Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu vi sinh vật học của quá trình feammox và bước đầu ứng dụng để xử lý nước thải nhiễm amoni

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Phương Chung

LUẬN AN TIEN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Phương Chung

Chuyén nganh: Vi sinh vat hoc

Mã số: 9420101.07

LUẬN ÁN TIEN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Dinh Thúy Hang

2 PGS.TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác cùng các cộng

sự khác.

Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố

trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của các đồng tác giả.Phần còn lại chưa được công bồ trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả luận án

Lê Phương Chung

LOI CAM ON

Thực hiện nghiên cứu để tạo nên Luận án hoàn chỉnh là một quả trình học

tập, tham khảo, tìm tòi, khám phá và giải quyết vô vàn khó khăn gặp phải Đối với

tôi, dé có được một Luận án như hôm nay, cùng với sự cổ gang cua ban thân, mộtphan quan trọng là nhờ sự giảng day và hướng dẫn của các thay cô, sự hỗ trợ của

anh chị em đồng nghiệp; sự tạo điều kiện và giúp đỡ của cơ quan công tác, đơn vịđào tạo, đơn vị triển khai nghiên cứu.

Trước hết, với tam lòng biết ơn và tri ân sâu sắc, tôi xin dành lời cảm ơn

chân thành đến TS Dinh Thúy Hang, GVHD thứ nhất, người đã gợi ý cho tôi bài

toán, hướng dan tận tình tôi từng bước đi trong nghiên cứu tim lời giải cho bài toánđó, cũng như luôn động viên tôi kiên tri thực hiện định hướng đã chọn cho đến ngàyhôm nay! Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Phạm Thế Hải, GVHD thứ hai,đã luôn động hành, hỗ trợ và hướng dẫn nhiệt tình trong suốt quá trình học tập,

thực hiện Luận án!

Tôi xin cảm ơn anh chị em Phòng Sinh thái Vi sinh vật ứng dụng, Viện Vi

sinh vật và Công nghệ sinh học - DHOGHN, những người đã luôn tạo mọi điềukiện thuận lợi nhất, hỗ trợ tích cực nhất, cùng tôi thực hiện các thí nghiệm khó khăntrong suốt thời gian nghiên cứu!

Xin cam on Ban Giảm hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Lãnh đạo ViệnCông nghệ sinh học và Môi trường — Trường Đại học Nha Trang, nơi tôi đang công

tác, đã tạo điều kiện, bo trí thời gian, hỗ trợ thủ tục trong suốt quá trình học tập! Tôi

cũng xin cảm ơn Ban Lãnh đạo và anh chị em các Phòng thí nghiệm của Viện Vì sinh

vat và Công nghệ sinh học — DHOGHN, nơi tôi triển khai thực hiện nghiên cứu, đãtạo điều kiện cơ sở vật chất dé tôi tiễn hành các thí nghiệm trong nghiên cứu!

Tôi xin cảm ơn PGS TS Bùi Thị Việt Ha, PGS TS Tran Văn Tuấn và quý

Thây Cô giáo của Bộ môn Vì sinh vật học và Khoa sinh học, Trường Đại học Khoahọc Tự nhiên - ĐHQGHN đã trực tiếp giảng dạy, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốtkhóa học Nghiên cứu sinh! Dong thời tôi cũng xin cảm ơn quý Thay Cô Phòng Sau

đại học và Phong Đào tạo — Trường Dai học Khoa học Tự nhiên DHOGHN, đã

hướng dẫn và giúp đỡ hoàn thiện các thủ tục trong suốt quá trình học tập!

Thành công của Luận án một phan đến từ sự động viên, giúp đỡ của gia

đình, người thân, anh chị em dong nghiệp, anh chi em bè ban tai Hà Nội va Nha

Trang, tôi vô cùng biết ơn và xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội ngày tháng năm 2022Lê Phương Chung

TỚI HỆ SINH THÁI 2-2: 2£ S£+SE£9EE£EE££EEEEEEEEEEEEEEEEE21171127112111211 21221 re 12

1.1.1 Anh hưởng đối với hệ sinh thái HưỚC :©25c©5cccccccxcscereersee 121.1.2 Anh hưởng đối với sức khỏe CON Hgười - ¿5c ccceectecstrterrereervee 131.1.3 Anh hưởng đến môi trường nước nuôi trồng thủy sản -. - 14

1.1.4 Anh hưởng đến quy trình xử lÿ nước Gấp -c-ce+cccccsceereerecereee 151.2 VI SINH VAT THAM GIA CHU TRÌNH CHUYEN HÓA NITƠ 15

1.2.1 Có định nito (nitrogen fixAtion) ccccccccccscsscecsesvsssssssssesessessessesseseseseeseeses 16

1.2.2 Khoáng hóa nito (ammOonlfiCđfiOH) ăcSccScSssshitrirerersereeerseeree 161.2.3 Nitrate hóa (HÌIT[CGHOH) Gv kg kg 161.2.4 Khử nitrate (deHifTIfiCGFÏORI) cv kg ket 18

NI an e 16

Jz nhe 21

1.3 LOẠI BO NITƠ TRONG NƯỚC THAI BANG BIEN PHAP SINH HỌC 23

1.3.1 Các công nghệ hiện hành xử ly loại bỏ nito trong nước thải 23

1.3.2 Feammox và tiềm năng phát triển công nghệ mới cho xử ly loại bỏ

NH 4g" trong nước thảÌ St St St St S‡E‡E‡E+EEvEEEEEEEEekekekrkrrrrrrereres 30

Chương 2 DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 DOI TƯỢNG VA VAT LIEU NGHIÊN CUU -: -¿©2©5z+2xz+ss2 352.1.1 Đối tượng NGHIEN CU cc eecccccececcecscsessesssseeseesessessessessesesssesseessssesseseseeseess 35

2.1.2 Hóa chất, thiết Di cecccecccsssesssessesssesssesssessssssesssessusssusssesssesssessesssesssecseesseeses 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2-2 5£+E£+££££E£+EE2EEtzEeerxesrxerred 39

2.2.1 Các thí nghiệm trên m6 hÌHÏ, sc kk nnnnrhnrh 402.2.2 Các phương pháp phân tích hóa NOC eccsccSSss+ssksseeeseeeeeee 432.2.3 Các phương pháp vi sinh Vat HỌC hưu 482.2.4 Các phương pháp sinh học phÂH tur -ccS-cSsksiiteirseirerersereske 50

2.2.5 Các phương pháp xử lý 80 iW e.cesceccecscesscessessessesesessessssessessessesseseseseess 56

Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN -.s-s-s< se ssecsecssessesseesess 57

3.1.LÀM GIÀU VSV FEAMMOX TRONG MÔ HÌNH

PHONG THÍ NGHIỆM - 22 2+SE+SE£2E2EEEEEEEEE2E1211171711211211 27111 1.1xrxe 57

3.1.1 Quan sát VSV được làm gidu trong M6 hịÌHh s-ccss«s+scssxs 57

3.1.2 Phân tích các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của quá trình

feammox trong thời gian làm giàu ở mô hình ~«csc << s2 57

3.2 NGHIEN CUU HỆ VSV DUGC LAM GIÀU TRONG MÔ HÌNH 60

3.2.1 Phân tích hệ VSV bằng phương pháp PCR-DGGE -: ó0

3.2.2 Phân tích hệ VSV bằng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 643.2.3 Phân lập vi khuẩn feammox từ mô hÌnh 2-5 c5s+ce+czcezeereered 663.3 XÁC ĐỊNH ANH HUGNG CUA CARBON HỮU CƠ TỚI QUA TRÌNH

OXY HÓA NH,* TRONG MÔ HÌNH - THÍ NGHIEM THEO ME 72

3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng cua carbon hữu cơ tới quá trình oxy hóa NH," 72

3.3.2 Tính toán cân bằng chất cho quá trình feammox ở diéu kiện

718/14/1120 ẺAe 78

3.4 THU NGHIEM XU LY NH,* TRONG MO HINH FEAMMOX THEO

CHE ĐỘ VAN HANH LIÊN TUC ooeessessssssssssesssesssessesssessssssssesecssessssssesssecsseeseseseeees 81

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên đầy đủ tiếng Việt

ANAMMOX | Ànaerobic Ammonium Oxi hóa amoni ky khíOxidation

AOB Ammonium Oxidizing Vi khuan oxy hoa amoniBacteria

A20/AAO Anaerobic, Anoxic, Oxic Ky khi, Thiéu khi, Hiéu khi

ATP Adenosine Triphosphate

DNA Deoxyribonucleic Acid

DO Dissolved Oxygen Oxy hoa tan

Anaerobic ammonium Quá trình oxy hóa amoni ky khí

FEAMMOX | oxidation coupled to iron F tend *

kêt hợp với khử satreduction

Fluorescent in situ eps 4k

FISH Hybridization Lai huynh quang tai cho

FC Ferricitrate Môi trường có chứa sắt dạngferricitrateFRB Ferrihydrite Môi trường có chứa satferrihydrite

GC Gas Chromatography Sac ky khi

HRT Hydraulic Retention Time Thời gian lưu

Chỉ sô ước lượng mật độ viMPN Most Probable Number sinh vật

NH," Ammonium Amoni

NN&PTNT Nome hn va Phat trién

NOB Nitrite Oxidizing Bacteria Vi khuẩn oxy hóa nitriteNRB Nitratee Reducing Bacteria Vi khuân khử nitrate

ORP/RP ` Reduction Potential!’ | Điện thế oxy hóa khử

PBS Phosphate Buffered Saline Muối đệm phosphate

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PTN Phòng thí nghiệm

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic DNA ribosome

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid | RNA ribosomeSDS Sodium Dodecyl Sulfate

suanos ä Removal Over Nitrite hoat tinh cao qua nitrite

TAE Tris Acetic EDTA

TAN Total Ammonia Nitrogen Tong pam lượng amoni và

UV Ultraviolet Tia tử ngoại

TN&MT Tài nguyên và Môi trườngVSV VỊ sinh vật

XLNT Xử lý nước thải

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình phú dưỡng (Eutrophication) trong các thủy vực 13

Hình 1.2 Quá trình chuyên hóa nitơ trong ao nuôi thủy sản - 2-55: 14

Hình 1.3 Chu trình nitơ và sự tham gia của VSV - cv vn ng re 15Hình 1.4 Quá trình khử nitrate và các enzyme tham g1a c5 5+ s+ss+s+s 18Hình 1.5 Sơ đồ con đường chuyền hóa anamimox :2¿ s+c+++++2s++¿ 20

Hình 1.6 Hình thái tế bào của chủng Acidimicrobium A6 -2- 25c: 22

Hình 1.7 Chu trình nito cập nhật với sự có mặt của Anammox và Feammox 23Hình 1.8 Mô hình quy trình công nghệ xử lý nước thải A2O - - 24Hình 1.9 Các bước của công nghệ SHARON-Anammox s5 +5 +++s 29

