Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Sử dụng microarray khảo sát tương tác giữa kháng thể trong máu bệnh nhân ung thư và các kháng nguyên ngẫu nhiên

Một nghiên cứu được thực hiện vào 2018-2019 cho thấy phương pháp sàng lọc ung thư bằng xét nghiệm miễn dịch tìm máu ẩn trong phân là một trong những chiến lược hợp lý nhằm áp dụng trong

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

LÊ HUỲNH SA

SỬ DỤNG MICROARRAY KHẢO SÁT TƯƠNG TÁC GIỮA KHÁNG THỂ TRONG MÁU BỆNH NHÂN UNG THƯ VÀ CÁC KHÁNG NGUYÊN NGẪU NHIÊN

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Mã số : 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học :

PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán bộ chấm nhận xét 1 :

PGS TS HUỲNH CHẤN KHÔN Cán bộ chấm nhận xét 2 :

TS NGUYỄN MINH NAM Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 06 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 Chủ tịch Hội đồng: PGS TS LÊ PHI NGA 2 Phản biện 1: PGS TS HUỲNH CHẤN KHÔN 3 Phản biện 2: TS NGUYỄN MINH NAM

4 Ủy viên hội đồng: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG 5 Thư ký hội đồng: TS HOÀNG MỸ DUNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Huỳnh Sa MSHV: 2070077 Ngày, tháng, năm sinh: 22-09-1993 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Sử dụng microarray khảo sát tương tác giữa kháng thể trong máu bệnh nhân ung thư và các kháng nguyên ngẫu nhiên (The application of random-sequence peptide microarray for scanning the serum immune signature of common cancers)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nhiệm vụ :

- Khảo sát tương tác miễn dịch của các bệnh ung thư vú, ung thư trực tràng, ung thư phổi và người bình thường đối với các kháng nguyên ngẫu nhiên tổng hợp

- Đánh giá khả năng sử dụng phương pháp microarray trong quá trình sàng lọc/chẩn đoán ung thư

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 15/01/2024 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 20/05/2024 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

- PGS TS Nguyễn Thúy Hương

PGS-TS Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được bài luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ tận tình từ các thầy cô trong ngành Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Kỹ Thuật Hóa Học trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

Đặc biệt là sự hướng dẫn và hỗ trợ từ cô PGS-TS Nguyễn Thúy Hương và thầy TS Nguyễn Hữu Huân với tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài

Kiến thức và những bài học quý giá trong suốt quá trình thực hiện đề tài sẽ là hành trang học thuộc đáng trân trọng nhất đi cùng tôi đến mãi sau này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo của Viện Nghiên cứu Y Sinh và công ty TNHH DV&TM Nam Khoa đã hết sức tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu và thực hiện thí nghiệm

Sau cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên tôi và ủng hộ tôi hết mình trong thời gian hoàn thiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2024

Lê Huỳnh Sa

TÓM TẮT

Ung thư là một trong những vấn đề sức khỏe luôn được quan tâm trong xã hội Những năm gần đây, số bệnh nhân ung thư tại Việt Nam có xu hướng tăng trong khi các phương pháp chẩn đoán và sàng lọc sớm ung thư còn nhiều hạn chế khiến việc phát hiện ung thư thường ở giai đoạn muộn, làm giảm khả năng thành công trong điều trị Do đó, thách thức được đặt ra cho giới khoa học nhằm tìm kiếm phương án sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư Dấu ấn miễn dịch là một công nghệ sử dụng kỹ thuật microarray với những peptide ngẫu nhiên có thể phác họa được phản ứng miễn dịch đối với các chứng bệnh, trong đó có ung thư

Mục tiêu chính của bài nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng về sự khác biệt miễn dịch giữa các loại ung thư phổ biến tại Việt Nam – ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thư phổi – so với nhóm đối chứng

Trong bài sử dụng microarray chứa hơn 100k peptide ngẫu nhiên nhằm định lượng khả năng bám của các kháng thể trong máu của 21 bệnh nhân khỏe mạnh/không triệu chứng so với 48 bệnh nhân ung thư bao gồm ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thử phổi Kết quả được phân tích bằng nhiều phương án dự đoán

Kết quả cho thấy, với hơn 100k peptide ngẫu nhiên được sử dụng, loại microarray này có thể phát hiện ung thư với độ nhạy 70,6%, 53,3% và 52,9% đối với ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thư phổi so với mẫu đối chứng Độ đặc hiệu cho các nhóm mẫu ung thư là 81,8% đối với ung thư trực tràng và 72,7% cho mỗi nhóm ung thư vú và ung thư phổi Kết quả đồng thời chỉ ra dấu ấn miễn dịch của từng loại ung thư so với nhóm đối chứng/không triệu chứng

Tóm lại, bài nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng về việc sử dụng microarray với hơn 100k peptide ngẫu nhiên trở thành một kỹ thuật có thể hỗ trợ sàng lọc nhiều loại bệnh/ung thư trên cùng một dataset thu được Tuy nhiên, để trở thành công cụ sàng lọc chính quy, cần thêm những nghiên cứu chuyên sâu về các giai đoạn ung thư mà phương pháp này có thể xác định Bài nghiên cứu với kỹ thuật microarray chứa các peptide ngẫu nhiên có thể sử dụng để khảo sát các bệnh tương tự, cung cấp cái nhìn tổng quát hơn về phản ứng của hệ miễn dịch với từng chứng bệnh, đồng thời, phương

pháp này còn có khả năng chỉ ra các biomarkers đặc hiệu cho từng loại ung thư nhằm phục vụ quá trình sàng lọc/chẩn đoán sớm

ABSTRACT

Cancer is a major health problem in Vietnam due to the increasing incidence of cancer and unique demographic and environmental factors contributing to the disease burden Early detection significantly reduces mortality and lowers treatment costs Current diagnostic methods often detect cancers already in late stages with clinical symptoms Therefore, there is a great interest early and accurate cancer diagnosis Immunosignature is a novel technology that uses microarrays of random peptides to determine specific profiles of antibody responses of individuals with different diseases

This thesis evaluated the potential of immunosignature using a microarray of 100k random peptides to detect the differences in antibody profiles between a control group and three types of cancer: colon cancer, breast cancer, and lung cancer

Serum antibody binding patterns from 21 healthy individuals and 48 patients with colon, breast, or lung cancer were determined using a microarray of over 100k random peptides The sensitivity and specificity of the microarray for discriminating between the control and cancer groups were calculated using multiple method analysis

The microarray detected colon cancer with a sensitivity of 70.6% and a specificity of 81.8%, while the sensitivity of breast cancer and lung cancer were 53.3% and 52.9%, respectively, with the specificity of 72.7% for each The microarray also revealed distinct immuno-signatures of each cancer types compared to the control group

In conclusion, this thesis demonstrated that immunosignature using a microarray of 100k random peptides is a promising technology for detecting multiple cancers with a single dataset The technology could potentially be applied to other diseases and provide insights into anti-cancer immunity

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện luận văn

DANH MỤC BẢNG BIỂU xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

a Xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật 3

b Phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu 3

c Xác định tính đặc hiệu của phương pháp 3

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tình hình ung thư tại Việt Nam 1

1.2 Cơ sở lý thuyết của dấu ấn miễn dịch 2

1.2.1 Các biomarker liên quan đến ung thư 5

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán 8

1.3 Tình hình nghiên cứu 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại nước ngoài 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Thiết bị và các vật tư tiêu hao 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Thu nhận mẫu 20

