Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng nấm sợi gây hại trên thấu kính ống nhòm tại việt nam

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với số cộng khác Các số liệu kết trình bày Luận án trung thực, phần công bố Tạp chí, Kỷ yếu Hội nghị khoa học chuyên ngành đồng ý sử dụng số liệu đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nghiên cứu sinh Ngô Cao Cường ii LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn PGS TS Phí Quyết Tiến, Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Văn Đức, Tổng Cục kỹ thuật - Bộ Quốc phòng tận tâm hướng dẫn khoa học, định hướng nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thu Hồi, Phân Viện Cơng nghệ sinh học - Trung tâm nhiệt đới Việt Nga tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực Luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cán Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tập thể cán thuộc Phòng Vi sinh - Phân viện Công nghệ sinh học - Trung tâm nhiệt đới Việt Nga; Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật; Phịng Cơng nghệ lên men thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu thực Luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc cán Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thành Luận án Tôi xin cảm chân thành đến Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học giảng dạy, cung cấp kiến thức để tơi hồn thành học phần và các chuyên đề chương trình đào tạo Tôi xin chân thành cảm ơn chuyên viên ThS Nguyễn Thị Minh Tâm - Học viện Khoa học Công nghệ ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành hồ sơ suốt q trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Tổng giám đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga, Thủ trưởng cùng các đồng nghiệp Phân viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện, hỗ trợ, giúp đỡ tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ suốt thời gian thực Luận án Nghiên cứu sinh Ngô Cao Cường iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm sợi gây hại kính q trình phát triển 1.1.1 Vật liệu kính, thành phần đặc tính 1.1.2 Nấm sợi xâm nhập nấm sợi bề mặt vật liệu kính 1.1.3 Quá trình phát triển nấm sợi vật liệu kính gây hại kính q trình trao đổi chất 1.1.4 Ống nhòm ON8x30 tác hại nấm thấu kính 1.2 Đặc điểm khí hậu điểm bảo quản ống nhòm đặc điểm sinh học nấm sợi thấu kính 1.2.1 Đặc điểm địa lý khí hậu điểm lấy mẫu 1.2.2 Cấu trúc thành phần nấm sợi vật liệu kính theo đặc điểm khí hậu địa lý 10 1.2.3 Cấu trúc thành phần chi, loài nấm sợi gây hại vật liệu kính 14 1.2.4 Một số phương pháp phân loại nấm sợi 16 1.3 Các yếu tố ngoại cảnh đặc điểm nấm sợi ảnh hưởng tới trình gây hại bề mặt kính 17 1.3.1 Độ ẩm khơng khí số yếu tố khác 17 1.3.2 Đặc tính sinh axít nấm sợi 18 1.3.3 Đặc tính sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) nấm sợi 18 1.3.4 Một số đặc tính sinh học khác nấm sợi (tạo màng sinh học, phát tán bào tử, khả phát triển sợi nấm) 19 1.3.5 Ảnh hưởng nấm sợi đến đặc tính quang vật liệu kính 21 1.3.6 Ảnh hưởng nấm sợi đến cấu trúc bề mặt vật liệu kính 21 1.4 Đặc điểm di truyền nấm sợi gây hại bề mặt kính 23 1.4.1 Đặc điểm di truyền chung lồi nấm gây hại bề mặt kính 23 1.4.2 Các gen tham gia vào sinh tổng hợp axít hữu 24 1.4.3 Các gen tham gia vào sinh tổng hợp EPS 30 iv 1.4.4 Sơ lược nghiên cứu hệ gen nấm sợi 32 1.4.5 Các nghiên cứu dự đoán cụm gen so sánh hệ gen nấm sợi gây hại bề mặt vật liệu 34 1.4.6 Các nghiên cứu hệ gen nấm sợi Curvularia 36 1.5 Phương pháp ức chế nấm sợi tình hình nghiên cứu nấm sợi kính Việt Nam 37 1.5.1 Kiểm sốt thơng số lí, hóa trình bảo quản 37 1.5.2 Sử dụng tác nhân (vật lí, hóa học,…) ức chế nấm gây hại 37 1.5.3 Chất ức chế nấm sợi dạng bay tiềm ứng dụng chống nấm sợi