Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic-chitooligosaccharide

COS, có thể hòa tan trong nước, sở hữunhiều hoạt tính sinh học như kháng viêm, kháng oxi hóa, làm lành vết thương v.v..và tiềm năng ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực như dược phẩm, thự

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM

TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN

Or KS

BUI VAN HOAI

NGHIEN CUU HOAT TINH KHANG OXI HOA, KHANG

VIEM CUA CHITOOLIGOSACCHARIDE VA DAN XUAT

PHENOLIC-CHITOOLIGOSACCHARIDE

LUAN AN TIEN SI SINH HOC

TP Hồ Chí Minh - Năm 2023

BÙI VĂN HOÀI

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HOÁ, KHÁNG

VIÊM CỦA CHITOOLIGOSACCHARIDE VÀ DẪN XUẤT

PHENOLIC-CHITOOLIGOSACCHARIDE

Ngành: Hóa sinh học

Mã số ngành: 624201 16

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Anh Dũng

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Phản biện 3: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi

Phản biện độc lap 1: GS.TS Nguyễn Anh Dũng

Phản biện độc lập 2: PGS.TS Võ Thanh Sang

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP

TP.Hồ Chí Minh, năm 2023

Lời cam đoan

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Hóa sinh học, với đề tài " Nghiên cứu hoạt

tinh kháng oxi hoá, kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất chitooligosaccharide " là công trình khoa học do tôi thực hiện và được sự hướng dẫn

phenolic-của PGS.TS NGO ĐẠI NGHIỆP

Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác vàkhông trùng lắp với các công trình đã công bố trong và ngoài nước

Nội dung số 1 và 2 được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm

Thực hành, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TPHCM và phòng thí nghiệm

Bộ môn Sinh hoá, Khoa Sinh học — Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM

Nội dung số 3 được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hoá, KhoaSinh học — Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

gia TPHCM.

Nội dung số 4 được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệmThực hành, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TPHCM

Nghiên cứu sinh

Bùi Văn Hoài

Lời cám ơn

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắc đến người Thầy

PGS.TS Ngô Đại Nghiệp, người đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ và hướng dẫn tôi

trong suốt thời gian theo học và thực hiện luận án

Tôi cũng xin cảm ơn đến quý thầy/cô bộ môn, khoa và phòng ban của trườngĐại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ trong suốt

thời gian tôi theo học.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc cùng toàn thé cán bộ Trung tâm thínghiệm thực hành, Trung tâm Phân tích Quốc tế, Khoa Công nghệ Thực phẩm thuộctrường Dai hoc Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi theo học và thực hiện

luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quỹ hỗ trợ nghiên cứu khoa học thuộc nội dungluận án từ trường Đại học Công nghiệp thực pham Tp.HCM; Quỹ học bỗng chínhphủ theo dé án 911 và Quỹ học bổng TOSHIBA đã hỗ trợ cho quá trình học tập và

thực hiện luận án của tôi.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô Đào Thị Mỹ Linh, cô Nguyễn Thị Nam Phương,

Khoa Công nghệ sinh học; cô Võ Thúy Vi, Nguyễn Thị Lương Khoa CNHH Trường

ĐH CNTP TP HCM, em Dao An Quang Tổng Công ty Rượu bia NGK SABECO

người đồng hành và chia sẻ những kinh nghiệm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực

hiệnh luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Cao học viên cùng các bạn sinh viên đãđồng hành và hỗ trợ tôi thực hiện luận án

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và những người bạn đã luôn cổ

vũ và động viên tôi trong suốt thời gian theo học tại Nhà trường

MỤC LỤC

Lời Cam đOaI <2 2 E2 2211111E1123311 111111835111 1119530 11 KH KH KT 1 re 1

LỜI er: 00) 0 0 22333030303030303010 1111 HE cet 1

MỤC LLỤC LG SE 22112311911 911 3119311110111 E11 TH TT ng iiDANH MỤC CÁC CHU VIET TAT wo.ceeccccecccscssssessscsecsessvssssssssssecsecsecsestsansaseessecavees VDANH MỤC BẢNG 2 St T11 1211112112111 211111111 1111111111111 1x1 rre viiDANH MỤC HINH cesccccscsscssssesssscsscsesscsvcersecsvsucsessssvsassucarsusansnsatsassvsasssavseseveeees viii

MO DAU eeecccccsscsscsssessssesssscessucessusevsussesassucarsecavsusaesasssassucassesansusensassesasseeansecanseseneess |CHUONG 1 TONG QUAN 5“ 4

1.1 CHITIN, CHITOSAN, CHITOOLIGOSACCHARIDE VÀ CÁC DẪN XUÁT - 4

1.1.1 Chitin - 2c G2 1111211211231 9311911011191 TH ng TH 4 1.1.2 Ch1fOSaTI EEEE6111111111111111188555555550 111kg 5555 5 1.1.3 Chitooligosaccharide và các dẫn xuât - 5c k*+sssseeree 6

1.2 PHƯƠNG PHÁP TẠO CHITOOLIGOSACCHARIDE TỪ CHITOSAN ‹ 7

1.2.1 Phương pháp hóa hoe - - 6 5 + 2 vn HH HH ngư 8 1.2.2 Phuong phap vat LY oc 8 1.2.3 Phương pháp ©eñZYIm - - s11 9H HH nh HH 9

1.3 HỢP CHAT PHENOLIC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC - - 2 + + s se £++££cczz 10

1.4 PHƯƠNG PHAP TẠO DẪN XUẤT PHENOLIC - CHITOOLIGOSACCHARIDE 14

1.5 HOAT TÍNH SINH HỌC CUA CHITOOLIGOSACCHARIDE VÀ CÁC DẪN XUAT 18

1.5.1 Hoạt tính kháng oxy hÓa 6 6s SH HH ng ướt 18 1.5.2 Hoạt tinh kháng khuẩn, kháng nam cecceeccescesesseesesseessessessesseesesseeseess 22 1.5.3 Hoạt tính kháng viÊm c6 1133111891113 111191111 11 8 11 81 1g ng vrg 24

1.5.3.1 Khái quát viêm và các con đường tín hiệu trong đáp ứng viêm 24

1.5.3.2 Tín hiệu dẫn truyền theo con đường IkB/NF-kB và phản ứng viêm 25

1.5.3.3 Con đường tín hiệu thông qua các protein kinase hoạt hóa mitogen

Va plan UNG VIGM 001117577 ga 27

1.6 TINH HINH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC - + ++xscsxexrer+ 32

1.6.1 Các nghiên cứu ngOải NƯỚC c2 22 32333 11 EEEErrrererrrkrrerreree 32

1.6.2 Các nghiên cứu trong TƯỚC - + + + xxx v 1v Hưng nh nh rưệt 35

CHƯƠNG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 NGUYEN LIEU, HOA CHAT VÀ TRANG THIẾT BỊ - 2 + 2 SE EE£zx kẻ 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ¿+ **k*k*kEvEvEvEeEEEEEEkekekrkrkrkrrrrkreekei 39

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát -. ¿ 2¿- 5£ ©+2+++++2E++£x+zrxzzxerxesres 39

2.2.2 Phương pháp tạo chitooligosaccharide ‹-s-sscssssssesserssereeres 40

2.2.2.1 Phương pháp thủy phan chitosan tạo chitooligosacharide 40 2.2.2.2 Phương pháp tạo bột chitooligosaccharide -. - 45

2.2.3 Phương pháp tong hợp tạo dẫn xuất COS gắn nhóm acid phenolic 47

il

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp có sử

810141308)141101907:1)120) 1 + 48

2.2.5 Phân tích khối lượng phân tử của COS 2 ¿5+ cs+cxecserssreee 48

2.2.6 Phương pháp Folin-Ciocalteu và công thức xác định hiệu quả tổng hợp

¬ 49

2.2.7 Phân tích đặc điểm dẫn xuất COS - ¿+ c+EEk+E£EvEvrEeEererkrrrreree 49

2.2.8 Phương pháp xác định năng lực khử - -ccccsxcsscssesseesesee 50

2.2.9 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH: 50

2.2.10 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do hydroxyl -OH 51

2.2.11 Phương pháp nuôi cấy tế DAO Ợ QUNNNNNgg 51

2.2.12 Đánh giá mức độ gây độc tế bào bằng phương pháp MTT 522.2.13 Hoạt tính bảo vệ DNA của tế bào RAW 264.7 -ccccesxsrcreree 52

2.2.14 Hoạt tinh bảo vệ protein màng thông qua ham lượng carbony) 53 2.2.15 Hoạt tính bảo vệ lipid mang theo phương pháp TBARS 53 2.2.16 Phuong phap Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT- 9.9.4 54 2.2.17 Phương pháp Western BÌOí - . - + 1S S9 ng rg 56 2.2.18 Phương pháp BradfOrd - - - c2 c 131132119 11111811 811g re 57

2.2.19 Phương pháp xác định NO -cceceeieiriererrrrre 57

2.2.20 Phương pháp xử lý số liệu thống kê - 2-2 2+ +x+£xe£erxsrxez 57

2.3 DIA DIEM NGHIEN 0960000 Ỷẳẳ 58

CHUONG 3 KET QUA VA BAN LUẬN - 5 keEkeESESEEEEEEEerkerkerkerkeree 59

3.1 KET QUA TAO CHITOOLIGOSACCHARIDE TU CHITOSAN - << << <+s 59

3.1.1 Khảo sát các thí nghiệm tai tâm của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

thủy phân chitosan tạo COS cctiththhhhehhehrhereherưee 59

3.1.2 Kết quả tối UU hóa 2 2¿©2+¿22++EEE2EE2EEE2EE27112712112211221 21122 crk 63

3.1.3 Kết quả thí nghiệm xác minh điểm tối ưu -2 ¿¿5+=++ 643.1.4 Kết quả phân tích khối lượng phân tử COS ¿2 5 s+cs+cs+¿ 653.1.5 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình say phun 673.1.6 Kết quả sấy phun tạo bột chitooligosaccharide - s5 5+: 693.1.7 Đặc điểm bột COS tt Hee 733.1.8 Khả năng bắt gốc tự do DPPH’ của các phân đoạn COS 75

