Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây hồ tiêu piper nigrum l nhằm tạo chế phẩm sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ TS HỒ TUYÊN Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Bùi Thị Việt Hà TS Hồ Tuyên Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí Khoa học, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội ngày 31 tháng năm 2020 Tác giả luận án Chu Thanh Bình LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, lời xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, TS Hồ Tun, Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ tơi tích cực nghiên cứu tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới tập thể cán Phòng Genomic, đặc biệt TS Trần Văn Tuấn, Trưởng mơn Vi sinh vật học, Trưởng phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu suốt thời gian nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện cho hồn thành kết nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Phương Nhuệ, TS Đỗ Thị Tun phịng Cơng nghệ lên men, Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ thực luận án Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Tôi mong muốn gửi lời cảm ơn đến Ban Tổng giám đốc, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga, Bộ Quốc phòng tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình, bạn bè ln bên, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2020 Tác giả luận án Chu Thanh Bình DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA fluoroorotic acid ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated tranformation (chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) APS Ammonium Persulphate AS Acetosyringone BCAs Các tác nhân kiểm soát sinh học (Biocontrol Agents) Bp Base pair CD Czapeck Dox CMA Corn Meat Agar CYA Czapeck Yeast Autolysate DNA Deoxyribonucleic acid DNS 3, 5-Dinitrosalicylic acid DsRed Red fluorecent protein ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GFP Green fluorecent protein HLCP Hiệu lực chế phẩm HLD Hiệu lực diệt HQPH Hiệu phục hồi IM Induction medium (môi trường cảm ứng) ITS Internal Transcribed Spacer KPH Không phát LB Luria-Bertani MH Mơ hình MM Minimal medium (môi trường tối thiểu) ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PPN Plant-parasitic nematodes P lilaciuns Paecilomyces lilacinus PCR Polymerase chain reaction PDB Potato Dextrose Broth PDA Potato Dextrose Agar SDS Sodium Dodecyl Sulfate TCA Tricloacetic acid UV Ultra violet TLC Tỷ lệ chết VOC Hợp chất hữu dễ bay WT Wild type (chủng tự nhiên) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại nấm diệt tuyến trùng 10 Bảng 1.2 Các chế phẩm sinh học thương mại phòng trừ bệnh tuyến trùng 31 Bảng 2.1 Thành phần gel cô gel tách 43 Bảng 2.2 Thiết kế biến ma trận Plackett-Burman 52 Bảng 2.3 Đánh giá cấp độ biểu bệnh 57 Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mơ hình nhà lưới 59 Bảng 2.5 Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mơ hình đồng ruộng 60 Bảng 3.1 Khảo sát khả diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp 67 Bảng 3.2 Kết tinh chitinase từ chủng P lilacinus P1 72 Bảng 3.3 Kết phân tích hồi quy hoạt độ chitinase 81 Bảng 3.4 Đánh giá tính thực tế mơ hình 83 Bảng 3.5 Vị trí sai khác trình tự nucleotide amino axit 89 Bảng 3.6 Khả sống sót chủng P1 dịch bảo quản 101 Bảng 3.7 Khả sống sót chủng P1 chế phẩm theo thời gian 103 Bảng 3.8 Mật độ tuyến trùng sống (MĐTT) Hiệu lực diệt (HLD) tuyến 104 trùng sau xử lý Chế phẩm sinh học chậu trồng nhà lưới Bảng 3.9 Tỷ lệ không phục hồi suất mơ hình thử nghiệm 106 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hồ tiêu bị bệnh vàng chết chậm Hình 1.2 Sự tương tác tuyến trùng, nấm vi khuẩn Hình 1.3 Hình thái bẫy tạo nấm bẫy tuyến trùng 13 Hình 1.4 Vịng đời nấm sợi Esteya vermicola 14 Hình 1.5 Sự biến đổi hình thái A oligospora