Hình 1.10 Sơ đồ mô hình nghiên cứu quá trình feammox ở điều kiện tự dưỡng,

pH 7 trong nghiên cứu của Sawayama (2006) - càng ngư 31

Hình 1.11 Sơ đồ mô hình nghiên cứu quá trình feammox ở điều kiện tự dưỡng,

pH thấp trong nghiên cứu của Huang va cs (2015) ¿5 s+cs+cs+z+eczxecei 32

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thong xử lý nước thải chế biến thủy sản tại Củ Chỉ 35Hình 2.2 Sơ đồ các bước thí nghiệm trong nghiên cứu - 2-2 2s: 39Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế mô hình bé ky khí feammox quy mô phòng thí nghiệm 41Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn xác định lượng COD (mg/L) trong mẫu nước thải 43Hình 2.5 Xác định điện thế oxy hóa khử (RP) của dung dich - 46Hình 2.6 Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh ra

từ các bề trong mô hình feamimoOXx 2 2® ©E£+E£+E££EE+EE£EE+2EE£EEtEErEerrerrxee 46Hình 2.7 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng khí nitơ (%)

trong hỗn hợp khí - ¿+ 2 +E9SE+E9EE£EEEE9E21911212121121112111 2111111111111 re 47

Hình 2.8 Các bước phân lập vi khuân feammox bằng phương pháp ống thạch

008000107 - 49

Hình 3.1 VSV trong mẫu bùn từ mô hình ở ngày làm giàu thứ 30 57

Hình 3.2 Hàm lượng NH," còn lại (a) và sản sinh Fe”* (b) trong các bể

của mô hình PTN trong thời gian làm giàu VSV feammox - ‹++s<++s 59

Hình 3.3 Hàm lượng N¿ trong các bé của mô hình trong quá trình làm giàu

VSV @ii 0 sa 60

Hình 3.4 Hình ảnh gel điện di biến tính đoạn gen 16S rDNA của hệ vi khuẩn

trong mô hình Í€aIImOX << 1119910112111 91 1 91 vn HH Hệ 62

Hình 3.5 Hình ảnh nhuộm DAPI (a, c) và tín hiệu lai với các đầu dò Delta385

đặc hiệu 6-proteobacteria (b), GAM42a đặc hiệu proteobacteria (d) thực hiện

trên mẫu bùn NI chứa hệ vi khuẩn đã được làm giàu trong mô hình 66Hình 3.6 Hình thái tế bào của các chủng vi khuân mới phan lập quan sát dưới

kính hiển vi phản pha (A) - chủng FN7; (B) chủng FN9 (b) -+- G7

Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại minh họa vi trí phân loại của các chủng FN7

(a) và FN9 (b) dựa trên so sánh trình tự 16S rDNA với các loài có liên quan 68

Hình 3.8 Oxy hóa NH," bởi chủng FN7 và FN9 trong điều kiện hiếu khí

(C1 AUG) ee 5 69Hình 3.9 Khả năng khử NO: của chủng FN7 và FNQ; ccccssersereeres 70

Hình 3.10 Kha năng khử Fe** của chủng FN7 và FN9 (a) Fe-citrate;

Hình 3.11 Ảnh hưởng của carbon hữu cơ tới quá trình oxy hóa NH,*

trong mô hình feammox phòng thí nghiệm -. 5 5-25 + *++**+‡++e+serseexes 74

Hình 3.12 Sự thay đối hàm lượng FeTM trong các bé của mô hình - 75

Hình 3.13 Khí N¿ sinh ra từ quá trình oxy hóa NH," trong mô hình feammox 76

Hình 3.14 Lượng N; tạo thành trong các bé của mô hình feammox TỉHình 3.15 RP trong các bể của mô hình trong thí nghiệm với nước thải nhân tạo

có tỷ lệ [COD]/[NH¿”] khác nhau (Bề 1 là 1,4; Bề 2 là 1,1 và Bề 3 là 0,7) 78

Hình 3.16 Xử lý loại bỏ NH," (a) va COD (b) trong mô hình feammox

ở chế độ vận hành liên tục - 5:5 SE‡EE+EEEESEEEEEEEEESEEEEEEEEEEEESEEEkEEkrkerkrrerxsee 82

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 1.1 Ngưỡng giới hạn cho phép của nito trong một số nguồn nước (mg/L) 12Bảng 1.2 Đặc điểm sinh trưởng và động học của một số vi khuẩn anammox 19Bang 2.1 Thành phần môi trường FRB 22 2£ 5222S+2£x2E+t£E+zrxezrxrrseee 37

Bảng 2.2 Hỗn hợp vi lượng và vitamin - 2 + 5+ +E+SE+EeEE£EeExexerkererrersred 38

Bang 2.3 Thành phan môi trường ferricitrate (FC) ¿2+ + s+cs+cz+£zzxezxeei 38Bang 2.4 Thành phan COD và NH," trong các bề ở thí nghiệm

vận hành theo TmẺ - - ¿+ 2 2116611623311 18111 955111111 9311 KHE 1 KH re 42

Bang 2.5 Thành phan phan ứng và chu trình nhiệt của PCR cho DGGE 52

Bảng 2.6 Thanh phan phan ứng và chu trình nhiệt PCR khuếch đại 16S rDNA 53

Bảng 2.7 Thành phần đệm lai trong thí nghiệm FISH -¿- 5:55: 54Bang 2.8 Thanh phan đệm rửa trong thí nghiệm FISH ¿5 5+- 55

Bang 3.1 Mật độ vi khuẩn khử Fe** trong mô hình 2- 2 s2 22522 z£sz£ 61

Bang 3.2 Kết quả giải trình tự các băng điện di biến tính - 2 25c: 62Bảng 3.3 Kết quả phân tích hệ vi khuẩn được làm giàu trong mô hình

feammox sử dụng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) - 65

Bang 3.4 Hiệu suất oxy hóa NH,* và COD ở điều kiện feammox trong mô hình

với các tỉ lệ [COD]/[NH¿] ban đầu khác nhau - 2-22 2+cs£xz+sz+z++cse2 73Bang 3.5 Hàm lượng NH¿Ÿ, carbon hữu cơ và các chất chuyển hóa ở điều kiện

feammox trong bé 1 của mô hình -2- 2 2 2 E££E£+EE+EE£EE£EEE+EEtEEerEerrezrerred 79

DANH MỤC CAC PHAN UNG CHUYEN HÓA SINH HOC

Phương trình phản ứng Năng lượng STT

N2 + 3 HO > 2 NHạ + 3/2 O; AG” =—658 kJ/mol (1.1)

R-NH; + HOH -> R-OH + NH,* + OH” (1.2)

NH," + 140, — NO; + HO + 2H* AG®’ =—57 kcal/mol (1.3)

NO; +1⁄2O; — NO3_ AG®’ = —74 kcal/mol (1.4)

NH," + 20) — NO; + H;ạO + 2H” (1.5)

2NO; + 6H* +6e —N>+3H2O AG’ = —284 kJ/mol (1.6)NH,* + NOY — Nạ + 2H2O AG” = — 357 kJ/mol (1.7)3Fe(OH); + SH* + NH¿ — 3Fe”” + 9H20 + 0.5N; AG” =— 245 kJ/mol | (1.8)6Fe(OH); + 10H* + NH¿” — 6FeTM* + 16H,O + NO, AG” =—164 kJ/mol (1.9)6Fe(OH) + 8H† + NH¿* — 6Fe?' + 15H,O + NO; AG?=-207kJ/mol | (1.10)

6NO3 + 5CH:OH —> 3N: + 5CO2 + 7H;O +6OH” (1.11)

NO; + 5/8CH3;COOTM + 13/8H* —> 0.5N; + 5/4CO; + 7/4H20 | AG” =—501 kJ/mol (3.1)Fe** + 5/3CH3COO + 1/2HạO — Fe** + 1/4HCO; +9/8H* | AG” =-814 kJ/mol (3.2)

MỞ ĐẦU

Trong môi trường nước, nitơ có thé tồn tại dưới dạng các hợp chất khácnhau, trong đó chủ yêu là khí amoniac hòa tan (NH3), amoni (NH¿”), nitrite (NO; )và nitrate (NO; ) Các hợp chất này nếu ở nồng độ cao sẽ trở thành nguồn ô nhiễm

nguy hại cho hệ sinh thái nước cũng như sức khỏe con người, do vậy cân phải đượcxử lý loại bỏ trước khi xả nước thải vào các thủy vực.

Loại bỏ NH¿” là khâu xử lý quan trong trong các quy trình xử lý nước thải,

được quan tâm nghiên cứu về nhiều phương diện, bao gồm việc ứng dụng các cơchế vật lý, hóa học, sinh học cũng như yếu tố công nghệ như thiết bị, điều kiện vận

hành xử lý Các biện pháp sinh học ứng dụng trong xử lý ô nhiễm, trong đó có việc

loại bỏ NH," từ nước thải, luôn được xem là mang lại hiệu qua tối ưu nhất bởi tính

thân thiện môi trường, có chi phí thấp và hiệu quả bền vững.

Theo cách truyền thống, amoni trong nước thải được loại bỏ bằng hai bước(i) nitrate hóa (hiếu khí, hóa tự dưỡng) và (ii) khử nitrate (ky khí, hóa di dưỡng).

Quy trình này được áp dụng sau khi nước thải đã được loại bỏ carbon hữu cơ

(thường thông qua các quá trình lên men ky khí sinh methane) dé tạo điều kiện chocác vi khuẩn nitrate hóa sinh trưởng, giảm cạnh tranh bới các VSV hiếu khí didưỡng Tuy nhiên, ở bước tiếp theo, VSV lại cần sử dung carbon hữu co dé khửnitrate, và trong thực tế nhu cầu này thường được đáp ứng bằng cách bổ sung

methanol, do vậy làm tăng chi phí vận hành Một cách tiếp cận khác dé xử lý NH,"

được đưa vào ứng dụng thực tế trong vài thập niên trở lại đây là công nghệ nitritehóa bán phần kết hợp với anammox Công nghệ này cũng gồm hai bước, (i) trướchết một nửa NH,* được oxy hóa thành NO, nhờ vi khuẩn oxy hóa NH,* (hiếu khí,

tự dưỡng), và (ii) sau đó nửa NH," còn lại được oxy hóa bằng NO; thành N; nhờ

một số loài Planctomycetes (ky khí) Công nghệ này giúp giảm tới 60% chi phínăng lượng cho việc cấp oxy trong bước nitrate hóa, tuy nhiên đòi hỏi quy trình vận

hành có độ chính xác cao dé đảm bao tỷ lệ các thành phần NH," và NO; ở mức phù

hop cho phản ứng anammox diễn ra sau đó Các công nghệ xử lý NH¿” hiện hành

nêu trên có hiệu quả xử lý tốt, tuy nhiên có nhu cầu về năng lượng lớn khi thực hiện

nitrate/nitrite hóa và đòi hỏi tính 6n định cao của nước thải, cũng như tính chính xáctrong quy trình vận hành, là những trở ngại khi triển khai thực tế Do đó, việcnghiên cứu phát triển các quy trình công nghệ mới giúp giảm sự phụ thuộc vào oxyvà thích hợp cho nhiều loại nước thải van là van đề hap dẫn các nhà khoa học.