3.2 KET QUA TẠO DẪN XUAT CHITOOLIGOSACCHARIDE GẮN ACID PHENOLIC 75

3.2.1 Kết quả tạo dẫn xuất COS gắn acid gallic -©5z©cz+cs+csecseee 76

3.2.1.1 Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình tạo dẫn xuất

3.2.3.2 Phân tích đặc điểm dẫn xuất CA-COS -2- c2 ce+xvEvEtzerrsrscez 85 3.2.4 Kết qua tạo dẫn xuất COS gắn acid ferulic ¿c5 s+cxscsez 87

3.2.4.1 Kết quả khảo sat các điều kiện thích hợp đến quá trình tao dẫn xuất

—=EễEÝŸẼŸẼŸỶÃ 87

3.2.4.2 Phân tích đặc điểm dẫn xuất FA-COS . ¿-ccccccrrrreee 89 3.3 HOẠT TÍNH KHANG OXY HÓA CUA COS VÀ CÁC DAN XUẤT 92

3.3.1 Năng lực khử của COS và các dẫn xuắt -¿cxc+cxvcxecree 92 3.3.2 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH: của COS và các dẫn xuắt 93

3.3.3 Hoạt tính bắt sốc tự do -OH của COS và các dẫn xuất - 95

3.3.4 Kha năng gây độc tế bào của COS và các dẫn xuất - 97

3.3.5 Kha năng bảo vệ DNA tế bào của COS và các dẫn xuất - 98

3.3.6 Kha năng bảo vệ protein mang tế bao của COS và các dẫn xuắt 99

3.3.7 Khả năng bảo vệ lipid mang tế bào của COS và các dẫn xuắt 101

3.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHANG VIÊM CUA COS VÀ CÁC DẪN XUÁT 103

3.4.1 Khảo sát khả năng ức chế NO của COS và các dẫn xuắt 103

3.4.2 Khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện COX-2, iNOS, IL~-1B, IL-6 và TNF-ơ bang phương pháp RT-PCR . c-ccccerietieririrrre 105 3.4.2.1 Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện COX-2 105

3.4.2.2 Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện ïNOS 107

3.4.2.3 Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện IL-1B 110

3.4.2.4 Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện IL.-6 112

3.4.2.5 Kết quả khả năng làm giảm biểu hiện TNF-d .: 5- 114 3.4.3 Khảo sát mức độ làm giảm biểu hiện protein trong con đường MAPK bằng phương pháp Western blOt c-ccccctsetetetretietieriiirrie 117 3.4.3.1 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biéu hiện protein ïNOS 117

3.4.3.2 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện NF-KB (p50) 120

3.4.3.3 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện NF-kB (P65) 123

3.4.3.4 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện JNK 125

3.4.3.5 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện p38 127

3.4.3.6 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện ERK1/2 129

3.4.3.7 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện MNKI 132

CHƯƠNG 4 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ, -:-ccccccrrrreerrrrrrrerree 136 4.1 KET LUẬN -G E1 1113111 K1 K KĐT K TK KHE 136 4.2 KIEN c 8 136

DANH MỤC CONG TRÌNH -c:¿222+vttEEExtttrttttrrtrtrrrrrrriirrrrre 138 IV 0002989:/)83: 0115 140

1V

Complementary deoxyribonucleic acid Caffeic acid

Chitooligosaccharide Cylooxygenase

Dalton Dicyclohexylcarbodiimide

Deoxyribonucleic acid

Dinitro salicylic Degree of Polymerization 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl 4-Dimethylaminobenzyl-

chitooligosaccharide Enzym commission

Extent of substitution Effective concentration 1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide

Extracellular signal-regulated kinases Ferulic acid

Fourier transform infrared

Fructose oligosaccharide Gallic-chitooligosaccharide Gel permeation chromatography p-hydroxylbenzoic acid

4-hyroxybenzaldehyde chitooligosaccharide

Optical density Phenolic acid chitooligosaccharide p-coumaric acid

protocatechuic acid

Quy hoạch thực nghiệm

Reactive oxygen species Reactive nitrogen species Ribonucleic acid

Response surface model Scanning electron microscope

Sinapinic acid

Syringic acid Tumor necrosis factor a Thiobarbituric acid

Ultrafiltration Ultraviolet-visible

Vanillic acid

vi

DANH MỤC BANG

Bang 1.1: Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của COS và các dẫn xuắt 21

Bang 1.2: Nghiên cứu kha năng kháng khuẩn, kháng nắm của COS và dẫn xuất 23

Bảng 2.1: Ma trận QHTN tối ưu 5 yếu tố theo phương án từng phần 44

Bảng 2.2: Ma trận QHTN tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phan 46

Bảng 2.3: Qui trình RT-PCR 1 DưỚC - -.- c5 2232112115151 EEEerkrrrrrree 55 Bảng 2.4: Chuỗi trình tự mỗi cho RT-PCR - 2-52 ©522S£2£E+£EtzEzEEzrxerxrez 55 Bang 2.5: Trình tự luân nhiệt sản phâm RT-PCR -2- 2 2 2+s+x+£x+zx+zszse2 56 Bang 3.1: Kết quả kiểm tra các hệ số của phương trình hồi qui - 64

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra tinh tương thích của phương trình hồi qui 64

Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm xác minh điểm tối ưu - 222522 +zx>sz 65 Bang 3.4: Kết quả phân tích sac ký gel thấm qua của mau Chitosan và COS 65

Bang 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính COS - 67

Bang 3.6: Kết qua khảo sát ảnh hưởng nông độ chất khô đến hoạt tinh COS 68

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng lưu lượng nhập liệu đến hoạt tinh COS 69

Bảng 3.8: Kết quả hoạt tinh kháng oxy hóa theo thiết kế ma trận . 70

Bảng 3.9: Kết quả tính toán và kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy ¬— 71

Bang 3.10: Kết quả xác nhận tương thích của phương trình hồi quy - 71

Bang 3.11: Kết quả thi nghiệm xác minh điểm tối ưu - 2 c5 s2 +2 +2 73 Bang 3.12: Khả năng bắt gốc DPPH: của các phân đoạn COS (EC50 ug/mL) 75

Vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cau trúc hóa học của chitOSan ¿- - c5 +x+E+EvEE+E‡EEEEEEeEeEErkerererxerereree 5

Hình 1.2: Quy trình tạo chitooligosacharide từ chi†OSa1 - 55s +5<ss++ss++sss2 8Hình 1.3: Con đường sinh tổng hợp các hợp chất acid phenolic 11Hình 1.4: Con đường chuyên hoá acid phenolic trong cơ thé . - 12Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp có sử dụng EDC 2- 5 25£+c++E££EezEerxerxersrree 16Hình 1.6: Cơ chế tổng hợp dẫn xuất có sử dụng enzym - 22 s2 sz+xz>sz 17Hình 1.7: Cơ chế hình thành gốc tự do :OH - 2- 5 2+5£+£++£££EezEe£xerserssez 18

Hình 1.8: Phan ứng ghép PA-COS - Q1 H11 1H TH kg TH HH ky 18

Hình 1.9: NF-«B trong quy định của bệnh viêm nhiễm thông qua thụ thé NLRP3 26Hình 1.10: Con đường dẫn truyền tín hiệu thông qua các protein kinase hoạt hóa

mitogen MAPK 02 4a 28

Hình 1.11: Con đường tín hiệu p38 trong MAPK -.c 5c cScs+ssserssrsses 29

Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu tổng quát ¿2-2 s2 s+£+£++E££EezEezxerxerszsez 40Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện sự thay đôi hàm lượng đường khử theo nhiệt độ 59Hình 3.2: Biểu đồ thê hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử theo pH 60Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện sự thay đôi hàm lượng đường khử theo cơ chat 61Hình 3.4: Biểu đồ thé hiện sự thay đôi hàm lượng đường khử theo hoạt độ cellulase

¬ 62

Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự thay đôi ham lượng đường khử theo thời gian 63Hình 3.6:A đường đồng mức, B bề mặt đáp ứng 2- 2 2 2+ +x+£xerxzrszse2 66Hình 3.7: Anh SEM cho thấy cấu trúc bề mặt của chitosan bị phân cắt 67Hình 3.§: Bề mặt đáp ứng và đường đồng mức được mô tả cho phương trình hồi

Quy thurc nghieM P1017 72

Hình 3.9: Kết qua phân tích kích thước hạt bột COS bằng máy phân tích kích thước

Hình 3.10: Kích thước bột COS sau quá trình sấy phun được quan sát dưới kính

hiển vi quét (SEM) Mẫu được làm khô và được chụp trong môi trường chân không

viii

Hình 3.12: Tóm tắt quy trình tạo bột COS ¿- + ¿2 +2 E+E++EzE££kerEerkerxrrsrree 75Hình 3.13: Các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp dẫn xuất - 77Hình 3.14: Kết qua TLC của ascorbic, acid gallic và dẫn xuắt 79Hình 3.15: Phố UV-vis của COS (a), dẫn xuất (b) và acid gallic (€) 79Hình 3.16: Phổ 'H-NMR của COS và dẫn xuất GA-COS -c2-ccc552 80Hình 3.17: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp dẫn xuất 81Hình 3.18: Kết qua TLC của ascorbic, acid syringic và dẫn xuất 82Hình 3.19: Phố UV-vis của COS (a), dẫn xuất (b) và acid SYTInBIC (C) - 82Hình 3.20: Phổ 'H-NMR của COS và dẫn xuất SA-COS -¿- 5c cccccccez 83Hình 3.21: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp dẫn xuất 84

Hình 3.22: Kết quả TLC của ascorbic, acid gallic và dẫn xuất . 86

Hình 3.23: Phố UV-vis của COS (a), dẫn xuất (b) và acid caffeic (C) - 86

Hình 3.24: Phổ 'H-NMR của COS và dẫn xuất CA-COS .-. -5:-5 87

Hình 3.25: Các yêu tô ảnh hưởng đến quá trình tong hợp dẫn xuắt - 88Hình 3.26: Kết qua TLC của ascorbic, acid ferulic và dẫn xuất . - 90Hình 3.27: Phố UV-vis của COS (a), dẫn xuất (b) và acid ferulic (€) 90

