Science & Technology Development, Vol 14, No.T6- 2011 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO CHITOSAN LÀM CHẤT HẤP PHỤ PROTEIN ỨNG DỤNG TRONG DẪN TRUYỀN THUỐC Dương Thị Ánh Tuyết, Võ Quốc Khương, Phan Huê Phương, Nguyễn Thị Phương Phong Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðHQG-HCM (Bài nhận ngày 24 tháng 01 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 28 tháng 03 năm 2011) TÓM TẮT: Trong báo này, hạt nano chitosan (CS)-tripolyphosphate (TPP) ñã ñược nghiên cứu chế tạo làm chất hấp phụ protein ứng dụng dẫn truyền thuốc Các yếu tố ảnh hưởng ñến kích thước hạt như: tác chất tạo nối ngang, tỷ lệ CS/TPP, pH ñã ñược khảo sát ðặc tính hóa lý hạt nano đánh giá thơng qua kỹ thuật phân tích hóa lý khác như: FT-IR, XRD, FE-SEM TEM Hiệu suất khả hấp phụ protein nano chitosan chế tạo ñược cao (96,41 % 1,93 mg/mg) 0,5 mg hạt nano chitosan Từ khóa: Chitosan, Bovine serum albumin (BSA), Hạt nano MỞ ðẦU nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học Ngồi ra, chitosan cịn có khả bám lên bề Ngày nay, với phát triển lĩnh vực y tế chăm sóc sức khoẻ người, nhiều cơng nghệ sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu ứng dụng công nghệ nano vào trình tổng hợp chất dẫn thuốc Nhiều loại peptide protein ñược ứng dụng làm thuốc khả chọn lọc cao điều trị hiệu Dẫn truyền thành công thuốc protein chủ ñề nghiên cứu nhiều năm ngành dược Chitosan ñược sử dụng làm nguyên liệu mặt niêm mạc xâm nhập vào tế bào biểu mơ Do đó, hạt nano chitosan trở thành hệ thống phân phối thuốc có tiềm lớn [1] Với nguồn nguyên liệu chitin phong phú Việt Nam, thực nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan ðồng thời khảo sát khả hấp phụ protein hạt nano chitosan ứng dụng dẫn truyền thuốc Các kết ñược ñánh giá nhiều phương pháp phân tích hóa lý khác FT-IR, XRD, FESEM TEM ñiều chế hạt nano chitosan năm gần tính chất ưu việt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP kích thước nano Chitosan dạng deacetyl hóa Hóa chất từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, tìm thấy lồi động vật giáp xác, côn trùng vài loại nấm Với nhiều tính tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng khơng độc hại, trở thành Trang 54 Chitosan (DD 75 %) Sigma-Aldrich; Sodium Tripolyphosphate (TPP) (Na5P3O1), Trung Quốc; Glutaraldehyde, Merck; NaOH 96 %, Trung Quốc; CH3COOH, 99,5 %, Trung TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 14, SỐ T6 - 2011 Quốc; Nước khử ion, Merck; Protein Bovine Serum Albumin (BSA); Thuốc thử Bradford Cho ml dung dịch huyền phù nano chitosan có nồng độ 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2,0 mg/ml trộn Thiết bị với ml dung dịch protein BSA nồng ñộ Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series; Máy đơng TELSTAR LYOQUEST, Tây Ban Nha; Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRI- FUGEN, ðức; Máy lắc HEIDOLPH PROMAX 1020, ðức; Máy quang phổ UV-Vis-NIRV670, JACCO, Nhật; Máy FE-SEM JSM 7401F, Nhật; Máy TEM JEM-1400, Nhật Máy nhiễu xạ tia X BRUKER mg/ml, lắc với tốc ñộ 250 vịng/phút nhiệt độ phịng, thời gian 60 phút Sau tiến hành ly tâm hỗn hợp 17000 vòng/phút 4oC, 30 phút Lấy phần dịch xác ñịnh