2.2.2 Quy trình thực hiện 21

2.2.3 Thuyết minh quy trình 21

2.3 Mẫu được sử dụng trong thử nghiệm 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả thu được từ microarray 27

3.2 Xu hướng khác biệt miễn dịch từng loại ung thư 29

3.2.1 Khác biệt miễn dịch của ung thư trực tràng so với mẫu đối chứng 29

3.2.2 Khác biệt miễn dịch giữa nhóm mẫu ung thư vú và mẫu đối chứng 33

3.2.3 Khác biệt miễn dịch giữa nhóm mẫu ung thư phổi và mẫu đối chứng 363.2.4 Khác biệt miễn dịch giữa các nhóm ung thư 43

3.3 Kiểm chứng khả năng phân biệt của bộ dữ liệu peptide 47

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58PHỤ LỤC 68PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 70

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số chất chỉ thị sinh hóa phổ biến tại các cơ quan khảo sát ung thư 8

Hình 1.2 Sơ đồ về cách thức hoạt động của phương pháp SEREX [31] 10

Hình 1.3 Thiết kế của random-peptide microarray [47] 13

Hình 1.4 Một số kết quả nghiên cứu ban đầu trên random peptide micro-array 14

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện 21

Hình 2.2 Phân bố độ tuổi của các mẫu thu thập được 26

Hình 3.1 Hình ảnh đại diện cho các điểm dữ liệu trên microarray 27

Hình 3.2 Xu hướng phản ứng của hệ miễn dịch lên các peptide ngẫu nhiên phân tích bằng tỷ lệ chênh lệch (bên trái) và giá trị trung vị của màu chính (bên phải) 28

Hình 3.3 Vocalno plot thể hiện sự khác biệt biểu hiện 2 nhóm mẫu ung thư trực tràng và nhóm đối chứng 29

Hình 3.4 Heatmap thể hiện sự khác biệt biểu hiện 2 nhóm mẫu ung thư trực tràng và nhóm đối chứng 30

Hình 3.5 Volcanoplot thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu ung thư vú và nhóm mẫu đối chứng 33

Hình 3.6 Heatmap thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu ung thư vú và nhóm mẫu đối chứng 34

Hình 3.7 Volcano plot thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư phổi 37

Hình 3.8 Heatmap thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư phổi (1) 38

Hình 3.9 Heatmap thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư phổi (2) 39

Hình 3.10 Heatmap thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư phổi (3) 40

Hình 3.11 Volcano plot biểu diễn sự khác biệt giữa từng cặp mẫu ung thư 44

Hình 3.12 Heatmap biểu hiện tại các peptide được khảo sát giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư trực tràng 50

Hình 3.13 Heatmap biểu hiện các peptide được khảo sát giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư vú 51Hình 3.14 Heatmap biểu hiện các peptide được khảo sát giữa nhóm mẫu đối chứng và nhóm mẫu ung thư phổi 52

Bảng 2.5 Số lượng mẫu thu nhận 26

Bảng 3.1 Bảng biểu thị các peptide đầu tiên (sắp xếp theo giá trị p-value) thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa mẫu ung thư trực tràng và mẫu đối chứng 31

Bảng 3.2 Bảng biểu thị 10 peptide đầu tiên (sắp xếp theo giá trị p-value) thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa mẫu ung thư vú và mẫu đối chứng 35

Bảng 3.3 Bảng biểu thị 10 peptide đầu tiên (sắp xếp theo giá trị p-value) thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa mẫu ung thư phổi và mẫu đối chứng (biểu hiện giảm) 41

Bảng 3.4 Bảng biểu thị 10 peptide đầu tiên (sắp xếp theo giá trị p-value) thể hiện sự khác biệt biểu hiện giữa mẫu ung thư phổi và mẫu đối chứng (biểu hiện tăng) 42

Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp sự khác biệt giữa các loại ung thư trong thử nghiệm 44

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát các peptide đặc trưng cho các nhóm mẫu 46

Bảng 3.7 Khả năng dự đoán các mẫu ung thư trực tràng /mẫu không ung thư dựa trên 49 peptide khác biệt giữa các mẫu đối chứng và mẫu ung thư trực tràng 48

Bảng 3.8 Khả năng dự đoán các mẫu ung thư vú/mẫu không ung thư dựa trên 49 peptide khác biệt giữa các mẫu đối chứng và mẫu ung thư vú 48

Bảng 3.9 Khả năng dự đoán các mẫu ung thư phổi /mẫu không ung thư dựa trên 362 peptide khác biệt giữa các mẫu đối chứng và mẫu ung thư phổi 49

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AMACR α-Methylacyl-CoA BC Ung thư vú

BRAF Gen được tìm thấy trên NST số 7, mã hóa cho protein BRAF BSA Bovine serum albumin

CA 15-3 Kháng nguyên carbohydrate 15-3 CC Ung thư trực tràng

cDNA Complementary DNA - chỉ thư viện DNA được tổng hợp ngược từ

mRNA trưởng thành CEA Kháng nguyên Carcinoembryonic c-Myc Gen tiền ung thư

ct-DNA circulating-DNA CTRL Mẫu đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FTA Flinders Technology Associates KLK3 Kallikrein Related Peptidase 3 KRAS Kirsten ras oncogene homolog - một trong những gen liên quan đến ung

thư thế bào nhỏ LC Ung thư phổi NGS Giải trình tự thế hệ mới NIH National Institutes of Health - Học viện sức khỏe Hoa Kỳ PBST Phosphate-buffered saline có chứa Tween

RNA Ribonucleic acid

TAA Tumor associated antigens TIL Tế bào miễn dịch thâm nhiễm khối u TSA Tumor specific antigens

WHO Tổ chức y tế thế giới

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Số lượng các ca mắc ung thư có xu hướng tăng trong thời gian gần đây Theo báo cáo từ GLOBOCAN – WHO đến năm 2020, Việt Nam đứng thứ 91/185 về tỷ lệ mắc mới và thứ 50/185 về tỷ lệ tử vong trên 100.000 người (thứ hạng này tương ứng của năm 2018 là 99/185 và 56/185) Trong đó, ung thư phổ biến trên nam giới bao gồm ung thư gan, phổi dạ dày, đại trực tràng; đối với nữ, ngoài các ung thư phổ biến tương tự như ở nam giới, ung thư vú cũng là một trong những ung thư phổ biến

Nguyên nhân gây nên tình trạng gia tăng tỷ lệ mắc ung thư chủ yếu do môi trường sống ô nhiễm, lối sống thiếu tích cực và tuổi tác Bên cạnh đó, những hạn chế về mặt kỹ thuật trong khả năng sàng lọc ung thư làm gia tăng chi phí sàng lọc, cùng với việc chương trình sàng lọc quốc gia chưa phát triển kịp thời với dân số ngày càng tăng nhanh của Việt Nam khiến ung thư trở thành gánh nặng [1]

Hầu hết các phương án sàng lọc ung thư đều xoay quanh các yếu tố liên quan đến trực tiếp đến khối u như các thụ thể hormone, hoặc glycoprotein [2] hoặc các đột biến gen từ khối u [3] Hệ miễn dịch tự nhiên luôn bảo vệ cơ thể trước các tác nhân gây bệnh, kể cả ung thư bằng các cơ chế nhận diện tế bào lạ và tế bào bình thường trong cơ thể Tuy nhiên, các tế bào ung thư lại có nguồn gốc từ chính tế bào của cơ chủ, chúng có nhiều cách để né tránh hệ miễn dịch, tạo cơ hội để tiếp tục tồn tại, bao gồm: tự tạo đột biến nhằm “che mắt” hệ miễn dịch, tiết ra một số tín hiệu hoặc hình thành protein bề mặt có khả năng ức chế hoạt động của các tế bào miễn dịch [4], dẫn đến khả năng tạo ra tín hiệu dương tính hoặc âm tính giả nếu chỉ khảo sát trên một loại chỉ thị miễn dịch ung thư