Hình 3.28: Phổ 'H-NMR của COS và dẫn xuất FA-COS -5¿c5c55+ 91

Hình 3.29: Tóm tắt quy trình tao bột các dẫn xuất COS c2 + s+cszce2 92Hình 3.30: Năng lực khử của COS và dẫn xuẤt ¿52 2+cccccxerxerxerssree 93Hình 3.31: Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH: của COS và dẫn xuắt - 94Hình 3.32: Hoạt tính bắt gốc tự do hydroxyl của COS và các dẫn xuắt 96Hình 3.33: Khả năng gây độc tế bao và dẫn xuất -: -¿ z+csz+cxcccsee 97Hình 3.34: Khả năng bảo vệ DNA tế bào RAW 264.7 của COS và dẫn xuắt 98Hình 3.35: Khả năng bảo vệ protein màng tế bào RAW 264.7 của COS và dẫn xuất

Hình 3.39: Kết quả điện di cDNA va mức độ biểu hiện gen iNOS trong tế bào RAW

2Ó4.71 2c 2k 21 212211221221221221 T11 11H 11111 re 109

Hình 3.40: Kết quả điện di cDNA va mức độ biểu hiện gen IL-1 trong tế bào RAW

264.7 cocsscssseessesssecssessssssesssecssessvsssesssesssessvsssecssessssssssssecsuessusssesssesssessesssesssessneesessseeess 111

Hình 3.41: Kết qua điện di cDNA và mức độ biểu hiện gen IL-6 trong RAW 264.7

Hình 3.42: Kết qua điện di cDNA va mức độ biểu hiện gen TNF-a trong RAW

trong con đường truyền tín hiệu MAPK va NF-kB 5-55 2+cz+czccee: 135

MỞ DAU

Những tác động từ môi trường ô nhiễm như UV, khói, bụi, hóa chất, nhiễm khuẩn,

V.V Và Các yếu tố nội sinh như hoạt động đôi chat tại ty thé, peroxisome, mang lưới

nội chat tạo ra rất nhiều gốc tự do gây nguy hai tế bao như ROS va RNS làm thay đôicấu trúc màng tế bào, nhân Gia tăng quá mức các gốc tự do dẫn đến gia tăng biểuhiện nhiều enzym iNOS, COX-2 và các cytokine tiền viêm như nhân tố hủy hoại mô

alpha, interleukin-18, interleukin -6 thông qua các con đường tín hiệu như MAPK,

NF-kB gây nên tinh trạng viêm cấp tính hay mãn tính Từ đó làm thay đôi chức năngsinh học tế bao và biểu hiện nên các bệnh lý khác nhau trong đó có ung thư, rỗi loạnthần kinh, sơ vữa động mạch, đái tháo đường, lão hóa, v.v [1]

Chitosan có những hoạt tính kháng khuẩn, giảm cholesterol, giảm huyết áp, kháng

viêm, kháng oxi hóa, v.v Ngoài ra, chitosan là nguyên liệu dễ phân hủy sinh học,

không độc vì vậy được ứng dụng rất nhiều và đa dạng trong công nghiệp được phẩm,

thực phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe [2] Mặc dù, chitosan có nhiều chức năng hiệu

quả trong nhiều lĩnh vực, nhưng chúng có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cao nênkhó ứng dụng trong cơ thé Hơn nữa, chitosan không được ruột non hap thu vì hệ tiêuhóa của động vật, đặc biệt là hệ tiêu hóa của cơ thé người không có chitosanase déthủy phân chúng thành những chat có khối lượng phân tử thấp dé co thé hap thu [3].Chính lý do trên, nghiên cứu cắt mach chitosan tạo chitooligosaccharide (COS) dé

mở rộng phạm vi ứng dụng là rất cần thiết Có 3 phương pháp chính dé tao COS từchitosan là phương pháp vật lý thường là chiếu xạ, phương pháp hoá học sử dụngacid dé thuỷ phân chitosan và phương pháp sinh hoc sử dụng enzym dé tạo COS.Trong đó phương pháp sinh học rất được quan tâm bởi khả năng áp dụng quy mô lớn

và thân thiện môi trường Tuy nhiên việc sử dụng enzym đặc hiệu gặp nhiều khó khăn

vì hạn chế trong sản xuất quy mô lớn [4] Do vậy, ứng dụng enzym không đặc hiệu

đã được thương mại hoá rất được quan tâm COS, có thể hòa tan trong nước, sở hữunhiều hoạt tính sinh học như kháng viêm, kháng oxi hóa, làm lành vết thương v.v và

tiềm năng ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm, thực

phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v Trong những năm gần đây, nghiên cứu gắn nhóm

chức năng acid phenolic có hoạt tính sinh học như khang oxi hoa, kháng viêm vao

chuỗi mạch của COS để tăng cường hoạt tính sinh học và đa dạng ứng dụng của COSrất được quan tâm Tiêu biểu như acid gallic thuộc nhóm acid phenolic được Ngo vacộng sự (2011) sử dụng là nguyên liệu dé ghép vào chuỗi mach COS nhằm tăng cườnghoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm của COS Kết quả nghiên cứu đã cho thấy dẫnxuất có tác dụng trung hòa các gốc tự do dé bảo vệ lipde, protein màng va DNA tránhcác tôn thương có thé dẫn đến thay đổi chức năng sinh học của tế bào Ngoài ra dẫnxuất cũng cho thay có tác dụng điều hòa giảm biểu hiện của NF-kB (p50 và p65),nhân tố biéu hiện trong quá trình viêm Kết quả là bang chứng cho thay dẫn xuất COSđược ghép acid gallic có vai trò như chất kháng oxi hóa và kháng viêm [5] Tuy nhiêndẫn xuất được tông hợp sử dụng xúc tác Dicyclohexylcarbodiimide có thể gây độc vìvậy dẫn xuất tạo thành không được xem là nguyên liệu sinh học [6] Do vậy, nguyêncứu sử dụng xúc tác an toan, thân thiện môi trường là rất cần thiết Bên cạnh đó vaiđiều hòa giảm biểu hiện các tín hiệu nội bao trong con đường MAPK và các yếu tốtiền viêm cần làm rõ nhằm khăng định vai trò kháng viêm của dẫn xuất mới Từnhững nhận định trên đề tài "Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm củachitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic-chitooligosaccharide" được thực hiệnvới mục tiêu chính là, nghiên cứu tạo chế phẩm chitooligosaccharide và các dẫn xuấtchitooligosaccharide gắn các hợp chất acid phenolic có hoạt tính sinh học từ đó làmtiền đề cho các ứng dung tạo các sản phâm thực phẩm chứa COS hoặc dẫn xuất Dé

tài được thực hiện với những nội dung chính:

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện tối ưu dé tạo COS

- Tối ưu hóa điều kiện thủy phân chitosan bằng enzym

- Tối ưu hóa điều kiện sấy phun COS

- Phân tích đặc điềm bột COS và lựa chọn phân đoạn COS gan acid phenolic

Nội dung 2: Nghiên cứu tao dẫn xuất COS

- Tạo dẫn xuất COS bằng phương pháp hóa học ghép nhóm chức năng như các

nhóm phenolic vao vòng pyranose cua COS.

- Phân tích đặc điểm va xác định cấu trúc dẫn xuất COS

Nội dung 3: Phân tích so sánh hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm của COS và

- Đánh giá hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào RAW 264.7 ở mức độ biéu

hiện gen và protein.

Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ di sâu nghiên cứu:

Nghiên cứu tạo COS với các phân đoạn: 1-10 kDa

Tạo 4 dẫn xuất COS gắn nhóm carboxyl của hợp chất acid phenolic như acid

gallic, acid caffeic, acid syringic, acid ferulic.

Nghiên cứu một số hoạt tính cua COS và dẫn xuất như: kháng viêm, kháng oxi

hóa.

Nghiên cứu thử hoạt tinh in vitro với tế bào RAW264.7 được cảm ứng bởi LPS

Tính mới luận án

Tối ưu hoá sản xuất COS băng cellulase: 0,76% cơ chat, 8,97 IU/g cellulase, pH

5,9; và nhiệt độ thuỷ phan 49°C, thời gian thuỷ phan 180 phút, COS có MW trung

bình 4,3 kDa Tối ưu hoá qui trình thu hồi COS bằng sấy phun: Nguyên liệu phun

14,3% w/v, nhiệt độ 138°C, lưu lượng 5,2 mL/phút.

Hoạt tính kháng viêm của chitooligosaccharide và các dẫn suất phenolic acid:giảm NO, ức chế biểu hiện gen COX-2, iNOS, IL-1, IL-6 va TNF-a; ức chế biểu

hiện protein theo con đường tín hiệu MAPK: iNOS, ERK1/2, p38, p50, p65, JNK và

MNKI trên mô hình tế bao RAW 264.7

tế bao nam, v.v.[4] Chitin tồn tại dưới 3 dạng hình thái là a, B, y chitin, 3 dạng nàykhác nhau về tính hydrat hóa và kích thước của đơn vi cấu trúc tạo thành chitin Cấutrúc của a-chitin là các mạch được sắp xếp song song và ngược chiều, trong khi B-chitin là các mạch được sắp xếp song song và cùng chiều, và dang phức tạp y chitinđược sắp xếp cứ hai mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngược chiều [8].Chitin được cô lập lần đầu tiên vào năm 1811, bởi nhà nghiên cứu hóa học và dược

học người pháp Henry Braconnot (1787-1855), là một polysaccharide được phan lập

từ nam va được đặt tên là fungine Sau đó vào năm 1823, Odier đã tìm thấy một chấttương tự như fungine trong bộ khung xương của côn trùng và đặt tên cho chất đó làchitin Năm 1859, Roughet đã cho thấy chitin có thé hòa tan trong dung môi sau khiđược biến đổi bang tác nhân hóa hoc Chitin là nguyên liệu để tạo chitosan vàchitooligosacchride Chitin đã thu hút nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh như chữalành vết thương và được cho là một vật liệu sinh học đầy hứa hẹn cho kỹ thuật mô vàcông nghệ tế bào gốc [9] Bae và cộng sự, (2013) đã cho thấy uống chitin (dạng alpha

và beta) có thé mang lại lợi ích là ngăn ngừa bệnh di ứng với thực phẩm Nghiên cứuđược tóm tắt như sau: chitin với kích thước nhỏ hơn 20 micromet được trộn với thức

ăn cho chuột Kết quả nghiên cứu trên mô hình chuột cho thấy alpha chitin làm giảmlượng đáng kế kháng thé IgE trong huyết thanh (31-47%), trong khi beta chitin không

có chức năng này, cả hai dạng chitin làm giảm mức interleukin (IL) như IL4, IL5, IL10 và IL13 [10].