cho thiết bị quang học 39 1.5.4 Tình hình nghiên cứu nấm sợi gây hại kính Việt Nam 39 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1 Thu mẫu nấm sợi nhiễm thấu kính ống nhịm 41 2.1.2 Chế phẩm diệt nấm 42 2.1.3 Hóa chất, thiết bị 43 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái 44 2.2.2 Phân loại nấm dựa phân tích trình tự gen ITS 45 2.2.3 Các phương pháp phân tích hóa sinh, hóa lý 46 2.2.4 Các phương pháp phân tích vật lý, hóa học 49 2.2.5 Giải trình tự phân tích hệ gen chủng nấm sợi gây hại mạnh 51 2.2.6 Phân tích, xử lý thống kê 53 2.2.7 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Luận án 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Đặc điểm thấu kính bị gây hại phân lập chủng nấm sợi thấu kính ống nhòm ON8x30 54 3.1.1 Mức độ gây hại nấm sợi thấu kính 54 3.1.2 Ảnh hưởng nấm sợi gây hại đến đặc tính quang thấu kính 57 Phân bố đặc điểm hình thái nấm sợi gây hại thấu kính ống nhịm ON8x30 61 3.2.1 Nấm sợi gây hại thấu kính ống nhịm ON8x30 miền Bắc (Xuân Mai-HN, Mê Linh-VP, Thanh Ba-PT, Lục Ngạn-BG) 61 3.2.2 Nấm sợi gây hại thấu kính ống nhịm miền Trung (Quỳnh LưuNghệ An, Thái Hòa-Nghệ An) 65 3.2 v 3.2.3 Nấm sợi gây hại thấu kính ống nhịm Biên Hòa-Đồng Nai 68 3.2.4 Nấm sợi gây hại thấu kính ống nhịm điều kiện khí hậu biển (thường đỗ An Dương-Hải Phịng) 70 3.2.5 Tổng hợp, so sánh đặc tính sinh học nấm gây hại khu vực thu thập mẫu 72 3.3 Đặc điểm phân loại đặc tính gây hại chủng nấm sợi phân lập từ thấu kính 75 3.3.1 Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi 75 3.3.2 Khả sinh axít hữu chủng nấm sợi 82 3.3.3 Đánh giá khả gây hại chủng nấm sợi bề mặt kính giả định điều kiện in vitro 87 3.3.4 Lựa chọn đánh giá đặc trưng số nấm sợi điển hình gây hại bề mặt kính 94 3.4 Giải trình tự hệ gen phân tích đặc tính di truyền liên quan đến khả gây hại thấu kính chủng Curvularia eragrostidis C52 95 3.4.1 Đặc điểm phân loại chủng nấm Curvularia eragrostidis C52 96 3.4.2 Giải trình tự, lắp ráp giải hệ gen chủng nấm sợi C eragrostidis C52 98 3.4.3 Phân tích phân lồi hệ gen so sánh 101 3.4.4 Con đường sinh tổng hợp số axít hữu liên quan đến phân huỷ kính từ Curvularia eragrostidis C52 102 3.4.5 Xác định gen liên quan đến sinh tổng hợp EPS 109 3.5 Thử nghiệm khả kháng nấm sợi gây hại điển hình thấu kính ống nhịm số chế phẩm diệt nấm 113 3.5.1 Thử nghiệm khả kháng nấm số chế phẩm diệt nấm 113 3.5.2 Khảo sát khả ức chế nấm sợi chế phẩm AI1 115 3.5.3 Thử nghiệm ảnh hưởng độ ẩm đến khả ức chế phát triển nấm sợi AI1 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120 CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần nấm khơng khí vật liệu số nước giới Bảng 1.2 12 Một số chủng loại nấm tìm thấy bề mặt vật liệu kính giới 15 Bảng 1.3 Tổng hợp số gen sử dụng phân loại nấm sợi 16 Bảng 1.4 Axít hữu sinh tổng hợp Aspergillus niger Penicillium chrysogenum 18 Bảng 2.1 Tổng hợp đặc điểm khí hậu tọa độ địa lý điểm lấy mẫu 41 Bảng 2.2 Bảng so sánh đánh giá mức độ gây hại nấm sợi 47 Bảng 3.1 Thống kê số liệu thu thập 08 điểm lấy mẫu số chủng nấm thấu kính ống nhịm Bảng 3.2 Đánh giá mật độ nấm sợi thấu kính nhiễm nấm 04 điểm lấy mẫu thuộc miền Bắc Bảng 3.3 69 Kết phân lập mật độ nấm sợi thấu kính nhiễm nấm ống nhịm sử dụng điều kiện khí hậu biển Bảng 3.9 69 Đặc điểm hình thái phân loại số chủng nấm đại diện phân lập từ mẫu ống nhòm Biên Hòa-Đồng Nai Bảng 3.8 67 Bảng 3.6 Kết phân lập mật độ nấm sợi thấu kính nhiễm nấm phân lập Biên Hòa-Đồng Nai Bảng 3.7 66 Đặc điểm hình thái phân loại số chủng nấm đại diện phân lập từ mẫu ống nhòm miền Trung Bảng 3.6 63 Kết phân lập mật độ nấm sợi thấu kính nhiễm nấm phân lập hai điểm lấy mẫu thuộc miền Trung Bảng 3.5 62 Đặc điểm hình thái phân loại số chủng nấm đại diện phân lập từ mẫu ống nhòm