỳnh quang tia X (XRF) như sau, kèm theo phụ lục 3:

Bảng 2.3: Thành phần mẫu cát đo băng XRF

Thành phần %

SiO, 95 3 FezOa 1,000

CaO 0,138

WO, 3,59

Lưu ý về hàm lượng WO; là do thiết bi chứa mau của máy XRF làm bằngchính vật liệu (trong quá trình nghiên mẫu trong thiết bị chứa mẫu, bột WO; đã bị lẫnvào bột cát) nên cần loại hàm lượng phan trăm của WO; trong kết quả phân tích

13

Từ các kết quả phân tích bên trên, việc chọn mẫu cát đã xử lý bằng quytrình 2 vì hàm lượng SiO, là cao nhất 98,22% là lựa chọn tốt nhất Hàm lượng này cóthé kết luận vật liệu là tinh khiết SiO, tương tự như các hóa chất chuẩn khác.

b Tính toán phối liệu nấu thủy tỉnh

Thanh phan thủy tinh can tong hợp:

45% SiO, — 24,5% CaO — 24,5% Na,O — 6% P;O;

Khối lượng nguyên tử các chat: SiO.= 60,09; CaO = 56,08; NasO = 61,98;

P05 = 141,94; NazSiO¿ = 122,07; Na3P309= 305 88 (g/mol)

Nguyên liệu su dung:

Cát (xử lý hóa chất theo quy trình 2): cung cap SiO,

CaO (hóa chất tinh khiết)

Na»SiO; ( hóa chất tinh khiết): cung cấp NazO và SiO,

NazPsOs (hóa chat tinh khiết): cung cấp NazO và P.O;

Tính phối liệu dé tong hợp 100g thủy tinh:

Phương trình phản ứng:

NaSi0; —> NaO + SiO;

X X X (mol) Na3P309 => 3/2Na0 + 3/2 P20;

CaO = 24,50 (g) Na2SiO3 = 43,09 (g)

Sau khi tính toán được phối liệu, vật liệu được đưa vào chén nau thủy tinhtrong lò trung tan với chén nau bang Pt Mỗi mẻ nau 100 (g) bột phối liệu

c Quy trình nấu thủy tinh

Cân phối liệu và đồng nhất sơ bộ:

Các chất dùng tổng hợp thủy tinh: Cát, CaO, NazSiOa, Na3P305 được cântheo đúng khối lượng đã tính ở trên Sau đó được cho vào chai nhựa, lắc đều để đồngnhất sơ bộ phối liệu trước khi nau

Nấu thủy tinh

Phối liệu được cho vào trong chén Pt và nung trong lò ở nhiệt độ 1450°C

trong thời gian 120 phút.

Ở nhiệt độ 900°C xảy ra các phản ứng phân hủy muối Na;SiO› thành NazO

và SiO», muối Na:PsOs thành NazO và P;Os [31]

Hỗn hợp các oxit vừa được sinh ra và các oxit trong phối liệu ban đầu đượcnung tới nhiệt độ 1450°C trong thời gian 120 phút nham làm nóng chảy và trộn lẫn cácoxit riêng biệt hình thành mạng lưới cấu trúc thủy tinh

Dưới đây là một số hình ảnh mô tả các thao tác tổng hợp thủy tinh y sinh tại

Phòng thí nghiệm Vật Liệu Silicat, Đại học Bách Khoa Tp HCM.

15

Hình 2.6: Nấu thủy tinh ở nhiệt độ 1450°C

17

2.2 Thực nghiệm ““In vitro” kiểm tra hoạt tính sinh học vật liệu thủy

tỉnh

Bột thủy tinh hoạt tính sinh học 45 S1O»; - 24,5Na¿O - 24,5CaO - 6P2Os tonghợp bằng phương pháp nung nóng chảy ở nhiệt độ cao (Melting Method) được tiếnhành thực nghiệm 1n vitro dé kiểm tra xem có dat yêu cầu của một vật liệu y sinhtrước khi dùng cấy ghép trong cơ thé sống in vivo_

Đây là một thực nghiêm nhanh và đơn giản, nhằm thực hiện quá trình hoặcmột phan ứng trong ống nghiệm, trong đĩa nuôi cay ở bên ngoài cơ thé sống Thựcnghiệm in vitro được tiến hành băng cách ngâm bột vật liệu trong dung dịch mồphỏng dịch thé người SBF (Simulated Body Fluid) để khảo sát khả năng hình thành

khoáng xương mới sau ngâm.