Kha năng ứng dụng của chitosan rộng hon chitin bởi chitosan có khả năng hòa tantốt trong môi trường acid yếu, trong khi chitin không tan trong môi trường nước vàacid [9].

1.1.2 Chitosan

Chitosan là polymer sinh học tự nhiên, không độc hại và là một polysaccharide

mạch thắng, được cấu tạo từ các đơn phân D-glucosamine liên kết với nhau qua các

liên kết beta-1,4-glucoside, vì vậy chitosan còn được gọi là poly-1,4-glucosamine.Công thức phân tử của chitosan: [CeH1104N]n và M chitosan = (161,07)n Cấu tạohóa học của chitosan được thê hiện hình 1.1 Chitosan không tan trong nước, tan trongdung môi acid hữu cơ Không giống như chitin, chitosan không là thành phần của cácloài động vật và hiếm khi tim thấy trong tự nhiên Nguôn tự nhiên cua chitin thườngtim thấy trong vỏ cua, tôm, xương mực trong khi chitosan thì không tìm thấy [11].Trong tế bào nắm thì có cả chitin lẫn chitosan tự nhiên, chúng hiện diện trong thành

tế bao nam Chitosan là thành phan quan trọng trong thành tế bào nắm Zygomycetes

[12] Chitosan tồn tại hai dạng khác nhau trong thành tế bao nắm, một là dạng chitosan

tự do, hai là dang chitosan liên kết glucan [11] Chitosan tự nhiên có thể chiết xuất trực tiếp các nguồn nguyên liệu Chất lượng và sỐ lượng của chitosan thu nhận từ

nguồn nam phụ thuộc vào loài nắm, điều kiện lên men và quy trình chiết xuất.Chitosan thu nhận từ động vật giáp xác có khối lượng phân tử cao, trong khi chitosanthu nhận từ nguồn nắm có khối lượng phân tử thấp hơn [11]

OH OH OH

HO HO HO OH

NH» NH» NH

n

Hình 1.1: Cầu trúc hóa học cua chitosan [13]

Chitosan thương mại phan lớn được thu nhận từ quá trình deacetyl của chitin tựnhiên và sản lượng hàng năm vải triệu tấn [14] Sản lượng tiêu thụ chitosan trên thịtrường thế giới vượt mức 118.000 tan năm 2018 và giá trị dự kiến đạt 6.8 tỉ USD vào

năm 2024 [15] Phần lớn chitosan được sử dụng tập trung vào các lĩnh vực như mỹ

phẩm, y học, phân bón hữu cơ, bé sung ché do an, v.v [16].

Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin bằng dung dich kiềm Do vậy,chitosan và chitin có thể được phân biệt cơ bản dựa vao sự acetyl hóa của đơn phânD-glucosamine Theo quy ước nếu mức độ deacetyl > 50% thì gọi là chitosan còn

nhỏ hơn 50% thì gọi là chitin Trong dung môi acid hữu cơ như acid acetic, acid

formic, acid lactic chitosan tôn tại dang muối va hòa tan Chitosan chứa ba nhómchức năng phản ứng chính là amino, N-acetamide va hydroxyl Tinh chất hóa ly của

chitosan phụ thuộc chủ yếu vào nhóm amino, N-acetamide [17] Chitosan được phân

loại theo mức độ deacetyl, mức độ polyme hóa và khối lượng phân tử [18].

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu sinh hóa bởi những hoạt tính kháng

khuẩn, giảm cholesterol, giảm huyết áp, kháng viêm, kháng oxy hóa, v.v Ngoài ra,chitosan là nguyên liệu rẻ tiền, dễ phân hủy sinh học, không độc vì vậy được ứngdụng rất nhiều và đa dạng trong công nghiệp thực pham [19] Mặc dù, chitosan cónhiều chức năng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, nhưng chúng có khối lượng phân tửlớn và độ nhớt cao nên rất khó dé cơ thé người và động vật hấp thu Hơn nữa, chitosankhông được ruột non hấp thu vì hệ tiêu hóa của động vật, đặc biệt là hệ tiêu hóa của

cơ thé người không có hệ enzym chitinase và chitosanase dé thủy phân chúng thànhnhững chất có khối lượng phân tử thấp dé cơ thé hấp thu Vi vậy, ảnh hưởng củachitin và chitosan trong cơ thé vẫn chưa rõ ràng Tuy nhiên, trong những năm ganđây đã có nhiều nghiên cứu chuyên chitosan thành dẫn xuất có khối lượng phân tửthấp hơn, những dẫn xuất phân tử thấp này được dự báo có hoạt tính sinh học và khảnăng ứng dụng cho cơ thể tốt hơn chitosan [3]

1.1.3 Chitooligosaccharide và các dẫn xuất

Chitooligosaccharide (COS) là dẫn xuất của chitosan có thể được thu nhận bằng

hai phương pháp: hóa học va sinh học (sử dụng enzym) Trường hợp thủy phân

chitosan dé thu COS bằng phương pháp hóa học gây độc cho cơ thé cao Trong khi

đó, thủy phân chitosan dé thu COS bằng enzym không độc cho cơ thé và thân thiện

môi trường Ngoài ra, chitooligosacchatide cũng có thé thu nhận bằng phương pháp

vật lý [3].

Chitooligosaccharide là dang oligomer của chitosan nên có được hau hết nhữnghoạt tính sinh học của chitosan như kháng oxy hóa, kháng nắm, kháng khuẩn, khángung thư, tăng cường miễn dịch, v.v Các tính chất này phụ thuộc rất nhiều vào độpolymer hóa, độ deacetyl hóa, sự phân bồ điện tích và ban chất các biến đồi hóa họctrên phân tử của COS Khác với chitosan, COS có khối lượng phân tử nhỏ hơn nên

dễ đi vào máu tạo nên các tác động sinh học một cách có hệ thống lên cơ thể [20]

Các nghiên cứu cũng cho thấy khả năng vượt trội của dẫn xuất COS so với COS

về đặc tính và hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa [21], kháng viêm [22],

hạ huyết áp [23] kháng tế bào ung thư [24], bắt gốc tự do [5], phòng ngừa bệnh

alzheimer [21, 25], v.v

1.2 Phương pháp tạo chitooligosaccharide từ chitosan

Có nhiều phương pháp được dé xuất tao COS từ chitosan, có thé chia làm ba loạichính như sau: Phân cắt băng tác nhân hóa học: acid vô cơ (HCI, HF, H2SO4, H3POa,HNO¿, v.v.), acid hữu cơ (CH3COOH, HCOOH, v.v.), chất oxy hóa (O3, HaO, v.v.),v.v.[9] Phân cắt bang tac nhan ly hoc nhu chiéu xa nhu tia gamma v.v [26] Phâncắt bằng tác nhân sinh học (enzym): chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase,v.v.[27] Sơ đồ tạo COS từ chitosan bằng phương pháp hóa học và enzym được trình

bày ở hình 1.2.

Acid HCl, HNO; Chiéu xa, vi song Dac hiéu: chitosanase

Không đặc hiệu: Cellulase, lipase,

| hemicellulase, pectinase v.v.

Chitooligosacharide

Hình 1.2: Quy trình tao chitooligosacharide từ chitosan

1.2.1 Phương pháp hóa hoc

Phương pháp hóa học sử dụng acid mạnh đề thủy phân chitosan rất phô biến và làphương pháp nhanh đề sản xuất hàng loạt các COS Nguyên tắc của phương pháp này

là sự thủy phân ngẫu nhiên liên kết O-glycoside giữa các đơn phân của phân tửchitosan dé tao COS [20]

Phương pháp thủy phân bang acid có ưu điểm là chu ki sản xuất ngắn, tác nhânthuỷ phân dé tìm Tuy nhiên, hiệu suất thu nhận COS còn thấp, khả năng gây độc caocủa sản phẩm là hạn chế khi áp dụng phương pháp hóa học quy mô công nghiệp [28]

1.2.2 Phương pháp vật lý

Quá trình thủy phân chitosan bằng chiếu xạ đã thu hút được sự chú ý đáng kể vìđây là một quá trình tương đối đơn giản, không sử dụng xúc tác hóa học, được thựchiện ở nhiệt độ phòng và có thé áp dụng trên quy mô lớn Tuy nhiên chi phí tạo rasản pham cao khi sử dụng liều xạ cao là hạn chế của phương pháp này [28]

Chiếu xa gamma thường được ứng dụng dé thuỷ phân chitosan, quá trình này có

thê thực hiện ở nhiệt độ phòng và quy mô lớn Hiệu quả của quá trình thuỷ phân phụ

thuộc vào liều xạ (0,5 — 200 kGy) va dung môi sử dụng (nước, acid acetic, hydrogen

được nghiên cứu và công nhận như: chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase,

protease, glucanase, lysozyme, v.v [30].

COS được sản xuất tir chitosan bởi enzym đặc hiệu như chitosanase và không đặc

hiệu như cellulase, lipase, papain, lysozyme, hemicellulase, pectinase, pepsin, v.v

Han ché khi str dung enzym đặc hiệu là giá thành cao và su thiếu hụt về số lượng khi

sử dụng quy mô lớn Vì lý do này, các nhà nghiên cứu và sản xuất thường nghiên cứu

và lựa chọn loại enzym không đặc hiệu thương mại, những enzym không đặc hiệunày cho hiệu quả tạo COS tương tự như enzym đặc hiệu trong khi giá thành lại thấp

[7].

1.2.3.1 Enzym dac hiéu

Chitosanase có nhiều trong tự nhiên, được thu nhận từ các nguồn như vi khuẩn,nam Hoạt tính của chitosanase cũng được tìm thấy ở thực vật và động vật Enzymđặc hiệu này xúc tác phân cắt liên kết B-1,4-glycoside một cách ngẫu nhiên dé tạoCOS Hiệu quả sử dụng chitosanase dé tao COS cao Tuy nhiên, chi phí cao cho thunhận chitosanase như tách chiết, tinh sạch, cô đặc, v.v Vì vậy, sỐ lượng enzym đặc

hiệu này không đủ cho sử dụng công nghiệp [7].