lượng protein lại theo phương pháp Bradford [2] Hiệu suất hấp phụ (loading efficiency-LE) khả hấp phụ (loading capacity-LC) hạt nano tính tốn theo công thức sau: XRD-D8 LE (%) = [(Tổng lượng protein – lượng ADVANCE, ðức; Máy ño phổ IR BRUKER EQUINOX 55, ðức protein dịch nổi)/ tổng lượng protein] x 100 Phương pháp Tổng hợp nano chitosan Dung dịch chitosan nồng ñộ 0,5 % (w/v) ñược pha acid acetic % (v/v) Sau hịa tan, điều chỉnh pH dung dịch chitosan dung dịch NaOH 5N TPP (hoặc glutaraldehyde) nồng ñộ 0,25 % (w/v) ñược pha nước khử ion Nhỏ từ từ TPP (glutaraldehyde) vào dung dịch chitosan ñiều kiện khuấy từ tốc ñộ 1500 vịng/phút nhiệt độ phịng Dung dịch sau phản LC (mg/mg) = [(Tổng lượng protein – lượng protein dịch nổi)/ khối lượng hạt nano chitosan] Xác định đặc tính hóa lý hạt nano chitosan ðặc tính hóa lý hạt đánh giá thơng qua ảnh TEM, giản ñồ XRD (BRUKER XRD-D8 ADVANCE), phổ FT-IR (BRUKER EQUINOX 55) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ứng ñược ly tâm với tốc độ 17000 vịng/phút 30 phút thu hạt nano chitosan Rửa hạt nano, lặp lại nhiều lần với nước khử ion Khảo sát quy trình chế tạo hạt nano chitosan đơng khơ máy đơng nhiệt độ -80oC, Khảo sát ảnh hưởng phương pháp áp suất 0,001 mBar 72 Mẫu ñược ñiều chế khác bảo quản 5oC tủ lạnh Kích cỡ hạt nano đánh giá thông qua ảnh FE-SEM Khảo sát khả hấp phụ protein Kết khảo sát ảnh hưởng phương pháp ñiều chế khác nhau, phương pháp tạo nối ngang, sử dụng tác chất glutaraldehyde Trang 55 Science & Technology Development, Vol 14, No.T6- 2011 phương pháp gel ion, sử dụng tác chất TPP trình bày Bảng Bảng ðặc ñiểm hạt nano chitosan ñiều chế từ phương pháp khác STT Phân bố kích thước Kích thước trung bình (nm) (nm) Phương pháp Phương pháp tạo nối ngang 149,03-561,63 281,62 Phương pháp tạo gel ion 36,08-94,90 68,89 (1.a) (1.b) (1.c) Hình Ảnh FE-SEM chitosan nano chitosan trước sau ñiều chế: (1.a) Chitosan; (1.b) Phương pháp tạo nối ngang; (1.c) Phương pháp tạo gel ion Hình 1.a cho thấy hình dạng nguyên liệu Trong phần này, ảnh hưởng tỷ lệ chitosan ban ñầu lớp polymer với kích CS/TPP khảo sát nhằm tìm tỷ lệ thích thước lớn Phương pháp tạo nối ngang với tác hợp ñể tạo hạt nano chitosan Các tỷ lệ chất glutaraldehyde, hạt nano chitosan thu ñược CS/TPP ñược khảo sát 3:1, 4:1, 5:1, có kích thước từ 149,03 nm-561,63 nm (kích 6:1, 7:1 thước trung bình 281,62nm, Bảng 1, Hình Kết từ Hình cho thấy, tăng tỷ lệ 1.b) Phương pháp tạo gel ion với tác chất TPP, CS/TPP từ 3:1 ñến 6:1, kích thước hạt giảm kích thước hạt nhỏ ñều hơn, phân bố từ dần Tuy nhiên, tỷ lệ CS/TPP tăng từ 6:1 36,08 nm-94,90 nm (kích thước trung bình đến 7:1, kích thước hạt tăng nhẹ trở lại Ở tỷ lệ 68,89nm, Bảng 1, Hình 1.c) Kích thước hạt CS/TPP 6:1, hạt thu có dạng hình cầu nhỏ phân bố đồng có tiềm kích thước hạt nhỏ lớn hấp phụ protein, thuốc… Phương pháp tạo gel ion với tác chất tạo nối TPP phương pháp ñơn giản, rẻ tiền, hiệu cao khơng độc hại nên lựa chọn cho nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ CS/TPP Trang 56 Khảo sát ảnh hưởng pH Chọn tỷ lệ CS/TPP 6:1 ñể khảo sát pH Các giá trị pH ñược khảo sát 4,0; 4,5; 5,0 5,5 Kết từ hình cho thấy, tăng pH từ 4,0 đến 5,5, kích thước hạt