Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật dứa dại (pandanus odoratissimus), nhó đông (morinda longissima), chùm ruột (phyllanthus acidus) việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LỒI THỰC VẬT DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS), NHĨ ĐƠNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN CƠNG THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LOÀI THỰC VẬT DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS), NHĨ ĐƠNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Mã số: 942 01 04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đỗ Thị Thảo Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Nguyễn Mạnh Cƣờng Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Hà Nội, 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án hoàn toàn trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Công Thùy Trâm i LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành Phịng thử nghiệm sinh học, viện Cơng nghệ sinh học phịng Hoạt chất sinh học, viện Hóa học hợp chất thiên nhiên thuộc viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Thảo PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường người hướng dẫn tận tình, chu đáo tạo điều kiện tốt giúp đỡ thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, hỗ trợ kinh phí hóa chất thực thí nghiệm liên quan q trình làm luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Ninh Thế Sơn (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên), ThS Nguyễn Thị Cúc, ThS Nguyễn Thị Nga, ThS Đỗ Thị Phương (Viện Công nghệ Sinh học) giúp tách chiết ni cấy tế bào q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc đại học Đà Nẵng, Ban Giám hiệu trường đại học Sư Phạm, Đà Nẵng hỗ trợ kinh phí tạo điều kiện cho thực luận án Cuối tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Công Thùy Trâm ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gan số bệnh gan 1.1.1 Cấu trúc gan 1.1.2 Chức số hoạt động sinh lý gan 1.1.3 Một số dạng bệnh lý thường gặp gan 1.2 Stress oxy hóa bệnh gan 1.2.1 Gốc tự 1.2.2 Stress oxy hóa bệnh gan .10 1.2.3 Chống oxy hóa bảo vệ gan 10 1.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan in vitro, ex vivo 13 1.3 Vai trò số cytokine hệ chuyển đổi tín hiệu hoạt hóa phiên mã (signal transducer and activator of transcription 3- stat3) bệnh gan .14 1.3.1 Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan .14 1.3.2 Tín hiệu hoạt hóa phiên mã (Signal transducer and activator of transcription – STAT3) tế bào Kupffer bệnh gan 18 1.4 Các loài thực vật sử dụng nghiên cứu 19 1.4.1 Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) 19 1.4.2 Cây Nhó đơng(Morinda longissima Y.Z.Ruan) 22 1.4.3 Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L Skeels) 26 Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu .31 2.1.2 Hoá chất sử dụng nghiên cứu .32 2.1.3 Thiết bị 32 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu hóa học .33 2.2.1 Phương pháp điều chế phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan 33 iii 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất .37 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất .37 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu sinh học 38 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH .38 2.3.2 Phương pháp xác định khả ức chế peroxyl hóa lipid (thử nghiệm MDA) 39 2.3.3 Phương pháp xác định khả bảo vệ tế bào gan .40 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính cảm ứng/ức chế cytokine 41 2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu .42 Chƣơng 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phân tích sơ thành phần hóa học phân đoạn Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.1 Điều chế phần chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.2 Sơ phân tích thành phần hóa học phân đoạn tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đông Chùm ruột 43 3.1.3 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa Dứa dại, rễ Nhó đông Chùm ruột 45 3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B;ML-B PA-C .49 3.2.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B Dứa dại 49 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đông 51 3.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 54 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất đƣợc tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 60 3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 60 3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 65 3.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 69 Chƣơng BÀN LUẬN KẾT QUẢ 85 iv 4.1 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 85 4.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B; ML-B PA-C .86 4.2.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-D Dứa dại 86 4.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 90 4.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PA-E Chùm ruột .92 4.3 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất đƣợc tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 106 4.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 106 4.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng .108 4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 118 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐLIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ATP Adenosine triphosphate ADN Deoxyribonucleic acid Bcl-xl B-cell lymphoma-extra large CCl4 Carbon tetrachloride C-NMR Carbon nuclear magnetic res COSY Correlation spectroscopy d Doublet dd Doublet of doublet DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DMEM Dulbescco´s modified eagle medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl EtOAc Ethyl acetate HMBC Heteronuclear multiple bond correlation H-NMR Proton nuclear magnetic resonance HSQC Heteronuclear singlet quantum coherence spetroscopy IC Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế) IL Interleukin IR Infrared spetroscopy (Phổ hồng ngoại) LPS lipopolysaccharide MDA Malondialdehyde MKK Mitogen - activated protein kinase kinase MMP matrix metalloproteinases MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide MS Mass spetrometry (Phổ khối) vi NF-B Nuclear factor kappa B NOESY Nuclear overhause effect ROS Reactive oxygen species s Singlet STAT3 Signal transducer and activation of transcription TNF- Tumor necrosis factors C Carbon chemicalshift ( độ dịch chuyển hóa học Carbon) H Proton chemicalshifrt (độ dịch chuyển hóa học Proton) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các phân đoạn chiết Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 Bảng 3.2.Kết định tính nhóm hợp chất tự nhiên phân đoạn chiết xuất từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 44 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính loại bỏ gốc tự DPPH phân đoạn từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 46 Bảng 3.4.Kết thử hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) Dứa dạiquả Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 47 Bảng 3.5.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 63 Bảng 3.6.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 68 Bảng 3.7.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 73 Bảng 3.8 Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào RAW 264.7 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 77 Bảng 4.1 Số liệu phổ H- 13 C-NMR chất PA5 PA8 (500 & 125 MHz, MeOD) 101 viii 43 Phổ PA7: Myricitrin (Phụ lục B14) PA7-MS 44 45 Phổ PA8: Kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester (Phụ lục B15) PA8-MS 46 47 48 Phổ PA9: Drabanemoroside (Phụ lục B16) PA9-MS 49 50 51 Phổ PA10: Isoquercitrin (Phụ lục B17) PA10-MS 52 53 54 Phổ PA11: rutin (Phụ lục B18) 55 56 57