Trong thập kỷ gần đây, một con đường trao đổi chất mới ở VSV là oxy hóa

NH¿ kết hợp với khử Fe** trong điều kiện không có oxy, gọi tắt là feammox, đãđược phát hiện và được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong chu trình

chuyền hóa nitơ, góp phan đáng kể vào việc hoàn trả khí N; vào khí quyền Quátrình feammox cũng bắt đầu được quan tâm nghiên cứu để đưa vào ứng dụng choxử lý NH¿ trong nước thải ít tiêu tốn năng lượng trong quy trình xử lý Tuy nhiên,

cho đến nay các kết quả nghiên cứu đã công bố về quy trình công nghệ xử lý NH,*theo cơ chế feammox cũng như các VSV tham gia còn hạn chế và chưa có sự thống

nhất Do vậy feammox và các VSV có khả năng thực hiện hình thức dinh dưỡngnày là đối tượng lý thú cho nghiên cứu cơ bản, cũng như nghiên cứu ứng dụng.

Hiểu biết về các VSV feammox và các đặc tính sinh lý của chúng là cơ sở để phát

triên các công nghệ xử lý mới đê loại bỏ nito trong nước thai.

Dé tài “Nghiên cứu vi sinh vật học của qua trình feammox và bước dauứng dụng dé xử lý nước thải nhiém amoni” được dé xuât cho luận an tiên sỹ vớimục tiêu nghiên cứu quá trình feammox trong mô hình xử lý nước thải có hàmlượng NH," cao và xác định các VSV tham gia dé làm cơ sở phát triển công nghệ.

“+ Mục tiêu của nghiên cứu:

1.Làm giàu VSV feammox trong mô hình phòng thí nghiệm và nghiên cứu cau

trúc quần xã của hệ VSV đã thiết lập sử dụng các phương pháp PCR-DGGE, FISHvà gen 16S rRNA làm chỉ thị phân tử.

2.Nghiên cứu mối liên quan giữa các yếu tố COD, NH,", thế oxy hóa khử tới

quá trình oxy hóa NH," trong mô hình, làm cơ sở để phát triển công nghệ xử lý

NH,’ theo nguyên lý feammox.

10

s* Nội dung nghiên cứu

1.Thiết kế mô hình thí nghiệm quá trình feammox ở điều kiện dị dưỡng và pH

trung tính quy mô 3 L/ngày đêm.

2.Làm giàu và nghiên cứu hệ VSV feammox ở điều kiện “di dưỡng — pH trungtính” trong mô hình bằng các phương pháp PCR-DGGE, FISH va gen 16S rRNA

làm chỉ thị phân tử.

3.Nghiên cứu ảnh hưởng ty lệ [COD]/[NH,"], thế oxy hóa khử tới quá trình

oxy hóa NH," trong mô hình va thử nghiệm xử lý nước thải theo tỷ lệ

[COD]/[NH,"], thế oxy hóa đã xác định ở chế độ liên tục.s* Tính mới của luận án

Nghiên cứu đã thu được một số kết quả khoa học mới công bó lần đầu tiên, tóm

tắt như sau:

1.Đã thiết lập được hệ VSV feammox trong mô hình phòng thí nghiệm ở điềukiện di dưỡng va pH trung tính, cho phép chuyên hóa hoàn toàn NH¿Ÿ thành N;; hệVSV được hình thành ở điều kiện này do vi khuẩn thuộc lớp y-Proteobacteria (gồmnhiều loài vi khuẩn ky khí tùy tiện khử Fe**) chiếm ưu thế.

2.Carbon hữu cơ được xác định đóng vai trò quan trọng trong quá trình

feammox ở điều kiện thí nghiệm; tỷ lệ [COD]/[NH,"] = 1,4 là thích hợp nhất dé quátrình chuyên hóa NH," thành N; diễn ra ôn định Xử lý đồng thời NH¿ và CODtrong mô hình theo tỷ lệ trên ở chế độ vận hành liên tục với lưu lượng thải là 3

L/ngay, thời gian lưu 6 ngày đạt hiệu quả loại bỏ NH¿” và COD tương ứng là ~ 91%và 60%.

3.Nghiên cứu mở ra khả năng áp dụng nguyên lý feammox dé xử lý nước thainhiễm NH,* và COD ở pH trung tinh, phù hợp với nhiều loại nước thải trong thực

tế NH,* được oxy hóa hoàn toàn thành N, trong một bước phan ứng, giúp đơn giản

về quy trình công nghệ và giảm tiêu tốn năng lượng, khắc phục những hạn chế củacông nghệ nitrate hóa - khử nitrate và nitrite hóa bán phần - aaammox hiện hành.

II

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ANH HƯỚNG CUA DƯ LƯỢNG NITƠ TRONG NƯỚC THAI TỚI HỆSINH THÁI

Mặc dù nito được xem là nguyên tố cơ bản của sự sông, nhiều dạng hợp chất

nitơ khi có mặt trong môi trường nước ở nồng độ cao sẽ trở thành mối nguy hại cho

hệ sinh thái, do vậy cần được kiểm soát ở đưới ngưỡng quy định (Bảng 1.1).

Bảng 1.1 Ngưỡng giới hạn cho phép của nitơ trong một số nguồn nước (mg/L)

Chỉ tiêu Nước sạch Nước mặt Nước ao nuôi tôm

[Bộ Y tê, 2018] [Bộ TN&MT, 2015] [Bộ NN&PTNT,Cột A Cột B 2014]

NH; 0,3 — — 0,3

NH,* 0,3 0,3 0,9

-NO, 0,05 0,05 0,05 —NO; 2 2 10 —

Chú thích: Ngưỡng nitơ trong nước sạch dựa theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất

lượng nước sạch sử dụng cho mục đích sinh hoạt, QCVN 01-1:2018/BYT Nước ao nuôi tôm dựa

theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về cơ sở nuôi tôm nước lợ - Điều kiện bảo đảm vệ sinh thú y,

bảo vệ môi trường và an toàn thực phâm, QCVN 02 - 19 : 2014/BNNPTNT Ngưỡng nitơ trong

nước mặt theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt, QCVN 08-MT:

2015/BTNMT Cột A là nước sử dụng cho mục đích cấp nước sinh hoạt (nước cấp) sau khi xử lý

thông thường; Cột B là nước sử dụng cho tưới tiêu, thủy lợi và các mục đích khác; (—) là không

được quy định.

1.1.1 Ảnh hướng đối với hệ sinh thái nước

Hợp chất amoni (NH,") khi có mặt ở hàm lượng quá cao trong các thủy vực

sẽ dẫn đến hiện tượng phú dưỡng của nước (eutrophication), do thúc đây sự pháttriển ồ ạt của các loài tảo Sự phân hủy sinh học sinh khối tảo sau đó dẫn đến giảmoxy trong nước, làm chết các động thực vật thủy sinh (Hình 1.1) [Camargo,

Alonso, 2006].

Trong môi trường nước, sản phẩm khoáng hóa hợp chat nitơ hữu cơ sẽ ton tại

ở dạng NH¿” khi pH <9,5 hay ở dạng khí ammoniac (NH3) khi pH >9,5; ở pH 9,5

thi ty lệ [NH3]/[NH,"] = 1 [Lê Văn Cát, 2007] Khí NH; hòa tan rất độc đối với cácloài thủy sinh, đặc biệt là cá Với nồng độ 0,01 mg/L, NH; đã có thể gây độc cho cáqua đường máu, nồng độ 0,2 — 0,5 mg/L đã gây độc cấp tính [Lương Đức Phẩm,

12

2008] Hợp chất NH,* không độc nhưng là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng

phú dưỡng, hoặc có thé bị chuyển hóa thành nitrite (NO; ) độc hại đối với nhiều

loài sinh vat và con người [Galloway et al., 2008].

oe O, trong khi quyén

Nước thải

Riva trôi từ đất

nông nghiệp & sp JẾ

@ 9 5e i aa Phú dưỡng # + w% Quang hợp Oxy hòa tan cao

N —— Se ae =——» trong nước mat

chất này trong các sản phẩm rau xanh, hệ lụy là ảnh hưởng đến sức khỏe con người

[Santamaria, 2006; Savino et al., 2006].

1.1.2 Anh hưởng đối với sức khỏe con người

Nitrite có tính độc cao, rất có hai cho cơ thé con người Nitrite gây ra chứngthiếu vitamin, và có thé kết hợp với các amin để tạo thành các hợp chấtnitrosamines gây ton thương di truyền tế bao, là một trong những nguyên nhân dan

đến ung thư thực quản, ung thư da dày, ung thư ruột kết và các khối u khác [Park et

al., 2015; Bedale et al., 2016].

Nitrate va nitrite đều có khả năng oxy hóa Fe”' trong hemoglobin thành Fe””,

khiến hemoglobin chuyén thành dang methemoglobin, không thé thuc hién duoc

13

chức năng liên kết và vận chuyển oxy [Savino er al., 2006] Hội chứng trẻ đa xanh(thiếu máu) do methemoglobin thường gặp ở trẻ đưới 6 tháng tuổi do có hàm lượng

enzyme NADH-cytochrome b; reductase (là enzyme khử methemoglobin thành

hemoglobin) thấp, chi bằng một nửa của người trưởng thành [Savino et al., 2006].1.1.3 Ảnh hướng đến môi trường nước nuôi trồng thủy sản

Chất lượng nước ao nuôi là yếu tố quan trọng hàng đầu trong nuôi trồng thủysản, trong đó tong hàm lượng ammonia (Total Ammonia Nitrogen, TAN) trong

nước là một trong các chỉ số được quan tâm nhất, thường được giới hạn ở mức < 0,5

mg/L [Hari et ai., 2006] Trong hai dang ammonia thì NH; có tính độc cao hơn gap100 lần so với NH,* [Francis-Floyd et al., 2010] Hàm lượng NH; = 0,1 mg/L có thélàm ức chế sinh sản, sinh trưởng cho cá, hàm lượng 1 — 3 mg/L gây chết cá va nhiềuloài thủy sản khác Tôm thậm chí còn nhạy cảm hơn, có thé chết hàng loạt khi nồng

độ NH; trong nước ở mức 0,7 — 1,2 mg/L [Boyd, 2018].