Những năm gần đây việc nghiên cứu sàng lọc và chẩn đoán quá trình ung thư vẫn luôn được chú tâm, trong đó, cùng với sự phát triển nhanh chóng trong kỹ thuật sinh học phân tử, một số kỹ thuật phát hiện gen đột biến liên quan đến ung thư được đẩy mạnh [2] Vai trò của hệ miễn dịch đối với ung thư hiện vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên, hệ miễn dịch, cụ thể là các kháng thể tỏ ra ưu thế hơn về số lượng biểu

hiện so với các mảnh vật liệu di truyền như DNA hoặc RNA từ khối u di chuyển tuần hoàn trong máu [5] Vì tính chất đặc biệt về nguồn gốc của các tế bào ung thư, chúng có tạo ra các mảnh protein lạ mang tính kích thích miễn dịch (neoantigens), do đó, hệ miễn dịch có khả năng tiết ra các kháng thể hoặc có hoạt động miễn dịch khác biệt so với các chứng bệnh khác [6] Tổ hợp các phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với từng chứng bệnh có thể tạo thành xu hướng miễn dịch, nhằm khảo sát sự tồn tại của xu hướng miễn dịch đối với ung thư và xem xét tính đặc trưng của xu hướng cần kỹ thuật có khả năng phát hiện trên diện rộng tất cả các phản ứng miễn dịch có liên quan

Microarray là một kỹ thuật cao năng – khả năng tầm soát nhiều đích đến cùng một lúc, đồng thời, quy trình thực hiện so với các kỹ thuật phân tử có phần đơn giản hơn Việc kết hợp khảo sát hệ miễn dịch trên microarray mở ra khả năng khảo sát xu hướng miễn dịch có trong máu, cung cấp tiềm năng phân biệt bệnh dựa trên phản ứng miễn dịch chung, trong đó có ung thư Đồng thời, giả thuyết nếu có đủ cơ sở dữ liệu về miễn dịch, có thể sẽ phát hiện và phân biệt được nhiều chứng bệnh cùng lúc, cung cấp thông tin cụ thể cụ thể hơn cho quá trình điều trị

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tạo nguồn dữ liệu sơ khởi cho kỹ thuật phân tích microarray dành cho miễn dịch ung thư trên mẫu máu

- Xây dựng quy trình ứng dụng microarray tầm soát dấu ấn miễn dịch của ung thư trên mẫu máu

- Khảo sát khả năng phân biệt ba loại ung thư phổ biến dựa trên dấu ấn miễn dịch bằng kỹ thuật microarray

- Khảo sát khả năng phân biệt các giai đoạn ung thư dựa trên dấu ấn miễn dịch

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên bệnh phẩm là máu toàn phần hoặc serum của các bệnh nhân ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư trực tràng

Mẫu được thu nhận tại các cơ sở khám chữa bệnh và phân loại theo bảng thông tin đính kèm về tình trạng bệnh và tình trạng mẫu

Địa điểm: Phòng thử nghiệm thuộc Viện nghiên cứu Y sinh (BRI) tại quận 7, thành phố Hồ Chí Minh

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

a Xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật Thực hiện thí nghiệm trên mẫu máu toàn phần, mẫu serum được gửi đến phòng thí nghiệm

Thu thập và chọn lọc thông tin mẫu

b Phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu

Tiến hành thực hiện microarray trên các mẫu đã thu nhận theo các set: - Training set: bao gồm mẫu đối chứng và mẫu bệnh, sử dụng để tạo cơ sở dữ

liệu - Testing set: các mẫu bệnh đã biết (hoặc chưa biết) kết quả, sẽ được sử dụng

nhằm kiểm tra khả năng sử dụng cơ sở dữ liệu thu nhận được từ training set Xây dựng cơ sở dữ liệu dựa trên các thông tin đã thu nhận từ các cơ sở khám chữa bệnh (thông tin về tuổi, giới tính, tình trạng bệnh/giai đoạn/tiến triển bệnh tại thời điểm lấy mẫu)

c Xác định tính đặc hiệu của phương pháp

Sử dụng một số thuật toán thống kê nhằm xây dựng, lựa chọn và đánh giá các mô hình phân tích dữ liệu phân loại các ung thư dựa trên dữ liệu thô từ microarray

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kiểm chứng quy trình ứng dụng microarray phát hiện dấu ấn miễn dịch dành cho ung thư đối với người Việt Nam

- Ứng dụng kỹ thuật mới trong việc tầm soát và phát hiện sớm các loại ung thư phổ biến một cách hiệu quả hơn

- Tạo nền tảng cho các nghiên cứu về miễn dịch đối với ung thư - Cung cấp nền tảng cơ sở dữ liệu cho một số ứng dụng về cá nhân hóa vaccine

chữa ung thư tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình ung thư tại Việt Nam

Tính đến năm 2020, theo báo cáo của WHO, Việt Nam đứng thứ 91/185 về tỷ lệ mắc mới và thứ 50/185 về tỷ lệ tử vong trên 100.000 người (thứ hạng này tương ứng của năm 2018 là 99/185 và 56/185) Ở các nước phát triển như Hoa Kỳ, Anh, Pháp, Ý và một số quốc gia tại Châu Á (Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản), chỉ số mắc phải mới tương tự, tuy nhiên, tỷ lệ tử vong do ung thư tại các quốc gia này lại giảm

Nguyên nhân có thể bao gồm: - Một số biến đổi về môi trường trong quá trình công nghiệp hóa tại các quốc

gia đang phát triển ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe, việc tiếp xúc hoặc phơi nhiễm nhiều tác nhân hóa học có nguy cơ gia tăng khả năng ung thư

- Sự quan tâm chưa đúng mực của xã hội đối với ung thư tại các nước chưa vững mạnh kinh tế như Việt Nam nói riêng và các nước khu vực Đông Nam Á nói chung

Theo WHO thống kê năm 2020, tại Việt Nam, các ung thư phổ biến ở nam giới gồm ung thư gan, phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến là những ung thư phổ biến nhất (chiếm khoảng 65.8% tổng các loại ung thư) Ở nữ giới, các bệnh ung thư phổ biến gồm ung thư vú, phổi, đại trực tràng, dạ dày, gan (chiếm khoảng 59.4% tổng các loại ung thư)

Ung thư trực tràng là một trong những loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao tại Việt Nam Chương trình sàng lọc ung thư quốc gia cho ung thư trực tràng chủ yếu dành cho lứa tuổi trên 50, tuy nhiên, lứa tuổi mắc loại ung thư này đang có xu hướng trẻ hóa [7] Một nghiên cứu được thực hiện vào 2018-2019 cho thấy phương pháp sàng lọc ung thư bằng xét nghiệm miễn dịch tìm máu ẩn trong phân là một trong những chiến lược hợp lý nhằm áp dụng trong quá trình sàng lọc sớm ung thư cho những địa phương có nguồn lực giới hạn tại Việt Nam Khoảng 67,8% bệnh nhân thường được chẩn đoán vào giai đoạn muộn III hoặc IV, trong khi đó, việc được sàng lọc và chẩn đoán sớm hơn có thể nâng khả năng sống sót trong vòng 5 năm lên đến 89,9% [8]

Mặc dù có mặt trong chương trình sàng lọc ung thư tại các điểm chăm sóc y tế trên toàn quốc, tuy nhiên đối tượng tiếp cận chương trình sàng lọc vẫn chưa đạt được mức hợp lý, việc kết hợp sàng lọc lâm sàng về polyp đại trực tràng cho lứa tuổi 40 trở lên cần được cân nhắc thực hiện [9]

Bên cạnh đó, ung thư vú tại Việt Nam cho thấy có tỷ lệ sống sót trong vòng 5 năm thấp hơn so với các nước khác với cùng nền tảng nghiên cứu