tăng dần Kích TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 14, SOÁ T6 - 2011 thước hạt nhỏ (48,70 nm) thu điều khơng có thay đổi lớn khoảng pH từ kiện pH 4,0, tỷ lệ CS/TPP 6:1 Có thể thấy 4,5 đến 5,0 Tuy nhiên, kích thước hạt tăng pH ảnh hưởng đến kích thước hạt nhanh đột ngột khoảng pH từ 5,0 ñến 5,5 khoảng từ 4,0 ñến 5,0 Kích thước hạt tăng nhẹ cho thấy pH cao khơng thích hợp cho hình pH tăng từ 4,0 đến 4,5 Kích thước hạt thành hạt có kích thước nhỏ Kích thước hạt (nm ) 250 200 150 100 50 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 Tỉ lệ CS/TPP 180 160 Kích thước (nm) 140 120 100 80 60 40 20 3.5 4.5 5.5 pH Hình Ảnh hưởng tỷ lệ CS/TPP đến kích thước hạt Hình Ảnh hưởng pH đến kích thước hạt Khảo sát khả hấp phụ protein hạt lượt 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; mg/ml; 1,5 nano chitosan mg/ml mg/ml hấp phụ với ml dung dịch protein BSA nồng ñộ mg/ml, lắc 250 Trong phần này, chúng tơi cho ml dung vịng/phút nhiệt độ phịng thời gian 60 dịch huyền phù nano chitosan có nồng ñộ lần phút Bảng Số liệu khảo sát hiệu suất hấp phụ khả hấp phụ protein Nồng ñộ nano chitosan Hiệu suất hấp phụ Khả hấp phụ (mg/ml) (%) (mg/mg) Trang 57 Science & Technology Development, Vol 14, No.T6- 2011 0,25 62,14 2,49 0,5 96,41 1,93 1,0 70,00 0,70 1,5 57,45 0,38 2,0 56,14 0,28 Bảng cho thấy nồng ñộ hạt nano Thứ hai, điều kiện thí nghiệm có tốc chitosan tăng từ 0,25 mg/ml đến 0,5 mg/ml độ lắc mạnh, nồng ñộ hạt thấp, số lần va hiệu suất hấp phụ tăng từ 62,14 % ñến 96,41 chạm hạt thấp Khi nồng ñộ hạt % Khi nồng ñộ hạt nano chitosan tăng từ 0,5 tăng, số va chạm có hiệu hạt mg/ml ñến 2,0 mg/ml, hiệu suất hấp phụ lại tăng Kết hạt dính kết lại với giảm từ 96,41 % xuống 56,14 % ðiều có tạo thành tập hợp lớn làm diện tích bề mặt lẽ hai nguyên nhân sau: hạt giảm dẫn ñến hiệu suất hấp phụ protein Thứ nhất, nồng ñộ hạt thấp, ảnh giảm hưởng ñộ nhớt dung dịch khơng đáng kể Khảo sát đặc tính hóa lý hạt nano nên protein dễ dàng hấp phụ lên bề mặt hạt, chitosan dẫn ñến hiệu suất hấp phụ protein tăng tăng nồng ñộ hạt Ở nồng ñộ hạt cao, ñộ nhớt dung dịch tăng lên ñáng kể cản trở hấp phụ protein lên bề mặt hạt, dẫn ñến hiệu suất hấp phụ protein giảm tiếp tục tăng nồng ñộ Khảo sát ảnh chụp TEM Hạt nano chitosan ñiều chế tỷ lệ CS/TPP 6:1, pH 4,0 ñược sử dụng ñể khảo sát kích thước ñộ phân bố kích thước hạt hạt nano chitosan Mật ñộ (%) 30 40 50 60 70 80 90 Kích thước (nm) Hình Ảnh TEM phân bố kích thước hạt nano chitosan ñiều chế pH=4,0; tỉ lệ chitosan/TPP 6:1 Trang 58 100 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 14, SỐ T6 - 2011 Hình cho thấy hạt có dạng hình cầu, ứng dụng nano chitosan, đặc biệt kích thước nhỏ, đồng phân bố ứng dụng hấp phụ thuốc bề mặt riêng lẽ, kích thước hạt trung bình 54,01 nm cầu có nhiều phương tiếp xúc với thuốc khoảng phân bố kích thước hạt 31,65 nm- Kích thước hạt nhỏ đồng thích hợp cho 91,28 nm ðặc biệt, hầu hết hạt có kích q trình dẫn truyền thuốc qua niêm mạc thước từ 50 nm-60 nm Dạng hình cầu đảm bảo thuốc phóng thích với tốc ñộ hạt nano chitosan dạng có hiệu thể Khảo sát giản ñồ nhiễu xạ tia X (XRD) Hình Giản đồ XRD chitosan nano chitosan Mức ñộ tinh thể nguyên liệu