Ammonia trong ao nuôi trồng thủy sản có nguồn gốc từ thức ăn thừa và cácchất thai của tôm, cá [Francis-Floyd et ai., 2010; Wei et al., 2016] Ở điều kiệnthích hợp, nito ammonia có thể được loại khỏi nước ở dạng N; nhờ quá trình nitrate

hóa-khử nitrate do VSV (Hình 1.2) [Linbo, 2009; Francis-Floyd et al., 2010].

Hình 1.2 Quá trình chuyên hóa nito trong ao nuôi thủy sản [Linbo, 2009]

So với NH; thì các hợp chất NO, và NO; có tính độc thấp hon Nitrite ởhàm lượng > 0,1 mg/L có thé ngắm qua mang và da dé đi vào máu, gây thiếu oxy,

14

làm cá chậm lớn và dé bị bệnh [Lương Đức Pham, 2008] Nitrate ít nguy hiểm đốivới động vật thủy sinh, tuy nhiên khi ở hàm lượng > 250 mg/L có thể bị khử không

hoan toàn, tạo ra nitrite và gây độc [Francis-Floyd et al., 2010].

1.1.4 Ảnh hướng đến quy trình xử lý nước cấp

Các hợp chất NH,* va NH; hòa tan trong nước cấp có thé phản ứng vớichlorine tạo thành chloramine, làm giảm hiệu quả diệt khuẩn của chlorine hon 100

lần Hơn nữa, NH," có thé là nguồn điện tử cho một số vi sinh vật, gây hiện tượng

“không ôn định sinh học”, làm cho nước bị đục, đóng cặn trong bề chứa và ống dẫn.Ngoài ra, NH,* ở nồng độ > 1 mg/L có thé gây ăn mòn cho các đường ống dẫn nước

và các công trình kim loại dưới nước [Bitton, 2005].

1.2 VI SINH VAT THAM GIA CHU TRÌNH CHUYEN HÓA NITƠ

Khí nitơ (N;) chiếm ~ 79% khí quyên trên trái đất, có cấu trúc phân tử bềnvững (N=N), chỉ tham gia các phản ứng hóa học khí có các yếu tố xúc tác mạnh(sắm sét/nhiệt độ và áp suất cao), hoặc nhờ enzyme nitrogenase ở một số vi sinhvật, được chuyên hóa thành NH,’ và bắt đầu đi vào chu trình tuần hoàn nito [Bitton,

2005] Vi sinh vật (VSV) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chu trình nitơ, dam

nhiệm hoàn toàn một số mắt xích quan trọng (Hình 1.3).

Hinh 1.3 Chu trinh nito va sy tham gia cua VSV

(1) Cé dinh nito, (2) Khoáng hóa nito, (3) Nitrate hóa, (4) Khử nitrate đồng hóa,

(5) Khử nitate di hóa [de-Sousa, Bhosle, 2012]

15

1.2.1 Cố định nito (nitrogen fixation)

Cố định nito sinh học là mắt xích đầu tiên, chuyên nito phân tử N; trong khíquyên thành nitơ hữu cơ, duy trì khoảng 2 x 10° tan nitơ/năm trong môi trường trêntoàn trái đất VSV có định nitơ có thé sinh trưởng tự do (như Azotobacter spp.,Klebsiella spp., Cyanobacteria phố biến trong môi trường nước và đất) hoặc cộngsinh (như Rhizobium spp trên cây họ đậu) [Marks et al., 2015] Quá trình cố định

nito (phản ứng 1.1) được thực hiện nhờ enzyme nitrogenase, chứa ion lưu huỳnh va

sắt-molybden, là các thành phần nhạy cảm với với oxy [Gutschick, 1982].

Ñ; + 3 H;O > 2 NH; + 3/2 O; (AG” =-658kJ/mol) — (1.1)

VSV có những công cụ dé bảo vệ nitrogenase khỏi anh hưởng của oxy, ví dunhư sinh polysaccharide để khử oxy hòa tan (ở vi khuẩn Azotobacter), hay hìnhthành lớp vỏ alginate ngăn can sự khuếch tán oxy vào trong tế bào (ở A vinelandii)

[Moir, 2011].

1.2.2 Khoáng hóa nito (ammonification)

Khoáng hóa nitơ là quá trình phân giải các hợp chất nitơ hữu cơ (protein,nucleic acid), được thực hiện bởi nhiều loại VSV di dưỡng nhờ các enzymeprotease, peptidase, nuclease, nhóm amine NH; sau đó được chuyên hóa thành sảnphẩm cuối cùng là NH,* (phản ứng 1.2) [Moir, 2011].

R-NH; + HOH -> R-OH + NH¿ + OH” (1.2)

1.2.3 Nitrate hóa (nitrification)

Nitrate hóa là quá trình oxy hóa NH,’ thành nitrate bởi VSV, diễn ra theo hai

bước: NH,* > NO; — NO; (phản ứng 1.3 và 1.4) [Bitton, 2005]:

NH," + 11440, — NO; + HạO + 2H” (AG°’ = -57 kcal/mol) (1.3)

NO; +1⁄2O; > NO3_ (AG®’ =—74 kcal/mol) (1.4)

Phương trình tổng quát của quá trình nitrate hóa như sau (phản ứng 1.5):

16

Bước oxy hóa NH¿ thành NO, được thực hiện bởi vi khuẩn oxy hóa NH,*(Ammonium Oxidizing Bacteria - AOB), là nhóm hiểu khí tự dưỡng vô cơ, các chithường gặp gồm có Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus, vàNitrosovibrio Trong bước tiếp theo, NO, được chuyền hóa thành NO; nhờ các vi

khuan oxy hóa nitrite (Nitrite Oxidizing Bacteria - NOB) như Nitrobacter,

Nitrospina, Nitrospira va Nitrococcus [Wolfe, Lieu, 2002; Moir, 2011].

Nitrate hóa là quá trình tự dưỡng vô co, năng lượng thu được rất thấp (57

kcal/mol cho phản ứng NH,* + NO, và 74 kcal/mol cho phản ứng NO, — NO; ),

mặc dù mức tiêu tốn oxy lại rất cao, kém hiệu qua so với các phản ứng oxy hóa chat

hữu cơ bằng oxy (ví dụ năng lượng thu được từ phản ứng oxy hóa acid acetic là 207kcal/mol) [Bitton, 2005] Các vi khuẩn nitrate hóa AOB và NOB có tốc độ sinh

trưởng chậm hơn so với các loài di dưỡng và tao it sinh khối [Schmidt et al., 2003].Do đó, nhược điểm chung của nhóm vi khuẩn nitrate hóa là (i) có nhu cầu về oxyrat lớn, (ii) khó cạnh tranh với các loài di dưỡng trong hệ sinh thái (bao gồm cả môi

trường nước thải) khi có mặt carbon hữu cơ [Bitton, 2005].

Mỗi tương quan giữa tốc độ oxy hóa NH,* do AOB hoặc nitrite do NOB(biéu dién là giá trị g mg N/L/ngày) và hệ số sinh trưởng của vi khuan (biểu diễn làu = số gram sinh khối hình thành/ngày) được biéu diễn bằng phương trình:

Trong đó: Y là hệ số năng suất sinh trưởng của AOB hoặc NOB tính bằng

lượng sinh khối (g) tạo ra từ 1 gram NH¿ hoặc nitrite bị oxy hóa.

Theo tính toán và thực nghiệm, hệ số sinh trưởng p của vi khuẩn nitrate hóa

trong khoảng 0,006 — 0,0035, thấp hơn nhiều so với của vi khuẩn dị dưỡng sinhtrưởng trên nguồn carbon hữu co, vi dụ như sử dụng glucose là 0,18 — 0,38 [Sedlak,

1991] Ngoài ra, năng suất sinh trưởng (Y) của vi khuẩn nitrate hóa cũng rất thấp, cụthé ở AOB (như Nitrosomonas spp.) là 0,04 — 0,13, và ở NOB (như Nitrobacter

spp.) là 0,02 — 0,07 Do vậy trong điều kiện nitrate hóa, AOB thường hiện diện vớisé lượng lớn hon so với NOB [Bitton, 2005; Cabello et al., 2009].

17

1.2.4 Khử nitrate (denitrification)

Khử nitrate là quá trình hô hấp ky khí trong đó nitrate đóng vai trò là chất

nhận điện tử (phản ứng 1.6).

2NO; + 6H* + 6e — N, + 3HạO (AG” =-284 kJ/mol) (1.6)

Khử nitrate là con đường sinh hoc chủ dao hoàn trả khí N2 vào khí quyền,trong đó NO; bị khử qua một chuỗi các chất trung gian (các oxit nitơ ở các mứcoxy hóa khác nhau), cuối cùng thành N; (Hình 1.4) [Takaya et al., 2003] Quá trình

khử nitrate có sự tham gia của 4 loại enzyme: nitrate reductase (NaR), nitritereductase (NiR), nitric oxide reductase (NOR) and nitrous oxide reductase (N»OR).

Các enzyme tham gia chuỗi phản ứng khử nitrate đều bị ức chế bởi oxy, trong đónitrite reductase ít nhạy cảm nhất với oxy, bị bất hoạt ở nồng độ oxy 2,5 mg/L, cácenzyme khác bị bất hoạt ở nồng độ oxy thấp hơn (thậm chí 10 lần hoặc hơn)

[Madigan et al., 2015; Hoseinzadeh, 2019].

Khí Khí Khí

Nitrate (NOx)———> Nitrite (NO; )———> Nitric oxit (NO) ———> Dinito oxit (NO) ———> Nitơ (N;)

Nitrate Nitrite Nitric oxit Dinito oxit

reductase reductase reductase reductase

Hình 1.4 Quá trình khử nitrate va các enzyme tham gia

Vi khuân khử nitrate chủ yếu là những loài di dưỡng, một số có khả năng hôhấp hiếu khí khi có mặt oxy trong môi trường (như Pseudomonas, Alcaligenes,

Commamonas ) và các loài ky khí bat buộc (như Paracoccus, Anaeromyxobacter,Thauera ) [Joo et al., 2005; de-Sousa, Bhosle, 2012].

1.2.5 Anammox

Anammox là quá trình sinh hoc do nhóm vi khuẩn chuyên biệt thuộc ngành

Planctomycetes thực hiện [Mulder et al., 1995; Strous et al., 1999a] Các vi khuẩn

anammox có chung hình thức dinh dưỡng tự dưỡng vô cơ (autolithotrophy), sử

dung CO; như là nguồn carbon duy nhất và nguồn năng lượng từ oxy hóa NH,*bang NO; , tạo sản pham là N; (phản ứng 1.7) [Schmidt et al., 2003].

NH,’ + NO, ->N; + 2HạO (AG”=-357kJ/mol) (1.7)

18

Trong tự nhiên, quá trình anammox được xác định tham gia chuyên hóa 30 —50% nito trong tram tich bién [Tomaszewski et al., 2017], tao ra khoang 67% khinito trong hé sinh thai biển và nước ngọt [Yang et al., 2012].