Ung thư phổi phổ biến tại Việt Nam một phần do thói quen hút thuốc và tác hại của khói thuốc đối với những người xung quanh [10] Tỷ lệ sống sót theo 4 giai đoạn tiến triển của ung thư phổi giảm dần từ giai đoạn I đến IV, tuy nhiên, số 70-80% bệnh nhân thường được phát hiện đã bắt đầu đến giai đoạn III hoặc IV trong khi các phương án sàng lọc sớm qua hình ảnh chụp cắt lớp CT liều thấp (LDCT) chưa thực sự hiệu quả do thiếu trang thiết bị [11]

Việc thiếu thốn trong quá trình sàng lọc ung thư cũng như phương án sàng lọc sớm một cách kinh tế và hiệu quả cao là một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng khó kiểm soát tình trạng ung thư tại Việt Nam, bên cạnh các yếu tố về thói quen sinh hoạt, môi trường sống [12], để việc phát hiện và chữa trị ung thư kịp thời vẫn là chưa khả thi [13]

Vì vậy, phương pháp sàng lọc ung thư phổ rộng và hiệu quả nhằm phát hiện sớm ung thư là cần thiết cho sức khỏe cộng đồng tại Việt Nam

1.2 Cơ sở lý thuyết của dấu ấn miễn dịch

Ung thư xuất phát từ việc các một hoặc một vài tế bào trong cơ thể phát triển bất thường phân chia không kiểm soát tạo thành khối u lớn, chèn ép và xâm nhập các tế bào hoặc cơ quan xung quanh dẫn đến các mô bị phá hủy, các chức năng cơ quan bị ảnh hưởng Nguyên nhân dẫn đến ung thư thường được biết đến là do đột biến soma (phản ứng phosphorylation, acetylation, glycosylation…) hoặc đột biến DNA trong quá trình sống dưới tác động của môi trường hoặc do di truyền

Các khối u tiết ra các kháng nguyên được biết đến bao gồm 2 loại chính: tumor associated antigens (TAA) là những antigen có trên tế bào nơi đang diễn ra khối u (lành và ác tính) và tumor specific antigens (TSA) là những antigens đặc hiệu trên tế

bào khối u Cụ thể, TAA là các protein được quy định bởi những gen không đột biến, có biểu hiện quá mức trong khối u ác tính tuy nhiên, chúng vẫn có thể được biểu hiện trong cơ thể bình thường bởi các tế bào khác với một mức độ nhất định Tế bào ung thư luôn có những rối loạn về di truyền, với tần suất đột biến cao trên toàn bộ genome, kết quả có thể tạo thành các chuỗi acid amin khác với các tế bào bình thường, được phân loại là TSA

Hệ miễn dịch tự nhiên có khả năng ngăn chặn tế bào ung thư thông qua việc nhận diện các kháng nguyên liên quan đến khối u (như TAA hoặc TSA) Cụ thể, cytotoxic T lymphocyte sẽ phát hiện các tế bào bất thường thông qua TAA được thể hiện trên bề mặt tế bào, từ đó phá hủy các tế bào bất thường; tế bào giết tự nhiên (NK killer cells) tuy không có khả năng nhận diện receptor nhưng vẫn có thể nhận diện được tế bào ung thư và tế bào thường Cùng với các tế bào khác như đại thực bào, tế bào tua trong hệ miễn dịch tế bào giúp phần nào tiêu diệt và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào bất thường Mặt khác, nói đến miễn dịch dịch thể, các kháng thể đặc hiệu chưa được chứng minh có tác động rõ rệt trong quá trình ngăn chặn quá trình phát triển của khối u, tuy nhiên, các autoantibody được tìm thấy có phản ứng đặc hiệu với các peptide có nguồn gốc từ khối u ung thư tuyến tiền liệt [14][15] là một bước tiến mới trong việc tìm kiếm phương án sàng lọc ung thư Khi các TAA xuất hiện, các receptor trên tế bào B sẽ đến liên kết và thu nhận thông tin về loại antigen này, quá trình được hỗ trợ bởi BCR – Igalpha/beta và CD19, CD21, CD81 Trải qua quá trình trình diện kháng nguyên, tế bào B được kích hoạt sẽ sản xuất các autoantibodies tương ứng vào máu Các autoantibodies có chu kỳ bán rã từ 7 đến 30 ngày [16], bên cạnh đó, chúng được xem là ứng cử viên tiềm năng cho việc dự đoán sớm ung thư do sự tăng sinh nhanh về số lượng ngay cả khi lượng antigen còn rất nhỏ [17] Mặc dù chưa rõ cơ chế kháng lại khối u của các autoantibody trong huyết thanh và sự xuất hiện của chúng không thể hiện cơ chế chống lại khối u, tuy nhiên có thể hình thành một kiểu dấu ấn dự báo sự bất thường trong cơ thể hoặc sự tiến triển của một loại bệnh đang xâm lấn cơ thể [18] Một số nghiên cứu cho thấy, autoantibodies trong một vài trường hợp có thể được sử dụng để chẩn đoán sớm ung thư, theo đó, mức độ các autoantibodies được biểu hiện tăng cao chống lại các khối u đã được phát hiện ở nhiều

bệnh nhân ung thư, cho thấy loại kháng thể này có thể đóng vai trò là biomarker tiềm năng [19] Một số autoantibodies có thể kể đến như autoantibody chống p53 được phát hiện trên bệnh nhân ung thư vú và ung thư biểu mô cổ tử cung hoặc autoantibody chống kháng nguyên khối u NY-ESO-1 được phát hiện trên bệnh nhân ung thư phổi… Bên cạnh đó, neoantigens được xem là một phần của TSA, là những protein lạ sinh ra từ nhiều loại đột biến (mất đoạn, chèn đoạn, đột biến điểm, hoặc gen fusion) trên gen hoặc RNA trong quá trình sinh tổng hợp, có khả năng gây kích thích hệ miễn dịch Số lượng và loại đột biến thường khác nhau đặc trưng cho từng khối u hoặc từng cá thể mang bệnh Cụ thể, có hai loại neoantigens liên quan đến ung thư được phân biệt như sau: Một loại neoantigen là các antigen được sinh ra từ các đột biến phổ biến của các loại ung thư và không hiện diện trong tế bào bình thường; loại còn lại là các đột biến khác biệt giữa các bệnh nhân, neoantigen theo hướng cá nhân hóa này đang là đích đến của nhiều nghiên cứu về trị liệu ung thư theo liệu pháp miễn dịch [20] Việc chuyển hướng sang neoantigens trở nên phổ biến trong vòng 20 năm trở lại đây

Lợi thế của neoantigens so với TAA bao gồm: - Neoantigen xuất phát từ chính khối u, tránh được tình trạng đánh trúng tế bào

thường - Đột biến soma, tránh được tình trạng T cell tự miễn thể hiện tính đặc hiệu, lưu

giữ được lâu trong hệ miễn dịch [21] Tuy nhiên, cho đến nay, việc phát hiện neoantigen và dự đoán khả năng đáp ứng của hệ miễn dịch cho từng neoantigen đang gặp khó khăn Hầu hết các nghiên cứu đều nhắm đến các đột biến trên exome, định type HLA, sử dụng thuật toán phân tích biểu hiện đột biến, dự đoán lực gắn TCR binding, ái lực với MHC, v.v [20] Để giải quyết vấn đề đó, phương pháp microarray dựa trên dấu ấn miễn dịch, khảo sát khả năng miễn dịch của cơ thể đối với các neoantigen được phát triển Đối với ung thư, khối u ác tính biến đổi tế bào gây sự biến đổi về DNA Neoantigen chính là hậu quả của sự đột biến DNA trong khối u, có khả năng kích thích hệ miễn dịch hoạt động chống lại khối u Do đó, nếu được quan tâm đúng mực và được hiểu rõ hơn, neoantigen trong tương lai gần sẽ có thể được sử dụng để tạo ra vaccine cho ung thư