1.2.3.2 Enzym không đặc hiệu

Cellulase là enzym không đặc hiệu có khả năng thủy phân chitosan dé tao COS.Sản phẩm tạo ra có khối lượng phân tử thấp, hòa tan tốt trong nước và không có sự

thay đổi về cấu trúc của sản phẩm Cellulase là enzym có nhiều trong tự nhiên, được

thu nhận từ các nguồn như vi khuẩn, nắm và thực vật [31]

Cellulase là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết glycoside trong phân tử cellulose Cellulase gồm nhiều enzym khác nhau và đượcxếp thành ba nhóm cơ bản endo- f-1,4glucanease, exo-j-1I,4-glucanase và B-glucosidase Mỗi loại enzym xúc tác phan ứng thủy phân cơ chất theo cơ chế nhấtđịnh và nhờ sự phối hợp của các enzym đó mà cơ chất được thủy phân tạo các cơ chấtthấp phân tử hơn [7]

B-1,4-O-Hoạt tính thủy phân cellulose và chitosan của cellulase là tương đương nhau Điềunày có nguồn gốc từ sự tương đồng trong cấu trúc của chitosan và cellulose Nhiềunghiên cứu về đặc điểm va cơ chế của cellulase trong quá trình thủy phân chitosan đãđược công bố Ở chitosan tại vị trí C-2 là nhóm amin trong khi ở cellulose là nhómhydroxyl, enzym không nhận ra sự khác nhau về nhóm —NH› và nhóm -OH ở vị triC-2 khi phức hệ enzym — co chất hình thành Nhiệt độ thích hợp dé cellulase thủy

phân chitosan là 50-60 °C và pH thích hợp trong khoảng 5-7 [3].

Mặc dù COS có thé được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau, nhưngphương pháp thủy phân chitosan bằng enzym là phương pháp cho hiệu suất thu hồicác phân đoạn có hoạt tính cao Điều kiện diễn ra phản ứng thủy phân nhẹ nhàng,nhiệt độ thấp, pH trung tính, chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường vàsản phẩm tạo ra được sử dụng an toàn hơn, hơn nữa việc sử dụng enzym không đặchiệu cellulase đã được thương mại hóa và ứng dụng nhiều trong công nghiệp gópphần tăng hiệu quả kinh tế Vì những lý do nêu trên enzym không đặc hiệu cellulase

được chọn cho nghiên cứu này.

1.3 Hợp chất phenolic và hoạt tính sinh học

Acid phenolic là hợp chất chuyên hoá thứ cấp hiện diện trong rất nhiều loại thực

vật, những hợp chất này được tạo ra dé chống lai tia UV, vi khuẩn, vi-rút và cả côn

trùng gây hại hoặc ức chế cạnh tranh giữa các loài thực vật Những hợp chất này cómặt trong chế độ ăn uống ở nhiều loại thực phẩm khác nhau đặc biệt là các loại nắm

ăn [32].

10

Acid phenolic chia thành hai nhóm chính acid hydroxyl benzoic và acid

hydroxycinnamic, chúng được tổng hợp từ con đường shikimate với sự góp mặt của

hai acid amin quan trọng cho con đường tông hợp là phenylalanin và tyrosin, các acidamin này là tiền chất chung cho phần lớn các sản phẩm phenolic tự nhiên Quá trìnhkhử amin cua phenylalanine hoặc tyrosine xảy ra tương ứng tao ra acid cinnamic hoặc

acid p-coumaric Các vòng thơm của acid cinnamic và acid p-coumaric sau đó được

hydroxyl hóa và metyl hóa dé tạo thành các dẫn xuất của nó ví dụ như acid ferulic và

acid caffeic Khu amin, hydroxyl hóa va methyl hóa là ba phản ứng chính liên quan

đến sự hình thành acid phenolic Sự hình thành acid benzoic là kết quả của sự phânhủy chuỗi bên của acid cinnamic, các phản ứng hydroxyl hóa và metyl hóa giốngnhau có thé xảy ra trong vòng thom của axit benzoic tạo ra các dẫn xuất tương ứng,

ví dụ, acid protocatechuic và p-hydroxybenzoic Quá trình sinh tổng hợp các acid

OCH3s —>

Syringic acid

Hình 1.3: Con đường sinh tong hợp các hop chất acid phenolic[32]

11

Sự chuyển hoá acid phenolic theo con đường ăn uống:

Acid phenolic tự do được giải phóng khỏi thực pham và đồ uống trong da dày, tácđộng cơ học của cơ thé làm giảm kích thước thức ăn va tăng cường hơn nữa việc giảiphóng các hợp chất phenolic dé cơ thé hap thu dé dang

Các acid phenolic được hap thu trong chế độ ăn uống được co thé coi là các chatxenobiotic và do đó chúng trải qua quá trình trao đôi chat dé tạo điều kiện loại bỏchúng Chuyên hóa xenobiotic trải qua nhiều co quan khác nhau, bắt đầu ở biéu môruột trên, sau đó tiếp tục ở ruột dưới va gan, cũng như ở các mô ngoại biên, chănghạn như thận và mô mỡ Các enzym gan biến đồi các phân tử bằng cách thêm hoặc

loại bỏ các nhóm hydroxy] (giai đoạn I) và liên hợp chúng với các phân tử khác (giai

đoạn II) dé tăng khả năng hòa tan trong nước, do đó tăng cường bài tiết qua nước tiểu[33] Con đường chuyền hoá acid phenolic trong cơ thé được thé hiện hình 1.4

GlucoromidaHon—+> UDP- glucoronosvitransferases Methylation —> Carechol-O-methyl transferases

GlucoronidaHon—> UDP- glucoronosvitransferases Methylation —+ Catechol-O-methyl transferases

chuyển nhóm methyl của S-adenosyl-L-methionine thành các polyphenol có sốc diphenolic và một tỷ lệ nhỏ sản phẩm 4’-O-methyl hóa cũng được hình thành Quá

O-trình methyl hóa thường xảy ra ở các cơ quan ruột non, gan và thận trong đó enzymchuyển hoá cho thấy hoạt động cao nhất ở gan và thận Sulfotransferase xúc tác quátrình chuyển gốc sulphate của 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate thành nhómhydroxyl, phản ứng liên hợp này xảy ra ở gan Enzym liên kết màng UDP-glucuronosyltransferase nam trong mạng lưới nội chất trong nhiều mô xúc tác chuyển

acid glucuronic từ axit UDP-glucuronic thành polyphenol Phan ứng liên hợp thay

đổi tùy theo bản chất của polyphenol và lượng ăn vào [32]

Acid phenolic có hoạt tính sinh học như kháng oxi hoá, kháng khuẩn và khángkhối u, nhiều nghiên cứu cho thấy những hợp chất có vai trò quan trọng trong ngănngừa và hỗ trợ điều trị bệnh Nhóm chức năng hydroxyl gắn vào cấu trúc mạch vòngcủa hợp chất đóng vai trò quan trọng về hoạt tính sinh học của acid phenolic Hoạttinh tăng hay giảm phụ thuộc vào số lượng nhóm chức năng này hiện diện trong cautrúc của các hợp chất acid phenolic vi dụ như acid gallic có 3 nhóm hydroxyl sẽ cóhoạt tính tốt hơn acid Syringic chỉ có 1 nhóm hydroxyl Nhóm chức năng này có khảnăng nhường proton H đóng vai trò là tác nhân khử nhằm khử oxygen tự do, khử cácphức kim loại, bắt gốc tự do superoxide, hydroxyl va peroxyl [4, 33] Nhiều côngtrình nghiên cứu cho thấy các hợp chất acid phenolic có vai trò quan trọng trongphòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh như:

Acid gallic có nhiều hoạt tính sinh học được chứng minh, chăng hạn như đặc tínhngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị ung thư, kháng khuẩn, chống tạo hắc tố và chống oxyhóa Hợp chất này cho thấy đặc tính chống ung thư trong tế bao ung thư biéu môtuyến tiền liệt Nghiên cứu trước đây cho thấy acid gallic đã gây chết tế bào ung thư

cô tử cung Hela băng quá trình chết theo chương trình [32]

Acid caffeic là hợp chất đại diện nhóm hợp chất phenolic được tìm thấy nhiềunguồn khác nhau trong tự nhiên như trái cây, rau, thảo mộc, trà, cà phê.v.v Acidcaffeic sở hữu nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng oxi hoá, kháng ung thu,

kháng virus, kháng viêm và có hiệu quả trong ngăn ngừa và điêu trị đái tháo đường.

13

Nghiên cứu trước đây đã cho thấy hợp chất này có thé đồng thời ngăn chặn sự kíchhoạt của các yếu tố phiên mã khác nhau như NF-kB và AP-1 trong con đường MAPKs

di ứng, kháng viêm, kháng vi sinh vật [39-41], v.v Với những lợi ích tốt cho sức

khỏe con người, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung nghiên cứu dé thu nhận những

hợp chất acid phenolic từ các nguồn thực vật và thực phẩm Bên cạnh đó, việc nghiên

cứu ứng dụng của những hợp chất này cũng được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm

Đặt biệt, nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,

v.v nhằm đem lại lợi ích sức khỏe cho con người

Với những ưu điểm nồi bật trên, hợp chất acid phenolic được lựa chọn để tạo

dẫn xuất phenolic-COS nhằm tăng cường hoạt tính sinh học của COS

1.4 Phương pháp tạo dẫn xuất phenolic - chitooligosaccharide

Hoạt tính của COS chủ yếu thé hiện nhóm amino tại vị trí C-2 va hydroxy] tại vịtrí C-3, C-6 của nhóm đường pyranose [4, 42] Vì vậy, nhóm chức mới có thé đượcthêm vào các vị trí trên, bằng cách cho những nhóm chat có chức năng hay phân tửmục tiêu tác dụng với các nhóm amino hay hydroxyl, dé tạo thành dẫn xuat thích hopcho các ứng dụng khác nhau Một số phản ứng hóa học có thé được sử dụng dé ghépnhững nhóm chức năng mục tiêu vào những nhóm chức năng của COS và kết quả làtạo ra dẫn xuất mới Các phản ứng tạo dẫn xuất bằng cách ghép các nhóm chức hoặc

phân tử mục tiêu vào vi tri carbon C-3 và C-6 thường khó khăn hơn ghép vào nhóm

amino ở C-2 [30] Có ba phương pháp chính thường được sử dụng phô biến để tạoliên kết hóa học giữa acid phenolic vào các vị trí chức năng của chitosan/COS chođến thời điểm này bao gồm phương pháp ghép có sử dụng carbodiimide, sử dụngenzym làm xúc tác tạo liên kết, phương pháp tạo liên kết thông qua các gốc tự do