Cho dén nay, có 5 chi vi khuân anammox đã được xác định, bao gomBrocadia [Strous et al., 1999a], Kuenenia [Schmid et al., 2000], Anammoxoglobus[Kartal et al., 2007], Jettenia [Quan et al., 2008] được phân lập từ bun hoạt tính, vaScalindua từ môi trường tự nhiên [Kuypers et al., 2003; Lackner et al., 2014] Với

mức tích lũy năng lượng thấp từ phan ứng trao đổi chất, hầu hết các vi khuẩnanammox đã được nghiên cứu có tốc độ sinh trưởng rất thấp (Bảng 1.2), Umax trong

khoảng 0,048 — 0,098/ngày, tương ứng thời gian nhân đôi khoảng 7 — 11 ngày.Bảng 1.2 Đặc diém sinh trưởng và động học của một sô vi khuân anammox

Vi khuẩn Brocadia Brocadia Kuenenia Scalindua Jetteniaanammoxidans sinica stuttgartiensis sp caeni

Tài liệu tham [Strous et al., [Oshiki et | [van-der-Star et | [Awataet | [Ali et al.,

khao 1997; Strous et | ai, 2011] | al., 2008; Russ | al., 2013] 2015]

al., 1999b] et al., 2014]

Nhiệt độ (°C) 20-43 25-45 25 — 37 10— 30 20 — 42,5

pH 6,7 — 8,3 7,0 — 8,8 6,5 — 9,0 6,0 — 8,5 6,5 — 8,5

Tốc độ phát 0,065 0,098 0,062 — 0,084 0,048 0,048triển cực đại

max (1/ngay)

Thời gian 10,7 7 8-11 ND NDnhân đôi (ngày)

Hiệu suất sinh 0,07 0,063 ND 0,03 0,056

khối (C/N, mM)

Km đối với NH¿* <5 2844 ND 3 17,1 44,3K„ đối với NO;ˆ <5 34+21 0,2—3 0,45 35,6 +0,92

Trong đó: Km là hệ số bán bão hòa (uM); ND là chưa xác định.

Vi khuân anammox có ái lực rat cao với các co chat NH¿” và NO, , giá tri

hòa tan bán bão hòa K,, của vi khuân anammox đôi với NH¿” và NO, đêu < 10.

Trong hai cơ chất nay, NH," it tac động lên vi khuẩn hơn so với NO Ở nồng độ<150 mg/L NH," chưa có tác dụng ức chế quá trình anammox [Aktan et al., 2012],

19

trong khi đó NO, ức chế tốc độ anammox ngay ở nồng độ > 50 mg/L [Egli et al.,

2001; Ganigue et al., 2007] Trong nghiên cứu cua Strous và cs., hoạt tính của vi

khuẩn anammox giảm 74% ở nồng độ NO, > 150 mg/L tại pH 7,0, tuy nhiên sự ứcchế này có thé được khắc phục bằng cách bổ sung vào môi trường hydrazine hoặc

hydroxylamine [Strous et al., 1999b] Trong nghiên cứu khác thực hiện trên loài K.

stuttgartiensis, hoạt tính của vi khuẩn bị ức chế (nhưng có thé phuc hồi) 0 nong độNO, là 260 mg/L, và bị bất hoạt hoàn toàn ở nồng độ NO, > 391 mg/L (tai pH

7,0) [Egll et al., 2001].

Vi khuan anammox thích nghi được trong môi trường có độ mặn cao, có thểhoạt động bình thường ở điều kiện NaCl 6 g/L, thậm chí duy trì ở điều kiện NaCllên đến 30 g/L [Kartal et al., 2006].

Nghiên cứu đối với một số loài anammox như B anammoxidans và K.stuttgartiensis cho thay vi khuẩn thực hiện các phản ứng anammox tại các cấu trúccó màng tế bào chất gọi là anammoxosome ([Jetten et al., 2001] Ở đây NH," đượcoxi hóa thành NO; thông qua chất trung gian hydrazine (N>H,), dẫn đến chênh lệchnồng độ H* trên màng anammoxosome, là cơ sở dé tổng hợp ATP qua hệ enzyme

ATPase (Hình 1.5).

Thanh té bao

Mang anammoxosome

Hình 1.5 So đồ con đường chuyên hóa anammox

[Bing et al., 2016] Trong đó nir: nitrite reductase (cytochrome cd1); hh: hydrazine hydrolase;

hzo: hydrazine/hydroxylamine oxidoreductase; cyt: mono- or di-haem cytochrome c electroncarriers; bcl: cytochrome bel complex (complex II; Q: coenzyme Q (ubiquinone)

20

Là quá trình ky khí, hoạt tính anammox chiu ảnh hưởng cua oxy hòa tan

trong môi trường, bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ oxy hòa tan cao hơn 2 mg/L như

trong thí nghiệm thực hiện với B anammoxidans [Jetten et al., 1997] Tuy nhiên,

tác dụng ức chế này chi là tạm thời, hoạt tinh của vi khuẩn có thé được khôi phục ở

mức tương đương sau khi oxy được loại bỏ khỏi môi trường [Strous et al., 1997].

Khả năng này có được là do vi khuẩn thực hiện phản ứng anammox trong bào quanchuyên biệt anammoxosome, giúp giảm thiểu ảnh hưởng của oxy tới các bước của

phan ứng [Strous et al., 1999a; Bing et al., 2016].1.2.6 Feammox

Feammox là quá trình oxy hóa NH,* ở điều kiện ky khí sử dung Fe** làm

chất nhận điện tử Quá trình này được đề cập lần đầu tiên bởi Clement và cs (2005)khi nghiên cứu các quá trình chuyên hóa nitơ và sắt trong đất ngập nước ven sông,

sau đó được chứng minh có vai trò quan trọng trong chu trình nitơ, tham gia hoàn

trả khí nitơ vào khí quyền [Clement er al., 2005] Các nghiên cứu đối với các hệsinh thái đất ngập nước ven sông, rừng ngập mặn, trầm tích biển cho thấy vikhuan feammox thực hiện phan ứng khử Fe** trong đất sét, oxit sắt và cả hydroxitđể có thê tạo ra các sản phẩm oxy hóa NH¿” khác nhau như khí Nj, NO, hoặc NO;

(phản ứng 1.8; 1.9; 1.10) tùy thuộc điều kiện môi trường, đặc biệt là pH

[Sawayama, 2006; Yang et al., 2012; Huang, Jaffé, 2015; Yang et al., 2019].

3Fe(OH); + 5H† + NH,* > 3Fe”' + 9H;O +0.5N; (AG”?=—245kJ/mol) (1.8)6Fe(OH); + 10H* + NH,* — 6FeTM* + 16HạO +NO;— (AG”?=-164kJ/mol) (1.9)

6Fe(OH); + 8H" + NH,* > 6Fe”' + 15HạO+NO; (AG”?=-207kJ/mol) (110)Phản ứng oxy hóa NH,* thành N; có mức tích lũy năng lượng cao nhất vacũng diễn ra ở môi trường có pH trung tính và kiềm, trong khi đó hai phản ứng tạora NO; hoặc NO; chỉ xảy ra ở điều kiện pH thấp [Luther et al., 1997; Clement et

al., 2005; Sawayama, 2006; Shrestha et al., 2009].

Cho đến nay, các VSV thực hiện con đường chuyên hoa feammox còn chưađược nghiên cứu nhiều Các thông tin có được từ phân tích hệ VSV bằng cácphương pháp sinh hoc phân tử (PCR va qPCR) đối với gen mã hóa cho 16S rRNA

21

cho thấy một số nhóm VSV feammox tiềm năng được làm giàu trong các mô hình

nghiên cứu như Exiguobacterium, Pseudomonas, Carnobacterium [Sawayama,2006], Pelobacteraceae, Desulfovibrio [Zhou et al., 2016], Ferrimicrobium (F.acidophilus), Alkaliphilus (A metalliredigus) [Huang, Jaffé, 2015].

Ching vi khuẩn feammox thuần khiết duy nhất được công bố là vi khuẩnAcidimicrobiaceae A6 (Hình 1.6A, B) được phân lập từ mẫu làm giàu ở điều kiệnfeammox tại pH 5, sử dụng đất ngập nước ven sông làm nguồn VSV ban đầu

[Huang, Jaffé, 2015] Chung Acidimicrobiaceae sp A6 có thời gian nhân đôi

khoảng 8 — 10 ngày và phát triển từ 7,5% lên 47,6% trong hon 300 ngày làm giàu.Kết quả chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) cũng xác định vi khuẩn nàycùng với Fe** được tích lũy Chung vi khuẩn Acidimicrobiaceae A6 đã được chứng

minh có thé sinh trưởng nhờ năng lượng tích lũy từ quá trình feammox oxy hóa

NH¿ kết hợp khử Fe** tạo sản phâm là NO, ở điều kiện pH thấp (pH 5) (Hình

1.6C) [Huang, Jaffé, 2018].

Loài vi khuẩn này có ty lệ tương đồng về trình tự 16S rRNA rat thấp với cácloài đã biết như Ferrimicrobium acidiphilum (92%), Acidimicrobium ferrooxidans

(90%), chứng tỏ đây là một nhóm phân loại mới cần được nghiên cứu dé xác định vị

trí tiến hóa [Huang, Jaffé, 2015; Huang, Jaffé, 2018; Ruiz-Uriguen et al., 2019].

Thời gian (ngày)

Hình 1.6 Hình thái tế bào của chủng Acidimicrobium A6

(A, B) và hoạt tính feammox ở điều kiện pH thấp, không có carbon hữu cơ

(C) [Huang, Jaffé, 2018]

Có thé thay rang VSV đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chu trình nitotrong tự nhiên (Hình 1.7), là tác nhân duy nhất trong nhiều bước chuyên hóa.

22

này mở ra các hướng phát triển công nghệ tiên tiễn hơn dé phục vụ mục đích loại bỏ

nito trong nước thai.

1.3 LOẠI BO NITƠ TRONG NƯỚC THAI BANG BIEN PHÁP SINH HỌC

Xử lý loại bỏ nito trong nước thai là một trong những bài toán môi trường

được cộng đồng và các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Trong thực tế triển khai,các công nghệ xử lý dựa trên nguyên lý sinh học bộc lộ ưu điểm về hiệu quả và tínhthân thiện với môi trường Các công nghệ xử lý bằng sinh học dựa trên nguyên lýcủa các quá trình chuyền hóa nitơ đều do VSV đảm nhiệm, đặc biệt với các nguồn

nước thải có nồng độ NH,* < 500 mg/L [Mulder, 2003].