Trong nhiều năm nghiên cứu, các tế bào miễn dịch được chứng minh có khả năng đáp ứng miễn dịch đối với các neoantigen được tạo ra do hậu quả của DNA bất thường từ các khối u ngay cả trong giai đoạn mới bắt đầu Hơn nữa, việc phát hiện neoantigen đóng vai trò quan trọng trong việc chữa trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch Neoantigen cho thấy sự tương quan về số lượng và loại epitope mà các tế bào ung thư khác nhau tạo ra, đồng thời, cũng khảo sát được tính khả thi của phương pháp điều trị - có thể tạo ra epitope phù hợp để chống lại tế bào ung thư đích hay không [22]

Nhìn chung, các biomarker tuần hoàn trong máu, bao gồm ct-DNA hoặc các yếu tố miễn dịch như autoantibodies, neoantigen đều là những yếu tố tiềm năng trong quá trình sàng lọc/chẩn đoán không xâm lấn bằng phương pháp sinh thiết lỏng [23]

Tuy vậy, trên nền tảng có nhiều tác nhân ảnh hưởng sự hoạt động của hệ miễn dịch (neoantigen, autoantibodies), giả thuyết về một xu hướng miễn dịch, tổng hợp tất cả các tín hiệu miễn dịch nói trên mang tính đại diện cho một chứng bệnh truyền nhiễm hoặc có ảnh hưởng đến miễn dịch được đặt ra Theo đó, phương án hỗ trợ hệ miễn dịch bằng các liệu pháp miễn dịch trong việc chống lại ung thư cũng đang có những bước tiến rõ rệt dựa trên việc tìm hiểu và nghiên cứu đối tượng kháng thể Số lượng kháng thể được sản sinh có thể gấp nhiều lần so với kháng nguyên có mặt trong cơ thể, do đó, việc xác định kháng thể có thể đơn giản hơn so với việc phát hiện các tác nhân mức độ phân tử khác, dẫn đến khả năng tiết kiệm chi phí và thời gian thực hiện

1.2.1 Các biomarker liên quan đến ung thư

Biomarker chỉ điểm ung thư có thể là những sản phẩm chuyển hóa do khối u ung thư hoặc tế bào khác phát ra hoặc một số hocmon/enzyme tăng mạnh bất thường về hàm lượng nhằm hỗ trợ hoạt động của ung thư Các biomarker được tìm thấy chủ yếu trong dịch thể, mô và tế bào Biomarker trong máu thường xuyên được chú ý vì tính ứng dụng cao, ít xâm lấn, thuận tiện hơn so với các phương án chẩn đoán hình ảnh hoặc sinh thiết mô

1.2.1.1 Các biomarker nucleotide

Đi từ nguồn gốc của các đột biến, DNA/RNA là mục tiêu ưu tiên của các nhà nghiên cứu trong quá trình sàng lọc chẩn đoán cũng như điều trị Gen BRAF, KRAS có vai trò trong quá trình phát triển bình thường của tế bào, các đột biến được tìm thấy trên các gen này được cho là có liên quan đến việc biểu hiện bất thường của tế bào, có mặt trong nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư đại tràng (10%), ung thư sắc tố da (50%) [3] Tuy nhiên, các đột biến lại có khả năng bị ảnh hưởng bởi giai đoạn hoặc giới tính [24] Các gen này thường được kiểm tra chủ yếu phục vụ công tác chẩn đoán giai đoạn và điều trị

Gần đây, với sự phát triển của công nghệ giải trình tự, việc phát hiện sự tồn tại của circulating-DNA (ct-DNA) do các tế bào khối u phát vào dòng máu, đã giúp các nhà phát triển có cơ hội đưa sinh thiết lỏng lên tầm cao mới, phát hiện được gen lạ của các khối u, đồng thời có thể dự đoán các đột biến liên quan đến khối u Công nghệ hiện tại có thể giúp phát hiện các khối u có kích thước từ 11-15mm, nếu kích thước bé hơn, khả năng xuất hiện của ctDNA trong dòng máu chỉ đạt 0,01%, khi đó sẽ cần các công cụ khác đặc hiệu hơn để hỗ trợ phân tích và chẩn đoán [25]

Trên nền tảng sinh học phân tử, ctDNA và miRNA là những đối tượng được quan tâm miRNA có vai trò điều hòa biểu hiện gen, chúng tham gia vào một số quá trình tế bào như tăng sinh, biệt hóa hay chu trình chết tự nhiên Một số kiểu biểu hiện miRNA được nghiên cứu có thể có khác biệt giữa người bình thường và nhóm bệnh, thậm chí, khác biệt giữa những giai đoạn hoặc tiến triển khác nhau của cùng một loại ung thư Thách thức chung trong việc sử dụng các biomarker phân tử đến từ việc số lượng chúng được sản sinh không quá nhiều, thời gian lưu hành trong máu của ct-DNA chỉ từ 15 phút đến 2,5 giờ, đôi khi gây khó khăn cho việc phát hiện [26] [27] Đồng thời, khó khăn chính của kỹ thuật phân tích ctDNA chính là nồng độ của ctDNA tương đối thấp (dưới 1%) [28] dẫn đến việc khó khăn trong quá trình trang bị thiết bị và máy móc trong thực tế tại một số địa phương

Cùng với sự hỗ trợ của NGS, các nghiên cứu trên trình tự gen ngày càng được chú trọng, đòi hỏi kỹ thuật phân tích trình tự chuyên nghiệp, hơn nữa, các đột biến

trên gen phù hợp hơn với việc nghiên cứu về mặt thay đổi và tiến hóa của khối u và khả năng đáp ứng thuốc điều trị của bệnh nhân

1.2.1.2 Các biomarker dựa trên cơ sở miễn dịch / protein

Protein là sản phẩm biểu hiện từ các DNA/RNA, phải trải qua nhiều quá trình biến đổi sinh học để thực hiện hoặc biểu hiện đúng chức năng [29], do đó, nhiều phương án nghiên cứu được triển khai và áp dụng nhắm đến protein hoặc các sản phẩm tương tự sản sinh từ cơ thể hoặc từ chính khối u đột biến trong quá trình tiến triển ung thư

Khảo sát hoạt động các hocmon hoặc các hợp chất bổ trợ cho quá trình phát triển của tế bào ung thư cũng mang đến những giá trị nhất định trong chẩn đoán Một số biomarker tìm thấy trong máu phổ biến thường được nhắc đến liên quan đến ung thư như:

- CEA (Carcinoembryonic antigen) là protein được tìm thấy trong mô của bào thai phát triển trong tử cung, nồng độ protein này giảm mạnh sau khi sinh, được phát hiện liên quan đến một số ung thư về đường tiêu hóa, ung thư phổi; - CA 15-3 (carbohydrate antigen 15-3) là hợp chất mucin được tìm thấy ở vùng

ngoại bào, biểu hiện quá mức khi bệnh nhân mắc ung thư vú; - PSA (Prostate-specific antigen) một kháng nguyên đặc hiệu được tiết ra từ các

tế bào biểu mô của tuyến tiền liệt được mã hóa bởi gen KLK3 - Cùng với các biomarker phổ biến kể trêm, một số protein biomarker khác như Cancer antigen 125 (CA-125), Cytokeratin fragment 21-1 (CYFRA 21-1), New York esophageal squamous cell carcinoma 1 (NY-ESO-1), Galectin-3 recombinant protein (LG3BP), Complement fragment C4d, v.v., có tiềm năng hỗ trợ sàng lọc ung thư khi sử dụng kết hợp với một số phương pháp hoặc chỉ số sinh hóa khác Độ nhạy và độ đặc hiệu của loại biomaker trong máu chịu sự ảnh hưởng từ nhiều yếu tố khác như giai đoạn tiến triển, cộng đồng sinh sống và phương pháp phát hiện, việc sử dụng và hiểu về tổ hợp các biomarker này để có thể cung cấp kết quả toàn diện về tình trạng sức khỏe sẽ cần tham khảo nhiều nguồn kết quả nghiên cứu