chitosan thể cao chitosan nguyên liệu Tuy nhiên, ban đầu hạt nano chitosan đánh giá khơng có mũi tìm thấy giản đồ thơng qua giản ñồ nhiễu xạ tia X chúng nhiễu xạ hạt nano chitosan sau ñiều Giản ñồ nhiễu xạ ñược ño khoảng 2θ từ chế ðiều cho thấy cấu trúc tinh thể o o ñến 70 chitosan ñã bị phá hủy sau tạo nối ngang Giản ñồ nhiễu xạ tia X chitosan có hai với TPP [3] [4] Sự phá huỷ cấu trúc polymer mũi mạnh 2θ 10,5o 20,0o, phù hợp với ñã cho thấy khả hấp phụ protein giản ñồ nhiễu xạ chitosan cơng bố hạt nano chitosan trình bày tài liệu trước, cho thấy mức ñộ tinh Khảo sát phổ hồng ngoại FT-IR Trang 59 Science & Technology Development, Vol 14, No.T6- 2011 Khảo sát phổ FT-IR chitosan, nano có dịch chuyển mũi từ 3423 cm-1 sang 3397 chitosan nhằm xác ñịnh cấu trúc hóa học cm-1 Mũi 1651 cm-1 biến hai mũi hạt nano ðối với phổ chitosan, mũi phổ xuất 1645 cm-1 1541 cm-1 liên 3423 cm-1 tương ứng với dao ñộng nhóm kết nhóm ammonium phosphoric [3] -1 NH2 OH chitosan Mũi 1651 cm Do vậy, kết luận nhóm ammonium tương ứng với dao động nhóm CONH2 chitosan tạo nối ngang với TPP sản -1 Mũi 1076 cm tương ứng với dao ñộng phẩm nano chitosan nhóm C-O-C ðối với phổ nano chitosan, Hình Phổ FT-IR chitosan (ñường dưới) nano chitosan (ñường trên) KẾT LUẬN tính hóa lý hạt đánh giá nhiều phương pháp phân tích khác TEM, Chúng tơi chế tạo thành cơng hạt nano chitosan có dạng hình cầu, kích thước nhỏ đồng ñều qua ảnh chụp FESEM, TEM Hiệu suất hấp phụ protein cao 96,41 % ðặc Trang 60 XRD FT-IR khẳng ñịnh chitosan ñã tạo nối ngang với TPP hình thành kích thước nano cấu trúc tinh thể ban ñầu chitosan bị phá hủy sau tạo nối TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 14, SỐ T6 - 2011 STUDY ON PREPARATION OF CHITOSAN NANOPARTICLE AS PROTEIN DELIVERY CARRIER FOR DRUG DELIVERY APPLICATION Duong Thi Anh Tuyet, Vo Quoc Khuong, Phan Hue Phuong, Nguyen Thi Phuong Phong University of Science, VNU-HCM ABSTRACT: This work investigates the polyanion initiated gelation process in fabricating chitosan (CS)-tripolyphosphate (TPP) nanoparticle intended to be used as protein delivery carrier Variations in cross-linking agents, CS/TPP weight ratio and solution pH were investigated The chitosan nanoparticles were characterized by several analytical techniques such as FT-IR, XRD, FE_SEM and TEM Finally, protein loading efficiency (LE) and protein loading capacity (LC) were investigated Key words: Chitosan, Bovine serum albumin (BSA), Nanoparticles loading and release, Colloids and TÀI LIỆU THAM KHẢO Surfaces B: Biointerfaces, 59, 24-34 [1] H Zhang, S Wu, Y Tao, L Zang, Z Su, Preparation and characterization (2007) [3] L Qui, Z Xu, X Jiang, C Hu and X nano- Zou, Preparation and activity of particles as protein delivery system, chitosan nanoparticles, Carbohydrate Journal of Nanometerials, 1-5 (2010) Research, 339, 2693-2700 (2004) of [2] Q water-soluble Gan, nanoparticle T as chitosan Wang, protein Chitosan delivery [4] L Qui, Z Xu, Lead sorption from aqueous solutions on chitosan of nanoparticles, Colloids and Surfaces fabrication conditons for efficient A: Physicochem Eng Aspects, 251, carrier-Systematic examination 183-190 (2004) Trang 61