TÊN ĐỀ TÀI: - Tiếng Việt: Nghiên cứu tổng hợp nanochitosan kết hợp dịch chiết nụ vối ứng dụng bảo quản trái cây - Tiếng Anh: Synthesis of nanochitosan combining Cleistocalyx operculatus
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Tổng quan chitosan
1.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc hóa học, độ hòa tan của chitosan
Chitin là một polysaccharide bao gồm các gốc acetylglucosamine liên kết với nhau bằng các liên kết 𝛽-1,4-glycosidic [14, 15] Đây là polysaccharide phong phú thứ hai được tìm thấy trong tự nhiên chỉ sau cellulose và được tìm thấy nhiều ở động vật giáp xác như sò, tôm, cua, v.v Trong đó, chitin có thể chiếm từ 20 – 30% [14-16]
Hình 1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan từ động vật có vỏ [17]
Chitosan là một loại polysaccharide mạch thẳng, được hình thành từ các liên kết (1,4) của 2-amino-deoxy-β-D-glucan, có hai nhóm hydroxyl tự do và một nhóm amine chính Cấu trúc phân tử của nó bao gồm các đơn vị monosaccharide nối tiếp với nhau qua liên kết β-glycosidic [14, 16, 18-21] Chitosan được tạo ra bằng cách thay đổi cấu trúc chitin thông qua việc loại bỏ các nhóm acetyl, được liên kết với các gốc amine ở vị trí C2 trên vòng glucan (Hình 1.1) của chitin Quá trình thủy phân hóa học trong dung dịch kiềm đậm đặc được thực hiện ở nhiệt độ cao để tạo ra
4 một dạng chitin được khử một phần gọi là chitosan Tuỳ vào mức độ khử acetyl có thể thu được các loại chitosan với tính chất vật lý và hoá học khác nhau
Chất lượng và đặc tính chức năng của chitosan được xác định bởi nhiều yếu tố bao gồm mức độ khử acetyl hóa, trọng lượng phân tử, nguồn nguyên liệu, và phương pháp chiết xuất [21] Điện tích dương của các nhóm amine khi bị proton hoá có thể làm cho chitosan có thể phản ứng với nhiều bề mặt tích điện âm của tế bào và các vật liệu polymer khác Tính hòa tan cũng là một trong những đặc tính quan trọng trong việc ứng dụng chitosan Đáng chú ý, chitosan không hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước mà chỉ thường hòa tan trong các dung dịch acid loãng với pH < 6,5 [18]
Tại Việt Nam ngành thủy sản đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là nuôi trồng thủy sản, ngành chế biến xuất khẩu thủy sản đang có xu hướng tăng trưởng mạnh đặc biệt là xuất khẩu tôm Nguồn nguyên liệu để sản xuất chitosan như vỏ tôm là bền vững và phong phú, có thể được thu hồi vỏ tôm từ các công ty thủy sản trong nước
1.1.2 Hoạt động kháng khuẩn của chitosan
Chitosan thường được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tiềm năng do hoạt động kháng khuẩn của nó chống lại một loạt các loại vi khuẩn và nấm trên thực phẩm Mặt khác, các hoạt động kháng khuẩn tiềm năng cũng như các hoạt động khác đã được báo cáo trước đây, chủ yếu là đối với ứng dụng của nó trên trái cây và rau quả [1, 22] Hoạt động kháng khuẩn mạnh hơn đã được quan sát đối với chitosan với mức độ khử acetyl cao hơn [23] Hơn nữa, chitosan với trọng lượng phân tử thấp có thể thể hiện khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với chitosan có trọng lượng phân tử cao [24] Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan có thể tăng lên khi có giá trị pH thấp do sự proton hóa của nó trong khoảng pH có tính acid và khả năng hòa tan cao hơn trong vi môi trường acid [25] Mặt khác, nhiệt độ và chất nền xung quanh có thể ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của lớp phủ chitosan [23] Đối với hoạt tính kháng khuẩn của chitosan, người ta báo cáo rằng nấm men và nấm mốc có độ nhạy cao hơn so với vi khuẩn [23] Theo báo cáo của Qi và cộng
5 sự [26] cho thấy rằng các hạt nano chitosan có thể kiểm soát sự phát triển của các vi khuẩn như E coli, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus Ganan và cộng sự [27] cũng báo cáo rằng, trong số một số mầm bệnh đã được thử nghiệm, Campylobacter spp là loại dễ bị bất hoạt nhất bởi chitosan Lou và cộng sự [28] cũng cho thấy dung dịch chitosan có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Burkholderia seminalis Hoạt tính kháng khuẩn cao của chitosan cũng được báo cáo bởi Han và cộng sự [29] Hơn nữa, Ristic và cộng sự [30] đã chỉ ra rằng sự ức chế của Lactobacillus đối với các hạt nano chitosan được phản ánh ở nồng độ ức chế tối thiểu thấp Theo báo cáo của Madureira và cộng sự [31], các hạt nano chitosan có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào của vi khuẩn và củng cố hoạt động kháng khuẩn của chúng Wang và cộng sự [32] báo cáo rằng sự phát triển của nấm có thể bị ức chế mạnh mẽ bằng cách xử lý bằng chitosan Kaya và cộng sự [33] quan sát thấy rằng chitosan với bọ cạp có trọng lượng phân tử thấp thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cụ thể đối với các loài vi khuẩn nói chung Hơn nữa,
Li và cộng sự [25] chỉ ra rằng giá trị pH cho khả năng kháng khuẩn cao nhất hoạt độ của chitosan là 6,0 Hoạt động kháng khuẩn của dung dịch chitosan (pH 6,0) chống lại E coli và S aureus có thể được tăng cường khi tăng mức độ khử acetyl của nó Theo báo cáo của Mohammadi và cộng sự [34], hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano chitosan được tăng cường đáng kể so với các vi hạt chitosan Goy và cộng sự cũng báo cáo rằng hiệu quả kháng khuẩn của chitosan bị ảnh hưởng đáng kể bởi nồng độ sử dụng của nó Sayari và cộng sự [35] cho rằng chitosan thể hiện hoạt tính ức chế chống lại các chủng vi khuẩn và nấm đã thử nghiệm
1.1.3 Tính an toàn của chitosan đối với ứng dụng trên trái cây
Sự an toàn của các hạt nanochitosan và dung dịch chitosan là rất quan trọng đối với ứng dụng của nó trong ngành công nghiệp thực phẩm và đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Chitosan như một chất phụ gia thực phẩm đã được phê duyệt ở Nhật Bản từ năm 1983 [36] Hơn nữa, tính an toàn sinh học của nó đã được chỉ ra bằng các thử nghiệm cho ăn với vật nuôi [37] Đáng chú ý, chitosan đã được FDA Hoa
Kỳ công nhận là an toàn (GRAS) vào năm 2005 [38] Do đó, chitosan được coi là
6 nguyên liệu tương thích sinh học, không độc hại và an toàn để sử dụng trên rau quả [16, 39]
Chitosan là một loại polymer độc đáo với nhiều chức năng do hoạt tính sinh học linh hoạt, khả năng tương thích sinh học tuyệt vời, khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn, không độc hại và an toàn Chitosan có sự kết hợp đặc biệt giữa hoạt tính sinh học với tính chất cơ học, vật lý Với những tính chất ưu việt đó chitosan thu hút sự quan tâm đáng kể trong y học, mỹ phẩm, công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm
Bảng 1.1 Ứng dụng của chitosan [40, 41]
Thực phẩm Màng bọc thực phẩm, chất bảo quản
Y tế Dẫn truyền thuốc, tăng miễn dịch cơ thể, giảm cholesterol, cầm máu, chữa vết thương Công nghiệp giấy Giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy
Mỹ phẩm Chất tẩy trang, kem chống khô da
Nhiếp ảnh Tạo màng phim trên máy ảnh
Xử lý nước thải Hấp phụ chất ô nhiễm
Nông nghiệp Thuốc trừ nấm, bệnh, thuốc kích thích sinh trưởng
Tổng quan nanochitosan