CMA PDA 24 Hình 1.6 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua A tumefaciens 26 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1 Hình thái, cấu trúc sinh bào tử chủng nấm sợi 61 Hình 3.2 Hoạt độ chitinase protease NV01, NV20 P1 71 Hình 3.3 Ảnh hưởng yếu tố đến khả sinh tổng hợp chitinase 75 Hình 3.4 Ảnh hưởng nguồn bon đến khả sinh chitinase 77 Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn ni tơ đến khả sinh chitinase 78 Hình 3.6 Ảnh hưởng muối khống đến khả sinh chitinase 79 Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hưởng đến sinh chitinase 80 chủng P lilacinus P1 Hình 3.8 Khả mẫn cảm với kháng sinh 5-FOA chủng P1 85 Hình 3.9 Kết chọn lọc thể đột biến phương pháp chiếu UV 87 Hình 3.10 Nhân dòng đoạn gen ORFpyrG chủng P1 thể đột biến 424 89 Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc chủng P1 424pyrG(-) nồng độ 90 uracil/uridine khác Hình 3.12 Điều kiện lựa chọn tối ưu cho trình chuyển gen 92 Hình 3.13 Quy trình chuyển gen phương pháp ATMT thể đột biến 94 424pyrG(-) sử dụng vectơ nhị thể pEX2A với marker pyrG Hình 3.14 Xác nhận thể chuyển gen biểu huỳnh quang đỏ DsRed 95 Hình 3.15 Hoạt tính chitinase protease thể chuyển gen 98 Hình 3.16 Tỷ lệ chết tuyến trùng 99 Hình 3.17 Các yếu tổ ảnh hưởng thu hồi sinh khối ướt P lilacinus P1 100 Hình 3.18 Sơ đồ sản xuất dịch thể chế phẩm sinh học 102 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp TRÊN CÂY HỒ TIÊU 1.1.1 Bệnh gây tuyến trùng Meloidogyne .4 1.1.2 Phân bố tuyến trùng Meloidogyne Tây Nguyên 1.1.3 Đặc điểm chế gây bệnh tuyến trùng Meloidogyne sp .5 Đặc điểm tuyến trùng Meloidogyne sp .5 Cơ chế gây bệnh tuyến trùng Meloidogyne sp 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG 1.2.1 Vai trò nấm diệt tuyến trùng kiểm soát sinh học 1.2.2 Phân loại nấm diệt tuyến trùng 10 1.2.2.1 Nấm bẫy tuyến trùng .12 1.2.2.3 Nấm ký sinh trứng tuyến trùng 15 Giới thiệu Paecilomyces sp .16 Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng 16 Protease từ nấm diệt tuyến trùng 20 1.2.2.4 Nấm sinh độc tố .20 1.2.3 Các giai đoạn diệt tuyến trùng nấm 21 1.3 CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG 24 1.3.1 Các phương pháp chuyển gen 24 1.3.2 Một số gen thị dùng cho chuyển gen nấm 26 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng trình chuyển gen 27 1.3.4 Một số nghiên cứu cải biến di truyền nấm diệt tuyến trùng .28 1.4 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 31 1.4.1 Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne 31 1.4.2 Tình hình phịng trừ bệnh tuyến trùng hồ tiêu Việt Nam 34 Chương 37 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 2.1 VẬT LIỆU 37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Hóa chất 38 2.1.3 Thiết bị 38 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Phương pháp phân lập quan sát hình thái 39 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu enzym/protein 41 2.2.3 Phương pháp điện di Gel polyacrylamid (SDS-PAGE) 43 2.2.4 Tách chiết DNA hệ gen phản ứng PCR 44 2.2.5 Phản ứng nối ghép gen 45 2.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli DH5α 46 2.2.7 Tách DNA plasmid 46 2.2.8 Đánh giá khả mẫn cảm với kháng sinh – FOA chủng P lilacinus P1 46 2.2.9 Phương pháp thu bào tử hệ sợi nấm P lilacinus P1 47 2.2.10 Phương pháp tạo chủng đột biến gen pyrG UV sử dụng môi trường chọn lọc 5-fluoroorotic axit (5-FOA) từ chủng P lilacinus P1 47 2.2.11 Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium tumefaciens 48 2.2.11.1 Biến nạp vector pEX2A vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 48 2.2.11.2 Tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen thể đột biến 424pyrG(-) 49 2.2.11.3 Xác nhận biểu gen DsRed thể chuyển gen .50 2.2.11.4 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase protease ngoại bào, khả diệt tuyến trùng thể chuyển gen .51 2.2.12 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp chitinase P lilacinus P1 51 2.2.12.