miền Bắc Bảng 3.4 56 71 Đặc điểm hình thái phân loại số chủng nấm đại diện phân lập từ mẫu ống nhịm sử dụng điều kiện khí hậu biển 71 vii Bảng 3.10 Bảng tổng hợp số chủng nấm sợi phân lập miền Bắc, Trung, Nam khí hậu biển làm giảm pH sau q trình ni cấy Bảng 3.11 Mức độ gây hại số chủng nấm đại diện phân lập miền Bắc, Trung, Nam khí hậu biển kính giả định Bảng 3.12 86 91 Bảng tổng hợp số chủng nấm sợi có khả gây hại mạnh (mức 3) thu nhận chia theo 04 khu vực Bắc-Trung-Nam khí hậu biển Bảng 3.13 Một số đặc điểm nhóm nấm gây hại điển hình lựa chọn từ điểm thu mẫu Bảng 3.14 98 Khả sinh tổng hợp axít hữu Curvularia eragrostidis C52 Bảng 3.16 95 Kết lắp ráp giải gen Curvularia eragrostidis C52 Bảng 3.15 92 102 Các gen mã hố enzym chức tham gia sinh tổng hơp axít hữu xác định hệ gen Curvularia eragrostidis C52 Bảng 3.17 Một số axít hữu sinh tổng hợp Curvularia eragrostidis C52 Bảng 3.18 114 Kết khảo sát khả ức chế phát triển nấm sợi phân lập AI1 nồng độ khác Bảng 3.21 111 Kết thử nghiệm khả ức chế nấm sợi số chế phẩm diệt nấm Bảng 3.20 108 Dự đoán gen tham gia sinh tổng hợp dạng Polysaccharide ngoại bào Bảng 3.19 105 116 Kết thử nghiệm ảnh hưởng độ ẩm đến khả ức chế nấm sợi AI1 nồng độ mg/l 119 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Sự phát triển Penicillium sp bề mặt vật liệu kính BK7 chụp kính hiển vi sáng Hình 1.2 Hình ảnh chụp hiển vi quét laser bề mặt kính lớp màng sinh học gây nấm sợi Hình 1.3 Hình ảnh chụp ống nhịm ON8x30 Hình 1.3A-ảnh chụp ngang, hình 1.3B-ảnh chụm đứng theo mặt vật thị kính, hình 1.3C-ảnh chụp đứng theo thị kính Hình 1.4 Hình ảnh chụp sợi nấm thời điểm khác (a, b, c) chụp kính hiển vi Zeiss Axio Z1 Mũi tên màu trắng phát triển sợi nấm bề mặt vật liệu Hình 1.5 Hình ảnh SEM kính màu thời trung cổ, lớp khơng màu bị phá hủy vi sinh vật Hình 1.6 20 22 Con đường sinh tổng hợp axít itaconic Aspergillus terreus 25 Hình 1.7 Tổng hợp nghiên cứu hệ gen vi sinh vật nhân chuẩn 33 Hình 2.1 Các địa điểm lấy mẫu thể vị trí tương đối đồ Việt Nam 42 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Luận án 54 Hình 3.1 Ống nhịm ON8x30 Việt Nam đại diện thu thập Vĩnh Phúc bị nhiễm nấm thấu kính quan sát Hình 3.2 Mức độ truyền qua dải ánh sáng nhìn thấy thấu kính ống nhịm ON8x30 nhiễm nấm Hình 3.3 61 Sự phân bố chi nấm phân lập điểm thuộc khác nhau: a-miền Bắc, b-miền Trung, c-miền Nam, d- khí hậu biển Hình 3.6 60 Độ truyền qua dải ánh sáng nhìn thấy trung bình theo khu vực thu mẫu Hình 3.5 59 Kết đo truyền qua ánh sáng qua kính dải ánh sáng nhìn thấy: Hình 3.4 54 Đánh giá phân bốánhi shi giá phân bậu biểnrung, c- 74 ix miềạphân liá thân liá phâthun mi ba minphân bchi nểnrung, c-miềại điểm Hình 3.7 75 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm sợi phân lập từ điểm thuộc miền Bắc lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ITS Hình 3.8 77 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm sợi phân lập từ điểm thuộc miền Trung lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ITS Hình 3.9 79 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm sợi phân lập từ Đồng Nai lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ITS Hình 3.10 80 Cây phả hệ chủng nấm sợi phân lập mẫu chịu ảnh hưởng khí hậu biển lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ITS Hình 3.11 Khả sinh axít hữu chi nấm phân lập điểm lấy mẫu khác nhau: Hình 3.12 87 Khả gây hại chủng nấm phân lập khu vực khác đánh giá theo ISO 9022-11 kính giả định Hình 3.14 83 Ảnh hiển vi SEM kính sau 28 ngày thử nghiệm Aspergillus tubingensis 17.2 Hình 3.13 81 90 Ảnh hưởng nấm sợi bề mặt thấu kính đến truyền ánh sáng qua mẫu thủy tinh dải ánh sáng nhìn thấy 11 chủng nấm thử nghiệm mẫu đối chứng Hình 3.15 Khả phân huỷ sinh học thấu kính đặc