1.3.1 Các công nghệ hiện hành xử lý loại bỏ nito trong nước thải

Hai nguyên lý công nghệ được áp dụng phổ biến hiện nay là (i) nitrate hóa —khử nitrate được đưa vào áp dụng từ cuối thế ky 19 đến nay với nhiều cải tiến trongcông nghệ và (ii) nitrite hóa bán phan-anammox mới được áp dung từ cuối thế kỷ20 Các kiến thức liên quan đến vi sinh vật học và các yếu tô lý hóa của hai dạng

23

công nghệ đã được nghiên cứu sâu và qua thực tiễn áp dụng cho thấy một số hạnchế nhất định cần được khắc phục.

1.3.1.1 Công nghệ xử lý NH," theo nguyên lý nitrate hóa — khử nitrate

Công nghệ nitrate hoá — khử nitrate gồm hai bước (i) nitrate hóa (NH¿ >

NO, —> NO; ) nhờ các nhóm vi khuẩn hiếu khí oxy hóa NH,* (AOB) và oxy hóanitrite (NOB) và (ii) khử nitrate (NO; —> N¿) nhờ các vi khuẩn khử nitrate (NRB).

Trong ứng dụng thực tế, quy trình này được tích hợp trong hệ thống xử lý nước thải

sau khi carbon hữu cơ đã được loại bỏ trước đó, ví dụ quy trình AAO.

Quy trình AAO (hay A2O) là hệ thống ba bề nối tiếp Anaerobic — Anoxic —Oxic (ky khí — thiếu khí — hiếu khí), phối hợp xử ly carbon hữu cơ và nito trong nướcthải (Hình 1.8) Công nghệ được áp dụng từ lâu để xử lý nước thải sinh hoạt, cho

phép loại bỏ carbon hữu co và nito tới trên 95% [Water_Environment_Federation,

2011] Nước thải đi vào hệ thống ở bé ky khí (loại bỏ carbon hữu cơ theo cơ chế lên

men sinh methane), sau đó chuyên sang bể thiếu khí (khử nitrate) và bé hiếu khí

(nitrate hóa).

Bé ky khí (Anaerobic): là nơi diễn ra quá trình phân hủy carbon hữu cơ theo

nguyên lý lên men ky khí sinh methane Trên 90% carbon hữu cơ được chuyền hóa

tại đây thành methane (và CO¿), do vậy nước thai di ra từ bề này sang bề thiếu khí

tiếp sau có hàm lượng carbon hữu cơ thấp, đối lập với hàm lượng NH," cao.

Bể ky khí Bể thiếu khí Bể hiếu khí

Hồi lưu bùn

Hình 1.8 Mô hình quy trình công nghệ xử lý nước thải A2O [Sedlak, 1991]

24

Bé thiếu khí (Anoxic): bề này tiếp nhận nước thải đã được loại bỏ carbonhữu cơ từ bé ky khí hòa trộn với nước thải được hồi lưu từ bể hiểu khí ở cuối quytrình xử lý (chứa nitrate cao) Dòng hồi lưu này được tính toán ở mức cao hơn 3 — 4lần lưu lượng nước từ bé ky khí chuyên sang Vi khuẩn khử nitrate thực hiện quátrình khử NO; thành N; trong điều kiện thiếu khí và có đầy đủ carbon hữu cơ do

không xử lý triệt để ở bé ky khí trước đó hoặc được bồ sung thêm.

Trong các hệ thống xử lý nước thải, NRB dị dưỡng đóng vai trò ưu thế, nhu

cầu carbon hữu cơ tính theo COD ở tỷ lệ khoảng COD/N ~ 4, tức là can khoảng 4

gram COD (có thé phan huy sinh hoc) dé khử 1 gram NO; Tuy nhiên, tỷ lệ này cóthé thay đổi tùy thuộc vào từng loại hợp chất hữu cơ [Tchobanoglous et al., 2003].Trong thực tế methanol thường được bồ sung vào bề thiếu khí dé hỗ trợ quá trình

khử nitrate (phản ứng 1.11) do (i) đây là cơ chất phù hợp đối với NRB và (ii) không

tham gia quá trình lên men có khả năng diễn ra ở điều kiện thiếu khí, do vậy có thêkiểm soát quá trình xử lý [Bitton, 2005].

6NO;3_ + 5CH:OH _—> 3N; + 5CO; + 7HạO +60H (1.11)

Theo phương trình phản ứng 1.11, NRB cần 5/6 mol methanol (26,7 g) đểkhử 1 mol NO; (14 g N), tương đương tỷ lệ [CH;OH]/[NO; ] là 1,9 Nếu tinh cảlượng methanol sử dung cho quá trình đồng hóa thì tỷ lệ [CH;OH]/[NO; ] ở mức2,5 cho phép đạt hiệu quả khử nitrate ở mức tối đa [Khin, Annachhatre, 2004].

Phần lớn NRB là ky khí tùy tiện, có khả năng linh hoạt trong thực hiện cácphương thức trao đổi chất, chuyên từ sử dụng oxy sang nitrate, nitrite, thậm chí

sulfate (SO,”) làm chất nhận điện tử cuối cùng Trong đa số hệ thong xử ly nướcthải (XLNT), vi khuẩn sẽ ưu tiên sử dụng oxy bởi hiệu suất năng lượng cao hơn, dovậy oxy là chất nhận điện tử cạnh tranh với nitrate và các VSV chỉ sử dụng đếnnitrate khi môi trường đã cạn kiệt nguồn oxy hòa tan Trong điều kiện nguồn điện tử(các hợp chất hữu cơ có phân tử lượng nhỏ) bị hạn chế, quá trình khử nitrate có thểdừng lại ở giữa chừng (ví dụ tích lũy nitrite) mà không tạo sản phẩm cuối là Np.Trong thực tế, quá trình khử nitrate diễn ra trong bê thiếu khí có nồng độ oxy hòa

25

tan ở mức < 0,1 mg/L [Hoseinzadeh, 2019] Ngoài ra, nhiều loài NRB còn có khảnăng kết tụ (flocculation) hay tạo màng sinh học, nhờ đó có khả năng tự bảo vệ

trước tác động của oxy tới quá trình khử nitrate [Sedlak, 1991; Sen, Randall, 2008].

Quá trình khử nitrate diễn ra ở pH 7,0 — 8,5, tối ưu ở pH = 7 [Tchobanoglouset ai., 2003] Theo phản ứng 1.11, quá trình khử nitrate làm kiềm hóa môi trường,có tác dụng trung hòa một phần độ axit tạo ra trong quá trình nitrate hóa trước đó;

mức kiềm hóa tương đương 3,57 g HCO; hay 3,57 g CaCO; được tạo ra từ quá

trình khử 1 g nitrate thành Ñ; [Bitton, 2005] Khoảng nhiệt độ 5 — 35 °C là thích

hợp cho quá trình khử nitrate, trong khoảng đó tốc độ khử nitrate sẽ tăng gấp đôikhi tăng thêm 10 °C Vị khuẩn NRB ngừng hoạt động ở nhiệt độ < 5 °C [Gerardi,

2006], và cũng giảm hoạt tính ở nhiệt độ cao hon, trong khoảng 35 °C — 50 °C[Bitton, 2005].

Bé hiếu khí (Oxic): đây là bể diễn ra quá trình nitrate hóa Nước thải ở bểhiếu khí không còn carbon hữu cơ, chỉ có NH¿” ở nồng độ cao cần được oxy hóathành nitrate Các nhóm vi khuẩn nitrate hóa như AOB và NOB đều có nhu cầu oxymạnh, hệ số bán bão hòa đối với oxy hòa tan (tức là nồng độ oxy tương ứng với tốcđộ phát triển của vi khuân đạt một nửa so với tốc độ cực đại) tương ứng đối với

AOB là 0,2 — 0,4 mg/L va NOB là 1,2 — 1,5 mg/L [Picioreanu et ai, 1997] Khi

nước thai có nồng độ oxy hoa tan thấp sẽ anh hưởng nghiêm trọng đến sự phat triển

của nhóm vi khuan NOB, làm tích lũy nitrite trong nước [Peng et al., 2004] Xét vềtỷ lệ các chất tham gia phan ứng nitrate hóa (phan ứng 1.5), dé oxy hóa 1 mol NH,*

cần 2 mol oxy, tương đương dé oxy hóa 1 mg NH¿* cần đến 4,33 mg oxy Do đó,cung cấp oxy tích cực là một trong các điều kiện tiên quyết dé quá trình nitrate hóa

diễn ra thuận lợi, khoảng oxy hòa tan tối thiểu là từ 1,0 — 1,5 mg/L, tốt nhất là 1,7 —

2,0 mg/L [Bitton, 2005; Ruiz-Urigiien et al., 2019].

Vi khuan nitrate hóa sinh trưởng tự dưỡng nên có hiệu suất sinh khối thấp,yêu cầu về ty lệ BODz/TKN thấp hơn so với các vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí [LêVăn Cát, 2007] Trong các hệ thống xử lý hiếu khí, quá trình nitrate hóa giảm khi tỷlệ BOD;/TKN tăng Trong các hệ thống xử lý kết hop carbon hữu cơ và NH,’ thì tỷ

26

lệ BODz/TKN cần giữ ở mức > 5, nhưng trong hệ thống nitrate hóa riêng biệt thì tỷlệ BOD./TKN cần giữ ở mức < 3 [Sedlak, 1991; Tchobanoglous et al , 2003].

Vi khuẩn nitrate hóa có thé sinh trưởng ở khoảng nhiệt độ 4 — 50 °C, tuynhiên khoảng nhiệt độ tối ưu là 30 — 36 °C, tốc độ sinh trưởng giảm ở nhiệt độ < 10°C, và bị ức chế hoàn toàn ở nhiệt độ < 4 °C [Van-Dongen et al., 2001] Trong vậnhành các hệ thong XLNT, nhiệt độ bên ngoài anh hưởng đến hoạt động của vikhuẩn nitrate hóa, dẫn đến thời gian xử lý dao động trong biên độ lớn (vài giờ đếnvài ngày) tùy thuộc nguồn thải [Eekenfelder, 2000].

Điều kiện pH tối ưu cho cả AOB va NOB trong khoảng 7,5 — 8,5; quá trìnhnày hoàn toàn dừng ở pH < 6,0 hoặc pH > 9,0 [Sedlak, 1991; Bitton, 2005] Theo

phương trình phản ứng tổng quát của quá trình nitrate hóa (phản ứng 1.5), cứ 1 mol

NH," bị oxy hóa thì tạo ra 2 mol ion H*, dẫn đến làm giảm pH môi trường Trong

môi trường nước thải, thay đổi về pH do vi khuẩn nitrate hóa được kiểm soát nhờ hệđệm bicarbonate (HCO;_ S H” + CO¿) Theo tính toán, dé trung hòa lượng H* sinh

ra từ quá trình oxy hóa 1 mg NH¿ là 8,6 mg NaHCO;, hoặc nếu sử dung CaCO; thì

sẽ là 7,14 mg [Sedlak, 1991] Trong các hệ thống xử ly, đá vôi thường được bé sungdé tăng pH môi trường, ngược lại khi pH bị hạ thấp thì tăng độ sục khí dé đuổi CO;giúp 6n định pH trong khoảng xử lý [Lê Văn Cát, 2007].