Về việc nghiên cứu các kháng nguyên đặc hiệu từ khối u, công tác nghiên cứu điều trị bằng miễn dịch phát hiện ra các autoantibody có phản ứng với các kháng nguyên đặc hiệu từ khối u, tạo thành tổ hợp các tín hiệu miễn dịch Autoantibody có mặt trong cơ thể với hàm lượng cao so với ctDNA hoặc kháng nguyên đặc hiệu, do đó, việc phát triển kỹ thuật phát hiện kháng nguyên tự miễn có giá trị ứng dụng cũng như nghiên cứu cao Autoantibody những năm gần đây được nghiên cứu nhiều trong việc chẩn đoán cũng như sàng lọc ung thư [18], [30], đang được xem là những mũi phát triển tiềm năng trong việc hỗ trợ điểu trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch Autoantibody có thể được phát hiện trong máu ngay cả khi các triệu chứng mới chuẩn bị khởi phát hoặc khi đã phát hiện được thông qua chẩn đoán hình ảnh Autoantibody được nghiên cứu và xem xét như một phương án quản lý rủi ro ung thư [27]

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán

1.2.2.1 Chẩn đoán hình ảnh và các thử nghiệm sinh hóa

Quy trình sàng lọc ung thư hiện tại tại đa số các cơ sở y tế tại Việt Nam đều thông qua các bước cơ bản bao gồm:

Trong đó, các phương pháp được sử dụng cho sàng lọc lâm sàng nói chung bao gồm các phương pháp chẩn đoán hình ảnh chụp X-ray, CT hoặc siêu âm đồng thời

Khám sàng lọc triệu chứng

lâm sàng

Chẩn đoán cận lâm sàng

Xét nghiệm đánh giá giai

đoạn

Tiến hành điều trị

Hình 1.1 Một số chất chỉ thị sinh hóa phổ biến tại các cơ quan khảo sát ung

thư

với xét nghiệm một số chất chỉ thị ung thư phổ biến (ví dụ AFP, CEA, CA-125…) hoặc riêng đối với ung thư trực tràng sẽ thực hiện thêm xét nghiệm về máu trong phân để xác định Nhìn chung, quá trình này cần khảo sát một loạt các cơ quan có khả năng xuất hiện ung thư, tốn thời gian nếu không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt như ung thư phổi hoặc ung thư vú mà không xem xét đến bệnh sử Mặt khác, các phương án chẩn đoán hình ảnh chỉ có thể phát hiện các khối u khi kích thước của chúng bắt đầu có thể nhận dạng bằng mắt thường do đó dẫn đến việc chậm trễ thời gian chữa trị Trong quy trình tầm soát ung thư vú hiện tại, chụp nhũ ảnh là một trong những phương án chẩn đoán tiêu biểu, góp phần không nhỏ cho quá trình phát hiện và điều trị ung thư vú, thường được chỉ định thực hiện định kỳ cho các đối tượng có nguy cơ cao

Đối với chẩn đoán ung thư phổi, phương pháp được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán và sàng lọc ung thư phổi là CT liều thấp (LDCT) cho các cá nhân có nguy cơ cao LDCT cho thấy có thể giảm được 20% tỷ lệ tử vong do ung thư phổi nhờ phát hiện sớm hơn so với chụp X quang bình thường

Chẩn đoán đánh giá giai đoạn là yếu tố quan trọng trong việc hỗ trợ điều trị đích khối u ung thư, do đó, phương pháp chính xác nhất đến hiện nay là sinh thiết mô, qua đó đánh giá tình trạng tế bào khối u, xác định, đánh giá u nguyên phát Tuy nhiên, phương pháp này không thể đồng bộ giữa các khối u, vị trí lấy mẫu có thể ảnh hưởng đến tính đầy đủ kết quả

Sinh thiết lỏng là phương pháp sinh thiết không xâm lấn nhằm phát hiện vật chất di truyền từ khối u lưu hành tự do trong dịch cơ thể (cơ bản là máu)

Từ đầu thế kỷ 21, khá nhiều các loại biomarker như protein, các chất sinh hóa lưu hành trong huyết thanh được nghiên cứu sử dụng trong việc hỗ trợ sàng lọc ung thư sớm, ví dụ CA-125, CA-27-29, CEA, CA 19-9… Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện khi có chỉ định nhằm khảo sát hoạt động của các biomarker thuộc nhóm protein nói trên liên kết với nhiều xét nghiệm lâm sàng khác để khẳng định sự hiện diện của ung thư Cụ thể, đối với ung thư trực tràng, phương pháp xét nghiệm máu trong phân thường xuyên được áp dụng, tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu lên đến 98% nhưng bị hạn chế bởi độ nhạy thấp (26%) [29]

Mặc dù vậy, các chỉ số về chất chỉ thị ung thư nói trên cũng đóng góp một phần không nhỏ trong quá trình hỗ trợ điều trị, nhằm phần nào đánh giá hiệu quả sau khi điều trị

1.2.2.2 Các phương pháp phát hiện và sàng lọc dựa trên cở sở phân tử

Đối với các biomarker cấp độ phân tử như DNA/RNA, miRNA, hoặc ctDNA, các kỹ thuật phân tử liên quan như PCR, giải trình tự thế hệ mới…được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu và ứng dụng Trong đó, việc giải trình tự đoạn gen BRCA có thể sàng lọc gen mang ung thư ở những bệnh nhân có tiền sử gia đình có ung thư Tuy nhiên, cần cân nhắc chi phí thực hiện sàng lọc tương đối cao [31], do đó cần cân nhắc thực hiện cùng với các sàng lọc cơ bản về độ tuổi, tiền sử gia đình [32]

SEREX (serological analysis of recombinant tumor cDNA expression libraries) là phương pháp từng được sử dụng để phát hiện các kháng nguyên khối u trong máu đối với bệnh nhân ung thư phổi, ung thư trực tràng, ung thư gan, ung thư bao tử, v.v [33] Tuy nhiên, thu nhận mRNA từ khối u hoặc từ huyết thanh của bệnh nhân tương đối khó khăn (hình 1.2) do tần suất lưu hành của chúng trong máu, các phương pháp thu nhận có giới hạn, khiến phương án này trở nên khó thực hiện trên diện rộng cũng như tốn kém về mặt thời gian và đầu tư về trang thiết bị cần thiết hỗ trợ cho các kỹ thuật chính

Hình 1.2 Sơ đồ về cách thức hoạt động của phương pháp SEREX [33]

Như đã bàn luận ở trên, đa số các kỹ thuật phân tử đều có phổ hoạt động tương đối hẹp, nhắm đến các gen đích nhất định, kỹ thuật thực hiện tương đối cao kéo theo

mức chi phí thực hiện cao hơn các phương án sàng lọc thường quy như xét nghiệm sinh hóa hay chụp X-quang