Các vật liệu có kích thước nano có thể thể hiện những đặc tính tốt hơn hoặc vượt trội hơn so với vật liệu cơ bản mà chúng được hình thành Các hạt nano được tạo thành từ các polyme tự nhiên hoặc tổng hợp với kích thước từ 10 đến 1000 nanomet [42] Nhiều quy trình chuẩn bị (từ trên xuống, liên kết ngang, vi sinh) và các lĩnh vực sử dụng tiềm năng (điện tử, dệt may và y học) cho các hạt nano vô cơ và hữu cơ đã được xác định Điều quan trọng cần đề cập là tác động của chúng đối với thiên nhiên và cơ thể con người đã bị nghi ngờ Mặt khác, NPs dựa trên
7 polysaccharide được công nhận là thân thiện với môi trường, ít hoặc không có độc tính, khả năng phân hủy sinh học hoặc các vấn đề về ổn định sinh lý
Do kích thước hạt lớn và độ nhớt cao nên chitosan vẫn có một số nhược điểm khi được sử dụng trực tiếp để bảo quản thực phẩm, chẳng hạn như hoạt tính bảo quản yếu và hạn chế tiếp xúc với các yếu tố gây hư hỏng thực phẩm Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng hạt nano chitosan (CS-NP) và các dẫn xuất của chúng là một trong những vật liệu nano tốt nhất để mang lại hoạt tính kháng khuẩn CS-NP có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng, nhưng chúng biểu hiện hiệu quả ức chế khác nhau đối với các loài vi khuẩn gram âm (G - ) và gram dương (G + ).Do vậy, một số nhà nghiên cứu đã điều chế chitosan thành các hạt nano Nanochitosan là loại vật liệu thân thiện với môi trường, không gây hại cho con người, ngoài các đặc tính như chitosan thì nanochitosan có thêm những đặc tính nổi bật hơn nhờ khả năng hòa tan tốt trong nước, ức chế hoạt động sinh học vượt trội và được ứng dụng trong việc dẫn truyền thuốc, bao bọc hoạt chất [43] CS NPs có thể làm cho cấu trúc của màng tổng hợp chitosan nhỏ gọn hơn, điều này không chỉ có thể nâng cao độ bền cơ học của màng mà còn cải thiện hiệu suất của rào cản [44]
1.2.1 Các phương pháp tổng hợp nanochitosan
Nanochitosan được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau như gel ion hóa, nhũ tương hóa, micelle đảo, top-down, sấy phun
Bảng 1.2 Các phương pháp tổng hợp nanochitossan
Phương pháp Cơ chế Ưu điểm Nhược điểm TLTK
Nhũ tương hóa và liên kết ngang
Liên kết ngang cộng hóa trị
Sử dụng hóa chất độc hại
Micelles đảo Liên kết ngang cộng hóa trị
Kích thước hạt nano nhỏ
• Sử dụng hóa chất độc hại
Kết hợp giọt nhũ tương
Kết tủa Khả năng đóng gói cao các hợp chất
• Yêu cầu lực cắt cao
• Sử dụng hóa chất độc hại
Gel hóa ion Liên kết ngang
• Không sử dụng hóa chất độc hại
• Dễ điều chỉnh kích thước NPs
Tự lắp ráp Tương tác tĩnh điện
• Không sử dụng hóa chất độc hại
Khó kiểm soát khi thực hiện hệ lớn
Top - down Thủy phân và khử
Sấy phun Nguyên tử hóa
Quy trình đơn giản, nhanh chóng
• Kích thước hạt lớn • Không phù hợp các chất nhạy với nhiệt độ
Trong đó phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là gel hóa ion với ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu điều kiện môi trường khắc nghiệt, dễ dàng điều chỉnh và dễ kiểm soát, không sử dụng dung môi hữu cơ Gel hóa ion là một phương pháp hóa học để tổng hợp các hạt nanochitosan dựa trên các tương tác tĩnh điện giữa các ion với các điện tích khác nhau với tác nhân tạo liên kết ngang Trong nghiên cứu này nanochitosan được tổng hợp bàng phương pháp gel hóa ion, chất tạo liên kết ngang được sử dụng là sodium tripolyphosphate (STPP) So với những chất tạo liên kết ngang hóa học như glutaraldehyde; glyoxal; 2,2-dimethoxy phenyl acetophenone, v.v thì STPP là chất không có độc tính và tạo liên kết hiệu quả [51]
Hình 1.2 Minh họa phương pháp gel hóa ion [49]
Nanochitosan có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học và dược phẩm, nông nghiệp, thực phẩm, v.v (Bảng 1.3) Một số ứng dụng phổ biến của CS NPs có thể kể đến như vận chuyển thuốc, chữa lành vết thương, kỹ thuật mô, cảm biến sinh học, đóng gói kháng khuẩn, lọc nước và bảo vệ thực vật
Bảng 1.3 Ứng dụng của nanochitosan
Thực phẩm Màng bọc thực phẩm [52, 53]
Y học và dược phẩm • Dẫn truyền insulin, cyclosporin, DNA
• Liệu pháp chữa ung thư [54, 55]
Xử lý nước thải • Loại bỏ kim loại nặng
Nông nghiệp • Thuốc diệt cỏ; Thuốc diệt côn trùng
• Thuốc diệt nấm; Kích thích sinh trưởng [58, 59]
Cây vối
1.3.1 Tổng quan về cây vối, tiềm năng về cây vối tại Việt Nam
Cây vối Cleistocalyx operculatus L (C operculatus) (Cleistocalyx nervosum, Syzygium nervosum, và Eugenia operculata) là một loài cây lâu năm, phân bố rộng khắp Trung Quốc, Việt Nam và một số nước nhiệt đới khác Theo truyền thống, lá và chồi của C operculatus đã được sử dụng làm trà thảo mộc phổ biến tại Việt Nam và Trung Quốc, nó được biết đến nhiều trong việc điều trị bệnh cúm và một số bệnh tiêu hóa theo y học cổ truyền [60] Ở Việt Nam, cây thường mọc
10 hoang hoặc được trồng ở khắp các vùng quê thuộc đồng bằng Bắc và Trung bộ để lấy lá, nụ hoa làm trà uống và làm thuốc [61] Lá Vối chứa tanin, vết alkaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học [10, 62] Các báo cáo trước đây tiết lộ rằng chồi C operculatus có các hoạt động sinh học khác nhau trong ống nghiệm và in vivo như chống ung thư, kháng u, chống tăng đường huyết và tác động lên tim [10-13] Vỏ cây chứa triterpene loại oleanane [63] và sterol (ví dụ b-sitosterol), trong khi flavanone, chalcones và acid triterpene (ví dụ acid ursolic) có mặt như những thành phần chính trong chiết xuất methanol của chồi C operculatus [13, 59, 64- 66]
Hình 1.3 Hình ảnh cây vối (a) và nụ vối tươi (b), nụ vối khô (c) [67].
Trong giai đoạn 2002–2019, các nghiên cứu hóa thực vật đã xác định được tổng số 86 hợp chất tự nhiên từ lá và nụ vối (S nervosum), các hợp chất có trong nụ vối được thống kê tại Bảng 1.4 Các thành phần chính của S nervosum được xác định là triterpenoid loại oleanane và ursane [68], flavonoid C-methyl hóa [69], và phloroglucinols đa vòng [70, 71] Trong số này, chalcones C-methyl hóa được coi là thành phần chính và chịu trách nhiệm về mặt dược lý của cây thuốc này Chiết xuất thô S nervosum và thành phần chính của nó, 2′, 4′-dihydroxy-6′- methoxy-3′, 5′-dimethylchalcone (hoặc DMC), cũng được kiểm tra trong nhiều thử nghiệm dược lý khác nhau Ở một mức độ nhất định, một số tác dụng dược lý đã giải thích các công dụng chữa bệnh của cây này trong y học dân gian, chẳng hạn a b c
11 như kháng virus [11, 69], chống viêm [72], và các hoạt động chống oxy hóa [73, 74] Hơn nữa, các hoạt tính sinh học thú vị khác cũng được phát hiện, chẳng hạn như đặc tính chống ung thư [75-79] và chống đái tháo đường [80, 81], góp phần rất lớn vào ứng dụng lâm sàng tiềm năng của loại cây này
Bảng 1.4 Thành phần hợp chất trong S.nervosum [82]
STT Nhóm Hợp chất Bộ phận chứa
5 3-O-trans-p-Coumaroyl maslinic acid Nụ
6 3-O-cis-p-Coumaroyl maslinic acid Nụ
2′,4′-Dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone Lá, Nụ
10 3′-Formyl-6′,4-dihydroxy-2′-methoxy-5′- methylchalcone 4′-O-β-D-glucopyranoside
11 2′,4′-Dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone Lá, Nụ
18 Myricetin-3′-methylether 3-O-β-D-galactopyranoside Lá, Nụ
36 7-Hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylisoflavone Lá, Nụ
39 (trans)-4-Hydroxy-5-(2-hydroxypropan-2-yl)-2- methylcyclopent-2-en-1-one
40 4-Hydroxy-2,2,5-trimethylcyclopent-4-ene-1,3-dione Nụ
Hàm lượng một số chất có trong các bộ phận cây Cleistocalyx operculatus đã được nghiên cứu thể hiện tại Bảng 1.5.