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 51 2.2.12.2 Sàng lọc yếu tố ma trận Plakett – Burman 52 2.2.12.3 Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) 52 CHY2 Chitin : 0.75%; glucose (2.12%), pepton (0.55%), K2HPO4 (0.09%), Ca2+/Mg2+ (3:4; g/g) CHY3 Chitin : 0.75%; glucose (1.93%), pepton (0.33%), K2HPO4 (0.1%), Ca2+/Mg2+ (3: 4; g/g) CHY4 Chitin : 0.75%; glucose (1.87%), pepton (0.58%) K2HPO4 (0.08%), Ca2+/Mg2+ (3: 4; g/g) CHY5 Chitin : 0.75%; glucose (2.41%), pepton (0.6%), K2HPO4 (0.09%), Ca2+/Mg2+ (4:5; g/g) Cám gạo Giống lúa IR50404 sử dụng để xay xát tạo thành cám, gạo, vỏ trấu Cấu trúc vector PEX2A AGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCT TCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGG CGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTAC GCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGAC TTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACC GGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTG ACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATC CAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGC CGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACC CGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCG GCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCA CTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACC GAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCC GAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCA TTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCT CAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCA GCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCT TGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCAT GAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGC CCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCG CGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGA CCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGA CTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGA CATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCT ACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGC GCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCAC TGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGC GCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGC 136 ACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTG GCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAG ATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCA GAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAA TCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGG CGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGC GTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGA AGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGT GGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGA TTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCA CCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTG GCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGG CCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGAT ACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGT TCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACA CCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGG GTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGA TCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTC ACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCG CAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGT TCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGA AGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAG CATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTC GAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGA ACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAA AAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCC TGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGT CGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGG CTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGC GCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAG CTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCG TCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTAT ACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATAC CGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGC TGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCA CAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCA AGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTC TTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA GGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTT GATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCAGGATCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT CAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTG 137 TAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGAT TCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGA Kanamycin GAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGAC TTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCAT TCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAAT CGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTC TTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGT ACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC ATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTT CCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATA TAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCT CATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATCTGGATCACAG GCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAAC CCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAA CGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGA GCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGC TTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGCTCTAGC CAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTC CCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCC AGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACA CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCACTGCTATGCGACCGTAGAGCAGTGCAAGACCAAC GTAAGCCAACCTCACACAAACAGGATTCCTCGAGCTAACATACATTCCGAACCGTGCAGCCCAAGG CCGAGCAGTTCAACTGCGCTCAGCGCGCTCATGCCAACTTCCTTGAGAACTCCAGCCAAACTATGC TCTTCCTCCTGGTAGCTGGACTGAAGTACCCCCAGTTGGCGACTGGCCTCGGAAGCATCTGGGTCC TCGGTCGCTCACTGTTCCTTTACGGATATGTGTACTCCGGCAAGCCGCGGGGTCGCGGTCGTTTGT ACGGCAGCTTCTACTTGCTTGCACAGGGAGCTCTCTGGGGCTTGACGTCTTTTGGAGTTGCGAGGG AGTTGATTTCCTACTTCTAAGTTTGGACTGAATCCGTGGTGTGATTGAGGTGATTGGCGATGTTTG GCTATACCAGCTATATGTAATAATCTCTACTGTATACTACTATTCAACGCATTTTACTATGCGTGC TGCTAGGGTCGGCAATGACAATGGCAATCTGACTGACGTGGTCTATTTCTCCATGTGCAGCAGGGA ATACGAGCTCCAATGGACCTCGGGAGTGGCACAGTCAATGGCAAGGAAACTCCGCCTTTGCAGGTG TGGCTGAACCCCACGGGTCGGAGGCGGAGCAATCCACCCCCGATGTGGCTGGTGCGTGGAGGGGCT CGCGATGATTTTACTGAGCTTGCTTTTCTTGTCGACATTGAACATTGTCCTTGGTCTTCCTTCAGA TTTAAGGGTCAGTCACTGCTACATTTTTCAGTAGTATCCGCGCACGTCTCTGGATTTACGAATCAG GGTCCACCAGTCGAAACTTCGAACTACTCTCATTATACAATCCTCTTTCCATTCCCGCATTAACCC CTCCATCAACACCATGTCCTCCAAGTCGCGATTGACCTACACTGCCCGTGCCAGCAAGCATCCCAA TGCTCTGGCGAAGAGGCTGTTCGAGATTGCCGAGGCCAAGAAGACCAATGTGACTGTCTCGGCTGA CGTTACCACCACTAAGGAGCTACTAGATCTTGCTGACCGTAGGCCGACCCGCTACTCTGCCTGATT ATGCTGCATGCAAACTTATTAACGGTGATACCGGACTGCAGGTCTCGGTCCCTACATTGCCGTGAT CAAAACCCACATCGATATCCTCTCTGATTTCAGCAACGAGACCATTGAGGGACTTAAGGCTFCTCG CGCAGAAGCACAACTTTCTCATCTTCGAGGACCGCAAGTTCATTGACATCGGCAACACGGTCCAGA AflII AGCAATACCACGGCGGTACCCTCCGTATCTCGGAATGGGCCCACATCATCAACTGCAGCATTCTCC CTGGTGAGGGTATCGTCGAGGCTCTCGCTCAGACGGCGTCTGCACCGGACTTCGCCTACGGCCCCG ApaI AACGCGGTCTGTTGATCTTGGCAGAGATGACCTCTAAGGGCTCCTTGGCTACCGGCCAGTACACTA