14

Phương pháp tạo dẫn xuất có sử dụng carbodiimide Là phương pháp được sửdụng phổ biến dé tạo dẫn xuất chitosan có gắn nhóm chức năng acid phenolic Phươngpháp cho hiệu quả tổng hợp cao, phản ứng ghép thực hiện trong môi trường acidloãng dé tăng cường phản ứng, các xúc tac dư và các dẫn xuất urea có thé loại ra khỏisản phẩm dễ dàng bằng thâm tích Phương pháp đã sử dụng thành công cho tông hợpnhiều nhóm chức năng của acid phenolic vào mạch chitosan và COS như acid gallic,acid caffeic, acid protocatechuic, acid salicylic [43-45] Cơ chế phản ứng ghép chotong hợp có phan ứng (1-ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (EDC) vàN-hydroxysuccinimide (NHS) được thé hiện như hình 1.5 EDC phan ứng trước tiênvới nhóm carboxyl trong hợp chat acid phenolic dé hình thành O-acylisourea phanứng với amine Nếu như hợp chat trung gian này không phản ứng ngay với amin, thì

sẽ tự phân hủy và tái tạo lại trạng thái nhóm carboxyl Thứ hai, sự hiện diện của NHS

làm O-acylisourea phản ứng với amin có thể tiếp tục được chuyền đôi thành este NHSphan ứng amin Sau cùng, liên kết este giữa amin và NHS có thé phản ứng với nhómamino và nhóm carboxyl trong mach chitosan hoặc COS dé hình thành nên dẫn xuấtgan acid phenolic [43] Nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả tổng hợp phụ thuộc vàođiều kiện tong hợp như tỷ lệ giữa co chất gắn vào mach polymer, pH, nhiệt độ và thờigian phản ứng [46] Xie va cộng sự (2014) cho thấy EDC và 1-hydroxybenzotriazle(HOBt) như cặp phản ứng trung gian cho tổng hợp acid gallic vào mach chitosan,nghiên cứu cho thấy rằng hiệu quả được tăng cường đáng kể trong sự hiện diện củaHOBt [47] Ngoài ra Ngo và cộng sự (2011), Vo và cộng sự (2012) cho thấy hiệu quảtổng hợp acid gallic vào mạch COS khi sử dụng Dicyclohexylcarbodiimide (DCC)trong methanol [5, 48] So với các phương pháp tông hợp khác phương pháp này chohiệu quả tổng hợp cao nhất Tuy nhiên, do phản ứng liên kết chéo giữa EDC, DCCNHS, HOBt tạo ra một lượng hóa chất dư thừa trong sản phẩm gây ảnh hưởng đếnsức khỏe khi san phâm được ứng dụng vào thực phẩm hay dược pham [47] Vì vaytìm phương pháp khác an toàn và thân thiện môi trường hơn là rất cần thiết

15

Hình 1.5: Cơ chế tong hợp có sử dụng EDC[46]

Phương pháp tạo dẫn xuất có xúc tác enzym Trong những năm gần đây phươngpháp tổng hợp có xúc tác enzym được áp dung dé tạo dẫn xuất acid phenolic ghépvào mạch chitosan Phương pháp này có ưu điểm là rẻ hơn phương pháp có sử dụngcarbodiimide Enzym được tái sử dụng nếu công nghệ cô định được áp dụng [49].Một ưu điểm nữa là enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc cao tăng hiệu quả quá trìnhtổng hợp Việc sử dụng enzym không tạo ra các phản ứng không mong muốn gây hạicho cơ thê nên an toàn hơn phương pháp carbodiimide Tuy nhiên, enzym thường xúc

tác phản ứng oxy hóa nhóm cacboxyl cua acid phenolic thành ø-quinone nên làm

giảm hoạt tính sinh học như giảm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn sau khi tạodẫn xuất so với phương pháp carbodiimide Các loại enzym thường được sử dụng là

laccase (EC 1.10.3.2), peroxydase (EC 1.11.1.x), va tyrosinase (EC 1.14.18.1)

o-quinone, được hình thành như hợp chat thứ cấp sau khi enzym xúc tác oxy hóa acidphenolic, hợp chất trung gian này gắn vào mạch chitosan/COS thông qua phản ứngtạo Schiff-base (C=N)/(C=CH) [50] Cơ chế tạo dẫn xuất thé hiện hình 1.6

16

Liu và cộng sự (2014) nghiên cứu sử dụng tyrosinase để ghép những hợp chấtphenolic vào mạch chitosan Tyrosinase đóng vai trò là chất oxy hóa trung gian gắnacid caffeic vào chuỗi mạch chitosan, những kết quả bước đầu cho thấy tyrosinasetriển vọng làm nguyên liệu xúc tác cho tổng hợp [51] Tiếp theo đó, Yang và cộng sự(2016) đã sử dụng laccase từ Pleutotus ostreatus, làm xúc tác đặc hiệu dé tong hợpnhững hợp chất thuộc nhóm cinnamicbenzoic vào mach chitosan Các phân tích FT-

IR, XRD, TGA và SEM đã cho thấy, các nhóm chức năng của acid caffeic, acid

ferulic, acid p-coumaric, acid chlorogenic đã ghép thành công vao vi trí C-2 cua

chitosan Ngoài ra kết qua phân tích hoạt tính kháng khuẩn cho thấy hiệu quả của danxuất tăng gấp 25 lần so với chitosan tự do [52]

Hình 1.6: Cơ chế tổng hợp dan xuất có sử dung enzym [50]

Phương pháp tạo dẫn xuất có sử dụng gốc tự do trung gian làm xúc tác Các hợpchat phenolic cũng có thé được ghép vào mach chitosan thông qua các gốc tự do làm

xúc tác Xúc tác thường được sử dụng là cặp xúc tác oxy hóa khử acid ascorbic

(Vc)/hydrogen peroxyde (H›O›), bởi tính không độc và chi phí thấp hơn carbodiimin

và enzym, điểm nổi bật nữa là phản ứng có thé thực hiện trong điều kiện nhiệt độphòng để giữ được hoạt tính phenolic tốt hơn phương pháp sử dụng enzym có nhiệt

độ cao hơn Dung dịch có chứa acid ascorbic trong môi trường acid yếu tồn tại dướidạng AscHa và phản ứng với H2O> dé hình thành nên gốc tự do -OH Sau đó, gốc tự

do :OH tách H từ nhóm amino va hydroxyl của chitosan/COS làm cho chitosan/COS

17

trở nên rất linh động và dễ dàng tiếp nhận acid phenolic, kết quả hình thành nên dẫnxuất chitosan/COS mới Cơ chế tổng hợp thé hiện hình 1.7 và 1.8 Các nghiên cứutrước đây cho thấy acid gallic, vanillic, protocatechuic thuộc nhóm hydroxylbenzoic,

và các hợp chất thuộc nhóm hydroxylcinnamic như acid caffeic, acid ferulic,

p-hydroxybenzoic, đã được ghép thành công vào chitosan khi sử dụng cặp xúc tác nay

PA: Phenolic acid

Hinh 1.8: Phan ung ghép PA-COS

Trong nghiên cứu nay chúng tôi quan tâm đến ghép nhóm chức carboxyl của cáchợp chất acid phenolic vào nhóm amino và hydroxyl của phân tử COS với xúc tác

acid ascorbic/H›O; Việc sử dụng xúc tác acid ascorbic/H2O2 thân thiện với môi

trường hơn khi sử dụng hai xúc tác EDC và NHS EDC và NHS gây độc và khó loại

khỏi môi trường phản ứng sau khi tổng hợp dẫn xuất [56]

1.5 Hoạt tính sinh học của chitooligosaccharide và các dẫn xuất

1.5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Gốc tự do là những phân tử hóa học chỉ có một điện tử duy nhất hay mang một số

điện tử lẻ Trong một sô phản ứng hóa học, có một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và

18

phân tử đó trở thành một gốc tự do với số lẻ điện tử Do đó, phân tử trở nên mat cânbang và không ổn định, dé dàng thực thiện các phan ứng Phân tử bat ồn này luôn tìmcách bắt các điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, lần lượt gây ra một chuỗi nhữnggốc tự do mới, gây rối loạn quá trình chuyền hóa bình thường của tế bào Gốc tự dohủy hoại tế bào theo diễn tiến như sau: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào,gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; Tiếp theo,gốc tự do tan công các ty lap thé, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng; Sau cùng, bằngcách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng

trưởng được.