Bảng 1.5 Hàm lượng một số chất trong các bộ phận cây Cleistocalyx operculatus
STT Tên chất Hàm lượng Bộ phận
1 Flavonoids 6,8 mg/g nguyên liệu khô Lá [83]
2 DMC 0.973–1.201 mg/g nguyên liệu khô Nụ [82]
3 Ursolic acid 2.857–3.549 mg/g nguyên liệu khô Nụ [82]
5 3-O-trans-p-Coumaroyl maslinic acid 0.16 % Nụ [84]
6 3-O-cis-p-Coumaroyl maslinic acid 0.52% Nụ [84]
7 Tổng lượng phenolic 58.5–157.7 mg GAE/g và 122.5 mg CE/g Nụ [80, 85, 86]
8 Tổng lượng phenolic 1.03 mg–511.4 mg
9 Tổng lượng phenolic 5.35–61.1 mg GAE/g Quả [88, 89]
Bảng 1.6 Hàm lượng DMC và tổng hàm lượng polyphenols trong nụ cây
Cleistocalyx operculatus theo dung môi sử dụng
Dung môi Hàm lượng DMC
Tổng hàm lượng polyphenols (mg/g)
1.3.2 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết từ cây vối
Năm 2017, Nguyen, P T M.và cộng sự [83] đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết metanol từ lá cây vối Cleistocalyx operculatus L (C operculatus) trồng ở Việt Nam Chiết xuất methanolic của lá C operculatus đã được sàng lọc hóa thực vật và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của nó đối với sáu loại vi khuẩn Gram dương (ba trong số đó là Staphylococcus spp Đa kháng sinh), hai vi khuẩn Gram âm và một loài nấm sử dụng phương pháp khuếch tán thạch Hoạt động kháng khuẩn được kiểm tra bằng cách sử dụng xét nghiệm độ pH giảm và màng sinh học được hình thành trong các đĩa nhựa 96 giếng Kết quả kiểm tra hóa thực vật cho thấy có sự hiện diện của flavonoid và tecpen, trong đó hàm lượng flavonoid là 6,8 mg / g nguyên liệu khô Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất C operculatus chỉ được chứng minh chống lại vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và StreptococcusmutansGS-5 (S mutans), và vi khuẩn kháng threemultiresistant là Staphylococcus epidermidis 847, Staphylococcus haemolyticus 535 và chủng Staphylococcus aureus Thật thú vị, chiết xuất methanolic của lá C operculatus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống sâu răng bởi vi khuẩn S mutans về việc ức chế sản xuất acid và hình thành màng sinh học Hoạt động của hai enzym quan trọng chịu trách nhiệm về khả năng sinh acid của S mutans, F-ATPase và hệ thống phosphotransferase đã bị ức chế bởi dịch chiết với IC50 tương ứng là 51,0 và 98,0 mg / mL Độc tính tế bào của chiết xuất chống lại tế bào sừng chỉ được tìm thấy ở nồng độ cao hơn [IC50 = (119,98 ± 4,63) mg/mL] Dịch chiết methanolic của lá C operculatus có tiềm năng phát triển các chế phẩm chống vi khuẩn, đặc biệt là các sản phẩm kháng vi khuẩn Dịch chiết được chuẩn bị bằng cách chiết riêng biệt với 400 mL n-hexane trong 8 giờ, sau đó chiết với 400 mL metanol trong 8 giờ nữa bằng thiết bị Soxhlet Quá trình chiết được lặp lại hai lần và được làm khô để thu được cặn hexan và metanol bằng cách sử dụng chân không quay
Dung, Kim và cộng sự [90] đã nghiên cứu dịch chiết ethanol từ nụ hoa cây Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr và Perry Dịch chiết được chuẩn bị bằng
15 cách chiết với dung môi 70% ethanol (200 mL, với 3 lần), ở nhiệt độ phòng Chiết xuất ethanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng chống lại toàn bộ vi khuẩn Gram dương đã được thử nghiệm và một loại vi khuẩn Gram âm gây hư hỏng thực phẩm là P aeruginosa Các giá trị MIC và MBC của chiết xuất ethanol chống lại vi khuẩn được thử nghiệm được tìm thấy trong khoảng 0,25–32 mg / mL Hơn nữa, tổng khả năng chống oxy hóa và tác dụng loại bỏ các gốc 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) của dịch chiết ethanol cũng được đánh giá Tổng hoạt tính chống oxy hóa của chồi C operculatus được biểu thị bằng số lượng đương lượng của ascorbic acid (ASE) Khả năng chống oxy hóa được ước tính từ phương trình hồi quy được chuẩn bị từ nồng độ so với mật độ quang của mẫu và ascorbic acid Việc chiết xuất bằng ethanol cho thấy tương đương 62,40 ± 3,16 mg ASE/g nụ C operculatus khô Giá trị IC50 của dịch chiết ethanol là 38.58 ± 2.08.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Chitosan là chất tạo màng sinh học phong phú thứ 2 trong tự nhiên, các hướng nghiên cứu về nó rất đa dạng và đang được thu hút Một trong số đó là nghiên cứu tổng hợp vật liệu chitosan kháng khuẩn ứng dụng trong bảo quản trái cây và rau quả Nhiều công nghệ được các nhà nghiên cứu phát triển để tăng khả năng bảo quản của vật liệu chitosan trong đó nổi bật là phương pháp tạo chitosan ở cấp độ nano hoặc kết hợp hoạt chất tự nhiên Đã có nhiều nghiên cứu về vật liệu chitosan kết hợp dịch chiết làm tăng khả năng bảo quản trái cây tươi ở điều kiện thường (Bảng 1.6) Việc kết hợp chitosan với các chiết xuất từ lô hội, chiết xuất trà xanh, chiết xuất lá vối, lá chùm ngây, v.v có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm đa dạng như: B Cinerea, P expansum, A Niger, E Coli, B subtilis, v.v [91, 92] và có khả năng kéo dài thời gian bảo quản từ 21 ngày đến 18 tuần
Những năm gần đây xu hướng vật liệu nano rất được thu hút và đầu tư nghiên Với các tính chất nổi bật và tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, nanochitosan được xem là vật liệu có khả năng kết hợp với nhiều thành phần có hoạt tính sinh học như dịch chiết, tinh dầu thiên nhiên và ion kim loại Các CS NPs được nạp hoạt chất giúp cải thiện tính ổn định trong quá trình bảo quản thực phẩm,
16 nông sản, giải phóng bền vững các hoạt chất, cho hoạt tính sinh học cao hơn như các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn so với dạng tự do [93] CS NPs kết hợp với các chiết xuất vỏ lựu, Byrsonima crassifolia, lá trầu, v.v ứng dụng trong bảo quản mơ và ớt đã được thí nghiệm và cho ra kết quả rất tốt kéo dài thời gian bảo quản từ 21 đến 30 ngày
Bảng 1.7 Một số nghiên cứu về CS NPs kết hợp dịch chiết
Dịch chiết Bảo quản Kết quả TLTK
- Thời gian bảo quản: 30 ngày
- Thời gian bảo quản: 6 ngày
- Kích thước hạt: 312 nm - Thế zeta: -40 mV
- Thời gian bảo quản: 21 ngày
Thành phần polyphenol cũng đã được đánh giá trên lá vối, nhiều báo cáo và nghiên cứu ghi nhận các thành phần polyphenol (TPC) trong dịch chiết lá vối nổi trội hơn nhiều so với những loại cây khác TPC của cao chiết ethanol từ lá vối thấp hơn khoảng 1.83 lần so với trà xanh, bằng với trà ô long, cao hơn trà đen (3.25 lần) và trà Pu-erh (8.90 lần) [96] Cao chiết có khả năng kháng tốt cả vi sinh vật gây bệnh như E coli, S aureus, C albicans, v.v [97]
Tại Việt Nam nhiều nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cây vối đã được báo cáo Năm 2017, Phuong Thi Mai Nguyen và cộng sự [83] đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết metanol từ lá cây vối Cleistocalyx operculatus L (C operculatus) trồng ở Việt Nam Dịch chiết methanolic của lá C operculatus có tiềm năng phát triển các chế phẩm chống vi khuẩn, đặc biệt là các sản phẩm kháng vi khuẩn Dung, Kim và cộng sự [90] đã nghiên cứu dịch chiết ethanol từ nụ hoa cây Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr và Perry Chiết xuất ethanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng chống lại toàn bộ vi khuẩn Gram dương đã được thử nghiệm và một loại vi khuẩn Gram âm gây hư hỏng thực phẩm là P aeruginosa
Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào đánh giá tính ứng dụng vật liệu Nanochitosan kết hợp dịch chiết từ nụ vối vào bảo quản trái cây được đăng trên các tạp chí, bài báo uy tín trên Thế giới
Nhận thấy tiền năng của những vật liệu tự nhiên này, một dự án liên quan đến sự kết hợp này sẽ được thực hiện Trong đề tài này, phương pháp tạo gel ion đã được áp dụng để tổng hợp vật liệu nanochitosan kết hợp dịch chiết nụ vối Nghiên cứu nhằm đánh giá chi tiết các đặc tính của vật liệu cũng như khả năng bảo quản của nó Vật liệu chitosan kết hợp dịch chiết nụ vối hướng tới khả năng tạo một lớp phủ (màng) trên trái cây Lớp phủ này có tác dụng giữ độ ẩm, mùi thơm, ức chế khả năng trao đổi chất trái cây (thông qua việc ức chế sự xâm nhập oxy vào mô thực vật) Việc bổ sung dịch chiết nụ vối nhằm ức chế các hoạt tính oxy hóa trên trái cây, ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyanin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn Hạn chế quá trình nâu hóa, đồng thời tăng khả năng kháng khuẩn, nấm, hạn chế sự phát triển vi sinh vật nhằm tăng thời gian bảo quản
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Tổng hợp thành công vật liệu nanochitosan kết hợp dịch chiết nụ vối có hoạt tính sinh học cao ứng dụng cho bảo quản trái cây
• Chiết suất và đánh giá hiệu suất chiết, định lượng hàm lượng hoạt chất trong dịch chiết nụ vối
• Tổng hợp vật liệu nanochitosan kết hợp dịch chiết nụ vối và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất lý hóa của vật liệu
• Đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa) của vật liệu
• Đánh giá khả năng bảo quản trên trái cây.
Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất
Nụ vối được mua tại huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh
Chitosan các loại phân tử lượng thấp (LW: 158 kDa; ≤150 cPs), phân tử lượng trung bình (MW1: 272 kDa; 150-500 cPs), (MW2: 290 kDa; 500-1000 cPs) và phân tử lượng cao (HW: 324 kDa; ≥1000 cPs) được mua tại công ty cổ phần Việt Nam Food
Nguyên liệu Thông số Xuất sứ
Phân tử khối 158 kDa Độ nhớt ≤150 cPs
Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng
Hóa chất Ký hiệu Xuất sứ Độ tinh khiết
Cồn tuyệt đối C2H5OH CAMECO-HCMC ≥ 99,5% Dimethyl sulfoxide DMSO JHD, Trung quốc ≥ 99,5% Quercetin C15H10O7 Sigma-Aldrich, Mỹ ≥ 95%
Sodium tripolyphosphate Na5P3O10 Trung Quốc
Sodium hydroxide NaOH Xilong, Trung Quốc ≥ 96% Sodium carbonate Na2CO3
Aluminum chloride AlCl3 Xilong, Trung Quốc ≥ 98% DPPH C18H12N5O6 TCL, Nhật Bản ≥ 97%
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị chính được sử dụng trong đề tài được nêu trong Bảng 2.3
Bảng 2.3 Các thiết bị chính trong đề tài
Thiết bị Model Xuất xứ
Máy xay Model 1500 Yamafuji, Nhật Bản
Bể siêu âm Powersonic 620 Hwashin, Hàn Quốc Máy UV-VIS UV-VIS 754 Stech international, Nhật Bản
Máy siêu âm UP400St Hielscher-Ultrasound
Technology, Teltow, Đức Máy cô quay chân không CF301, RE301,
Khuấy từ, cân phân tích, bơm chân không
Rây, dụng cụ khác (Becker, burret, Erlen,…)
Chiết xuất và định lượng thành phần cao chiết nụ vối
2.3.1 Quy trình xử lý và chiết xuất nụ dịch chiết nụ vối
Quy trình được tham khảo dựa trên quy trình của nhà nghiên cứu Tuyết Nguyễn và cộng sự năm 2020 với các bổ sung và chỉnh sửa [98] Ban đầu, nụ vối được nghiền và rây để loại bớt mịn Sau đó, thu được bột phía trên sàng và xác định độ ẩm Cuối cùng, chúng được bảo quản trong các túi khóa kéo chứa silica hút ẩm cho đến các bước tiếp theo Bột nụ vối được cho vào dung dịch ethanol với tỉ lệ bột nụ vối : ethanol là 1:6 (g/mL) Sau đó, hỗn hợp được đun cách thủy duy trì ở nhiệt độ 50 °C trong điều kiện khuấy Hỗn hợp này tiếp tục được lọc trong điều kiện chân không và cặn được chiết xuất lần thứ hai Dịch lọc sau đó được cô quay bằng cách sử dụng thiết bị cô quay chân không (với nhiệt độ dao động trong khoảng 45 °C đến
50 °C và tốc độ quay là 25 vòng/phút) Cuối cùng, thu được cao chiết khô, dính và có màu nâu Cuối cùng, cao chiết được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong tủ đông
Hình 2.1 Quy trình xử lý và chiết xuất nụ vối t =2 phút
400 vòng/phút T= 50 0 C tE phút Bột nụ vối: ethanol =1:6
Lọc chân không Phần dưới
Cô quay chân không T= 45 0 C v% vòng/phút
2.3.2 Phương pháp định lượng cao chiết nụ vối
Hiệu suất thu hồi cao nụ vối xác định dựa trên khối lượng cao khô thu được và bột nguyên liệu ban đầu sử dụng (đã trừ hàm lượng ẩm), được tính dựa trên phương trình sau:
H: Hiệu suất thu hồi (%) m2: khối lượng cao khô thu được (g) m1: khối lượng bột khô sử dụng (g)
Tổng phenolics được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm Folin- Ciocalteu [99] Sự trao đổi điện tử trong môi trường kiềm của hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin - Ciocalteau sẽ tạo thành hợp chất có màu xanh (molydenium) Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo gallic acid, tính được hàm lượng tổng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích Hàm lượng phenolic tổng được biểu diễn theo milligram đương lượng gallic acid trên gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết) Hàm lượng Phenolic toàn phần (TPC) được tính theo công thức sau:
TPC = GAE × V m× 1000 Trong đó TPC: hàm lượng phenolic toàn phần (mg GAE/g cao chiết); GAE: giá trị nồng độ từ đường chuẩn gallic acid (ppm); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
Flavonoid là nhóm lớn nhất của các hợp chất phenol tự nhiên, xuất hiện trong các bộ phận khác nhau của thực vật Hàm lượng flavonoid tổng được xác định
22 theo phương pháp tạo màu với AlCl3 bởi Wang và các cộng sự năm 2019 có chỉnh sửa [100] Phản ứng tạo phức giữa nhóm flavonoid với muối aluminium chloride (AlCl3) cho phức chất màu vàng Đo độ hấp thu ở bước sóng 425 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn với quercetin (QE) ta tính được hàm lượng tổng Flavonoid có trong mẫu phân tích Hàm lượng flavonoid tổng được biểu diễn theo milligram đương lượng Quercetin trên gram cao chiết (mg QE/g cao chiết) Hàm lượng flavonoid toàn phần (TFC) được tính theo công thức sau:
TFC = QE ×V m× 1000 Trong đó TFC: hàm lượng flavonoid toàn phần (mg QE/g cao chiết); QE: giá trị nồng độ từ đường chuẩn quercetin (ppm); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).
Tổng hợp vật liệu nanochitosan kết hợp cao chiết nụ vối
2.4.1 Quy trình tổng hợp vật liệu
Quy trình dịch chiết nụ vối được đóng gói trong các CS NPs đã được điều chế bằng phương pháp tạo gel ion (Hình 2.2) Ban đầu, chitosan được thêm vào dung dịch acid acetic 1%, sau đó hỗn hợp được khuấy khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng Tiếp đến, hỗn hợp được lọc chân không để loại bỏ cặn không tan pH của dung dịch được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 2N Sau đó, một lượng tween 80 được thêm vào và hỗn hợp được khuấy trong 25 phút Đồng thời, cao chiết được cân và hòa tan trong 25 mL ethanol (70% mL/mL) để thu được dung dịch đồng nhất, sau đó dung dịch cao chiết này được thêm vào dung dịch chitosan, khuấy trộn hỗn hợp trong 20 phút Bước tiếp theo, STPP được hòa tan trong 25 mL nước, sau đó STPP được nhỏ từ từ vào hỗn hợp nhũ tương trong khi khuấy ở nhiệt độ môi trường trong 90 phút Cuối cùng, quá trình siêu âm mẫu được ngâm trong bể nước đá trong 15 phút và công suất siêu âm là 200W Hỗn hợp cuối cùng có màu nâu có thể có ánh xanh, mùi thơm nhẹ, trong và không bị lắng Nồng độ chitosan, tỉ lệ cao chiết nụ vối và chitosan, tỉ lệ chitosan và STPP, thời gian siêu âm là các yếu tố ảnh hưởng trong quy trình tổng hợp và được lựa chọn để khảo sát tại bảng 2.4 dựa trên
23 tham khảo các bài báo trước đây liên quan đến tổng hợp vật liệu nanochitosan [101- 103]
Hình 2.2 Quy trình tổng hợp vật liệu CS/NV NPs
Bảng 2.4 Các yếu tố khảo sát trong quy trình tổng hợp vật liệu CS/NV NPs
Tỉ lệ CS/STPP (g/g) pH
Thời gian siêu âm (Phút)
Chitosan Dung dịch acid acetic1%
Khuấy Lọc Chuẩn độ Khuấy Khuấy Khuấy Siêu âm
2.4.2 Phương pháp phân tích vật liệu
2.4.2.1 Phân tích phân bố kích thước hạt
Tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS) là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để xác định kích thước động học của hạt nano Trong phương pháp đo DLS, chuyển động Brown của các tiểu phân sẽ được đo bởi mức độ biến động của cường độ ánh sáng, từ đó xác định kích thước vật liệu dựa trên phương trình Stokes-Einstein Kích thước hạt và thế zeta được xác định bằng thiết bị Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS, Mỹ Mục đích nhằm đánh giá kích thước hạt CS/NV NPs tạo thành, xác định độ phân tán kích thước hạt (PDI) và thế zeta
Hình 2.3 Thiết bị DLS Zetasizer Nano ZS
2.4.2.2 Hiệu suất bao bọc (EE) và khả năng tải (LC)
Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của hạt đặc trưng khả năng mang hoạt chất của nanochitosan Hiệu quả bao bọc và khả năng tải được xác định bằng phương pháp gián tiếp thông qua đánh giá quang phổ của chất nổi trên bề mặt thu được sau khi ly tâm [44] Trong đó, hiệu suất bao bọc (EE%) được xác định dựa trên hàm lượng hoạt chất bên trong hạt so với tổng hàm lượng hoạt chất đưa vào hệ (biểu thức 2.1) và khả năng tải của hạt (LC%) được xác định dựa trên hàm lượng hoạt chất bên trong hạt so với hàm lượng hạt nano sử dụng làm chất mang (biểu thức 2.2) Để xác định lượng hoạt chất tự do, pH của hệ được điều chỉnh đến 6 bằng NaOH 2N, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để tách các hạt nano mang hoạt chất Hàm lượng hoạt chất TPC tự do trong phần dịch thu được sau
25 khi ly tâm được xác định bằng quang phổ tử ngoại khả kiến thực hiện trên thiết bị UV-VIS 754, Stech International
2.4.2.3 Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến được thực hiện trên thiết bị UV- VIS 754, Stech international, Nhật Bản Phương pháp dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng Phương pháp này được sử dụng để đánh giá hàm lượng tổng TFC trong dịch chiết, hiệu suất đóng gói và khả năng tải thành phần dịch chiết trong hạt nanochitosan
2.4.2.4 Phân tích hình thái và kích thước hạt
Hình thái học của vật liệu được xác định bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM S4300, Hitachi, Nhật Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (Field Emission Scanning Electron Microscope – FESEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra hình ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu rắn bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật FE-SEM có thể phóng đại vật thể từ 10 lần đến 300.000 lần Do vậy, dựa trên ảnh FE-SEM kết hợp thang đo từ đó có thể tính toán được kích thước thật của vật thể