điểm phân loại chủng nấm sợi C52 Hình 3.16 93 97 Bản đồ hệ gen Curvularia eragrostidis C52 Bản đồ xây dựng cách sử dụng kết hợp đường viền xếp theo chiều dài thể đường tròn Hình 3.17 100 Mối quan hệ tiến hố Curvularia eragrostidis C52 chủng thuộc chi Curvularia dựa phân tích ANI (A), AAI (B) tương đồng protein (C) 101 x Hình 3.18 Hình ảnh phổ số axít hữu điển hình Hình 3.19 Dự đốn đường sinh tổng hợp axít hữu từ chủng 103 Curvularia eragrostidis C52 Các gen tìm thấy hệ gen nấm thể màu xanh Hình 3.20 104 Khả sinh polysaccharide chủng Curvularia eragrostidis C52 khoảng thời gian lên men khác 110 Hình 3.21 Phổ chụp EPS sinh tổng hợp chủng C eragrostidis C52 110 Hình 3.22 Ảnh chụp thử nghiệm khả ức chế ba chất thử nghiệm hai chủng nấm sợi đại diện 115 36 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 TTHF1-6 TTHF2-1 TTHF2-2 TTHF2-3 TTHF2-4 TTHF3-2 TTHF3-3 TTHF3-4 TTHF4-2 TTHF4-4 TTHF4-5 TTHF5-2 TTHF5-3 TTHF5-4 TQLG1-1 Aspergillus protuberus LN898712.1 99,81% Lentinus squarrosulus KT273380.1 99,04% Lentinus squarrosulus MK851539.1 98,99% Lentinus tigrinus GQ849476.1 98,40% Aspergillus niger KU729033.1 99,82% Aspergillus niger NR111348.1 99,81% Aspergillus tubingensis NR131293.1 99,25% Schizophylum commune MH861655.1 100% Schizophyllum commune KC505579.1 100% Pleurotus ostreatus NR163515.1 98,80% Aspergillus flavus MH279408.1 100% Aspergillus flavus NR111041.1 99,40% Aspergillus krugeri NR171614.1 98,80% Coprinellus disseminatus MN209934.1 99,52% Coprinellus disseminatus KC771476.1 99,39% Coprinellus disseminatus MK304374.1 98,38% Curvularia clavata JQ730852.1 100% Curvularia guangxiensis MN215669.1 98,80% Curvularia eragrostidis KU232930.1 98,79% Nigrospora sphaerica KU360609.1 100% Nigrospora sphaerica MN795539.1 99,80% Nigrospora sphaerica MN215802.1 99,60% Coprinellus radians KJ714004.1 99,55% Coprinellus radians MT077145.1 99,54% Coprinellus radians JX501304.1 99,24% Aspergillus versicolor JN545818.1 99,80% Aspergillus griseoaurantiacus NR135459.1 99,79% Aspergillus hongkongensis NR138262.1 99,17% Lasiodiplodia pseudotheobromae MG878103.1 99,81% Lasiodiplodia pseudotheobromae NR111264.1 99,81% Lasiodiplodia sterculiae NR147365.1 99,79% Penicillium citrinum MH858380.1 99,63% Penicillium citrinum MF380923.1 99,63% Penicillium hetheringtonii NR111482.1 99,40% Lasiodiplodia pseudotheobromae MG878103.1 100% Lasiodiplodia pseudotheobromae NR111264.1 100% Lasiodiplodia jatrophicola NR147348.1 99,79% Tricoderma harzianum KT314298.1 100% Trichoderma aureoviride AF359266.1 99,66% Trichoderma guizhouense MH712265.1 99,66% Hypoxylon monticulosum JQ760257.1 98,72% Hypoxylon monticulosum KM458814.1 98,57% Hypomontagnella monticulosa MT762710.1 98,03% Aspergillus niger AY373852.1 99,81% Aspergillus niger ON231640.1 99,81% MN398967.1 MN398968.1 MN398969.1 MN398970.1 MN398971.1 MN398972.1 MN398973.1 MN398974.1 MN398975.1 MN398976.1 MN398977.1 MN398978.1 MN398979.1 MN398961.1 MZ414200.1 37 TQLG1-2 72 TQLG1-3 73 TQLG1-4 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 TQLG2-2 TQLG3-3 C1.1 C1.2 C2.2 C2.3 C3.1 C3.2 C3.3 C3.4 C5.2 C5.3 Aspergillus foetidus ON054326.1 99,63% Aspergillus oryzae KY425742.1 99,42% Aspergillus minisclerotigenes OL711675.1 99,32% Aspergillus oryzae HQ285588.1 99,32% Pencillium oxalicum NR121232.1 100% Penicillium soosanum NR173354.1 98,47% Penicillium pedernalense NR146250.1 95,56% Aspergillus aculeatus NR111412.1 99,65% Aspergillus aculeatus KU203321.1 99,47% Aspergillus japonicus MZ376648.1 99,47% Penicillium oxalicum NR121232.1 100% Penicillium soosanum NR173354.1 98,51% Penicillium pedernalense NR146250.1 96,65% Penicillium citrinum MH858380.1 99,64% Penicillium citrinum LC106114.1 99,64% Penicillium griseofulvum EU664471.1 