CTTCCTCGGTCGATTATGCCCGGAAATACAAGAACTTCGTTATGGGATTCGTGTCGACGCGCGCGT TGGGTGAGGTGCAGTCGGAAGTCAGCTCTCCTTCGGATGAGGAGGACTTTGTGGTCTTCACGACTG GTGTGAACATTTCTTCCAAGGGAGATAAGCTTGGTCAGCAGTACCAGACGCCCGGATCGGCTATCG GCCGGGGTGCTGACTTCATTATCGCGGGTCGCGGTATCTACGCCGCGCCGGATCCGGTGCAGGCTG CGCAACAGTATCAGAAGGAGGGGTGGGAAGCCTACCTGGCCCGTGTCGGCGGAAAACTAATACTAT 138 LB EcoRI XhoI An pyrG promoter BglII EcoRV KpnI BamHI AAAAGGAGGATCGAAGTTCTGATGGTTATGAATGATATAGAAATGCAACTTGCCGCAACGGATACG GAAGCGGAAACGGACCAATGTCGAGCACGGGTAGTCAGACTGCGGCATCGGATGTCCAAACGGTAT An pyrG TGATCCTGCAGGCTACTATGGTGTGGCACAAGGATCAATGCGGTACGACGATTTGATGCAGATAAG terminator CAGGCTGCGAAGTAGTAACTCTTGCGTAGAGAAAATGGCGACGGGTGGCTGATAAGGGCGGTGATA AGCTTAATTGTCATCGCAGATAAGCACTGCTGTCTTGCATCCAAGTCAGCGTCAGCAGAAATACGG GACTTCCGAAAGTATATGGCAAAATTAAAGAACTTGACTCTCCAGCAATGTTTTGCCCTGACCGTC GCTAAAACGTTACTACCCCTATACCCGTCTGTTTGTCCCAGCCCGAGGCATTAGGTCTGACTGACA GCACGGCGCCATGCGGGCTTGGGACGCCATGTCCGTCGCGTGATAAGGGTTGATCCATGCAGCTAC TATCCTTCCATCGTTCCATTCCCATCCTTGTCCTATCTCCATCCTTGAAACTTTACTAGTTTAGTT GGATGCTCGAGCTTGCTCTCGGCTACTCCGTCCAATGGATAAGACCCCGATGCCGGTCCTCATTGG TCTCCAGCTGGTATCGCCCCAACCTTCGTGTGATCGCCTCTCTGCTTCCCCTCATCATCATTACTA ACTAGTACATCCAAAAGCCATCCCAGTGCTTCCCCTCACCCTTGCCCAAGACATTCCAAGTGGGCC TTCGGCTGGAAAACATGGACCCATTGGTTCCATCGATAAGCTAGCTCCTCGTCCGTTACCCCAGAT TGATACCAGATAACATTGACCAGCGGCTTATCACCGAGGTCTGCGGGTGAGACCCCCCCTGCGACA AGTTAGATAAAAGAAACTCGCCTCATTGTGCTTCCGATGTCTAGTGTGACCGGTGACTCTTTCTGG CATGCGGAGAGACGGACGGACGCAGAGAGAAGGGCTGAGTAATAAGCCACTGGCCAGACAGCTCTG gpdA GCGGCTCTGAGGTGCAGTGGATGATTATTAATCCGGGACCGGCCGCCCCTCCGCCCCGAAGTGGAA promoter AGGCTGGTGTGCCCCTCGTTGACCAAGAATCTATTGCATCATCGGAGAATATGGAGCTTCATCGAA Rr TCACCGGCAGTAAGCGAAGGAGAATGTGAAGCCAGGGGTGTATAGCCGTCGGCGAAATAGCATGCC ATTAACCTAGGTACAGAAGTCCAATTGCTTCCGATCTGGTAAAAGATTCACGAGATAGTACCTTCT CCGAAGTAGGTAGAGCGAGTACCCGGCGCGTAAGCTCCCTAATTGGCCCATCCGGCATCTGTAGGG CGTCCAAATATCGTGCCTCTCCTGCTTTGCCCGGTGTATGAAACCGGAAAGGCCGCTCAGGAGCTG GCCAGCGGCGCAGACCGGGAACACAAGCTGGCAGTCGACCCATCCGGTGCTCTGCACTCGACCTGC TGAGGTCCCTCAGTCCCTGGTAGGCAGCTTTGCCCCGTCTGTCCGCCCGGTGTGTCGGCGGGGTTG ACAAGGTCGTTGCGTCAGTCCAACATTTGTTGCCATATTTTCCTGCTCTCCCCACCAGCTGCTCTT TTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCC TAAGTAAGTACTTTGCTACATCCATACTCCATCCTTCCCATCCCTTATTCCTTTGAACCTTTCAGT TCGAGCTTTCCCACTTCATCGCAGCTTGACTAACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCCTCGA XhoI GCACGTGCTTAAGGATATCATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGT PmlI GCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTA AflII CGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACAT EcoRV CCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTA CAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGT DsRed GGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTCCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGG CGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGA PstI StuI GCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGG StuI CGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTA CTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTA CGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGGATATCGAGCTCCCGCGGGGATCCACTTA EcoRV ACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCT CCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGA SacI GTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTTCGGGTTTACCTCTT SacII CCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGACTGCAACCTAGTAACGCCTTNCAGGCTCC BamHI GGCGAAGAGAAGAATAGCTTAGCAGAGCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAAC TrpC GGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTC terminator TAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAG CNCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCATGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATT CATCGTAGGTATAAACCTCGAAATCANTTCCTACTAAGATGGTATACAATAGTAACCATGCATGGT 139 