Hình 2.4 Thiết bị FE-SEM S4800 (Hitachi)
2.4.2.5 Phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) Đo phổ hồng ngoại là phương pháp được sử dụng để phát hiện các liên kết hóa học và trạng thái tập hợp của các nguyên tử trong hệ thống phân tử Phương pháp được thực hiện trên thiết bị Alpha II, Bruker, Đức Kỹ thuật này dựa vào hiệu ứng là các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại tạo ra các kiểu dao động và quay khác nhau, từ đó hình thành nên các dải phổ hấp thụ đối với từng hợp chất Từ phổ hồng ngoại, có thể phát hiện ra các thành phần chưa biết dựa vào tần số đặc trưng của dải hấp thụ và có thể xác định được hàm lượng của thành phần trong một mẫu Ngoài ra, nó còn cho biết cấu trúc phân tử (như các nhóm chức, các liên kết), xác định đồng phân Quang phổ FTIR được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hóa học của CS/NV NPs
Hình 2.5 Thiết bị ALPHA II (Bruker)
2.4.2.6 Phương pháp quang phổ nhiễu xạ tia X (XRD)
Phương pháp quang phổ nhiễu xạ tia X (XRD, X-ray diffraction) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định cấu trúc của tinh thể chưa biết bằng cách sử dụng một chùm tia X song song, hẹp, đơn sắc chiếu vào mẫu Phương pháp XRD dựa trên phương trình Bragg, trong đó liên kết khoảng cách mạng tinh thể với các góc quan sát của các nhiễu xạ khi tia X tán xạ từ một vật liệu kết tinh CS/NV NPs, CS NPs, chitosan dạng bột được chuẩn bị, phép đo được thực hiện trên thiết bị Bruker, D8 Advance, Đức Phổ XRD được sử dụng để kiểm tra cấu trúc tinh thể của vật liệu và sự khác biệt giữa các hạt kết hợp hoặc không kết hợp dịch chiết
Hình 2.6 Thiết bị D8 ADVANCE (Bruker)
Đánh giá hoạt tính sinh học của vật liệu
2.5.1 Khả năng chống oxy hóa
Các hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của các chất chiết xuất được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm bắt gốc tự do DPPH được mô tả bởi Nithianantham và cộng sự với một số sửa đổi [104] Quy trình đánh giá khả năng nhặt gốc tự do DPPH thực hiện theo trình tự Hình 2.7
Các nồng độ khác nhau của NV (5,5, 16,5, 27,5, 38,5 và 55 ppm) và dung dịch vitamin C thu được khi hòa tan NV và vitamin C dạng rắn trong dung dịch methanol 80% để tạo dung dịch gốc Chúng được sử dụng để chuẩn bị các mẫu thử nghiệm, màu sắc và đối chứng Mẫu đo: 1,8 mL dung dịch gốc được trộn với 3,2
28 mL DPPH 0,1 mM và để trong bóng tối trong 30 phút Mẫu trừ màu: 1,8 mL dung dịch gốc được trộn với 3,2 mL dung dịch methanol 80% Mẫu đối chứng: Trộn 1,8 mL dung dịch methanol 80% với 3,2 mL DPPH 0,1 mM và được giữ trong cùng điều kiện với mẫu thử
Khả năng bắt gốc tự do DPPH được tính dựa trên phương trình sau:
%I = A đối chứng - (A mẫu - A trừ màu )
Trong đó Ađối chứng, Amẫu và Atrừ màu lần lượt là độ hấp thụ của mẫu đối chứng, mẫu đo và mẫu trừ màu Mối quan hệ giữa nồng độ NV và %I có thể được biểu thị bằng %I=A+B×C (C (ppm) là nồng độ chiết xuất) Giá trị IC50 thu được bằng cách thay %I bằng 50 vào đường chuẩn hiệu suất bắt gốc tự do
Hình 2.7 Quy trình đánh giá khả năng nhặt gốc tự do DPPH
2.5.2 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm
2.5.2.1 Phương pháp đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
MIC là nồng độ tối thiểu của một chất khỏng khuẩn (được đo bằng àg/mL hoặc g/mL) ức chế hoàn toàn sự phát triển có thể nhìn thấy của các sinh vật được thử nghiệm trong điều kiện in vitro [105] Giá trị MIC của cao nụ vối với các chủng vi khuẩn và nấm được thực hiện trên các chủng vi khuẩn Gram âm, Gram dương và
29 nấm Vi khuẩn Gram âm gồm vi khuẩn E coli và P aeruginosa Vi khuẩn Gram dương gồm vi khuẩn E faecalis, S aureusvà MRSA Nấm bao gồm A niger và C albicans
Cao chiết nụ vối pha loãng với DMSO được trộn với thạch Mueller-Hinton và glucose để tạo ra các nồng độ khác nhau (10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,32 và 0,16 g/mL) trong đĩa petri để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) DMSO (2,5% mL/mL) và ketoconazole lần lượt được sử dụng làm đối chứng âm và dương Các huyền phù vi sinh vật (1 - 2 μL) được thả xuống bề mặt thạch và các đĩa petri được ủ ở 30°C trong 24 - 48 giờ
2.5.2.2 Phương pháp đánh giá OD600
Khả năng kháng khuẩn của vật liệu thử nghiệm bằng phương pháp xác định khả năng tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng và mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo quang Đây là một giá trị tùy ý giúp xác định giai đoạn phát triển của tế bào, khi so sánh với tham chiếu tiêu chuẩn hoặc đối chứng Vật liệu được đo mật độ quang học (OD) của môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở bước sóng 600 nm [105] Bước sóng 600 nm được lựa chọn vì nó không làm hỏng hoặc cản trở sự phát triển của vi sinh vật Sử dụng máy đo quang Gene Quant 1300 để xác định mật độ quang học của mẫu Phương pháp xác định mật độ quang học là cách dễ nhất để đánh giá giai đoạn phát triển của vi khuẩn Mật độ quang đo mức độ tán xạ ánh sáng do vi khuẩn gây ra trong môi trường nuôi cấy; càng có nhiều vi khuẩn thì ánh sáng càng bị tán xạ Mẫu càng đục thể hiện mật độ vi khuẩn càng lớn làm cho ánh sáng càng bị tán xạ và do vậy mật độ quang đo được sẽ tăng theo độ đục của mẫu
Vi khuẩn được nuôi cấy trong Luria-Bertani (LB), pha loãng và trộn với chất thử nghiệm, sau đó ủ ở các điều kiện cụ thể Các chủng vi khuẩn đầu tiên được cấy trên các đĩa thạch LB và được ủ trong 16 giờ ở 37°C Sau đó, chọn 3-5 khuẩn lạc và cấy vào môi trường lỏng và ủ ở 37°C cho đến khi OD600 đạt 0,6 Các mẫu thử
30 nghiệm sau đó được bổ sung vào các môi trường nuôi cấy này để thu được nồng độ 20% mL/mL.
Đánh giá khả năng bảo quản trái cây
Quy trình thực hiện dựa trên quy trình bảo quản của Natalia Suseno và các đồng nghiệp có chỉnh sửa bổ sung [106] Trái cây sẽ được chọn lọc, xử lý, phân nhóm sau đó được nhúng ngập vào vật liệu trong 2 phút, sau đó những trái đã nhúng được xếp lên khay và cho ráo tự nhiên, Những trái dâu được cho vào hộp ở các ô riêng biệt nhằm tránh lây nhiễm chéo mầm bệnh Các hộp sau đó được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 °C Chuối được bảo quản ở nhiệt độ phòng Thời gian bảo quản được tính từ khi trái đã nhúng đến khi trái chín hoàn toàn hoặc xuất hiện nấm Hình 2.8, Hình 2.9 và Hình 2.10 minh họa quy trình xử lý và bảo quản dâu tây, chuối cau Bảng 2.5 trình bày các nghiệm thức được dùng để đánh giá bảo quản
Hình 2.8 Quy trình bảo quản dâu tây
Hình 2.9 Hình ảnh xử lý và bảo quản dâu tây
Hình 2.10 Hình ảnh xử lý và bảo quản chuối cau
Bảng 2.5 Các nghiệm thức sử dụng trong quy trình đánh giá bảo quản
Chitosan + cao chiết nụ vối (CSNV) 0,3 0,5
Nanochitosan + cao chiết nụ vối (CS/NV NPs) 0,3 0,5
*Công ty CP Việt Nam Food (VNF)
2.6.2.1 Đánh giá độ hụt khối Độ hụt khối được hiểu là độ giảm khối lượng theo thời gian của trái cây Dựa vào kết quả sự giảm khối lượng phần nào đánh giá được mức độ chín, mất nước của trái cây Những quả có độ hụt khối thấp được hiểu là khả năng bảo quản lâu hơn Thông số này có thể đo bằng cân phân tích Tỉ lệ phần trăm hao hụt khối lượng được tính theo phương trình sau: Độ hụt khối (%) = i f i
Trong đó, Wi là trọng lượng ban đầu và Wf là trọng lượng cuối cùng của quả trong thời gian bảo quản tại thời điểm khác nhau
Màu sắc là khía cạnh quan trọng xác định sự trưởng thành, độ chín và độ tươi của trái cây [107] So sánh màu sắc bằng mắt, ghi lại hình để so sánh màu sắc thay đổi theo thời gian và kết hợp thang đo để đánh giá [108] Tỉ lệ thối rữa một thiệt hại gây ra bởi các triệu chứng hư hỏng như sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn và ức chế các quá trình enzyme trên sản phẩm tươi, được đánh giá bằng cách kiểm tra trực quan dựa trên sức hấp dẫn thị giác, màu sắc và sự hoàn chỉnh về cấu trúc có thể nhìn thấy được theo thang điểm sau:
3 = thiệt hại vừa phải từ 25% đến 50%;
4 = thiệt hại nghiêm trọng từ 50% đến 75%;
5 = thiệt hại hoàn toàn từ 75% đến 100%
Trái cây đạt điểm dưới 2 được coi là chấp nhận được [80]
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chiết xuất và định lượng thành phần cao chiết nụ vối
Bảng 3.1 Hiệu suất thu hồi, TPC và TPC cao chiết
Kỹ thuật chiết rắn – lỏng ở nhiệt độ 45 0 C trong 45 phút là điểm phù hợp dựa theo khảo sát của quy trình của Tuyet Nguyen và các cộng sự năm 2020 [98] Cao chiết nụ vối chiết bằng cồn 70% cho hiệu suất thu hồi cao đạt 30,8 ± 0,9% Hàm lượng TPC đạt 321,4 ± 3.07 mg GAE/g cao khô được đánh giá cao so với số liệu các bài báo trước đây hàm lượng TPC từ 58,5 – 157,7 mg GAE/g cao khô [109] Hàm lượng TFC đạt 22,086 ± 1,89 QE/g cao khô nằm trong khoảng phù hợp với số liệu các bài báo trước đây hàm lượng TFC từ 25,719 – 30,995 mg/g cao chiết (tính theo chất đối chiếu CO-1 là 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) [67] Cao chiết thu được khô, có màu nâu, có độ dính và có mùi thơm nhẹ.