99,46% Aspergillus fumigatus NR121481.1 99,66% Aspergillus oerlinghausenensis NR138362.1 98,80% Aspergillus fischeri NR137479.1 98,77% Fusarium proliferatum MN256658.1 100% Fusarium fujikuroi NR111889.1 99,60% Fusarium concentricum NR111886.1 99,36% Cladosporium xanthochromaticum MK732115.1 100% Cladosporium cladosporioides MN427956.1 99,81% Cladosporium asperulatum MF319884.1 99,81% Megasporoporia spp LC269926.1 99,83% Megasporoporia minor NR120050.1 99,46% Megasporoporia spp KP013029.1 98,20% Curvularia lunata MW081258.1 100% Curvularia lunata MG649266.1 99,81% Curvularia kusanoi MG847354.1 99,42% Periconia thailandica MW081291.1 99,42% Periconia sp MW670519.1 99,42% Periconia thailandica KY753887.1 99,03% Pithomyces chartarum MF040205.1 100% Pithomyces maydicus HG933801.1 99,81% Pithomyces chartarum JQ388922.1 99,81% Torula chromolaenae MT214384.1 99,78% Torula chromolaenae MT007586.1 99,18% Torula chromolaenae MN061345.1 98,68% Curvularia eragrostidis MG250430.1 100% Curvularia eragrostidis MF038140.1 99,82% Cochliobolus eragrostidis JN943411.1 99,65% Gliomastix polychroma OW982584.1 100% Gliomastix polychroma MH859647.1 99,61% Gliomastix murorum KT968542.1 98,24% MN396681.1 MN396682.1 MZ414201.1 MN396683.1 MN396684.1 MN398981.1 MN398982.1 MN398983.1 MN398984.1 MN398985.1 MN398986.1 MN398987.1 MN398988.1 MZ148448.1 MN398989.1 38 87 C5.4 Trichoderma harzianum MZ044273.1 100% Trichoderma lixii OK275120.1 99,82% Trichoderma sp MZ423067.1 99,82% MN398990.1 39 Hình Cây phát sinh chủng loại chủng nấm sợi phân lập lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ITSr DNA 40 Phụ lục 41 Hình Phổ Cosi, phổ 1H, phổ 13C Phụ lục Bảng 17 So sánh hệ gen lắp ráp NCBI Hệ gen C C lunata C eragrostidis CX-3 geniculata C52 W3 C_IFBZ10_fna C kusanoi 30M1 C papendorfii Số contigs 3594 340 737 136 107 374 Tổng chiều dài 36879453 35 493 212 33 535 945 33 010 211 33 340 726 33 379 470 Số contig (>= 1000 bp) 298 318 593 136 107 374 Tổng chiều dài (>= 1000 bp) 36 452 990 35 486 198 334 32 264 33 010 211 33 340 726 33 379 470 Contig dài 136 284 994 917 857 631 101 661 989 576 159 086 GC (%) 52.07 50.22 50.64 50.47 52.13 50.65 N50 225 477 788 415 226 947 949 676 018 367 146 099 N75 73 331 481 241 114 467 419 467 469 684 89 686 L50 52 16 44 12 68 L75 122 30 92 12 24 140 số N's 100 kbp 1952.91 1.84 177.68 2.74 42 Hình Độ tuyền ánh sáng ghi nhận kính khơng (A) nhiễm (B) nấm C eragrostidis C52 Hình Chú giải gen mã hoá protein chức sở liệu COG 43 Hình Chú giải gen mã hoá protein chức sở liệu KEGG Phụ lục Hình Ảnh sợi nấm sau 28 ngày thử nghiệm; a/d-chủng A niger BXMA5-2 đối chứng/thử nghiệm, b/e-chủng P citrinum TTHF4-5 đối chứng/thử nghiệm, c/fchủng C eragrostidis C5.2 đối chứng/thử nghiệm, độ phóng đại 1000 lần 44 Bảng 18 Kết thử nghiệm khả ức chế phát triển nấm sợi phân lập AI1 T T 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Khu vực Miền Bắc Tên chủng Aspergillus flavus 13.1 Aspergillus tubingensis 17.2 Penicillium chrysogenum 20.4 Aspergillus aculeatus 19.1 Pencillium oxalicum 20.1 Penicillium citrinum 20.2 Aspergillus fumigatus BMLC1-1 Aspergillus ochraceopetaliformis BMLC1-2 Aspergillus asperescens BMLC1-1 Aspergillus sclerotiorum BMLC1-4 Penicillium lanoso BMLC1-5 Pithomyces chartarum BMLC1-6 Neopestalotiopsis sp BMLC1-7 Penicillium chermesinum BMLC2-1 Penicillium roqueforti BMLC2-3 Trichoderma koningiopsis BMLC2-5 Cladosporium tenuissimum BMLC2-6 Cladosporium tenuissimum BMLC2-7 Penicillium toxicarium BMLC2-8 Aspergillus niger BMLC3-4 Pithomyces maydicus BMLC3-6 Aspergillus sp BMLC4-6 Pleospora herbarum BMLC4-7 Humicola insolen BMLC5-5 Aspergillus sydowii BTBB1-1 Aspergillus flavus BTBB1-2 Torulomyces lagena BTBB1-3 Penicillium oxalicum BTBB2-2 