Các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự lão hóa và chết của cácsinh vật Gốc tự do phản ứng lên ti lap thé, gây ton thương các phân tử bang cách làmthay đổi hình dạnh, cấu trúc, khiến chúng trở nên bat én, mat chức nang, mất khảnăng sản xuất năng lượng.Tuy nhiên, không phải là các gốc tự do nao cũng là nhữngtác nhân nguy hại Đôi khi chúng cũng có tác động hữu ich cho cơ thé Nếu được kimchế, các gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamincần cho thị giác, góp phan sản xuất prostaglandin có công dụng ngừa nhiễm trùng,tăng cường miễn dịch, hỗ trợ sự truyền đạt tín hiệu thần kinh được dễ dàng, co bóp

cơ thịt Trong cơ thê có rất nhiều loại gốc tự do nguy hiểm, gây hại đến tế bào nhưsuperoxide (Oz'), ozon (Os), hydrogen peroxyde (HaO;), lipid peroxyde và nguy hiểmnhất hydroxyl (-OH) là gốc tự do phan ứng rất mạnh và gây ra nhiều tổn thương cho

tế bào Trong cơ thể, các phản ứng oxy hóa tạo ra các gốc tự do Nhưng cơ thể sinhvật có khả năng tạo ra các loại enzym đề trung hòa gốc tự do và mỗi phân tử enzym

có thê vô hiệu hóa hàng ngàn gốc tự do Các enzym đó có sẵn trong cơ thê trước khi

có phản ứng tạo ra gốc tự do nên nó kịp thời đối phó với gốc tự do này Các enzymgồm có superoxide dismutate [SOD], glutathione peroxidase[GSH-Px] và catalase.Mỗi enzym tham gia vào từng phản ứng hóa học riêng biệt Ngoài ra, người ta có thêtrung hòa gốc tự do bằng cách dùng chất kháng oxy hóa Các chất kháng oxy hóa vừa

có nguồn gốc trong tự nhiên vừa được tổng hợp bằng phương pháp hóa học [30]

19

Trong cơ thé sinh vật sông thường xuyên diễn ra nhiều quá trình chuyên hóa cácchất, trong đó có quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa Có những chất được coi như

là dinh đưỡng chính của tế bào nhưng đồng thời cũng có những chất gây hại đến tếbào Trong các phân tử gây tôn thương đến tế bào thì nhóm gốc tự do chứa oxy đượcchú ý đến nhiều nhất do những tác hại của chúng Gốc tự do chứa oxy được hìnhthành bằng nhiều con đường khác nhau như con đường hô hấp hiếu khí thông thường,quá trình kích thích các tế bào bạch cầu đa nhân của các đại thực bào, peroxysome.Ngoài ra, các nguồn tác nhân ngoại sinh như khói thuốc lá, sự bức xạ ion, các chấtgây ô nhiễm, các dung môi hữu cơ, các loại thuốc trừ sâu, v.v cũng là nguồn gốc làmtăng thêm các gốc tự do này [23]

Các gốc tự do cũng là nguyên nhân liên quan đến nhiều loại bệnh khác nhau nhưbệnh sốt rét, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải, bệnh tim, đột ngụy, chứng xơ

cứng động mạnh, bệnh đái tháo đường, Alzheimer, Parkinson, các bệnh ung thư, v.v Nếu trong quá trình chuyền hóa, các gốc tự do được tạo ra thừa thì sẽ dẫn đến sự tổnthương tế bào Tuy nhiên, tất cả sinh vật hô hấp hiếu khí, bao gồm cả con người, đều

có những cơ chế kháng lại những tác nhân oxy hóa gây hại này, loại bỏ tác nhân gây

hại này, kích thích các enzym loại bỏ hoặc chỉnh sửa lại các phân tử oxy hóa có hại.Mặc dù vậy, các cơ chế kháng oxy hóa tự nhiên này tỏ ra không hiệu quả, nhất là đốivới các cơ thé sinh vật ở giai đoạn già hoặc suy yêu Nếu sự mat cân bằng xảy ra thìdẫn đến tình trang oxy hóa quá mức từ đó dẫn đến làm tốn hai các thành phan tế bào

và gây chết tế bào Do đó, phương pháp hiệu quả nhất chính là việc tăng cường hấpthụ các chất có hoạt tính kháng oxy hóa vào cơ thể qua con đường tiêu hóa [22]

Chitosan cho thấy tiềm năng là một chất chống oxy hóa tự nhiên hiệu quả Hoạt

tính kháng oxi hóa của chitosan hay chitooligosaccharide phụ thuộc vào độ deacetyl,

chitosan có độ deacetyl 90% có hoạt tính cao nhất trong việc trung hòa các gốc tự do

alkyl, hydroxyl, superoxide [42] Ngoai ra khả năng kháng oxi hóa còn phụ thuộc vào

khối lượng phân tử của chitosan hay chitooligosaccharide [58, 59]

20

Bảng 1.1: Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của COS và các dẫn xuất

COS và các dẫn xuất Hoạt tính Tài liệu

tham khảo

Carboxylated COS Kháng oxy hóa [60]

Chitosan oligomer (DA 78— Kháng oxy hóa [61]

91%)

NA-COS (229.21—593.12 Da) Kháng oxy hóa trong tế bào [62]

RAW 264.7 và HL-60

COS (DP 2 —- 6) Kháng oxy hóa [63]

NA-COS (1-3, < 1 kDa) Khang oxy hóa trong mô [64]

LMWC (2.8 kDa-87.7 hinh té bao RAW 264.7

kDa)

COS (DP 2-8) Kháng oxy hóa [65]

COS (< 1, I—5, 5-10 kDa) Kháng oxy hóa [66]

Gallic acid conjugated COS Kháng oxy hóa trong mô [5]

hình tê bào chang liver

Sulfated-COS Kháng oxy hóa [67]

Phenolic acid conjugated COS | Kháng oxy hoa [21]

COS (DP 2-12) Kháng oxy hóa [68]

COS (5 kDa) Kháng oxy hóa [69]

4-hydroxybenzyl-COS Kháng oxy hóa [70]

COS (DD =95%, MW < 1 Khang oxy hóa trong mô [71]

kDa hình tê bao chang liver

COS (DP 2-5, MW 1.5 kDa) Khang oxy hóa trong mô [72]

hinh té bao liver

COS (2 or 3 kDa) Kháng oxy hóa trong bia [73]

Gallic acid-conjugated COS Kháng oxy hóa trong tế bao [48]

A549

COS (MW 5.1, 14.3, 41.1 kDa) | Kháng oxy hóa [74]

Mặt dù chitosan có nhiều chức năng sinh học nhưng kha năng hòa tan kém trongmôi trường có pH trung tính hoặc cao hơn (pH > 6,5) nên hạn chế ứng dụng Vì vậychuyển chitosan thành dạng chiooligosaccharide (COS) và các dạng dẫn xuất củaCOS gan các nhóm chức năng được các nhà nghiên cứu quan tam COS có độ nhớtthấp, phân tử lượng thấp, hòa tan trong nước và hấp thu dễ dàng trong hệ thống sinh

học của cơ thê và có hoạt tính kháng oxy hóa tot hơn so với chitosan Nghiên cứu vêhoạt tinh COS và dẫn xuất thé hiện ở bang 1.1

21

1.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nắm

Chitosan và COS được biết với hoạt tính kháng khuẩn vào 1979, sau khi Allan vàHadwiger báo cáo lần đầu về phố kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất củachúng [75] Sau đó nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nam khánglại nhiều loài vi khuẩn và nắm gây hai[4]

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất kháng lại nhiều vi khuẩn đã đượcghi nhận và chúng có những tính năng quan trọng Hoạt tính kháng khuẩn của chúngphụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ polymer hóa, mức độ deacetyl, loại vi sinh

vật v.v [20].

Chitosan và COS có nhóm amino trong cấu trúc hóa học Số lượng nhóm aminocủa chúng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng khuẩn và nhiều cơ chế đãđược đặt ra để mô tả hoạt tính đó COS có thể thay đổi đặc tính thấm của màng tế bào

vi sinh vật, ngăn chặn quá trình trao đổi chất của tế bào và kết quả là làm chết tế bào

vi sinh vật Đề nghiên cứu cơ chế này các tác giả Choi và cộng sự (2001) đã thực hiệnnghiên cứu đánh giá hoạt tinh kháng khuẩn của COS (có khối lượng phân tử từ 2-30kDa) đối với một số vi khuẩn gây bệnh Kết quả phân tích ảnh SEM và TEM trongnghiên cứu cho thấy, vi khuân được xử lý với COS đã thay đồi hình dạng từ hình cầuchuyên sang hình khối đặc, màng tế bào tách khỏi thành tế bào và các thành phần tếbào chất đã đông lại [20]

Ảnh hưởng của điện tích dương và khối lượng phân tử của COS đến hoạt tínhkháng khuan Trong phân tử chitosan và COS, nhóm amino (mang điện tích đương)tại vị trí C-2 của glucosamine sẽ liên kết nhóm carboxyl (mang điện tích âm) của cácđại phân tử trong tế bào vi khuẩn, tạo nên lớp điện tích dày đặc trên bề mặt tế bảo vikhuẩn, ngăn chặn các hoạt động trao đôi chất của tế bào vi khuẩn với môi trường bênngoài, điều này sẽ cản trở sự phát triển của vi khuẩn Nhiều nghiên cứu cho thấy hiệuqua kháng khuân phụ thuộc vào khối lượng phân tử của COS COS có khối lượngphan tử nhỏ hơn 2,2 kDa có hiệu quả kháng khuẩn kém nhất vì không đủ nhóm amino

để tạo nên lớp điện tích trên mặt vi khuẩn COS có khối lượng phân tử 5-27 kDa cóhiệu quả kháng khuẩn tốt nhất COS có khối lượng phân tử lớn hơn 30 kDa thì không

22

dùng làm tác nhân kháng khuẩn vì khả năng hòa tan rất kém trong dung dịch tại pH

trung tính [76].

Bảng 1.2: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của COS và dẫn xuất

typhimurium và Salmonella enteritidis

COs Hoat tinh Tai liệu

tham khao

COS (MW 2-30 Kháng khuan Actinobacillus [77]

kDa, DD 91,5%) actinomycetemcomitans va Streptococcus

mutans)

COS Khang khuan Streptococcus mutans [78]

COS (MW<5,<3 Kháng khuan Staphylococcus aureus and | [79]

kDa, DD 80-85%) Escherichia coli

COS (DP 2-12) Khang nam Alternaria alternate, [80]

Rhizopus stolonifera

COS (MW<5,<3 Khang khuan E coli ATCC 25922, | [81]

kDa, DD 80-85% Klebsiella peumoniae, S aureus ATCC

25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC

10145, Staphylococcus — epidermidis ATCC 155, Candida albicans ATCC 18804

Sulfated COS (MW_| Khang HIV-1 [82]

3-5 kDa)

Chitin, chitosan and | Kháng khuan S aureus ATCC 25923, S | [83]

their oligomers aureus ATCC 43300, Bacillus subtilis and

Bacillus cereus, E coli ATCC 25922, P.

aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Prevotella melaninogenica

and Bacteroides fragilis.