Tổng hợp vật liệu nanochitosan kết hợp cao chiết nụ vối
3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến tính chất hạt CS/NV NPs
Hình 3.1 Kích thước trung bình của CS/NV NPs theo các nồng độ chitosan khác nhau
Nồng độ chitosan (%, g/mL) Size (nm)
Hiệu suất thu hồi (%) TPC (mg GAE/ g cao khô) TFC (mg RU/ g cao khô)
Hình 3.1 cho thấy ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến kích thước hạt trung bình của CS/NV NPs được xác định từ phân tích DLS Kích thước của CS/NV NPs tăng lên đáng kể từ 423,5 nm lên 5457,0 nm khi tăng nồng độ CS từ 0,3% (g/mL) đến 1,2% (g/mL) Nhóm nghiên cứu Gan và nhóm nghiên cứu Shapi đều đã cho thấy kết quả tương tự, khi kích thước của CS NPs tăng lên tương ứng với sự gia tăng nồng độ chitosan [45, 110] Xu hướng này có thể được giải thích là do sự kết tụ của các hạt khi nồng độ chitosan tăng dần Ở nồng độ chitosan thấp, kích thước hạt nhỏ hơn do lực tương tác giữa các phân tử yếu khi khoảng cách giữa các phân tử chitosan cách xa nhau, do đó các phân tử chitosan có xu hướng ổn định dưới dạng một phân tử hoặc chuỗi đơn lẻ Khi nồng độ chitosan tăng lên, tương tác giữa chitosan-chitosan và chitosan-STPP trở nên mạnh mẽ hơn do khoảng cách giữa các phân tử ngắn đi, dẫn đến việc kết hợp giữa những hạt riêng lẻ thành một khối hạt lớn hơn [111]
Hình 3.2 PDI và thế zeta của CS/NV NPs theo các nồng độ chitosan khác nhau
Nhìn chung, khi tăng nồng độ chitosan thì thế zeta có xu hướng giảm dần (Hình 3.2), điều này có thể được giải thích do sự kết tụ hoặc phân cụm trong dung dịch chitosan [112] Nồng độ chitosan còn được đánh giá có ảnh hưởng lớn nhất đến thế zeta [113] Thế zeta ở nồng độ chitosan 0,3 đến 0,7% (g/mL) nằm trong
35 khoảng 21,43-24,93 mV (Hình 3.2) được xem là nằm trong vùng ổn định tốt (20-30 mV) Độ đồng nhất của kích thước hạt nano còn được biểu diễn bằng hệ số đa phân tán PDI Hình 3.2 cho thấy nồng độ chitosan 0,3% (g/mL) có hệ số PDI 0,257 nằm trong vùng 0,1 – 0,25 được đánh giá là có sự phân bố hẹp về kích thước hạt [114] Nồng độ chitosan 0,3% (g/mL) cũng cho thấy hệ ổn định (thế zeta 24,93 mV), do đó nồng độ chitosan 0,3% (g/mL) được lựa chọn cho các thí nghiệm đánh giá tiếp theo
3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ NV/CS đến tính chất hạt CS/NV NPs
Hình 3.3 cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cao chiết nụ vối/chitosan (NV/CS) đến kích thước hạt trung bình của CS NPs từ phân tích DLS Kích thước hạt tăng từ 416,0 nm đến 2784,8 nm khi tăng tỉ lệ NV/CS từ 0,25 lên 1,25 (g/g) Điều này có thể là do sự gia tăng lượng hoạt chất bên trong hạt nano giúp mở rộng kích thước của nhân, từ đó làm tăng kích thước hạt [115] Đồng thời, sự gia tăng lượng NV trong CS NPs sẽ dẫn tới sự gia tăng khối lượng của CS/NV NPs
Hình 3.3 Kích thước trung bình của CS/NV NPs theo các tỉ lệ NV/CS khác nhau
Khi tăng tỉ lệ NV/CS các mẫu đều nằm trong vùng ổn định (thế zeta từ 20-26 mV) và có xu hướng giảm dần (Hình 3.4) Thế zeta của hạt nano là hiệu điện thế tĩnh điện giữa bề mặt của hạt nano và chất lỏng xung quanh Khi lượng hoạt chất trong hạt nano tăng lên có thể dẫn đến giảm điện thế của hạt nano Điều này là do sự gia tăng lượng hoạt chất đẫn tới sự gia tăng kích thước hạt nano, dẫn đến giảm diện tích bề mặt của hạt nano, từ đó dẫn đến giảm điện thế zeta [116] Một lý do khác có thể do thành phần hoạt tính dư có thể hấp phụ lên bề mặt của hạt nano và trung hòa điện tích bề mặt Điều này có thể dẫn đến giảm điện thế zeta của hạt nano [117] Ngược lại, PDI có xu hướng tăng khi tăng lượng NV, thể hiện sự phân bố kích thước hạt trở nên rộng hơn Khi hàm lượng các hoạt chất trong hạt nano tăng lên, sự phân bố dịch chiết không đồng đều trong ma trận polymer có thể dẫn đến sự đa dạng phân bố kích thước hạt, dẫn đến giá trị PDI tăng [118] Tỉ lệ NV/CS bằng 0,5 có giá trị PDI thấp nhất và thế zeta cao nhất nên được lựa chọn cho các thí nghiệm đánh giá tiếp theo
Hình 3.4 PDI và thế zeta của CS/NV NPs theo các tỉ lệ NV/CS khác nhau
3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ CS/STPP đến tính chất hạt CS/NV NPs
Hình 3.5 Kích thước trung bình của CS/NV NPs theo các tỉ lệ CS/STPP khác nhau
Hình 3.5 cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan/STPP (CS/STPP) đến kích thước hạt trung bình của CS NPs từ phân tích DLS Kích thước hạt giảm từ 602,2 nm xuống 407,2 nm với tỉ lệ CS/STPP giảm từ 5,50 xuống 2,50 (g/g) nhưng sau đó tăng đáng kể lên 1700,0 nm ở tỉ lệ CS/STPP là 2,0 (g/g) Theo Fan và cộng sự, kích thước hạt giảm là do mật độ liên kết ngang giữa chitosan và STPP tăng lên dẫn đến thu được hạt nano nhỏ hơn, trong khi STPP dư thừa có thể kết nối các hạt nano riêng lẻ thành các khối hạt có kích thước lớn hơn [119]
Từ Hình 3.6 có thể nhận thấy thế zeta của các CS/NV NPs dao động khoảng 26-27,5 mV khi tỉ lệ CS/STPP tăng từ 2,5 đến 5,5 (g/g) Tuy nhiên, sự gia tăng hơn nữa của STPP tại tỉ lệ CS/STPP bằng 2,0 cho thấy thế zeta rất thấp (khoảng 16 mV), cho thấy sự mất ổn định của hệ khi khối hạt kết tụ [119]
Tất cả các giá trị PDI trong khảo sát này đều nằm trong khoảng 0,15-0,27 thể hiện sự phân bố kích thước hạt hẹp, ngoại trừ điểm tại CS/STPP bằng 2,0 có PDI rất cao (0,777) và quan sát được hiện tượng lắng Tỉ lệ CS/STPP bằng 2,5 (g/g) cho kích thước hạt trung bình nhỏ nhất (407,2 nm), đồng thời có giá trị PDI và thế zeta nằm trong vùng ổn định nên được chọn để thực hiện khảo sát tiếp theo
Hình 3.6 PDI và thế zeta của CS/NV NPs theo các tỉ lệ CS/STPP khác nhau
3.2.4 Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến tính chất hạt CS/NV NPs
Hình 3.7 cho thấy ảnh hưởng thời gian siêu âm đến kích thước hạt trung bình của CS NPs từ phân tích DLS Việc tăng thời gian siêu âm từ 5-25 phút làm giảm kích thước trung bình của các CS/NV NPs từ 485,8 nm xuống 370,4 nm Điều này có thể giải thích là do quá trình siêu âm sử dụng sóng xung kích mang năng lượng lớn, giúp phá vỡ và phân tách các khối hạt lớn thành các hạt riêng lẻ nhỏ hơn, giúp hệ phân tán tốt và đồng đều hơn [120] Một lý do khác là do quá trình siêu âm thúc đẩy chitosan và STPP tương tác với nhau thuận lợi hơn, từ đó làm tăng mật độ liên kết giữa chitosan-STPP dẫn đến thu được các hạt nano nhỏ hơn Việc kéo dài thời gian siêu âm nhìn chung sẽ làm giảm kích thước hạt
Hình 3.7 Kích thước trung bình của CS/NV NPs theo thời gian siêu âm khác nhau
Nhìn chung, giá trị PDI của các mẫu đều nằm trong vùng phân bố hẹp (0,14 – 0,23) Mặt khác, khi thời gian siêu âm tăng lên từ 5-25 phút thì thế zeta giảm dần từ 33,4 xuống 26,7 mV, điều này có thể là do quá trình siêu âm thúc đẩy STPP trung hoà điện tích bề mặt của chitosan, dẫn đến thế zeta giảm
Hình 3.8 PDI và thế zeta của CS/NV NPs theo thời gian siêu âm khác nhau
Phân tích tính chất lý hóa của CS/NV NPs
3.3.1 Hiệu suất bao bọc và khả năng tải của CS/NV NPs
3.3.1.1 Ảnh hưởng bởi nồng độ chitosan
Năm nồng độ chitosan 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,2 % (g/mL) được thực hiện với lượng dịch chiết không đổi NV/CS = 0,5 (g/g) và STPP CS/STPP = 2,5 (g/g) Kết quả thể hiện trong Hình 3.9, cho thấy rằng hiệu suất bao bọc (EE) tăng từ 55,53% lên 81,07% trong khoảng nồng độ chitosan từ 0,3–1,2% (g/mL) Điều này có thể là do việc tăng nồng độ polymer giúp mở rộng ma trận polymer, giúp hấp phụ và bao bọc hoạt chất hiệu quả [121] Bên cạnh đó, hiệu suất tải (LC) tăng từ 19,80% lên 28,96% khi tăng dần nồng độ chitosan Điều này thể hiện rằng mỗi đơn vị chitosan bao bọc được nhiều hoạt chất hơn
Hình 3.9 EE & LC của CS/NV NPs khi thay đổi nồng độ chitosan
3.3.1.2 Ảnh hưởng bởi tỉ lệ NV/CS Ảnh hưởng của sự thay đổi lượng NV đến hiệu suất bao bọc và khả năng tải được thể hiện trong Hình 3.10 với nồng độ chitosan 0,3 % (g/mL), tỉ lệ CS/STPP bằng 2,5 (g/g) và thời gian siêu âm 15 phút Giá trị EE tăng từ 45,06% lên 66,96% và giá trị LC tăng từ 8,05% lên 59,79% khi tỉ lệ NV/CS tăng dần từ 0,25 lên 1,25 (g/g) Điều này thể hiện rằng mạng lưới chitosan đủ lớn để hấp phụ và bao bọc hoạt
41 chất khi lượng hoạt chất ban đầu tăng lên, và khi có nhiều lượng NV thêm vào thì đồng thời cũng có nhiều hoạt chất được bao bọc [122]
Hình 3.10 EE & LC của CS/NV NPs khi thay đổi tỉ lệ NV/CS
3.3.1.3 Ảnh hưởng bởi tỉ lệ CS/STPP
Kết quả thể hiện trong Hình 3.11, cho thấy giá trị EE tăng từ 29,91% lên 52,27%, đồng thời giá trị LC tăng từ 12,66% đến 18,67% khi tỉ lệ CS/STPP giảm từ 5,5 đến 2,5