BamHI TGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGT CGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGAAGTCCTCGTGTA CTGTGTAAGCGCCCACTCCACATCTCCACTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCC CTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCC TGAATGGCGAATGAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGT GTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTT AAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCT CGGGATCAA Các đồ thị đường chuẩn A B OD Mật độ quang (750nm) 00 (540 nm) 0.2 y = 0.0011x + 0.0419 R² = 0.9923 0.15 0.1 0.05 0 50 100 μg/ml Đồ thị đường chuẩn tyrosin y = 0.909x + 0.0184 R² = 0.9986 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ tyrosin (µM/ml) A Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo Miller (1959) B Đường chuẩn tyrosin theo phương pháp Anson cải tiến 00 (595 nm) 0.8 y = 0.9027x + 0.0198 R² = 0.9998 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nong BSA (μg/ml) Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết bò theo Bradford 140 XbaI SbfI PstI HindIII RB PHỤ LỤC 0.05 Penicillium digitatum KJ834506 92 50 Paecilomyces variotii KF305752 89 71 99 100 Paecilomyces variotii FJ549438 100 NV01 Paecilomyces variotii JQ796880 Paecilomyces variotii KU729023 Paecilomyces variotii AF455416 100 Paecilomyces variotii JX231004 100 Paecilomyces variotii GU968667 100 Byssochlamys spectabi KC009788 80 Paecilomyces variotii KC237293 Paecilomyces variotii JX231002 50 Purpureocillium lilac KC157750 Byssochlamys spectabi KC157706 100 100 Paecilomyces variotii FJ487938 Cây phả hệ dựa trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) chủng NV01 chủng có mối quan hệ gần gũi 141 Cây phả hệ dựa trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) chủng P1 chủng có mối quan hệ gần gũi 142 Cây phả hệ dựa trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) chủng NV20 chủng có mối quan hệ gần gũi A B A - Sản phẩm điện di DNA gen chi (M: marker – 1Kb); B - Sản phẩm điện di chitinase polyacrylamid chủng P1 143 Kết 63 thí nghiệm với yếu tố ảnh hưởng Cơ chất chitin huyen phu Glucose Pepton K2HPO4 0,5 1 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,75 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 1 1 1 3 3 3 3 1 1 3 1 1 1,43 1,21 2,23 2,12 2,08 2,4 0,3 0,7 0,3 0,7 0,7 0,3 0,7 0,7 0,3 0,7 0,7 0,7 0,7 0,5 0,3 0,7 0,3 0,3 0,3 0,3 0,7 0,7 0,3 0,3 0,3 0,3 0,7 0,7 0,7 0,3 0,3 0,7 0,3 0,34 0,45 0,38 0,48 0,61 0,41 0,1 0,1 0,01 0,1 0,1 0,1 0,01 0,1 0,01 0,1 0,01 0,1 0,01 0,06 0,01 0,01 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,1 0,01 0,1 0,1 0,1 0,1 0,04 0,06 0,07 0,08 0,01 0,03 144 2+ 2+ Ca /Mg 1,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 1,25 0,25 1,25 0,25 1,25 0,25 0,75 1,25 1,25 1,25 0,25 1,25 0,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 0,25 0,25 0,25 1,25 0,25 0,25 1,25 1,25 0,84 0,95 0,69 0,75 0,38 0,86 Hoạt tính (U/ml) 54,87 57,56 53,01 53,22 54,55 60,97 55,34 49,30 41,17 60,47 49,49 54,71 48,75 70,75 47,42 56,00 58,73 53,88 56,39 55,50 55,34 51,49 52,01 49,25 47,16 46,16 53,58 52,71 48,33 59,73 50,14 57,56 54,72 68,80 68,48 70,17 71,29 63,71 66,51 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 1,68 2,27 2,48 1,18 1,24 1,37 2,57 2,47 2,27 1,83 1,84 1,33 1,45 2,43 1,77 1,93 2,96 1,23 1,12 2,55 1,89 1,87 1,14 2,41 0,32 0,54 0,46 0,36 0,66 0,53 0,54 0,65 0,42 0,36 0,55 0,47 0,54 0,44 0,61 0,33 0,63 0,6 0,57 0,46 0,53 0,58 0,5 0,6 145 0,06 0,05 0,1 0,02 0,01 0,03 0,02 0,03 0,01 0,04 0,09 0,05 0,1 0,04 0,02 0,1 0,06 0,02 0,03 0,05 0,06 0,08 0,1 0,09 1,11 0,47 0,82 0,8 1,02 1,12 0,8 0,6 1,01 1,13 0,63 1,08 0,38 1,16 0,64 0,7 1,17 1,15 1,07 0,94 1,24 0,76 0,25 0,92 67,07 67,28 70,52 66,69 64,58 64,57 66,07 67,36 63.79 65,34 71,30 66,41 68,15 64,22 68,39 72,23 64,49 62,71 64,39 67,51 64,96 71,48 65,20 