Aspergillus sp BTBB5-1 Penicillium decumbens BTBB5-2 Penicillium brevissimum BXMA1-1 Byssochlamys spectabilis BXMA1-2 Aspergillus sydowii BXMA1-3 Aspergillus tritici BXMA1-4 Aspergillus sydowii BXMA1-5 Byssochlamys spectabilis BXMA2-1 Curvularia veruculosa BXMA2-2 Phomopsis sp BXMA2-3 Coprinellus radians BXMA2-4 Aspergillus flavus BXMA3-1 Penicillium oxalicum BXMA3-2 Curvularia lunata BXMA3-5 Penicillium brevissimum BXMA4-1 Penicillium ramusculum BXMA4-2 Perenniporia tephropora BXMA4-4 Nồng độ AI1 (mg/l) 0,1 10 20 57 0 0 62 0 0 45 0 0 68 0 0 34 0 0 63 0 0 67 0 0 51 0 0 65 0 0 62 0 0 61 0 0 54 0 0 57 0 0 63 0 0 62 0 0 53 0 0 47 0 0 67 0 0 63 0 0 75 0 0 38 0 0 54 0 0 36 0 0 41 0 0 57 0 0 45 0 0 56 0 0 62 0 0 53 0 0 57 0 0 59 0 0 34 0 0 54 0 0 45 0 0 53 0 0 57 0 0 51 0 0 56 0 0 37 0 0 65 0 0 62 0 0 67 0 0 56 0 0 58 0 0 35 0 0 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 Khí hậu biển Miền Nam Miền Trung Aspergillus niger BXMA5-2 Aspergillus niger MADE1-1 Aspergillus aculeatus MADE1-2 Penicillium brevicompactum MADE1-3 Penicillium oxalicum MADE1-4 Aspergillus aculeatus MADE2-3 Aspergillus fumigatus C1.1 Fusarium proliferatum C1.2 Cladosporium xanthochromaticum C2.2 Megasporoporia sp C2.3 Curvularia lunata C3.1 Periconia thailandica C3.2 Pithomyces chartarum C3.3 Torula chromolaenae C3.4 Curvularia eragrostidis C5.2 Gliomastix polychroma C5.3 Trichoderma harzianum C5.4 Aspergillus niger TQLG1-1 Aspergillus flavus TQLG1-2 Pencillium oxalicum TQLG1-3 Aspergillus aculeatus TQLG1-4 Penicillium oxalicum TQLG2-2 Penicillium citrinum TQLG3-3 Curvularia genculata TTHF1-2 Aspergillus sclerotiorum TTHF1-2 Chaetomium globosum TTHF1-3 Phanerochaete chrysosporium TTHF1-4 Aspergillus creber TTHF1-5 Lentinus tigrinus TTHF1-6 Aspergillus niger TTHF2-1 Schizophylum commune TTHF2-2 Aspergillus flavus TTHF2-3 Coprinellus disseminatus TTHF2-4 Curvularia clavata TTHF3-2 Nigrospora sphaerica TTHF3-3 Coprinellus radians TTHF3-4 Aspergillus versicolor TTHF4-2 Lasiodiplodia theobromae TTHF4-4 Penicillium citrinum TTHF4-5 Lasiodiplodia theobromae TTHF5-2 Tricoderma harzianum TTHF5-3 Hypoxylon monticulosum TTHF5-4 76 78 65 67 62 56 58 42 36 23 58 32 35 46 65 54 56 71 65 62 58 56 54 51 37 43 47 32 41 67 43 64 34 32 45 37 52 38 42 35 43 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bảng 19 Kết thử nghiệm khả ức chế phát triển nấm sợi phân lập AI1 Nồng độ AI1 (mg/l) Khu TT Tên chủng vực 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Miền Aspergillus flavus 13.1 56 42 36 24 12 Bắc Aspergillus tubingensis 17.2 63 45 32 27 46 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Penicillium chrysogenum 20.4 Aspergillus aculeatus 19.1 Pencillium oxalicum 20.1 Penicillium citrinum 20.2 Aspergillus fumigatus BMLC1-1 Aspergillus ochraceopetaliformis BMLC1-2 Aspergillus asperescens BMLC1-1 Aspergillus sclerotiorum BMLC1-4 Penicillium lanoso BMLC1-5 Pithomyces chartarum BMLC1-6 Neopestalotiopsis sp BMLC1-7 Penicillium chermesinum BMLC2-1 Penicillium roqueforti BMLC2-3 Trichoderma koningiopsis BMLC2-5 Cladosporium tenuissimum BMLC2-6 Cladosporium tenuissimum BMLC2-7 Penicillium toxicarium BMLC2-8 Aspergillus niger BMLC3-4 Pithomyces maydicus BMLC3-6 Aspergillus sp BMLC4-6 Pleospora herbarum BMLC4-7 Humicola insolen BMLC5-5 Aspergillus sydowii BTBB1-1 Aspergillus flavus BTBB1-2 Talaromyces trachyspermus BTBB1-3 Penicillium oxalicum BTBB2-2 Aspergillus sp BTBB5-1 Penicillium decumbens BTBB5-2 Penicillium brevissimum BXMA1-1 Byssochlamys spectabilis BXMA1-2 Aspergillus sydowii BXMA1-3 Aspergillus tritici BXMA1-4 Aspergillus sydowii BXMA1-5 Byssochlamys spectabilis BXMA2-1 Curvularia veruculosa BXMA2-2 Phomopsis sp BXMA2-3 Coprinellus radians BXMA2-4 Aspergillus flavus BXMA3-1 