Các vi khuẩn nitrate hóa, đặc biệt là AOB, man cảm với một số độc tốthường có mặt trong nước thải, trước hết là các hợp chất hữu cơ tổng hợp nhưphenol, hợp chất chứa clo, hợp chất chứa nitơ [Zhang et ai., 2000] Ngoài ra, các

loại hóa chất khác cũng có tính độc đáng kế đối với AOB là cyanide, thiourea,

anilines và các ion kim loại như Cr, Ni, Cu, Zn, Pb, Cd Mức độ ảnh hưởng của

các kim loại nặng thé hiện ở nồng độ khác nhau, vi dụ Nitrosomonas spp bi ứcchế hoàn toàn bởi Ni, Cr ở 0,25 mg/L, Cu ở 0,1 — 0,5 mg/L Cyanide là loại độc tốmạnh đối với AOB, làm giảm 50% hiệu suất oxy hóa NH,* 50% ở nồng độ 0,1 —0,2 mg/L và ức chế hoàn toàn ở nồng độ 0,6 - 0,7 mg/L Một số anion như F ởnồng độ 100 mg/L sẽ làm giảm 80% quá trình nitrate hóa [Eekenfelder, 2000;

Bitton, 2005].

27

Từ khi ra đời đến nay, công nghệ nitrate hóa — khử nitrate được áp dụng phôbiến trên thé giới nhờ các ưu điểm về (i) tính linh hoạt trong thiết kế và vận hành,

(ii) mức đầu tư không cao và (iii) đạt hiệu quả xử lý tốt Tuy nhiên, trải qua thờigian đài ứng dụng, mặc dù không ngừng được cải tiến trong thiết kế và vận hành,công nghệ này vẫn bộc lộ một số điểm hạn chế như (i) có chi phí vận hành cao (chủyếu trong bước cấp oxy cho vi khuẩn nitrate hóa ở bể hiếu khí và bố sung methanollàm nguồn carbon và năng lượng cho NRB ở bể thiếu khí), và (ii) yêu cầu được

kiểm soát chặt chẽ dé các bước xử lý ky khí — thiếu khí — hiếu khí với điều kiện vận

hành rất khác nhau có thể diễn ra nhịp nhàng và đạt hiệu quả cao.

1.3.1.2 Công nghệ xử lý loại bỏ NH¿” trong nước thải theo nguyên lý nitrite

hóa ban phan — anamimox

Trong những năm 1990 nguyên lý anammox được nghiên cứu rộng rãi về cảhai phương diện VSV học và ứng dụng dé xử lý loại bỏ NH," trong nước thải Côngnghệ này cho phép tiết kiệm tới 60% chỉ phí năng lượng cần thiết so với nitrate hóa— khử nitrate nhờ thay thế bước nitrate hóa (NH,* > NO > NO; ) bang nitritehóa bán phần (NH,* > NO, đối với 50% lượng NH,* can xử lý), và 40% lượng

carbon cần bổ sung (so với bước khử nitrate), cũng như giảm lượng kiềm cần thiếtdé ôn định pH so với quá trình nitrate hóa hoàn toàn [Jetten et al., 2002] Dựa trên

nguyên lý nitrite hóa bán phần — anammox, một số quy trình công nghệ đã đượcphát triển, trong đó quy trình SHARON (Single reator system for High activityAmomonium Removal Over Nitrite) được đề xuất đầu tiên bởi nhóm nghiên cứu tạitrường đại học Delft (Hà Lan) năm 1998 là ứng dụng điên hình (Hình 1.9) [Hellinga

et al., 1998].

Trong bề SHARON, nhiệt độ được duy trì trong khoảng 30 — 40 °C, pH từ7,0 — 8,0, kết hợp với thời gian lưu của nước thải (HRT) ngắn và oxy được cung cấpdé tạo điều kiện cho vi khuẩn AOB oxy hóa NH¿ thành NO, [Van-Dongen et al.,2001; Paredes et al., 2007] Suc khí oxy được thực hiện gián đoạn dé phu hop voipha hiếu khí (AOB) va pha ky khí (anammox) của công nghệ, đồng thời tao điềukiện dé điều chỉnh pH Sản phẩm dau ra của bé SHARON phù hop cho quá trình

28

Anammox ở bé tiếp theo, tức là chứa 50% nitơ ở dang NO, và 50% vẫn ở dạngNH,’ (Hình 1.9) Công nghệ SHARON - Anammox có thé áp dụng với nước thải có

hàm lượng NH," cao tới trên 500 mg/L, hiệu quả xử lý lên tới 90 — 95% [Schmidt et

al., 2003; Jermakka et al., 2015].

95% N>

100% NH„-N 5% NO3-N

Quy trình SHARON — Anammox kết hop hai nhóm VSV AOB (hiéu khí) vaanammox (ky khí), do vậy việc kiểm soát hàm lượng oxy hòa tan trong các bước xửly có ý nghĩa rat quan trọng Điểm đặc biệt của vi khuẩn anammox là mặc dù bị ứcchế ở điều kiện oxy > 2 mg/L nhưng vi khuẩn có thể khôi phục hoạt tinh gần như

hoàn toàn sau khi oxy được loại bỏ khỏi môi trường Strous và cs đã ghi nhận sựkhôi phục hoạt tính của bùn anammox trong 20 ngay thí nghiệm sục khí gián đoạn

theo chế độ 2 giờ hiếu khí và 2 giờ thiếu khí [Strous et al., 1997] Day là yếu tốthuận lợi cho vi khuẩn anammox và vi khuẩn nitrate hóa có thé hình thành mối quanhệ cộng sinh trong điều kiện hạn chế oxy (DO < 0,5 mg/L) [Ciudad et al., 2005].

Theo phương trình anammox (phản ứng 1.7), tỷ lệ các chất tham gia phản

ứng là [NH,]/[NO; ] = 1/1 Tuy nhiên, trong thực tế vận hành, tỉ lệ [NH¿*]/[NO; ]

= 1/1,32 trong đó 89% nito được chuyén thành N2, 11% còn lại được sử dung cho

nhu cầu tổng hợp sinh khối tế bào [Strous et al., 1998] Các hệ thống xử lý áp dung

quá trình anammox có thé vận hành ở nhiệt độ 6 — 43 °C, tối ưu ở 35 — 38 °C, hiệu

quả giảm mạnh ở nhiệt độ < 15 °C hoặc > 40 °C [Rysgaard et al., 2004; Yamamoto

et al., 2006; Ni et al., 2009] Điều kiện pH không chi ảnh hưởng đến sự tốc độ phát

29

triển của vi khuẩn anammox, mà còn ảnh hưởng đến dạng tồn tại của ammonia

trong môi trường (ở dang NH hay NH¿”), do đó ảnh hưởng đến ty lệ [NHy*J/[NO> ]

trong hệ thống xử ly [Fux ef al., 2002] Vi khuẩn anammox hoạt động tốt trongkhoảng pH 6 đến 8, khi pH > 8 tốc độ phát triển giảm 8 — 10 lần so với ở pH 7[Hellinga et al., 1998] Một ưu điểm của vi khuân anammox là có khả năng thíchnghỉ trong môi trường có nồng độ muối dao động trong khoảng rộng, từ nước ngọt

(< 5 g NaC1/L) đến nước Ig (10 — 15 g NaC1/L) và nước biển (25 — 30 g NaC1/L), do

vậy quá trình anammox có thé được áp dụng cho các nguồn nước thải có độ mặncao, ví dụ như nước thải từ các cơ sở chế biến hải sản [Kartal et al., 2006].

Ngoài ưu điểm tiết kiệm chi phí so với công nghệ nitrate hóa — khử nitratetrong giảm tiêu tốn năng lượng cho việc cap oxy (bước nitrate hóa) và bổ sungcarbon hữu cơ (bước khử nitrate), công nghệ nitrite hóa bán phần — anammox còncó một số ưu điểm khác như (i) giảm 90% lượng bùn sinh ra (nhờ quá trình ky khí),(ii) giảm nhu cầu diện tích (do vi khuẩn có ái lực cao với cơ chat), (iii) giảm phát

thải các khí nhà kính CO,/N,O [Jetten et al., 2001; Ahn, 2006; Siegrist et al., 2008].

Tuy nhién, trong thuc té van hanh, công nghệ nitrite hóa bán phần — anammoxcũng bộc lộ một số hạn chế như (1) có thời gian khởi động dai do vi khuẩn anammox

sinh trưởng chậm (thời gian hoạt hóa bùn anammox thường khoảng 100 — 250 ngày)

và (ii) đòi hỏi tính 6n định cao của nước thải đầu vào và vận hành chính xác để đảm

bảo tỷ lệ [NH¿']/[NO; ] phù hợp Những điểm hạn chế này là nguyên nhân làm cho

công nghệ khó được triển khai áp dụng rộng rãi, đặc biệt tại các quốc gia có nền tảngkhoa học công nghệ thấp và chính sách đầu tư cho xử lý nước thải còn hạn chế

[Strous et al., 1997; Schmidt et al., 2003; Peng, Zhu, 2006].

1.3.2 Feammox và tiềm năng phát triển công nghệ mới cho xử ly loại bỏ

NH,’ trong nước thai

Các công nghệ xử lý sinh học hiện hành loại bỏ nitơ trong nước thải vẫn

chưa hoàn toàn đáp ứng được nhu cầu thực tế, do vậy việc nghiên cứu phát triển các

quy trình công nghệ mới vẫn rất cần thiết, đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoahọc Feammox là con đường trao đôi chất mới được phát hiện ở VSV, trong đó

30

NH,’ được chuyển hóa ở điều kiện khử Fe**, hoàn toàn không phụ thuộc vào oxy.

Chính vì vậy quá trình này bắt đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vềcác yếu tô VSV học, cũng như mức độ chi phối bởi các điều kiện môi trường xungquanh dé có thé đưa vào ứng dung trong thực tế, giúp khắc phục những điểm han

chế của các công nghệ xử lý hiện hành.

Sawayama là tác giả đầu tiên công bố nghiên cứu về quá trình feammoxtrong mô hình phòng thí nghiệm (Hình 1.10) và hệ VSV được thiết lập trong môhình Trong nghiên cứu này, feammox được trình diễn ở điều kiện tự dưỡng (khôngcó carbon hữu co) va pH trung tính/kiềm nhẹ (kiểm soát bằng hệ đệm bicarbonate)với Fe(III)-EDTA là chất nhận điện tử Sản phâm của quá trình oxy hóa NH," làNO,, hiệu quả xử lý đạt được trong mô hình là 20% trong thời gian 50 ngày Điều

kiện thí nghiệm đã dẫn đến làm giàu một số nhóm vi khuẩn thuộc các chỉ

Exiguobacterium, Pseudomonas, Carnobacterium, theo két qua phan tich thu vién

gen 16S rDNA [Sawayama, 2006].