Hình 3.11 EE & LC của CS/NV NPs khi thay đổi tỉ lệ CS/STPP
Sự tăng trưởng về hiệu suất bao bọc có thể là do mức liên kết ngang cao hơn khi tăng STPP, giúp cải thiện hàm lượng dịch chiết bên trong hạt nano chitosan Tuy nhiên, hiệu quả bao bọc và hiệu suất tải giảm xuống khi tăng STPP hơn nữa Nguyên nhân có thể là do nhiều liên kết ngang được tạo ra giữa các chuỗi polymer dẫn đến sự co rút của các hạt Điều này tương tự như báo cáo của Hosseini và cộng sự cho thấy sự gia tăng ban đầu về khả năng tải tinh dầu oregano sau đó giảm xuống khi tăng nồng độ chất liên kết (từ 0,25% đến 10,0% g/mL) [123]
3.3.1.4 Ảnh hưởng bởi thời gian siêu âm
Kết quả trong Hình 3.12 cho thấy khi tăng thời gian siêu âm từ 5-15 phút thì giá trị EE tăng từ 48,96 lên 51,98%, đồng thời LC cũng tăng từ 17,48 lên 18,56% Điều này có thể giải thích là do thời gian siêu âm dài giúp thúc đẩy STPP liên kết với ma trận chitosan tốt hơn, từ đó giúp cải thiện khả năng bao bọc hoạt chất Tuy nhiên, khi tăng thời gian siêu âm hơn nữa thì EE và LC có xu hướng giảm Điều này có thể là do quá trình siêu âm dài có thể dẫn đến sự rò rỉ hoạt chất khi phân tách khối hạt thành những hạt nhỏ hơn có kích thước lỗ rỗng nhỏ hơn
Hình 3.12 EE & LC của CS/NV NPs khi thay đổi thời gian siêu âm
Thời gian siêu âm (phút)
3.3.2 Hình thái của CS/NV NPs
Hình 3.13 Hình ảnh FE-SEM của CS/NV NPs (b)
Hình thái của các hạt nano được phân tích bằng FE-SEM được thể hiện trong Hình 3.13 Các hạt nanochitosan nạp NV nhìn chung có hình cầu, bề mặt nhẵn và phân bố đều và đôi lúc xuất hiện sự kết hợp giữa các hạt Trong đó, các hạt nanochitosan nạp NV có kích thước từ 400-500 nm Trong khi đó, phép đo DLS cho thấy rằng hạt nanochitosan nạp NV có đường kính 350-370 nm Sự khác biệt kết quả giữa DLS và FE-SEM có thể là do sự biến đổi của hệ số khuếch tán trong phương trình Stokes-Einstein thành đường kính hạt thủy động lực học trung bình, hoặc các yếu tố như chuẩn bị mẫu, nồng độ và chỉ số khúc xạ của dung môi [124] Tuy nhiên, nhìn chung kết quả DLS và FE-SEM là phù hợp do không chênh lệch quá nhiều
3.3.3 Tính chất hóa học (FTIR) của CS/NV NPs
Hình 3.14 cho thấy đối với các mẫu CS NPs và chitosan (CS), một số đỉnh đặc trưng xác định ở 3444 và 3360 cm -1 đại diện cho các dao động hóa trị của nhóm
OH và NH2 Cả hai mẫu cũng cho thấy nhóm C-H xác định ở 2920 và 2874 cm -1
Do liên kết ngang giữa các chuỗi chitosan, có sự dịch chuyển mức thấp liên quan đến nhóm chức C=O của nhóm amide I, từ 1582 và 1418 cm -1 của mẫu chitosan sang 1558 cm -1 và 1409 cm -1 tương ứng chỉ ra sự tương tác tĩnh điện giữa các nhóm
44 amine trong chitosan và nhóm anion trong STPP [123] Độ giãn C-O-C không thay đổi ở 1195 cm -1 cho cả hai vật liệu CS và CS NPs
Hình 3.14 Phổ FTIR CS, CS NPs, NV và CS/NV NPs
Phổ FTIR vật liệu của CS/NV NPs cho thấy các đỉnh tương ứng với nhóm
NH2, C=O, O-H thay đổi đáng kể so với các đỉnh tương tự của NV, sự thay đổi này có thể là do sự tương tác giữa các nhóm -C=O, -OH trong NV với nhóm NH2, OH trong CS thông qua các tương tác lưỡng cực và liên kết hydro Nhóm chức CH thể hiện rõ ràng ở khoảng 2800-2900 cm -1 ở cao chiết NV, trong khi đó vật liệu CS/NV NPs có tín hiệu ở khoảng này rất mờ nhạt Điều này cho thấy có thể đã xảy ra việc đóng gói chiết xuất hoạt tính sinh học trong ma trận polymer của chitosan Ngoài ra, mẫu CS/NV NPs không thể hiện đỉnh đặc trưng nhóm C=O của NV tại vị trí khoảng
1600 cm -1 , điều này một phần nào cho thấy sự biến mất tín hiệu của các hợp chất bao gồm kaempferol, quercetin trong NV [125] Tóm lại, các tín hiệu đặc trưng của
NV được thể hiện yếu hoặc biến mất trong CS/NV NPs đã giúp dự đoán sự đóng gói thành công của NV trong các CS NPs
3.3.4 Cấu trúc vật liệu (XRD) của CS/NV NPs
Hình 3.15 Giản đồ nhiễu xạ tia X của CS; CS NPs và CS/NV NPs
Các dạng nhiễu xạ tia X của chitosan và CS NPs được thể hiện trong Hình 3.15 Hình ảnh nhiễu xạ của chitosan cho thấy hai đỉnh ở 2θ bằng 10° và 20° tương ứng với các mặt phẳng (020), (110) biểu thị cấu trúc tinh thể có trật tự của chitosan Trong khi, các peak này trở nên yếu đi trong giản đồ nhiễu xạ XRD của CS NPs, cường độ tương đối của đỉnh nhiễu xạ 20° giảm đáng kể và diện tích vô định hình tăng tương đối Điều này có thể là do chitosan có cấu trúc tinh thể đã bị phá hủy một phần sau khi liên kết ngang với STPP trong quá trình hình thành hạt CS NPs, điều này cho thấy bản chất vô định hình, điều này phù hợp với công trình trước đó [126]
CS/NV NPs cho thấy sự biến mất hoàn toàn của đỉnh peak 10° và có xuất hiện peak mới rộng hơn tại 20,2° Điều này có thể là do sự hình thành phức hợp vô định hình mà có thể là do sự tương tác giữa các phân tử giữa chitosan, TPP và hoạt
46 chất NV trong vật liệu Những kết quả này chỉ ra rằng bản chất vô định hình của CS NPs sau quá trình đóng gói không bị loại bỏ Kết quả tương tự như báo cáo kết hợp
CS NPs và chiết xuất nho của Sepideh Soleymanfallah và đồng nghiệp [127].
Đánh giá hoạt tính sinh học
3.4.1 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa
Hình 3.16 Khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết NV
Các gốc tự do làm hỏng các phân tử sinh học và các chất chống oxy hóa được sử dụng để trung hòa chúng và cung cấp các mức độ bảo vệ khác nhau [98] Sau khi hồi quy tuyến tính IC50 của chiết xuất nụ vối được xác định là 5,08 ppm, cao hơn so với giá trị vitamin C (2,78 ppm) Nhiều giá trị IC50 của cây thuốc Ấn Độ có thể được cung cấp để so sánh với cây thuốc đã đề cập: Chiết xuất rau má (17,33 ppm), hoa D falcata (7,93 ppm) và vitamin C được kiểm soát (2,12 ppm) [124] Tuyết Nguyễn và cộng sự cũng báo cáo chiết xuất lá vối IC50 là 29,73 ppm [98] Những kết quả này suy ra mức độ hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ của chiết xuất nụ vối y = 5,949x + 19,761 R² = 0,9907
Nồng độ cao chiết nụ vối (ppm)
3.4.2 Định tính khả năng kháng khuẩn và kháng nấm
Bảng 3.2 Xác định đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết NV
Chất thử Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Gram âm Gram dương Nấm
E coli P aeruginosa E.feacalis S aureus MRSA C.albicans A niger
Ghi chú: “-“: không có hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng kháng khuẩn bao gồm cả đường kính lỗ 8 mm đối với chất thử
Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy dịch chiết nụ vối 10000 ppm cho khả năng kháng khuẩn ở tất cả các chủng vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm Trong đó đường kính kháng khuẩn trên chủng nấm A niger là cao nhất Để có thể đánh giá cụ thể hơn về tác động của dịch chiết trên chủng vi khuẩn thử nghiệm dựa trên giá trị MIC Cao chiết nụ vối có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm Trong đó tác động kháng lại vi khuẩn Gram âm, nấm tốt hơn Gram dương (Bảng 3.2) Điều này có thế được lí giải dựa trên rằng cấu tạo của vi khuẩn Gram âm có lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài chứa các đơn vị lipid và saccharide phong phú giúp vi khuẩn tương tác và kết dính với hạt nanochitosan tốt và lâu hơn, từ đó giúp tạo ra hiệu ứng ức chế vi khuẩn tốt và bền vững hơn
Bảng 3.3 MIC (mg/mL) của dịch chiết NV
Chủng vi sinh vật MIC (mg/mL)
3.4.2.2 Vật liệu CS/NV NPs
Bảng 3.4 OD600 của vi khuẩn E coli và S aureus
Vi sinh vật Mẫu thử OD600
CS NPS 0,051 ± 0,032 CS/NV NPS 0,097 ± 0,051
CS NPS 0,067 ± 0,033 CS/NV NPS 0,030 ± 0,017
CS NPS 0,010 ± 0,009 CS/NV NPS 0,140 ± 0,070
CS NPS 0,000 ± 0,040 CS/NV NPS 0,019 ± 0,016
CS NPS 0,032 ± 0,028 CS/NV NPS 0,154 ± 0,078
CS NPS 0,000 ± 0,041 CS/NV NPS 0,033 ± 0,030 CS/NV NPs thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại cả E coli (OD600 0,097 ± 0,051) và S aureus (OD600 = 0,030 ± 0,017), E feacalis (OD600 = 0,019 ±
0,016) nhưng kém hiệu quả hơn một chút đối với E.coli CS/NV NPs thể hiện hoạt tính kháng nấm chống lại C.albicans (OD600 = 0,033 ± 0,030) (Bảng 3.3) Điện tích dương của chitosan tương tác với thành tế bào vi khuẩn mang điện tích âm dẫn đến phá vỡ và chết tế bào [128] Vi khuẩn Gram âm như E coli có màng ngoài chắc chắn, khiến các chất chống vi trùng khó thâm nhập hơn và làm giảm hiệu quả của chúng Ngược lại, vi khuẩn Gram dương như S aureus có lớp peptidoglycan dày hơn tạo ra một rào cản Việc thiếu màng phospholipid khiến chúng dễ bị một số tác nhân kháng vi sinh vật hơn [129] Chiết xuất nụ vối giúp tăng cường hơn nữa hoạt tính kháng khuẩn của chitosan.