Penicillium oxalicum BXMA3-2 Curvularia lunata BXMA3-5 Penicillium brevissimum BXMA4-1 Penicillium ramusculum BXMA4-2 Perenniporia tephropora BXMA4-4 Aspergillus niger BXMA5-2 Aspergillus niger MADE1-1 Aspergillus aculeatus MADE1-2 46 69 37 66 63 54 62 66 67 58 53 61 65 55 44 42 66 71 39 55 38 44 55 46 57 64 56 53 56 37 58 43 56 53 54 58 38 64 65 62 57 55 37 72 74 67 32 53 25 52 47 42 45 41 37 32 37 41 39 37 28 27 42 53 23 41 25 31 38 31 36 51 42 38 42 25 42 28 41 36 42 35 22 46 42 47 39 34 24 51 52 48 26 47 14 34 32 35 31 35 22 18 22 28 23 21 16 18 26 41 12 28 13 22 26 24 23 36 31 21 31 12 35 16 34 22 28 21 14 35 34 18 25 17 11 38 35 26 13 28 14 16 12 13 16 13 13 15 14 12 11 32 12 13 11 12 19 15 13 19 23 21 11 15 13 21 22 13 25 21 12 14 0 0 0 0 0 0 0 16 0 0 0 0 11 15 0 0 12 11 0 0 14 16 47 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 Penicillium brevicompactum MADE1-3 Penicillium oxalicum MADE1-4 Aspergillus aculeatus MADE2-3 Aspergillus fumigatus C1.1 Fusarium proliferatum C1.2 Cladosporium xanthochromaticum C2.2 Megasporoporia sp C2.3 Curvularia lunata C3.1 Miền Periconia thailandica C3.2 Nam Pithomyces chartarum C3.3 Torula chromolaenae C3.4 Curvularia eragrostidis C5.2 Gliomastix polychroma C5.3 Trichoderma harzianum C5.4 Aspergillus niger TQLG1-1 Aspergillus flavus TQLG1-2 Pencillium oxalicum TQLG1-3 Aspergillus aculeatus TQLG1-4 Penicillium oxalicum TQLG2-2 Penicillium citrinum TQLG3-3 Curvularia genculata TTHF1-2 Aspergillus sclerotiorum TTHF1-2 Chaetomium globosum TTHF1-3 Phanerochaete chrysosporium TTHF1-4 Aspergillus creber TTHF1-5 Lentinus tigrinus TTHF1-6 Miền Aspergillus niger TTHF2-1 Trung Schizophylum commune TTHF2-2 Aspergillus flavus TTHF2-3 Coprinellus disseminatus TTHF2-4 Curvularia clavata TTHF3-2 Nigrospora sphaerica TTHF3-3 Coprinellus radians TTHF3-4 Aspergillus versicolor TTHF4-2 Lasiodiplodia theobromae TTHF4-4 Penicillium citrinum TTHF4-5 Lasiodiplodia theobromae TTHF5-2 Tricoderma harzianum TTHF5-3 Hypoxylon monticulosum TTHF5-4 Khí hậu biển 63 64 58 53 45 34 36 56 37 32 44 65 57 53 73 67 64 54 57 56 53 35 46 44 36 43 65 47 63 36 34 42 39 54 36 43 37 45 32 39 37 42 38 26 17 15 42 21 18 28 51 35 37 54 46 48 42 45 42 38 22 32 18 25 21 49 25 47 18 21 34 17 41 16 31 16 29 18 24 21 35 26 13 36 15 16 42 22 24 41 31 36 26 31 28 25 13 24 11 18 34 13 35 11 19 22 27 25 16 15 13 19 12 0 17 27 14 11 28 18 23 13 19 13 12 11 25 26 13 17 0 0 0 0 13 0 12 15 11 0 0 0 14 13 0 0 0 0 48 Bảng 20 Kết thử nghiệm ảnh hưởng độ ẩm đến khả ức chế nấm sợi AI1 nồng độ mg/l T T 10 11 12 13 14 15 16 T N 0 Độ ẩm thử nghiệm (%RH) 55 79 97 Đ T Đ T Đ T Đ C N C N C N C 22 45 55 61 32 53 62 67 0 0 0 0 0 0 0 34 21 25 28 21 34 37 41 26 31 26 28 34 42 Tên chủng 32 Humicola insolen BMLC5-5 Aspergillus ochraceopetaliformis BMLC1-2 Talaromyces trachyspermus BTBB1-3 Penicillium oxalicum BTBB2-2 Penicillium ramusculum BXMA4-2 Byssochlamys spectabilis BXMA1-2 Curvularia verruculosa BXMA2-2 Aspergillus niger BXMA5-2 Aspergillus niger MADE1-1 Penicillium oxalicum MADE1-4 Curvularia eragrostidis C5.2 Aspergillus flavus TQLG1-2 Pencillium oxalicum TQLG1-3 Aspergillus niger TTHF2-1 Aspergillus flavus TTHF2-3 Penicillium citrinum TTHF4-5 0 0 0 0 0 0 0 56 53 54 46 53 63 58 65 41 54 58 54 47 62 0 0 0 0 0 0 0 Bảng 21 Tổng hợp chủng nấm mã số đăng ký Genbank TT Ký hiệu chủng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 BXMA1-1 BXMA1-2 BXMA1-3 BXMA1-4 BXMA1-5 BXMA2-1 BXMA2-2 BXMA2-3 BXMA2-4 BXMA3-1 BXMA3-2 BXMA3-5 BXMA4-1 BXMA4-2 BXMA4-4 BXMA5-2 BTBB1-1 BTBB1-2 BTBB1-3 BTBB2-2 Mã số Genbank đăng ký MH634479.1 MH634480.1 MH634481.1 MH634482.1 MH634483.1 MH634484.1 MH634485.1 MH634486.1 MH634487.1 MH634488.1 MH634489.1 MH634490.1 MH634491.1 MH634492.1 