Hình 1.10 Sơ đồ mô hình nghiên cứu quá trình feammox ở điều kiện tự dưỡng,

pH 7 trong nghiên cứu của Sawayama (2006)

Quá trình feammox trong nghiên cứu này chưa phù hợp cho ứng dụng trong

thực tế do có thời gian lưu dài tới 50 ngày mà hiệu quả xử lý mới chỉ đạt mức 20%.

Nghiên cứu thứ hai về quá trình feammox trong mô hình phòng thí nghiệm là

của nhóm tác giả Huang và cs (Đại hoc Princeton) công bố năm 2015 (Hình 1.11).Tương tự như nghiên cứu của Sawayama, feammox trong mô hình này được thiết

31

lập ở điều kiện tự đưỡng (không có carbon hữu cơ) nhưng khác là pH thấp (pH 5,5)va sử dung ferrihydrite là chất nhận điện tử Sản phâm của quá trình oxy hóa NH,*

cũng là NO, như trong nghiên cứu của Sawayama (2006), hiệu quả loại bỏ NH,* ở

mức thấp 9,8% trong thời gian 6 ngày, và 64,5% trong thời gian 150 ngày [Huang,

Jaffé, 2015] Sử dụng phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA các tác giả đã phát

hiện một số VSV mới, có tỷ lệ tương đồng về trình tự 16S rDNA ở mức thấp (90 —

92%) so với các loài đã biết Ferrimicrobium acidiphilum và Acidimicrobium

ferrooxidans [Huang, Jaffé, 2015].

pH thấp trong nghiên cứu của Huang và cs (2015)

Cũng từ nghiên cứu này, vi khuẩn feammox đầu tiên và duy nhất cho đếnnay được công bồ là chủng vi khuẩn Acidimicrobiaceae A6 (Hình 1.6A, B) Có độtương đồng rất thấp về trình từ 16S rDNA so với các loài đã công bố (< 92%),

chủng vi khuẩn Acidimicrobiaceae A6 được đề xuất là một nhánh phân loại mới.

Nhóm tác giả này cũng đề xuất giải pháp loại bỏ NH," trong nước thải theo nguyênlý feammox ở điều kiện pH 4, không có carbon hữu cơ [Huang, Jaffé, 2015; Huang,Jaffé, 2018] Quy trình này mới chỉ chuyển hóa NH," thành NO;ˆ, do vậy cần kết

hợp với một số bước tiếp sau như nitrate hóa (NO, — NO; ) và khử nitrate (NO3—

—>N›) dé loại bỏ hoàn toàn NH,* khỏi nước thải [Jaffé, Huang, 2019].

32

Nghiên cứu ứng dụng quá trình feammox dé xử lý nước thải đã được quantâm gần đây Wang và cs (2021) đã thử nghiệm quá trình feammox đối với nước rỉrác và cho thấy quá trình feammox có thê diễn ra hiệu quả trong điều kiện pH trongkhoảng 4,3 — 6,1 [Yang et al., 2012; Zhou et al., 2016; Wang et al., 2021] Một sốchi vi khuẩn khử sắt IRB) như Geobacter, Anaeromyxobacter, Desulfosporosinus,Dechloromonas, Geothrix đã được xác định trong các quần xã VSV feammox

[Yang et ai, 2012; Zhou et al., 2016; Bao, Li, 2017] Ngoài Fe**,

9,10-anthraquinone-2,6-disulfonate (AQDS) cũng là chất nhận điện tử dành cho VSVfeammox Trong nghiên cứu của Yang và cs (2019) quá trình feammox ở điều kiện

pH 4,5 với Fe;O; và AQDS loại bỏ được 82,6% NH,", trong khi đó với một mình

FeO; thì hiệu quả loại NH," là 64,3%, mẫu đối chứng không có mặt cả 2 hợp chất

trên thì hiệu quả loại bỏ NH¿ là 46,0% [Yang et al., 2019] Điện cực và AQDS

cũng được chứng minh là có tác dụng hỗ trợ quá trình feammox ở chủng vi khuẩnAcidimicrobiaceae A6, chủng này sinh trưởng bám dính trên bề mặt điện cực dương

và thực hiện quá trình oxy hóa NH,” [Ruiz-Urigiien er al., 2019] Nghiên cứu cũng

chi ra khả năng có thé dùng điện cực dé thay thé cho Fe** trong quá trình feammoxxử lý nước thải thực tế.

Như vậy, quá trình feammox được thực hiện trong điều kiện ky khí hoàntoàn, do vậy giảm tiêu tốn năng lượng để cấp oxy cho bước nitrate hóa như ở các

quy trình công nghệ trước đây Tuy nhiên, quá trình do Sawayama (2006) hay

Huang và Jaffe (2015) và một số nghiên cứu mới đây đề xuất diễn ra ở điều kiện tựdưỡng và pH thấp, sản pham chuyền hóa NH," là NO; nên việc áp dụng trong thực

tê sẽ bị hạn chê do một sô nguyên nhân sau:

- _ Thứ nhất, carbon hữu co trong nước thải cần được xử lý hoàn toàn trước khi

chuyền sang quy trình loại bỏ NH¿ bang feammox dé giảm thiểu sự cạnh

tranh của các loài dị dưỡng, cũng như đáp ứng tính mẫn cảm của quá trình

này đối với carbon hữu cơ.

- Thứ hai, NH,* được oxy hóa thành NO;”, do đó sẽ cần được (i) tiếp tụcoxy hóa thành NO; (tiêu tốn oxy) và sau đó khử thành N; (cần bố sung

33

carbon hữu co làm nguồn điện tử) hoặc (ii) chuyên hóa trực tiếp thành N>nhờ các vi khuẩn anammox Cả hai quá trình do Sawayama (2006) hayHuang và Jaffe (2015) đều có những yếu điểm cần được khắc phục như đã

phân tích ở trên.

- Thứ ba, các nghiên cứu thử nghiệm quá trình feammox mới áp dụng với

nước thải có hàm lượng NH,* thấp, cần thời gian lưu dài nhưng hiệu quả xửly không cao, kém khả thi trong điều kiện thực tế.

Trong thực tế, nước thải có hàm lượng NH," cao và pH trung tính là phổ biến

(điển hình là nước thải sau biogas) Bên cạnh đó, carbon hữu cơ trong nhiều trườnghợp cũng không được loại bỏ hoàn toàn, sẽ đồng thời có mặt trong nước thải cùngvới NH,* Việc kết hợp quá trình loại bỏ NH,* và COD theo nguyên lý feammox ở

pH trung tính sẽ phù hợp với đặc tính hóa học của nhiều loại nước thải trong thựctế, tạo ra một bước cải tiến công nghệ quan trọng, giúp khắc phục những hạn chế

của các công nghệ loại bỏ NH," hiện nay như nitrate hóa — khử nitrate hay nitrite

hóa — anammox, cho phép (i) tiết kiệm năng lượng (do không cần cấp oxy cho

VSV), (ii) đơn giản hóa quá trình vận hành (quá trình do một nhóm vi khuẩn duy

nhất đảm nhiệm).

34

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 DOI TƯỢNG VA VAT LIEU NGHIÊN CỨU2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng mẫu bùn được lấy từ cụm xử lý ky khí NH,* trong hệthống xử lý nước thải tập trung của nhà máy chế biến thủy sản (xã Tam Tân, huyện

Củ Chi, TP Hồ Chí Minh) Cụm xử lý gồm 3 bé ky khí, mỗi bé có kích thước 0,75mx 1,0 m x 2m, với thé tích làm việc mỗi bề khoảng 1,125 mỶ (0,75 m x 1 mx 1,5

m) (Hình 2.1 và Hình Phụ lục 1) Lớp bùn đỏ được duy trì khoảng 10 — 20 cm dưới

đáy các bể, là nguồn cung cấp Fe** cho vi khuẩn Thành phan sắt trong bùn đỏ ởdạng Goethite (FeOOH) va Hematite (Fe.03, 45%), nong độ Fe7 tổng sỐ trong hệ

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống xử lý nước thải chế biến thủy sản tại Củ Chi

Mẫu bùn đỏ thu từ các bé trong cụm xử lý ky khí, bảo quản trong hộp nhựa

sạch và vận chuyển về phòng thí nghiệm để sử dụng làm nguồn VSV ban đầu đểlàm giàu vi khuân feammox trong mô hình.

35

2.1.2 Hóa chất, thiết bị

Hóa chất: Hóa chất dé pha môi trường nuôi VSV do hãng Merck (Đức),

Wako (Nhật Bản), BioBasic (Canada) cung cấp; hóa chất cho các thí nghiệm phân

tích và sinh học phân tử do hãng Sigma Aldrich (Mỹ), Prolabo (Pháp), Fermentas

(Đức), Bioneer (Hàn Quốc) cung cấp; các loại khí sử dung (N2, Nz/CO;, Heli, H›,CO;, Argon) có độ tinh sạch cao dùng dé tạo môi trường ky khí và vận hành thiết bị

sắc ký khí do hãng Messer (Việt Nam) cung cấp.

Thiết bị: nghiên cứu được thực hiện bằng các trang thiết bị tại các phòng thínghiệm của Viện VSV và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Trong đó

chủ yếu là tại Phòng thí nghiệm Sinh thái VSV ứng dụng, Phòng thí nghiệm Nghiêncứu và Phát triển công nghệ cao, Phòng thí nghiệm Enzyme và Protein Các thiết bị

chính sẽ được sử dụng gồm có:

- Thiết bi đo quang phổ Beckman Coulter, Mỹ- Thiết bị ly tâm lạnh dé ban Eppendorf, Đức

- Thiết bị khử trùng khô Memmert, Đức

- Thiết bị khử trùng ướt Hyrayama, Nhật Bản

- Kính hién vi phản pha và huỳnh quang Zeiss, Đức

- Thiết bi DGGE DcodeTM Universal Mutation Detection Bio-Rad, Mỹ

- PCR-Thermocycler Eppendorf, Duc

- Thiết bi phân tích sắc ký khí Agilent 789A, My- Bê ôn nhiệt Jieo Tech, Hàn Quốc

- Máy đo pH dé ban Horiba, Nhật Ban

- May dién di ngang Nyx Technik, MyCác loại dung dich và môi trường

2.1.2.1 Ferrihydrite

Ferrihydrite 1a nguồn Fe** sử dụng trong mô hình feammox và các thí

nghiệm liên quan, được chuẩn bị như sau [Ratering, 1999]:

- Pha 1 lít FeCl; 0,25M vào cốc đong thủy tinh (thé tích 5 lít) có khuấy từ và

đặt vào vi trí đo pH.

36