70,36 So sánh trình tự nucleotide đoạn gen pyrG ORF P lilacinus P1 thể đột biến 424pyrG(-) P1 424pyrG(-) GGTATCGGGCTGGGACTTTCACCCCCAGACCGGTACGGGCGCCAAGCTCGCCTCTCTCGC 60 GGTATCGGGCTGGGACTTTCACCCCCAGACCGGTACGGGCGCCAAGCTCGCCTCTCTCGC 60 ************************************************************ P1 424pyrG(-) CCGCAAGCATGGCTTCCTCATTTTTGAGGACCGCAAGTTCGGCGACATCGGCAACACGGT 120 CCGCAAGCATGGCTTCCTCATTTTCGAGGACCGCAAGTTCGGCGACATCGGCAACACGGT 120 ************************ *********************************** P1 424pyrG(-) CGAGATGCAGTACATTGGGGGCTCGGCCCGCATCATCGAGTGGGCCCACATTGTCAACGT 180 CGAGATGCAGGACATTGGGGGCTCGGCCCGCATCATCGAGTGGGCCCACATTGTCAACGT 180 ********** ************************************************* P1 424pyrG(-) CAACATGGTCCCGGGCAAGGCGTCCGTCGCCTCGCTCGCCAACGCCGCCACGCGATGGTT 240 CAACATGGTCCCGGGCAAGGCGTCCGTCGCCTCGCTCGCCAACGCCGCCACGCGATGGTT 240 ************************************************************ P1 424pyrG(-) CGAGCGGTATCCGTACGAGGTCAAGACTTCCGTCACCGTCGGCACGCCCACCGCGGAACA 300 CGAGCGGTATCCGTACGAGGTCAAGACTTCCGTCACCGTCGGCACGCCCACCGCGGAACA 300 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GTTCGAGGACGTGGACACAGGCTCAAGTCAGGAGGGAAAGGCAGACAAGGAGGAGGGCAA 360 GTTCGAGGACGTGGACACAGGCTCAAGTCAGGAGGGAAAGGCAGACAAGGAGGAGGGCAA 360 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GACGCGAGCCGACGACGGGCGCAAGGGCAGCATCGTTTCCGTCACCACCGTCACGCAGCA 420 GACGCGAGCCGACGACGGGCGCAAGGGCAGCATCGTTTCCGTCACCACCGTCACGCAGCA 420 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GTATGAGCCTGCCAACTCGCCGCGCCTGACCAAGAGCATGGCCGGCGGCGACGAGGTTTT 480 GTATGAGCCTGCCAACTCGCCGCGCCTGACCAAGAGCATGGCCGGCGGCGACGAGGTTTT 480 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GTTCGCCGGCATCGACGAGGCTCCGATGACCAGGGGTCTGCTGATCCTGGCGCAAATGTC 540 GTTCGCCGGCATCGACGAGGCTCCGATGACCAGGGGTCTGCTGATCCTGGCGCAAATGTC 540 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GAGCCAGGGCAACTTCATGAACAAGGAGTACACGCAGGCCTGCGTCGAGGCCGCGCGAGA 600 GAGCCAGGGCAACTTCATGAACAAGGAGTACACGCAGGCCTGCGTCGAGGCCGCGCGAGA 600 ************************************************************ P1 424pyrG(-) GCACAAGGACTTTGTCATGGGCTTCGTGTCACAGGAGAGCCTCAACTCGGAGCCGGAGGA 660 GCACAAGGACTTTGTCATGGGCTTCGTGTCACAGGAGAGCCTCAACTCGGAGCCGGAGGA 660 ************************************************************ P1 424pyrG(-) CCAGTTCATCCACATGACGCCCGGCTGCCAACTGCCGCCCGAGGACGAGGACCA CCAGTTCATCCACAAGACGCCCGGCTGCCAACTGCCGCCCGAGGACGAGGACCA ************** *************************************** 146 714 714 So sánh trình tự amino axit mã hóa vùng ORF_pyrG chủng P lilacinus P1 thể đột biến 424pyrG (-) P1 424pyrG(-) PTRLGRPSWCSRLTTTWYRAGTFTPRPVRAPSSPLS 59 PTRLGRPSWCSRLTTTWYRAGTFTPRPVRAPSSPLS 45 ************************************ P1 424pyrG(-) PASMASSFLRTASSATSATRSRCSTLGARPASSSGPTLSTSTWSRARRPSPRSPTPPRDG 119 PASMASSFSRTASSATSATRSRCRTLGARPASSSGPTLSTSTWSRARRPSPRSPTPPRDG 105 ******** ************** ************************************ P1 424pyrG(-) SSGIRTRSRLPSPSARPPRNSSRTWTQAQVRRERQTRRRARREPTTGARAASFPSPPSRS 179 SSGIRTRSRLPSPSARPPRNSSRTWTQAQVRRERQTRRRARREPTTGARAASFPSPPSRS 165 ************************************************************ P1 424pyrG(-) SMSLPTRRA*PRAWPAATRFCSPASTRLR*PGVC*SWRKCRARATS*TRSTRRPASRPRE 235 SMSLPTRRA*PRAWPAATRFCSPASTRLR*PGVC*SWRKCRARATS*TRSTRRPASRPRE 221 ************************************************************ P1 424pyrG(-) STRTLSWASCHRRASTRSRRTSSST*RPAANCRPRTRT STRTLSWASCHRRASTRSRRTSSSTRRPAANCRPRTRT ************************* ************ 292 279 Khả phân nhánh hệ sợi nồng độ bào tử PE858 WT Ghi chú: WT-chủng P1; PE858: Thể chuyển gen từ P1; PDA, CDA – Môi trường nuôi cấy 147 PHỤ LỤC Lấy mẫu rễ đất bị bệnh cấp Lấy mẫu rễ đất bị bệnh cấp Lấy mẫu rễ đất bị bệnh cấp Lấy mẫu rễ đất bị bệnh cấp Lấy mẫu rễ đất bị bệnh cấp 148 149 PHỤ LỤC Hình ảnh triển khai mơ hình thử nghiệm ĐăK LăK Mơ hình thử nghiệm Chế phẩm sinh học Phân lơ thí nghiệm 150