1.2.2.3 Các phương pháp phát hiện và khảo sát hoạt động kháng thể

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển, bên cạnh các phản ứng sinh hóa, phương pháp ELISA giúp phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng p53 và một số các kháng thể liên quan được sử dụng trong chương trình sàng lọc tại một số quốc gia Tuy nhiên, hạn chế của phương án này là lưu lượng khảo sát thấp, chỉ khảo sát trên kháng thể kháng p53 là chưa đủ [17] Một số các autoantibody như p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, SOX2, HuD, và MAGE A4 được đánh giá có tiềm năng trong việc phát hiện sớm ung thư Nghiên cứu cho thấy nhóm autoantibody có thể đạt độ đặc hiệu lên đến 93% nhưng độ nhạy vào khoảng 40% [27] Tuy nhiên autoantibody có thể không được tìm thấy, hoặc vẫn có mặt ở nồng độ thấp khi mắc một số chứng bệnh khác Do đó, việc sử dụng phương án này trong quá trình sàng lọc bệnh ung thư phổi vẫn cần được cân nhắc hoặc kết hợp nhiều yếu tố khác để kiểm chứng Trong thực tế, ELISA vẫn chưa được áp dụng nhiều trong sàng lọc, chủ yếu được sử dụng nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu kháng nguyên/kháng thể cho ung thư

1.2.2.4 Microarray và ứng dụng trong nghiên cứu miễn dịch

Trong quá trình phát triển giải trình tự thế hệ mới, một loạt database về các biomarker có bản chất DNA/RNA có thể được sử dụng trong quá trình chẩn đoán bệnh Bên cạnh đó, để phục vụ quá trình phát hiện và phân tích protein, kỹ thuật khối phổ được phát triển nhanh Tuy nhiên, nhược điểm chính của các biomarker nói trên là nguồn gốc – tỷ lệ phát tán và lưu hành khá nhỏ đòi hỏi kỹ thuật phải có độ nhạy cực kỳ cao để truy vết được hoặc dùng kết hợp với các phương pháp chẩn đoán khác

Phương pháp phát hiện kháng thể thường có độ nhạy cao do tốc độ tăng trưởng theo cấp số nhân của kháng thể khi phát hiện tác nhân lạ trong cơ thể Microarray là phương pháp có mức đọc dung lượng lớn so với các phương án trên cùng nền tảng miễn dịch như ELISA, được ứng dụng trong các nghiên cứu phổ rộng hoặc khảo sát xu hướng Trong khi ELISA thường là những monoplex, microarray cho phép thực hiện định lượng cho nhiều đối tượng cùng lúc [34]

Riêng đối với nghiên cứu trên ung thư, microarray thường xuyên được sử dụng nhằm khảo sát sự có mặt của nhiều kháng nguyên khối u cùng lúc với lượng mẫu tiêu thụ không quá nhiều [35], đồng thời, peptide microarray cũng là công cụ hữu ích hỗ trợ mô tả các đặc tính phản ứng miễn dịch đối với các kháng nguyên khối u đã biết [36][37] Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều dựa trên các peptide thuộc các kháng nguyên đã biết để khảo sát phản ứng miễn dịch, điều này có thể dẫn đến việc đánh giá chưa toàn diện và bỏ sót một vài xu hướng tích cực cho việc phát hiện các chứng bệnh, nhất là các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch tự miễn như ung thư

Mặt khác, mục đích chính của phương pháp là nhằm khảo sát được loạt kháng thể được hình thành trong cơ thể bằng cách cho chúng tương tác với 10.000 hoặc nhiều hơn, có thể lên đến 30.000 các đoạn peptide được tổng hợp ngẫu nhiên nhằm xác định tình trạng miễn dịch của vật chủ Theo các nghiên cứu, hầu hết các kháng thể dù có đặc hiệu đến đâu thì cũng có một mối liên kết chéo (cross-reactivity) với những tác nhân không đặc hiệu [5] Trên mỗi kháng thể có vùng bao gồm khoảng 50 amino acid đa dạng mang nhiều paratopes – vùng nhận biết epitope từ kháng nguyên Mỗi vùng paratope có 15 amino acid tương tính với epitope về hình dạng và điện tích Mỗi paratope có thể gắn với nhiều epitope, epitope có thể gắn với các paratope không đặc hiệu [38] Điều này khiến cho việc sử dụng các peptide ngẫu nhiên trở nên khả thi vì khả năng bám phong phú của các kháng thể Microarray sử dụng các peptide ngẫu nhiên cũng đã được ứng dụng phong phú nhằm mục đích sàng lọc thêm cũng như khảo sát phương án chẩn đoán một số chứng bệnh khó phân biệt dựa trên lâm sàng như Valley’s fever [39], dự đoán khả năng phát bệnh Alzeimer’s [40], hay các nghiên cứu về thuộc tính của các kháng thể [41], đồng thời cũng đã được ứng dụng trong một số nghiên cứu ung thư và mang lại các kết quả khả quan về một phương pháp sàng lọc/chẩn đoán ung thư mới so với các phương án khảo sát miễn dịch đã biết [42][43][44] Phương án khảo sát miễn dịch bằng microarray đã và đang được sử dụng nhiều với các chứng bệnh lây nhiễm trên người [45] [46], gần đây nhất là với Covid 19 [47]

Áp dụng trong quá trình nghiên cứu, sàng lọc và chẩn đoán ung thư, microarray có cách thực hiện đơn giản, tương tự ELISA, có thể dùng phát hiện các tác nhân

nucleotide hoặc protein dựa theo liên kết giữa các phân tử tương ứng Pandita và đồng sự đã sử dụng mciroarray với bề mặt phủ 10.000 array từ thư viện cDNA thu thập từ khối u ung thư phổi nhằm xem xét sự thay đổi về mặt tiến hóa di truyền của khối u ở giai đoạn đầu và giai đoạn cuối [48]

Kỹ thuật phát hiện dấu ấn miễn dịch được phát triển trên nền tảng sinh thiết lỏng, với mong muốn góp phần hỗ trợ hoặc thay thế một phần vào những nhược điểm của các phương pháp nói trên, chỉ cần 1 giọt máu để sàng lọc khả năng miễn dịch của cơ thế đối với các tế bào ung thư, có thể phát hiện và dự đoán trước xu hướng bệnh của cơ thể dựa vào phân tích dữ liệu từ database Cùng với xu hướng phát triển neoantigen vaccine trong việc trị liệu và ngăn ngừa ung thư, phương pháp này có triển vọng mang lại các lợi ích về sau trong lĩnh vực nghiên cứu cũng như sức khỏe người được sàng lọc

Hình 1.3 Thiết kế của random-peptide microarray

[49]

1.3 Tình hình nghiên cứu

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Đối với kỹ thuật microarray khảo sát hệ miễn dịch nói chung, tại Việt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu về đề tài này, đến thời điểm hiện tại chỉ có một nghiên cứu công bố nghiên cứu trên bệnh sốt xuất huyết [50] Đối với nghiên cứu trên ung thư, phần lớn các nghiên cứu tập trung nghiên cứu về phân bố hoặc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành bệnh ung thư Phương pháp thực hiện nghiên cứu thường dựa trên số liệu thống kê giải phẫu học [7] hoặc nghiên cứu biểu hiện gen điều hòa chuyển hóa trong cơ thể [51][52] hoặc một số phương án như hóa miễn dịch [53]

Gần đây nhất vào năm 2021, nghiên cứu về kỹ thuật phân tích ct-DNA nhằm xác định mẫu ung thư thông qua mức độ methyl hóa và kích thước của ct-DNA (SPOT-MAS) trên mẫu ung thư trực tràng cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao (96,5

Hình 1.4 Một số kết quả nghiên cứu ban đầu trên random peptide

(A)

(B)