COS (DP 23, 40) Khang nam Botrytris cinerea, Mucor [84]

kDa, 10-5 kDa,<5 monocytogenes

kDa)

COs Khang khuan E coli, Salmonella [74]

23

Ngoài ra, khả năng tích điện âm của thành tế bào vi khuẩn cũng là yếu tố tạo nênhoạt tính kháng khuẩn của COS Thành tế bao vi khuẩn Gram âm tích điện âm mạnhhơn thành tế bào vi khuẩn Gram dương Điều này giải thích tại sao tế bào vi khuẩn

Gram âm thường nhạy với COS khi thử hoạt tính kháng khuẩn [20] Các nghiên cứu

khả năng kháng khuẩn, kháng nắm của COS và dẫn xuất thé hiện ở bảng 1.2

1.5.3 Hoạt tính kháng viêm

1.5.3.1 Khái quát viêm và các con đường tín hiệu trong đáp ứng viêm

Viêm là phản ứng của hệ thống miễn dịch đối với các tác động bat lợi gây tonthương cho cơ thể bao gồm các yếu tố gây hại như mầm bệnh, chất độc gây hại, chiếu

xạ hay các tiếp xúc với nhiệt nóng hoặc lạnh, chấn thương, v.v Trong đó, cơ thé sẽtìm cách phục hồi bằng cách loại bỏ các kích thích gây tôn thương và tiễn hành cácsửa chữa các ton thương Vì vậy, viêm được xem là một cơ chế bảo vệ quan trọngtrong cơ thé [88] Trong diéu kién binh thường, quá trình viêm sẽ loại bỏ tác nhân lạ,các mầm bệnh và tái tạo mô [89] Tuy nhiên, một số trường hợp bị rối loạn, phản ứngviêm trở nên quá mức gây ra viêm cấp hoặc mãn tính và làm tổn thương tế bào hoặc

mô [90].

Viêm được chia thành hai loại chính là viêm cấp tính và viêm mãn tính Viêm cấp

tính khởi phát nhanh trong vai phút hoặc vai giờ, thường khỏi trong vài ngày Ban đỏ

gặp trong tình trạng viêm cấp tính là kết quả của việc tăng lưu lượng máu đến vùng

bị ảnh hưởng do giãn mạch Viêm cấp tính là phan ứng của cơ thé đáp ứng lại kíchthích có hại bằng cách huy động bach cầu từ máu vào các mô bị tổn thương thôngqua một loạt các phản ứng sinh hóa Phản ứng viêm cấp tính được bộc lộ trong thờigian ngắn, đây cũng là phản ứng bảo vệ tế bào chủ từ các yếu tố gây tổn thương Quátrình viêm kéo dài dẫn đến viêm mãn tính, làm tiền đề gây nên một số bệnh như bệnh

viêm khớp, đái tháo đường, xơ vữa động mạch, tim mạch, ung thư, Alzheimer,

Parkinson, v.v.[62].

Viêm mãn tính khởi phát chậm trong nhiều ngày, kéo dai hàng năm Tiếp xúc lâudài với các hóa chất độc hại và các tác nhân môi trường như khói thuốc lá, UV, vikhuẩn, v.v có thé gây viêm mãn tính [91]

24

Quá trình viêm được điều phối thông qua sự phối hợp của các con đường tín hiệuđiều chỉnh mức độ trung gian gây viêm trong các tế bào mô thường trực và các tế bàoviêm được truyền từ máu Trong đó, ba con đường tín hiệu tế bào chính của quá trìnhviêm bao gồm yếu tố hạt nhân-kappa B (NF-kB), bộ chuyên đổi tín hiệu Januskinase/và chất kích hoạt phiên mã (JAK-STAT) và protein kinase kích hoạt mitogen

(MAPK) [92].

Quá trình viêm được biểu hiện thông qua một số tín hiệu tế bao Trong đó có yếu

tố nhân kappa B [NF-kB: nuclear factor-kappa B] và protein hoạt hóa 1 [AP-1:activator protein 1] NF-kB và AP-1 là hai yếu tố phiên mã giữ vai trò quan trọngtrong kiểm soát mức độ biểu hiện của nhiều gen (cytokine, chemokine, v.v.) liên quanđến quá trình viêm Các thành viên của họ NF-kB bao gồm c-Rel, p65 (RelA), RelB,p50 (NF-kB1), p52 (NF-kB2) Tat cả các thành viên ho NF-kB đều bảo tồn được mộtvùng (domain) Rel giống nhau Vùng này chứa khoảng 300 amino acid giữ vai tròchính cho quá trình gan với DNA [90] Hoạt động cua NF-kB va AP1 được hoạt hóabởi tac nhân kích thích của môi trường (tia UV, khói, bụi, v.v.) và các rỗi loạn sinh

lý thông qua các kênh truyền tín hiệu tế bào khác nhau Ngoài ra, trạng thái kích hoạthoặc không kích hoạt của NB-kB phụ thuộc vào chất ức chế IkB Khi IkB tương tácvới NF-kB hình thành nên phức không hoạt hóa NF-kB/IkB trong tế bào chất KhiIkB bị chia cắt, các NF-kB sẽ được giải phóng, đi vào trong nhân và kích thích quátrình phiên mã Là một yêu tô phiên mã, NF-kB kiểm soát mức độ biéu hiện của nhiềuchất trung gian của quá trình viêm Trong số đó có cytokine (IL-1a, IL-1B, IL-6 vànhân tố hủy hoại mô TNF- a) và chemokine (IL-8, CCL2) [90]

1.5.3.2 Tín hiệu dẫn truyền theo con đường IkB/NE-kB và phản ứng viêm

Yếu tố phiên mã NF-«B điều chỉnh nhiều khía cạnh của các chức năng miễn dịchbam sinh và thích ứng, đồng thời đóng vai trò là chất trung gian quan trọng của cácphản ứng viêm NF-«B điều hòa sự biểu hiện của các gen gây viêm khác nhau, baogồm các gen mã hóa cho các cytokine và chemokine

NF-«B đại diện cho một họ cảm ứng các yếu tố phiên mã, quy định một loạt các

gen tham gia vào các quá trình khác nhau của miễn dịch và đáp ứng viêm Họ này

25

bao gồm năm cấu trúc thành viên bao gồm NF-KBI (còn có tên là p50), NF-KB2

(p52), RelA (còn có tên là p65), RelB va c-Rel, đóng vai trò làm trung gian phiên mã

của các gen mục tiêu Các protein NF-«B thường được cô lập trong tế bào chất bởimột họ protein ức chế bao gồm các thành viên họ IKB Ngoài ra, các protein tiền thâncủa NF-kBI và NF-«B2 là p105 và p100, đóng vai trò là protein giống IkB, vi đầucuối C của chúng giống cau trúc của IKB và có chức năng của chat ức chế NF-KB[93].

Con đường kích hoạt

Cơ chế chính dé kích hoạt NF-«B chuẩn là cơ chế cảm ứng sự phân hủy IkBađược kích hoạt thông qua quá trình phosphoryl hóa theo vị trí cụ thể bởi phức hợpIkB kinase (IKK) đa tiểu đơn vị IKK có thé được kích hoạt bởi các kích thích khácnhau, bao gồm các cytokine, các yếu tố tăng trưởng và các thành phần vi sinh vậtthông qua thụ thê TLR4 Khi kích hoạt, IKK phosphoryl hóa IKBơ ở hai serines tậncùng đầu N dẫn đến kích hoạt tách phức hợp IkB/NF-kB, sau đó NF-kB chuyền vịvào nhân dé thực hiện chức năng Cơ chế kích hoạt thê hiện hình 1.9 [93]

ca NF-xB dependent gene transcription =| — <3 A)

EE

Nuclear DNA

Hình 1.9: NF-kB trong quy định của bệnh viêm nhiễm thông qua thụ thé NLRP3.

Sự kích hoạt của NLRP3 gây bệnh can có hai tín hiệu là môi và sự kích hoạt Một vi dụ điển

hình của môi là LPS của vi khuẩn liên kết với thụ thé TLR4, dẫn đến việc kích hoạt tín hiệu

26

NF-«B Trong hạt nhân, NF-kB được chuyển vị vào sau hoạt động của môi sẽ hoạt động thúc day quá trình phiên mã các gen phụ thuộc NF-«B, chang hạn như NLRP3, Pro-IL- 1

và Pro-IL-18, can thiết cho qua trình kích hoạt bệnh viêm Tin hiệu thứ hai cua sự kích hoạt

bệnh viêm được cung cấp bởi chất chủ vận NLRP3 kích hoạt NLRP3 để kích hoạt sự tập hợp

của các thé viêm và tiết IL-1B trưởng thành [93].

1.5.3.3 Con đường tín hiệu thông qua các protein kinase hoạt hóa mitogen và

phản ứng viêm

Mitogen là một peptide hay một protein nhỏ có chức năng khởi phát hay cảm ứng

cho quá trình phân chia tế bào Mitogen hoạt động thông qua việc kích hoạt các conđường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến các protein kinase hoạt hóa mitogen(MAPK) MAPK có ba protein kinase bao gồm p38, JNK va ERK, được hoạt hóa détham gia vào hoạt động chuyên đổi các kích thích ngoại bao thành một loại các phảnứng tế bào MAPK đóng vai trò quan trọng trong các con đường dẫn truyền tín hiệucủa tất cả các tế bào nhân thực như quá trình điều phối biểu hiện gen, tăng sinh vàbiệt hóa của tế bào, quá trình trao đôi chất của tế bào cũng như tham gia điều khiển

quá trình apoptosis [94].

Dòng tín hiệu ngoại bào sẽ dẫn đến sự kích hoạt một MAPK thông qua thụ thé và

hoạt hóa liên tiếp một MAPKK kinase (MAPKKK) và một MAPK kinase (MAPKK).

Trong đó, MAPKKK được hoạt hóa thông qua sự tương tác với một GTPase, đôi khi

đồng thời diễn ra với quá trình phosphoryl hóa bởi protein kinase từ các thụ thé bề

mặt tế bào Sau khi được hoạt hóa, MAPKKK sẽ trực tiếp phosphoryl hóa MAPKK

và cudi cùng MAPKK hoạt hóa MAPK thông qua quá trình phosphoryl hóa kép [95].Sau khi được kích hoạt, MAPK sé phosphoryl hóa các cơ chat da dạng trong tế bao

và nhân dé mang lại những thay đổi trong chức năng protein và biểu hiện gen thựchiện phan ứng sinh học thích hợp MAPK thường chứa các vị trí gan kết cho MAPKK

và cơ chất, cho phép tương tác giữa protein-protein có ái lực cao Con đường dẫntruyền tín hiệu thông qua các protein kinase hoạt hóa mitogen MAPK được thé hiện

hình 1.10.

27