Đánh giá khả năng bảo quản trái cây
Bảng 3.4 thể hiện hình ảnh cảm quan của trái dâu tây được bảo quản trong điều kiện bảo quản lạnh 4 °C trong 17 ngày Về cảm quan những trái đối chứng cho cảm quan tốt đến ngày thứ 7, ngày thứ 9 có dấu hiệu bị mềm và xuất hiện nấm ở ngày thứ 9 Vỏ dâu tây rất mỏng nên dễ bị mất nước nhanh dẫn đến giảm khối lượng và teo tóp lại Mặt khác, lớp phủ ăn được cung cấp một rào cản vật lý đối với
CO2, O2 và ethylene, giúp giảm trao đổi khí và mất nước Một nghiên cứu của Lee và cộng sự chỉ ra rằng dâu tây đối chứng cho thấy tốc độ hô hấp cao hơn so với trái cây được phủ nhiều polysaccharide trong quá trình bảo quản [130]
Những trái được bảo quản bằng vật liệu chitosan, nanochitosan và chitosan thương mại COS cho hiệu quả bảo quản tốt đến ngày thứ 11 Vật liệu chitosan kết hợp dịch chiết nụ vối cho thấy khả năng bảo quản vượt trội đến ngày thứ 13, trong đó vật liệu nanochitosan kết hợp dịch chiết nụ vối cho kết quả bảo quản tốt đến ngày thứ 15 tương tự như những báo cáo trước đây [131] Tất cả các nghiệm thức có sử dụng chất bảo quản không có dấu hiệu bị nấm mốc trong khi đó những trái đối chứng đã có dấu hiệu xuất hiện nấm mốc từ ngày thứ 9 Theo bảng điểm đánh giá cảm quan (Bảng 3.5) những trái dâu tây xử lý bằng CS/NV NPs được chấp nhận sau 15 ngày
Bảng 3.5 Ngoại quan của dâu tây trong 17 ngày bảo quản
Bảng 3.6 Bảng điểm đánh giá ngoại quan của dâu tây
Nghiệm thức Đối chứng Chitosan CS NPs CS/NV CS/NV
3.5.1.2 Đánh giá độ hụt khối
Dựa vào đồ thị độ hụt khối (Hình 3.17) cho thấy, sau 7 ngày bảo quản nhóm nghiệm thức bổ sung dịch chiết nụ vối (CS/NV và CS/NV NPs) và những trái không bổ sung dịch chiết (CS NPs và COS) đều cho thấy độ hụt khối thấp hơn những quả đối chứng Trong khi đó những trái được bảo quản bằng dung dịch chitosan lại có độ hụt khối cao hơn so với các nhóm trên và có chút nhỉnh hơn so với mẫu đối chứng Điều này cho thấy chỉ sử dụng chitosan không hiệu quả trong bảo quản Đến ngày bảo quản thứ 11 có sự phân hóa rõ ràng về độ hụt khối Nhóm bổ sung dịch chiết vẫn là nhóm có độ hụt khối thấp nhất Trong đó vật liệu CS/NV NPs cho thấy độ hụt khối thấp hơn hẳn so với CS/NV Nhóm vật liệu tạo nano có độ hụt khối thấp hơn đối chứng Trong nhóm này, vật liệu CS NPs cho thấy độ hụt khối thấp hơn chitosan nhưng cao hơn COS Vật liệu nanochitosan có bổ sung dịch chiết nụ vối có độ hụt khối thấp nhất Điều này cho thấy vật liệu được tổng hợp dưới dạng nano
52 giúp cải thiện khả năng bảo quản hơn với chitosan và việc bổ sung dịch chiết nụ vối làm tăng hiệu quả bảo quản đáng kể
Xu hướng trên vẫn giữ không đổi đến ngày thứ 17 Độ hụt khối của vật liệu không bổ sung dịch chiết trên 54,0%, đối chứng 55,17% và nhóm bổ sung dịch chiết dưới 50%, trong đó CS/NV NPs là 48,79% Vật liệu bổ sung hoạt chất từ dịch chiết nụ vối và được tổng hợp dưới dạng nano đã cho thấy hiệu quả trong việc bảo quản so với những nhóm còn lại Một số nghiên cứu cũng chỉ ra việc dâu tây được xử lý bằng dung dịch phủ polysaccharide có thể ăn được bao gồm tinh dầu kinh giới cay, sodium alginate, nanochitosan và tinh thể nano cellulose đã giảm 10,8% trọng lượng sau 9 ngày bảo quản so với 37,0% của quả không được xử lý [130] Điều này là do lớp phủ mỏng, giúp giảm mất độ ẩm và ức chế sự lây nhiễm của vi sinh vật
Hình 3.17 Đồ thị độ hụt khối các nghiệm thức bảo quản dâu tây
Xu hướng đối với bảo quản trên chuối cau cũng tương tự dâu tây, trái đối chứng bảo quản tốt tới ngày thứ 5, tới ngày thứ 7 xuất hiện đốm mốc Trái bảo quản bằng vật liệu tạo nano kết hợp dịch chiết cho hiệu quả bảo quản đáng kể, đến ngày thứ 10 trái không bị nhũng, chưa xuất hiện nấm mốc Trong khi đó trái được nhúng bằng chitosan thương mai bị nhũng từ ngày thứ 8, tới ngày thứ 10 bị nấm mốc Trái được nhung bằng CS/NV NPs bắt đầu xuất hiện nấm mốc từ ngày thứ 10 Theo bảng điểm đánh giá cảm quan (Bảng 3.6) chuối cau xử lý bằng CS/NV NPs được chấp nhận sau 9 ngày Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hỗn hợp chiết xuất cây vối kết hợp với chitosan và gum arabic làm lớp phủ ăn được cho thấy khả năng bảo quản chuối 21 ngày ở điều kiện phòng [132]
Bảng 3.7 Bảng điểm đánh giá ngoại quan của chuối cau
Nghiệm thức Đối chứng Chitosan CS NPs CS/NV CS/NV
Bảng 3.8 Ngoại quan của chuối cau trong 10 ngày bảo quản
3.5.2.2 Đánh giá độ hụt khối
Hình 3.18 Đồ thị độ hụt khối các nghiệm thức bảo quản chuối cau
Dựa vào đồ thị độ hụt khối (Hình 3.18) cho thấy, sau 4 ngày bảo quản nhóm nghiệm thức bổ sung dịch chiết nụ vối (CS/NV và CS/NV NPs) và nhóm không bổ sung dịch chiết (CS, CS NPs và COS) đều cho thấy độ hụt khối thấp hơn những quả đối chứng Độ hụt khối của vật liệu CS/NV NPs thấp nhất, thấp hơn cả mẫu thương mại COS và xu hướng trên vẫn giữ không đổi sau 10 ngày bảo quản Đến ngày thứ 9 có sự phân hóa rõ rệt hơn về độ hụt khối Nhóm bổ sung dịch chiết vẫn là nhóm có độ hụt khối thấp nhất Trong đó vật liệu CS/NV NPs cho thấy sự nhỉnh hơn hẳn so với CS/NV Nhóm không bổ sung dịch chiết có độ hụt khối vẫn thấp hơn mẫu đối chứng trong đó vật liệu CS NPs bắt đầu có xu hướng độ hụt khối thấp hơn so với vật liệu CS Điều này cho thấy vật liệu được tổng hợp dưới dạng nano giúp cải thiện khả năng bảo quản hơn với chitosan
Xu hướng đối với đánh giá bảo quản trên chuối cau cũng tương tự với dâu tây, độ hụt khối giảm đáng kể, sau 10 ngày bảo quản độ hụt khối của vật liệu không bổ
57 sung dịch chiết xấp xỉ 52,96%, đối chứng là 56,9%, nhóm bổ sung dịch chiết dưới 43% trong đó vật liệu CS/NV NPs có độ hụt khối thấp nhất 37,6%, thấp hơn cả mẫu thương mại COS 40,85% Vật liệu bổ sung hoạt chất từ dịch chiết nụ vối và được tổng hợp dưới dạng nano đã cho thấy hiệu quả trong việc bảo quản so với những nhóm còn lại Một số nghiên cứu cũng chỉ ra việc nano chitosan kết hợp với chiết xuất cây nha đam và Moringa oleifera ứng dụng bảo quản chuối, kết quả cho thấy độ hụt khối tối đa là 23% sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 18 ± 1°C [133] Điều này là do lớp phủ mỏng, giúp giảm mất độ ẩm và ức chế sự lây nhiễm của vi sinh vật