MH634493.1 MH634494.1 MN396671.1 MN396672.1 MW911783.1 MN396673.1 Tên chủng Penicillium brevissimum Byssochlamys spectabilis Aspergillus sydowii Aspergillus tritici Aspergillus sydowii Byssochlamys spectabilis Curvularia veruculosa Phomopsis sp Coprinellus radians Aspergillus flavus Penicillium oxalicum Curvularia lunata Penicillium brevissimum Penicillium ramusculum Perenniporia tephropora Aspergillus niger Aspergillus sydowii Aspergillus flavus Talaromyces trachyspermus Penicillium oxalicum 65 71 74 76 75 77 73 79 65 67 58 73 68 76 0 0 0 0 0 0 0 71 76 79 82 81 84 86 89 83 85 76 84 87 89 49 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 BTBB5-1 BTBB5-2 BMLC1-1 BMLC1-2 BMLC1-3 BMLC1-4 BMLC1-5 BMLC1-6 BMLC1-7 BMLC2-1 BMLC2-3 BMLC2-5 BMLC2-6 BMLC2-7 BMLC2-8 BMLC3-4 BMLC3-6 BMLC4-6 BMLC4-7 BMLC5-5 13.1 17.2 20.4 19.1 20.1 20.2 MADE1-1 MADE1-2 MADE1-3 MADE1-4 MADE2-3 TTHF1-1 TTHF1-2 TTHF1-3 TTHF1-4 TTHF1-5 TTHF1-6 TTHF2-1 TTHF2-2 TTHF2-3 TTHF2-4 TTHF3-2 TTHF3-3 TTHF3-4 TTHF4-2 TTHF4-4 TTHF4-5 MN396674.1 MN396675.1 MW911781.1 MN394129.1 MZ292395.1 MN394130.1 MZ292396.1 MN394131.1 MN394132.1 MN394134.1 MZ292397.1 MN394133.1 MN394135.1 MN394136.1 MN394137.1 MW911782.1 MN394138.1 MN394139.1 MZ292398.1 MZ292399.1 MN396712.1 MN396713.1 MZ414199.1 MN396714.1 MN396715.1 MN396716.1 MH634495.1 MH634496.1 MH634497.1 MH634498.1 MH634499.1 MN398962.1 MN398963.1 MN398964.1 MN398965.1 MN398966.1 MN398967.1 MN398968.1 MN398969.1 MN398970.1 MN398971.1 MN398972.1 MN398973.1 MN398974.1 MN398975.1 MN398976.1 MN398977.1 Aspergillus spp Penicillium decumbens Aspergillus fumigatus Aspergillus ochraceopetaliformis Aspergillus asperescens Aspergillus sclerotiorum Penicillium lanosum Pithomyces chartarum Neopestalotiopsis spp Penicillium chermesinum Penicillium roqueforti Trichoderma koningiopsis Cladosporium tenuissimum Cladosporium tenuissimum Penicillium toxicarium Aspergillus niger Pithomyces maydicus Aspergillus spp Stemphylium vesicarium Humicola insolen Aspergillus flavus Aspergillus tubingensis Penicillium chrysogenum Aspergillus aculeatus Pencillium oxalicum Penicillium citrinum Aspergillus niger Aspergillus aculeatus Penicillium brevicompactum Penicillium oxalicum Aspergillus aculeatus Curvularia geniculata Aspergillus sclerotiorum Chaetomium globosum Phanerochaete chrysosporium Aspergillus tabacinus Lentinus squarrosulus Aspergillus niger Schizophylum commune Aspergillus flavus Coprinellus disseminatus Curvularia clavata Nigrospora sphaerica Coprinellus radians Aspergillus versicolor Lasiodiplodia pseudotheobromae Penicillium citrinum 50 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 TTHF5-2 TTHF5-3 TTHF5-4 TQLG1-1 TQLG1-2 TQLG1-3 TQLG1-4 TQLG2-2 TQLG3-3 C1.1 C1.2 C2.2 C2.3 C3.1 C3.2 C3.3 C3.4 C5.2 C5.3 C5.4 MN398978.1 MN398979.1 MN398961.1 MZ414200.1 MN396681.1 MN396682.1 MZ414201.1 MN396683.1 MN396684.1 MN398981.1 MN398982.1 MN398983.1 MN398984.1 MN398985.1 MN398986.1 MN398987.1 MN398988.1 MZ148448.1 MN398989.1 MN398990.1 Lasiodiplodia pseudotheobromae Tricoderma harzianum Hypoxylon monticulosum Aspergillus niger Aspergillus oryzae Pencillium oxalicum Aspergillus aculeatus Penicillium oxalicum Penicillium citrinum Aspergillus fumigatus Fusarium proliferatum Cladosporium xanthochromaticum Megasporoporia spp Curvularia lunata Periconia thailandica Pithomyces chartarum Torula chromolaenae Curvularia eragrostidis Gliomastix polychroma Trichoderma harzianum Phụ lục Bảng 22 Thành phần số mơi trường Mơi trường xác định pH Tên hóa chất Tỷ lệ g/L Glucose 2,5 (NH4)2SO4 0,75 MgSO4 · 7H2O NaCl CaCl2 · 2H2O 0,5 Môi trường thử nghiệm khả gây hại theo ISO 9022-11 KH2PO4 K2HPO4 NH4NO3 MgSO4·7H2O NaCl FeSO4·7H2O ZnSO4·7H2O MnSO4·7H2O 0,7 0,7 0,7 0,005 0,002 0,002 0,001