đến 97%) Nghiên cứu khác trên nền tảng tương tự vào năm 2022, cho thấy phương pháp có giá trị tiên đoán dương (PPV) vào khoảng 60% và độ chính xác là 83,3% [54] Tuy nhiên, như đã bàn luận ở trên, phương án phân tích dựa trên ct-DNA thuộc kỹ thuật cao, đòi hỏi trang bị máy móc và thiết bị tương đối phức tạp so với các phương án khảo sát về miễn dịch nói chung do hàm lượng ctDNA tương đối thấp khi khối u chưa hình thành kích thước nhất định

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại nước ngoài Phương pháp sử dụng microarray nhằm khảo sát miễn dịch nói chung và miễn dịch ung thư nói riêng đã và đang được sử dụng phổ biến tại các quốc gia khác trong quá trình sàng lọc cũng như nghiên cứu

Năm 2010, Joseph BL và đồng sự sử dụng microarray chứa các peptide ngẫu nhiên để khảo sát miễn dịch dịch thể nhằm phân tích sự khác biệt của việc bị nhiễm bệnh so với tiêm vaccine Kết quả cho thấy mặc dù sử dụng các peptide ngẫu nhiên, nhưng do tính phản ứng rộng của các kháng thể, tín hiệu về phản hồi miễn dịch vẫn khá rõ ràng và đặt nền tảng cho việc truy vấn tình trạng kháng thể tổng quát mà các test miễn dịch khác không làm được [55]

Năm 2011, microarray với peptide ngẫu nhiên được sử dụng với mục đích khảo sát các epitope của kháng thể Các tác giả cho thấy tiềm năng của việc sử dụng peptide ngẫu nhiên nhằm khảo sát khả năng phản ứng của kháng thể, qua đó không cần sử dụng đến các peptide chuyên biệt đặc hiệu cho kháng thể, đồng thời, với khả năng tích hợp lên đến hàng ngàn peptide trên cùng 1 array, phương án này cho thấy ưu thế hỗ trợ cho việc thiết kế và phát triển các thí nghiệm chẩn đoán dựa trên miễn dịch [56]

Năm 2012, microarray chứa 10.000 peptide ngẫu nhiên được sử dụng để khảo sát trên ung thư não cho thấy kết quả khả quan về các phản ứng miễn dịch khác nhau giữa các giai đoạn ung thư khác nhau [57]

Năm 2013, Muskan Kukreja và đồng sự sử dụng nền tảng tương tự để khảo sát sự khác biệt miễn dịch giữa các bệnh khác nhau nhưng xảy ra trên cùng một cơ quan,

cho thấy microarray với các peptide ngẫu nhiên có khả năng phân biệt các bệnh như vậy cho độ đặc hiệu lên đến trên 90% [44]

Các nghiên cứu này đặt nền tảng cho một phương pháp sàng lọc với khả năng sàng lọc nhiều loại bệnh cùng lúc chỉ cần dùng đến một array duy nhất so với các phương pháp truyền thống như sinh hóa miễn dịch chỉ tập trung vào một số chất chỉ thị trong máu đã biết Chúng có phần dễ thực hiện và trực tiếp hơn so với các phương pháp khảo sát dựa trên ct-DNA

Microarray mang các trình tự peptide ngẫu nhiên được thực hiện thử nghiệm khảo sát các tín hiệu sơ khởi cũng như tiến trình điều trị của ung thư hạch chó, cho thấy phương án này có khả năng dự báo ung thư sớm 3 tháng trước khi được chính thức chẩn đoán ung thư, đồng thời có thể dự báo tái phát trong vòng 120 ngày [58] Khảo sát các autoantibody phản ứng với các kháng nguyên đặc hiệu từ khối u phổi, tác giả Brezina và đồng sự cho rằng cần kết hợp kết quả phản ứng với càng nhiều các kháng nguyên đặc hiệu thì độ chính xác trong quá trình sàng lọc mới được đưa đến mức tối ưu [59]

Kỹ thuật phát hiện dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp microarray phủ các peptide ngẫu nhiên được phát triển trên nền tảng sinh thiết lỏng, với mục đích chính nhằm mở rộng phạm vi nghiên cứu các kháng nguyên đặc hiệu khối u thông qua các autoantibody, chỉ cần 1 giọt máu để sàng lọc khả năng miễn dịch của cơ thế đối với các tế bào ung thư, có thể phát hiện và dự đoán trước xu hướng bệnh của cơ thể dựa vào phân tích dữ liệu từ database Cùng với xu hướng phát triển neoantigens vaccine trong việc trị liệu và ngăn ngừa ung thư, phương pháp này có triển vọng mang lại các lợi ích về sau trong lĩnh vực nghiên cứu cũng như sức khỏe người được sàng lọc [18] Gần đây nhất, phương án này đã được S Podlesnykh và đồng sự sử dụng nhằm khảo sát tính khả dụng phát hiện sự tương tác giữa các autoantibody trên bệnh nhân ung thư vú với các peptide ngẫu nhiên trên microarray và phát hiện thêm một số kháng nguyên đặc hiệu có thể có giá trị trong chẩn đoán [60]

Bên cạnh đó, nghiên cứu cho thấy khác biệt chủng tộc có thể dẫn đến khác biệt trong hướng phản ứng đối với khối u [61], vì vậy, để có thể triển khai các kỹ thuật

liên quan đến miễn dịch, cần có những nghiên cứu mang tính địa phương nhằm khảo sát các khác biệt (nếu có) giữa những quần thể khác nhau

Kết hợp các yếu tố trên, đề tài này có thể xem là nghiên cứu đầu tiên áp dụng kỹ thuật microarray chứa các peptide ngẫu nhiên để khảo sát xu hướng miễn dịch trên các bệnh nhân ung thư tại Việt Nam với mục đích chính nhằm khảo sát tính khả thi của microarray phát hiện dấu ấn miễn dịch bao gồm phản ứng của các autoantibody đối với ung thư các loại ung thư phổ biến tại Việt Nam (ung thư trực tràng, ung thư phổi và ung thư vú), đồng thời tìm hiểu thêm về một số kháng nguyên đặc hiệu hoặc neoantigens có thể làm chỉ điểm phân biệt giữa các loại ung thư này góp phần đặt nền tảng cho các nghiên cứu miễn dịch ung thư về sau cũng như xây dựng cơ sở dữ liệu hỗ trợ công tác sàng lọc ung thư trong tương lai

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu máu toàn phần / serum của bệnh nhân ung thư thu nhận từ cơ sở khám

chữa bệnh - Mẫu máu đối chứng của người bình thường (không có chẩn đoán dương

nghiệm với các loại bệnh nghiên cứu) 2.1.2 Hóa chất

- Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Cat No A7906-500G - Casein Sodium Salt from Bovine Milk Sigma Cat No C8654-500G - Tween 20 Sigma Cat No P7949-500Ml

- Alexa fluor 555 secondary IgG anti-human - Alexa fluor 647 secondary IgG anti-human - NaCl

- KCl - Na2HPO4.2H2O - KH2PO4

2.1.2.2 Pha blocking buffer

Thể tích cần

(uL)

Thể tích hút

(uL) AF 647 goat anti-

- Syringe Filter Sartorius Cat No 2021-02 - 96 Deep Well 2,2 mL Plate VWR Cat No 82006-448 - GeneMate Orbital Shaker VWR Cat No S-3200-LS

- Agilent Rotator Hybridization Oven Cat No G2545A - 3M Adhesive Cover Cat No 98-0604-0472-4

- Gel Company Thermo-Mix 500 Cat No THM500 - Dipping Jar Set Fisher Cat No 22-038-495

- Beckman Coulter Centrifuge 25R Cat No - Dry nitrogen gas cylinder

- VWR 500 mL 0,2um PES Filter Unit Cat No 10040-40-436 - Plastic Autoclave Tub Fisher Cat No 1336125

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận mẫu

Mẫu được thu nhận cùng với một số thông tin nhằm mục đích thống kê và phân tích kết quả