2.2.1 Dung dịch SBF

Dung dịch SBF (Simulated Body Fluid) là dung dịch gia dịch thé người cóthành phần các ion tương tự như máu trong cơ thể con người Dung dịch này đượctong hợp trong phòng thí nghiệm theo tài liệu tham khảo [16]

Thanh phan ion trong dung dịch được thé hiện trong bang sau [16]:

Bang 2.4: Nong độ các ion trong dd SBF (107 mol/l)

Ions Na" K† Ca” | Mg* cr | HCO; | HPO,”

SBF 1420 | 50 2.5 1.5 1488 | 42 1.0

Plasma 1420 | 50 2.5 1.5 103.0 | 27.0 1.0

2.2.2 Quy trình tổng hợp dung dich SBF

Dé điều chế dd SBF, ta đi điều chế hai dung dịch riêng rẽ, gọi là Ca-SBF vàP-SBF Trộn hai dung dịch này thu được dung dịch SBF Ưu điểm phương pháp nay làdung dịch có thể được lưu trữ một vài tuần [16]

Đối với mỗi dung dịch Ca-SBF hoặc P-SBF, đong 990 ml nước cất, gianhiệt trong 1 bể điều nhiệt và giữ ốn định 6 37°C (Body Temperature) trong suốt quá

19

trình tong hợp Thêm các chất hóa học theo hàm lượng có trong bảng dưới, mỗi chatcách nhau 30 phút Sử dung cá từ để khuấy trộn dung dịch Ca hai dung dịch Ca-SBF

và P-SBF đều đc điều chỉnh pH=7,4 (môi trường dich thể người), băng cách sử dụngdung dich HCI 6M Sau đó thêm nước vào các bình dé làm tròn thể tích 1000 ml

Khi cần dùng SBF, ta trộn những lượng thể tích như nhau của cả hai dung

dịch Ca-SBF và P-SBF thu được dung dịch SBF Các dung dịch Ca-SBF và P-SBF

duoc dự trữ trong tủ lạnh ở 5-10°C, dung cho 2-3 tuần

Bảng 2.5: Các hóa chất dùng tong hợp dung dich SBFCa-SBF m (g) P-SBF m (g)

Tris : CạH¡¡NOa 6,057 Tris : CaH¡NO¿ 6,057

CaCh 0,5549 KH»PO43 H;O 0.4566

°C tương tự như nhiệt độ cơ thể người Tốc độ lắc các mẫu ngâm là 50 (vòng/phú0).Sau các khoảng thời gian ngâm, bột vật liệu thủy tinh được tách ra và rửa bang nước

cat dé loại bỏ các ion dư thừa sau đó rửa lại băng côn nguyên chat dé loại bỏ hoàn toàn

21

các ion tự do Mẫu bột được say khô và đem đặc trưng lý hóa bang các phương phápphân tích hiện đại như nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction XRD), phân tích quang phốhồng ngoại (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) và hiến vi điện tử quét

(Scanning Electron Microscope SEM).

Hình 2.14: Thực nghiệm invitro ngâm bột vật liệu thủy tinh trong dung dich SBF

2.3 Thực nghiệm kiểm tra tính độc của vật liệu trên tế bào

Vật liệu sau khi được thử nghiệm băng dung dich SBF đạt yêucầu chuyển sang tạo hình va thử nghiệm độc tính trên tế bào Day là phương phápnhăm xác định vật liệu có bị độc với tế bào hay không theo tiêu chuẩn ISO 10993-5,vật liệu chỉ ngâm 24 giờ trong dung dịch môi trường nuôi cấy tế bào Chưa phải làtham khảo tính tăng sinh của tế bào trong môi trường vật liệu, việc tham khảo tínhtăng sinh của tế bào sẽ năm trong bước tiếp theo sau khi biết chắc chăn vật liệu khônggây độc với tế bào

Quy trình: