Luận án tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu chuyển hóa Saccharose thành Fructooligosaccharides (FOS) và tinh sạch FOS bằng phương pháp lọc Nano

Lu n n đã đạt du cm tsố kết qu chính như sau: 1 Kết quả nghiên cứu lý thuyếte Xây dựng du c mô hình đ ng học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS.e X cđịnh du c quy l

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHI MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

LE THI HONG ANH

NGHIEN CUU CHUYEN HOA SACCHAROSETHANH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)

VA TINH SACH FOS BANG PHUONG PHAP LOC NANO

LUAN AN TIEN SI KY THUAT

TP HO CHI MINH NAM 2013

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHI MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

LE THI HONG ANH

NGHIEN CUU CHUYEN HOA SACCHAROSETHANH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)

VA TINH SACH FOS BANG PHUONG PHAP LOC NANO

Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm va dé uốngMã số chuyên ngành: 62540201

Ph nbi nd cl p 1: PGS TS Nguyễn Thị Xuân SâmPh nbi nd cl p2: PGS TS Ly Nguyén BinhPh n bi n 1: GS TSKH Luu Duan

Ph n bi n2: PGS TS Nguyễn Tiến Thang

Ph n bi n3: PGS TS Mai Thanh Phong

NGU’ I HUONG DAN KHOA HỌC:1 PGS TS Đống Thi Anh Dao

2.TS Nguyễn Hữu Phúc

LỜI CAM ĐOAN

T cgi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu e ab n thân t cgi C c kếtqu nghiên cứu vac c kết lu n trong lun n nay là trung thực, và không sao ch p tb tcứm tnguôn nào và dư ib tk hình thức nao Vi e tham kh oc c nguồn tài li uđã du c thực hi n tr ch d n và ghi nguồn tải li u tham kh o đúng theo yêu e u

Tcgi lun n

Lê Thị Hồng Ánh

TÓMT TLU NÁN

S n xu t prebiotie va b6 sung prebiotic vào thực phẩm là xu hư ng nổi b te ae c nghiên cứu trong lĩnh vực công ngh_ thực phẩm hi n nay trên toàn thé gi i M ttrong những prebiotic đã và dang du c quan tâm nhiều là fructooligosaccharides(FOS) Ch nh viv y, vi e nghiên cứu s nxu t FOS có đ tỉnh khiết cao, phùh pv itiêu chuẩn chế biến thực phẩm t nguồn nguyên li u trong nu c th t sự làv nđềc nquan tâm và ph t triển

Dé góp ph n gi i quyết v n dé trên, lun n tiến hành nghiên cứu c c yếu tổ nhhưởng, đ ng học phn ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzymefructosyltransferase (FTS) và nghiên cứu nâng cao đ tinh khiết c a FOS bang phươngph p lọc nano Lu n n đã đạt du cm tsố kết qu chính như sau:

1) Kết quả nghiên cứu lý thuyếte Xây dựng du c mô hình đ ng học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành

FOS bằng enzyme FTS.e X cđịnh du c quy lut nh hưởng c am t số thông số công ngh đến kh

năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano vàdé xu t phương n lọc tu n hoàn kết h p pha loãng để nâng cao đ tinhkhiết c a FOS

2) Kết quả nghiên cứu thực nghiệme Dax cđịnhc c thông số đ ng học c aenzyme FTS bang phương ph p gi i

thu t di truyền, giúp gi m thiểu số th nghi m, thời gian và chi ph khi

nghiên cứu đ ng học ph n ứng enzyme, đặc bi t trong trường h p ph n ứng

có nhiều cơ ch t.e Xây dung du c phương trình hỏi quy thực nghỉ m môt nh hưởng c a

nhỉ t d , pH, nồng đ saccharose ban đ u và ty | enzyme đến hi u su tchuyển hóa saccharose thành FOS,t đó x c định du c điều ki n tối ưu choqu trinh téng h p FOS

e Đã tối ưu hóa c c thông số công ngh c a qu _ trình lọc nano bằng phươngph p vùng c m và lựa chọn chế đ lọc tu n hoàn thchh p để nâng cao đtinh khiếtc a FOS đến 86,7%.

Những kết qu trên bu c đ u đã tạo tiền dé cho vi c triển khai công ngh , ứngdụng vao thực tế, đồng thời là nguồn tham kh o tin c y cho những nghiên cứu tiếp

theo trong cùng lĩnh vực.

ABSTRACT OF THESIS

Nowadays, production of prebiotic and prebiotic supplements in food products isconsidered a prominent trend in food technology worldwide One of the mostinterested prebiotics is fructooligosaccharides (FOS) Hence, the study of producinghigh purity of FOS that can meet the food processing standards from domesticmaterials must be a matter of concern and development.

To solve this problem, the thesis aims to study the influencing factors, thekinetics of FOS synthesis from sucrose using fructosyltransferase (FTS), and theimprovement of purity of FOS by nanofiltration Thesis has achieved some majorresults are as follows:

1) Theoretical resultsA kinetics model of FOS synthesis from sucrose using fructosyltransferasewas built.

Rules of main factors that give impacts of technological parameters on theseparation of monosaccharides, saccharose and FOS by nanofiltration weredetermined, and the technique of diafiltration to enhance the purity of FOSwas also proposed.

2) Experimental resultsThe parameters of enzyme kinetics FITS by genetic algorithm method weredetermined The result reduced the quantity of experiments, time and costrelated to study of kinetics of FITS enzyme, especially in case of multiplesubstrates.

The regression equation which stimulates the effects of temperature, pH,initial concentration of sucrose and enzyme rate on the performance oftransforming saccharose into FOS was established Then, the optimumconditions of FOS synthesis was determined.

Main parameters of nanofiltration process were optimized by means ofrestricted areas Moreover, the optimum diafiltration mechanism was alsoset to enhance the purity of FOS to 86.7%.

The results have established initial steps for the application of new technologyinto practice In addition, results found in this thesis would be useful references forfurther research in the same field.

Tôi muốn gửi lời e m ơn sâu sắc đến gia đình b nhỏ đã tạo điều ki n cho tôi

nghiên cứu, yên tam làm vi c,c m ơn c ccon Vĩnh Liêm, Viên Phương và Thục Khuê

đã mang lại niềm vui và nhi t tình cho mẹ

Dac bi t, c m ơn người bạn Như Nguy n das tc nh nghiên cứu cùng tôi, t ng

ngày t ng ngày, dù đã ở th t xa, vn luôn hỗtr vad ng viên tôi hoàn thành lun n

này.Tôi cũng xin c m on Khoa Kỹ thu t Hóa học — Trường Dai hoc B ch khoa, t p

thé đồng nghi p khoa Công ngh thực phẩm — Trường Dai hoc Công nghi p thựcphẩm TP.HCM đã giúp đỡ và chia sẻ v i tôi trong thời gian v a qua

Lê Thị Héng Ánh

MỤC LỤC`

PDEPEĐPEĐPTPEVDTPTPPDPPDPDPDPDTPDDEDEPEDEPĐPEPDDDYDVUVDVVVVVPVVVYVVVVPPPPPPDPPDTPDEDEDEPEPEPEPDPDUPUVVVVVVVVVVVVPPDPPPDPDPDPDPDEDEDEPEPPPEPVDUVUVUVVVVVDĐDĐVĐVĐĐVạawwmxawMmMmmmmx,Mm<wMáa—.m£wá—wMmmaMmmm<œ<aaMMmMma§gMmœaựưmmaaammM,M.M.,

pqo q € qe p p [SBR A BAA BA BA BA BA IN VN VN BA BA BA BA BA BA BA BA BN BA BA BA BA BA BA BN BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA BA A A A BA A A A A A A A A A A DR VY` ?

DDETDEDVEDVDVDVVDUEPVUPVEDVDVVDVVDUVVEĐVEDVDVVDEPVDVVUVDUVDVVDVVDVVEPDVEDVVDVVDVVDUVĐVDVVDVVDVVDEVUUVDVVDVVDVVDUEVUEDVDUVVDVVDVVUEVUVVDVVDUVVDVVDVVVVUVDV 7 7

IqmMmuamaMmmaaMmMmmmMm EE SERRE SE SEES SEESESESSEEESESEEEESESESEESESSERESESSEEE EE SEEEE EE SESEESRREEEEERG 71.mm ma&<maMmmmmMmaMmaMmMm mm mm KTmmm

DDEDEDEVEDVDVDVVEPVPVDVDVVDVVDVVDVDVDVDVVDUVVVUVDVEDVEDVVEVDUEDVDVDVVDVVVVUVUVDVDUVVDVVVVDVEUVEĐDVDVDVVDUVVDUVUDVĐDVDVVDVVDVEVĐVPDVVDVDVVDVVDVVEVEĐVVDVVV 44I„amxmmmnaamaáMmăm<M<<mmm<mmMmmas<MmMmamMmMmMmmmmMMa‹À%ämmHmẮmn.m£œmmmnPSSSSSSSS ESS V SSS VN VN ESTEE TESTES SETS VN VN VN VN VN VN VN VN TST TTT TST TTT TTT TST VI II XIV IV VY VN ma

D D

` ?

PDETEDEDEVPEDVDVVDEPVEPVĐDVDVDVVDVVEPVDVDVVDVVDUEVUVĐDVDVVDUVDUEVEVĐDVDVDVVDUVVVUVĐDVDVVEDVVDVVEVVDVĐDVVDVVVVEVIaaạaằmœămaáxaMmmaMmMm MmmMmmaa&ámMmMMmmaăm£mmmmmm.<‹

D

2

PDDETDEDPEDVEDVVDVVDVVPDVDVDVDVVDVVPVDVDVVDVVUVVUUVDVDVDVVDEVEUVDVDUVVDVVDVVVDVDVVEUVVDVVDVVEVVVĐVVDVVVIqMMmaaaMmmmmmaMmMmmammamamMmmmm mm £†Ẽmmm

[BRA V V VU VN | VN VY VY KV KV KV KV KV KV VY VVVVYVVVÊ

`1 TONG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH

1.1 FOS và prebiotic

1.2.C c phương ph p t6ngh pFOSt saccharose.1.3 D ng học ph n ứng chuyén hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS L41.4.C cphuong ph p nâng cao đ tinh khiết ¢ a FOS c -c-c .2Ô1.5 Ứng dụng phương ph p gi i thu t di truyền (GA - Genetic Algorithm) vào bài

to n tìm kiêm va tôi ưu 2

1.6 Những v n đề tổn tại trong công ngh s nxu tFOS

1.7 Hư ng nghiên cứu vàn 1 dung nghiên cứu c alu n n ¬—.

A L4

PDEDEPDĐPEĐTPTPTPPPPPDPDPDPDPDEDEDEDEPEDEPĐDĐPDDVDUVPVVVVVVPVVVVVVPVPPPPDPDPDPDPDPEDEPDEPPDPDĐDPDUVVVVVVVVVVVVVPPPPPPDPDDPDEDEDEPDEPVPUDUVUVUVUVVEDĐPDĐPĐĐVVVĐVam x<.,mmaaxwMmmwMMqmmMm.m,ẹmmaawmMMmMMmmmmmnaMmmmMmmmặmaaaaMwmmMMAmn

ÐV VY MS VY MS VY KV KV XS VY VY MS MS MS KV MS XS XS VY VÀ §€€VS§ VY

2Ó2.1 Nguyên li u

3 NGHIÊN CỨUC_ C YEU TO ANH HUONG VA DONG HỌC PHÁN UNGCHUY NH A SACCHAROSE THÀNH FOS BANG ENZYME FTS THUNH NTU pnbodfiirpei s tnbpt

3.1 Tong h pFOSt saccharose bang enzyme FTS 5- c2 +2 2+s+s+escee 433.2 Nghiên cứu c c yếu tố nh hưởng đến qu trinh tong h pFOSt saccharosebăng enzyme FTS «+ + se S333 E1E15151515 5151511111111 111110150111 11 11T 1y 413.3 Nghiên cứu đ ng học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang

enzyme FTS thu nh nt Aspergillus flavipes Ăn ke, 513.4.D nhgi mucd tuongthche amo hình to n học đã xây dung v 1 thực

4 NGHIEN CUU NANG CAO DO TINH KHIET CUA FOS BANG PHUONG

PH P LOC NANOI

4.1 Nghiên cứu lua chọn mang lọc nano để tinh sạch EOS se c+s+ccse: 674.2 Nghiên cứu c c yếu tố nh hưởng đếnkh năng loại bỏ glucose, fructose vasaccharose ra khỏi dung dịch FOS sau tong h p bang phương ph p lọc nano 69

4.3 Nghiên cứu nh hưởng c a phương thức pha loãng trong qu_ trình loc nano

đến đ tinh khiết và hi usu t thu hồi FOS - c++cccereereerkeerkrerkeerkrrrk 944.4 Kiểm tra ch tlu ng, x c định tong hi usu t thu hồi s n phẩm FOS 85% 106` nh 1085 KET LU N VÀ KIÊN NGHIR

5,1 KẾT ÏU tececccccscscsesssscscscscscscscscscssscscsessssscscscscsvsvsvsssssssvsessssscscscacavavevacavavevenens 1095.2 Kiến nghị - +: E1 S121 3 151151111 1151111 111101151101 11 0115110101 01.0101 0111011110 y0 1106.C C TÀI LIỆU CÔNG BO CUAT CGIAR

7 TÀI LIEU THAM KHẢÁOI

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ty1 tiêu thụ c c loại prebiotic trên thé gi i năm 2008 - 4Hình 1.2.C u trúc e am t số phân tử FOS ¿-¿- 5+ 2 E23 E2 2E EEEEEEEErkrkrkred 5Hình 1.3 Sơ đồh thống s n xu t FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao đ

(Neosugar P) sử dụng phương ph p lọc gØe@Ì - << 5S S1 ke 13

Hình 1.4 So s nh kết qu giữa dự đo n theo mô hình to n học và thực nghỉ m 18Hình I.5 So s nh kết qu giữa dự đo n theo mô hình c a Lee và thực nghỉ mv i

nông d saccharose ban đ u là 4008/ÌL - G9900 19

Hình 1.6 So s nh két qu dự đo n theo mô hinhe a Rocha và thực nghỉ m 20Hình 1.7 Sơđồh thống phứch ps nxu tFOS cao đ theo nghiên cứu c a

SHOU VAC NE SU .ea 24

Hình 1.8 Sơ dé h théng th nghỉ mv ibinhph nứng cótchh pb phn

loc màng trong nghiên cứu c a Nishizawa Va C NG SU eeeeecscccccccccceeeseseeseseeessnneeeeeees 26

Hình 2.1 H thống thiết bị loc nano sử dung mang dang cu N xoắn 39Hình 3.1 Quy trình tong hh pFOSt saccharose bang enzyme FTS - 43Hình 3.2 Lưu d6 thu t to n xây dựng qu n thé bang phương ph p ng u nhién 59Hình 3.3 Luu đồ thu t to n tìm nghỉ m tối ưu bằng phương ph p gi i thu t

3810/2017 61

Hình 3.4 So s nh giữa mô hình đ ng học ph n ứng tong h p FOS bang enzyme

FIS v 1 thực nghi Im -G c0 9.00 65

Hình 4.1 Sơ đồ h thống thiết bị lọc nAñnO s5 6S E391 SE EE SE eEseekekseesed 68Hình 4.2 Anh huéngc anhi tđ t id phân riêng va thông lu ng dòng qua mang 72Hình 4.3 Anh huéngc anông đ t id phân riêng va thông lu ng dòng qua màng 77Hình 4.4 Cơ chế qu trình loc nano c.ecccccscsccccscsecsesessscsssscscssscsssscsessssssssesesessesssesees 78Hình 4.5 Ảnh hưởng c a lưu lư ngt it id phân riêng.thông lu ng dòng qua màng

Hình 4.6 Ảnh hưởng c a psu tt id phân riêng và thông lu ng dòng qua màng 85Hình 4.7 Anh hưởng e anông đ nh pli ut ¡ thông lu ng dòng (DS-5-DL) 94Hình 4.8 Sự thay đối c anồng đ c c đường, đ tỉnh khiétc a FOS, hi usu t

thu hồi FOS theo sô bư c lặp đôi v ic c phương thức pha loãng kh c nhau(màng IDS-Š5-lDÌL) - 0000300 0000000 99

Hinh 4.9 Su thay doi c anÖng đ c cduong, d tinh khiét c a FOS, hi u su t

thu hồi FOS theo sô bư c lặp đôi v ic c phương thức pha loãng kh c nhau

DANH MỤC CAC BANG BIEU

B ng 1.1 Tong kết thị trường prebiotic trên thé gi i giai đoạn 2004-2009 va

dự đo n giai đoạn 2009-20 Ì⁄4 1 12222 000010111 1 11 1110000 1101 ng và 4

B ng 1.2 Tỷl bổ sung FOS vào m t số thực phẩm ¿2-5 2 c2 2 2+s££+£z£scscxd 7B ng 1.3 Thông số đ ng học e am t số enzyme FTS ¿- + 2 25s 2+s+s+ezzscscsd 17

B ng T1.4 So s nhc c phương ph p tinh sạch FOS SH he gưg 28B ng 2.1 Chỉ tiêu ch tlư ngc a đường saccharOSe 5 ĂĂ Ăn he 36B ng 2.2 Đặc t nhe a enzyme FITS - << - G00 ngờ 36

B ng 2.3 Thông số kỹ thu te a màng M-N2514A5 525cc cccecesrsrerred 37B ng 2.4 Thông số kỹ thu te a màng DS-5-DK ¿5- 2555 S2 £2££+EzEzrersred 38B ng 2.5 Thông số kỹ thu te a màng DS-5-DL 2 252-652 £+£2£2£££E£EzEz£zrsred 38B ng 2.6 Thông số kỹ thu te a màng GS ¿- 5+ 2 2 SE2E+E2EEE£E£EEeErerkrered 38B ng 2.7 Thông số kỹ thu te a màng GM ¿- - + 2222223 ESEEEEEEEEEErrkrkrered 39B ng3.1 Mức và kho ng biến thiên c ac c yếu tố trong qu trình chuyển hóa

saccharose thành FOS sử dung enzyme FTS HH ng vn 45

B ng3.2.Kếtqu thực nghỉ m theo ma tr n TYT 2Ê ¿5 2 +c2£e+s+EzEzrersred 45B ng3.3 Ảnh hưởng c a thời gian ph nứng đến qu trình tong h p FOS băng

ENZYME ETS oo eee 50

B ng 3.4 Thong số d ng hoce a enzyme FIS thunh nt Aspergillus flavipes

x c định băng phương ph p gi i thu t di fruyÊn - (<< c1 he reg 62B ng 4.1 Kh năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS c ac c mang 68

B ng 4.2 Bố tr th nghi m nghiên cứu c c yéuté nh hưởng đến qu trình lọc nano

B ng4.7.Kếtqu kh ost nhhưởngc a psu tđến qu trình loc nano 83B ng 4.8 Mức và kho ng biến thiên c ac c yếu tô (màng DS-5-DL) 88B ng 4.9 Matr n thực nghi m toàn ph n, k=2 và kết qu (mang DS-5-DL) 88B ng 4.10 Mức và kho ng biến thiên c ac c yếu tô (mang GS) -5¿ 89B ng 4.11 Matr n thực nghi m toàn ph n, k=2 và kết qu (mang G5) 90

B ng 4.12 Bồ tr th nghi m lọc tu n hoàn có pha loãng - 5552 s5s55¿ 95B ng4.13 Kếtqu th nghi m lọc tu n hoàn có pha loãng theo phương thức CVD

Chữ viết tắt

CATCVDFFOSFTS

GAGFGF2GF3GF4GIGODMFMWCONFROSASCFAUFVVDw/ww/vviv

DANH MUC CHU VIETT T

Thuật ngữ tiếng Việt

Catalase

Phương ph p lọc tu n hoan v i thé t ch không đổi

FructoseFructooligosaccharidesFructosyltransferaseGlucose

Genetic Algorithm - Gi i thu t di truyén

Saccharose1-kestoseNystose

IF- Fructosylnystose

Glucose isomeraseGlucose oxidaseQua trinh vi loc

Tai Vi t Nam, người tiêu dùng đã quen v im t số thực phẩm du c bổ sung FOSnhư sữa b t Ensure, Nestle, Dielac, m t số loại b nh (Kinh Đô, Bibica), kẹo Mac dù

nhu c u tiêu thụ FOS tại Vi t Nam r t cao nhưng hi n nay thị trường s n xu t FOS

trong nu c chưa ph t triển, c e nhàm y v n sử dụng 100% s n phẩm FOS ngoại nh p

t cc hang Orafti (Bi), Meiji Seika Kaisha (Nh t) Cũng ch nh vì v y, nghiên cứucông ngh s nxu tFOSt saccharose vas n xu t ở quy mô pilot đã du c ch nh ph

quan tâm và đưa vào n ¡ dung ch nh trong chương trình nghiên cứu trọng điểm quốcgia ph t triển công nghi p hóa dư c đến năm 2020 (quyết định số 61/2007/QĐ-TTgcaTh tư ngchnhph ký ngày 7/5/2007) Do đó, vi c nghiên cứu qu trình chuyểnhóa saccharose thành FOS và tinh sạch dé thu du c FOS có đ tinh khiết cao (>75%),t nguyên li u sẵn có trong nu c, thay thế FOS nh p ngoại, lav n đề thực suc n thiết,

có y nghĩa khoa học, có gi trỊ thực tiên và t nh xãh i cao.Mục tiêu của luận án:

(1) Nghiên cứu cc yếu tố nh hưởng và d ng hoc ph n ứng chuyển hóasaccharose thành FOS bang enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nh nt Aspergillusflavipes nhằm lựa chọn e c thông số công ngh th chh p và thông qua mô hình hóa vềd ng học ph nứng, có thể dự đo n du c nồng đ saccharose, glucose, fructose, FOStheo thời gian ph n ứng, tăng kh năngch đ ng điều khiến qu trình tong h p FOS

(2) Nghiên cứu nâng cao đ tỉnh khiết c a FOS bang phương ph p lọc nano,khang định t nh ưu vi t c a phương ph p này so v ic c phương ph p truyền thống

như lên men, enzyme.

Y nghĩa khoa hoc và thực tiên của luận an:

(1) Đã nghiên cứu m tec chcóh thống về công ngh s nxu t FOS, bao gồm cchuyển hóa tao FOS và tinh sạch đến đ tinh khiết 86%, phù h p v i tiêu chuẩn sửdụng cho thực phẩm Dac bi t, đã chứng minh du c cơ chế ph n ứng chuyển hóasaccharose thành FOS bang enzyme FTS thông qua mô hình đ ng học và dữ li u thựcnghỉ m.C ckét qu thu du c có ý nghĩa như những bu ckhaiph band u để e c nhàkhoa học công ngh kh c tham kh o khi nghiên cứu về lĩnh vực này

(2) Đã x c định du cc c thông số công ngh tối ưu và xây dựng mô hình to nhọc mô t đ ng học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTSdư idạngh phương trình vi phân Đây là co sở khoa học quan trong cho vi c tiến t ich đ ng điều khiến qu trìnhtổngh p FOS, hư ngt ¡ quy mô công nghỉ p

(3) L nd u tiên đã ứng dụng thành công phương ph p gi i thu t di truyền (GA —Genetic Algorithm) dé x c định c c thông số đ ng học c a enzyme FTS và tối ưu hóathông số công ngh c aqu trình lọc nano bằng phương ph p vùng c m Thành côngbu cd u này đã chứng minh m tc ch thuyết phục rằng ứng dụng lý thuyết to n họcvào gi i quyétc cv ndéc a khoa học công ngh sẽ mang lại hi uqu tốt, chnh x c,rút ngắn kho ng c ch giữa to nhọc v ic c ngành khoa học công ngh

(4) Đã x c định du c quy lu t nh hưởng c a nhi tđ , nông đ, lưu lu ng, psu t đến kh năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nanovax cl pdu cchéd lọc nanothchh p nhằm nâng cao đ tỉnh khiếte a FOS

(5) Vi c ứng dụng thành công màng lọc nano để t che cc u tử có kch thư cphân tử như glucose, fructose, saccharose ra khỏi hỗn h p nhiều c u tử là g iy cósức thuyết phục e c nhà khoa học Vi t Nam trong vi c nghiên cứu v t li u nano ứngdụng vào thực tẾ snxutecqu trình c a công neh cao như tỉnh sạch enzyme,

kh ng sinh, c c hoạt ch t sinh học

Lun nđư c trình bay trong 110 trang, chia làm 5 chương bao gồm:

t Aspergillus flavipes (24 trang).

Chương 4: Nghiên cứu nâng cao đ tinh khiết c a FOS bang phương ph p

lọc nano (42 trang).

Chương 5: Kết lu n và kiến nghị (02 trang)

1 TONG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNHNÑ¿£Il paia

Prebiotic là nguồn thức ăn cho c ¢ vi sinh v t sống hữu ch trong đường ru tv tch Nhờ có prebiotic mà vi sinh v thữu ch có điều ki n ph t triển mạnh mẽ hơn, do

đó c ithi nh tiêu hóa cho v tch

Trên thế gi ¡ có trên 400 s n phẩm prebiotic t hon 20 công ty s n xu t Ở châuAu, tong doanh thu c_a thực phẩm chức năng vào năm 2005 là kho ng 8 ty euro, trongđó phân đoạn prebiotie kho ng 87 tri u euro Kh năng s n xu t prebiotie ở châu Âuuc tnh khong 30.000 tnnăm, bao gồm inulin, oligofructose, fructo-

oligosaccharides (FOS), galacto-oligosaccharides (GOS) va lactulose, trong đó FOS

chiếm 19,7% Thị trường oligosaccharides tăng trưởng kho ng 15% mỗi năm [5], [6].Bảng 1.1 Tổng kết thị trường prebiotie trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và dự

đoán giai đoạn 2009-2014 [7]

Năm Tong doanh thu (triệu USD) Năm Tổng doanh thu (triệu USD)

2004 268.13 2010 526412005 291/72 2011 585842006 317,50 2012 645,292007 349 42 2013 705,082008 406,03 2014 765 852009 466,59

Hình 1.1 Ty lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thé giới năm 2008 [6]C c prebiotic du c bố sung nhiều vào thực phẩm là fructo-oligosaccharides

(FOS), galacto-oligosaccharides (GOS), isomalto-oligosaccharides (IMO), inulin và

oligosaccharides đ u nành [8] Trong số đó, FOS du cc c nhà nghiên cứu đặc bi tquan tâm bởi chúng có nhiều hoạt t nh sinh học tốt cho cơ thể e a người, dé thu nh n

và phạm vi ứng dụng r ng rãi.Melji Seika Co là công ty đ u tiên s n xu t FOS thương mạit saccharose v 1

tác nhân là Aspergillus niger vào năm 1984 S n phẩm du c đưa ra thị trường Nh tB nv i tên gọi Meioligo (Neosugar) Công ty nay sau đó thiết | pm t liên doanh v i

Beghin-Say c a Ph p và s nxu t FOS v i tên thương mại Actilight Ngoài ra, công ty

Cheil Foods & Chemical c a Hàn Quốc cũng dis n xu t FOS ở quy mô công nghỉ pv it cnhân lac c tế bào Aureobasidum pullulans cô định [5], [9], [10]

1.1.1 Dinh nghĩa, cấu tao, nguồn gốc của FOSFOS lac c oligomer fructose v ic c nhóm fructosyl du c gắn v i saccharose ởvitr B-2.1, thường du cmôt bang công thức GE›, trong đó G chỉ nhóm glucosyl vàF chỉ nhóm fructosyl, n là số nhóm fructosyl [11] C e dang phổ biến nh te a FOS là

1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1*-fructofuranosyl nystose (GF4) [12].

FOS có nhiều trong c c loại thực v t như hành, măng tây, lúa mì, lúa mạch,artichoke Jerusalem [13], chuối, m n, hành, hẹ tay, c chicory [14] Quá trình trích lyFOS t những nguén này ở quy mô công nghi p không có t nh kinh tế do nồng đFOS trong nguyên li ur tth p Vì lý do đó, FOS thương mai du cs n xu t bằngphương ph p tong h pt sacharose hoặcth y phânt inulin [15]

CH,OH

OOHO

HO 4CH;OH CH;OH

Kestose Nystose FructofuranosyÏ nystose

Hình 1.2 Cấu trúc của một số phân tử FOS [16]

NWOW ai tro và ứng dụng của FOS

Mtsốtcgi khi nghiên cứu về t nh ch t hóa lý c a FOS đều đưa ra kết lu nchung là FOS có nhiều t nh ch t hóa lý tương tự saccharose như d hòa tan, đ đôngđặc, nhi tđ sôi vac c thông số về qu trình kết tinh [9], [17] Tuy v y, khev isaccharose, FOS mang nhiéu dac t nh sinh hoc uu vi t hon Day ch nh la dac diémkhiến c c nhà thực phẩm chú ý vat p trung khai th c loại đường này

FOS có kh năng gây sâu răng th p hơn so v i saccharose, do vi khuẩn

Streptococcus mutans trong khoang mi ng gây sâu răng không su dung du c FOS[18] Ngoài ra Ikeda T (1990) [2] con nghiên cứu cho th y FOS không chỉ có kh

năng phòng ma còn có kh năng chữa b nh sâu răng Vi thé ngày nay nhiều nơi trênthé gi i dùng FOS thay thé cho đường saccharose trong thành ph n thức ăn hoặc trongchế biến b nh kẹo, đặc bi t là b nh kẹo cho trẻ em dé phòng b nh sâu răng

FOS không bị tiêu hóa ở ru t non nên đến du c ru t già m tc ch nguyên vẹn

Tại day FOS bị lên men bởih vi sinh v t trong ru t tạo thành những acid b o mạch

ngăn (SCFA) như acid acetic, acid propionic, acid butyric làm cho FOS có t e dụnggiống ch t xơ: gi mt o bón, c i thi nt nh ch te a phân, c i thi n mỡ m u va ngănchan su tong h peccht thối rita trong ru t Mat kh c, vi c su dung FOS con thucday qu trình h p thu Ca, Mg, không làm tang lu ng đường trong m u do FOS không

hoặc r t t bi th y phân boi h enzyme đường ru t Viv y FOSthchh p cho người

gia, phụ nữ va người bị b nh tiểu đường [3], |4].T nh an toan c a FOS đã du c chứng minh trong nhiều nghiên cứu kh c nhau

(Hidaka và c ng su, 1986; Clevenger và c ng sự, 1988; Tokunaga và c ng sự, 1989;

Kolbye, 1992; Coussement, 1999) v i kết qu là FOS không có nguy co gây ung thư.Nhiều nghiên cứu tiến hành trên đ ng v t va người cho th y có r t tt c dụng phụ liênquan t i vi c sử dụng FOS [19] C e kết qu nghiên cứu đ c t nh đã chứng tỏ FOSkhông gây đ t biến hoặc sinh qu i thai và không tạo ra t c dụng phụ nghiêm trọnghoặc kh năng gây ung thư od ng v t sau khih p thu v ¡ liễu lu ng lênt i 15% trongchế đ ăn [20]

Bang 1.2 Ty lệ bo sung FOS vào một số thực phẩm [20]

Loại thực phẩm TY lệ bố sung (%w/w)

Thức ăn trẻ em 1,2Nu cgiikht 1,2Banh quy 3,6B nh ngọt 1,6 -3,6Keo 5,0Banh cookie 25-343Bánh quy giòn 17-33

Sữa không bồ sung và có bổ sung mùi 04

Kẹo cứng 6,7Kem 1,5Mut va thach 0.9

Bánh nư ng xốp 3,6

B tngũ cốc ăn liền 33-154

Kem tr 1cay vanu c qu 1⁄4Súp 0,4Stra chua 13

FOS du c bồ sung vào c c loại thực phẩm như nu c gi ¡kh t,c es n phẩm sữa,b nh kẹo, mứt, thức ăn gia súc [16] Trong mứt, FOS có thé du c dùng làm ch t tạongọt, s n phẩm có mức năng lu ng th p hơn khi so s nh v i dùng saccharose Mac dùc c đặc điểm c m quan tương tự nhau, s n phẩm bồ sung FOS có đ ngot th p hơn vac u trúc mém hơn Trong kem, FOS có thé đư c dùng v i inulin dé thay thế đường,

tạo c m gi c ngon mi ng [21].

O Nh tB n, FOS du c dung pho bién nhu ch t tao ngot, ch t điều vi, ch td nva ch t giữ âm, bố sung vào c e s n phẩm thực phẩm như b nh quy, b nh ngọt, b nhmì, kẹo, c es n phẩm sữa va m t số loại nu c gi ¡kh t thay thế saccharose Ngoài ra,FOS còn đu c bổ sung vào m t số loại thực phẩm chức năng để tăng cường sự ph ttriển c a vi khuẩn có ch trong tuyến tiêu hóa [17]

NQCac phương pháp tổng hợp FOS từ saccharoseFOS du c tổng h pt saccharose bang phương ph p lên men v it c nhân là vi

sinh v t hoặc enzyme theo phương thức liên tục hoặc không liên tục Trong phương

ph p lên men không liên tục, người ta thường sử dụng tế bảo vi sinh v t va enzyme tựdo, còn công ngh cố định enzyme hoặc cố định tế bào du c sử dụng đối v i phương

ph p liên tục [22], [23], [24].

Gi ¡ph p cô định enzyme và có định tế bào trong s n xu t FOS cho hi u qu cao

hơn vis n xu t du c liên tục, tiêu hao nang lu ng t, nhà xưởng nhỏ v.v nhưng t nh

ôn dinhk mvac nm y moc, thiét bi hi n dai, nha xưởng tiêu chuẩn Mặc dù v y, đây

lại là phương ph p có kh năng công nghi p hóa cao và du ct p trung nghiên cứu

nhiều ở e c nu c có nên công nghỉ p ph t triển như Nh t B n, Trung Quốc, HànQuốc Phương ph p không liên tục có kỹ thu ts n xu t don gi n, thiết bị rẻ tiền hơnphương ph p liên tục Viv y, phương ph p này đư c sử dụng nhiều 6c c qui mô nhỏ,

Sangeetha và c ng sự [28] dùng tế bao Aspergillus oryzae CFR 202 dé tổng h pFOS v ico ch t là dung dịch saccharose 60% trong điều ki n nhi t d 55°C và pH

5,15 Hi usu tthu nh n FOS đạt 53% (g FOS/g saccharose).Trong m t nghiên cứu kh c, Aspergillus sp N74 có hoạt t nh fructosyltransferase

đã du c Oscar vac cc ng sự [27] dùng dé tổng h p FOS trong thiết bị ph n ứng cókhu y tr n cơ học v i hai nông đ sinh khối c a Aspergillus sp N74 là 6 và 9,5g/L.C c điều ki n ph nứng là nhỉ td 60°C, pH 5,5, nồng đ saccharose ban đ u là 70%(w/v) và thời gian ph n ứng 26 giờ Kếtqu thunh n đư cchoth y hi usu ttongh pFOS cũng như thành ph nc as n phẩm FOS phụ thu c vào nồng đ sinh khối và thời

gian ph n ứng Thời gian ph n ứng tối ưu cho qu trình tong h p FOS ứng v i nồngd sinh khối 6 và 9,5¢/L 1 n lu t là 24 giờ và 4 giờ (nông d FOS tương ứng là 378 va427g/L) Nồng đ sinh khối 9,5g/L tong h p du c I-B-fructofuranosylnystose, trongkhi đó s n phẩm FOS tổng h pv ¡nồng đ cơ ch t 6g/L không có thành ph n nay.Cctcgi cũng khang định răng thiết bi ph n ứng thiết kế trong dé tài và enzymfructosyltransferase du cs nxu tt Aspergillus sp N74 nguyên b n có thé là phương

ns nxu t FOS ở quy mo công nghi p.

Ngoài Aspergillus, m t số loại tế bào vi sinh v t tự do kh c cũng đư c sử dungdé tong h p FOS Prata và c ng sự (2010) [30] đã nghiên cứu tổng h p FOS t

Penicillium expansum ở nhit d 22 — 25°C, sau 12 gio thu du c 0,58g FOS/g

saccharose Kết qu này đã khang định tiềm năng c a ch ng Penicillium expansum

trong s nxu t FOS.

1.2.1.2 Sứ dụng té bào vi sinh vật cô địnhĐối v i công ngh cố định tế bào, m t số ch t mang có hi uqu cao đã du cnghiên cứu là calcium-alginate [31], [32], gluten [33], lõi bap [34]

Nhiều nhà khoa học đã có định tế bao vi sinh v t trên gel calcium alginate détong h p liên tục FOS như Feng, Bo v i Aspergillus niger AS0023 [31] và Sanchezv i Aspergillus sp N74 [32] Bang kh o s t thực nghi m và tối ưu hóa c c thông sốnhỉ td , pH, nồng đ saccharose ban đ u, kết qu cho th y có thé đạt hi u su t tongh p FOS lên đến 53% w/w (Aspergillus niger AS0023) và 50% w/w (Aspergillus sp

N74).

Vi c tong h p FOSt saccharose sử dung công ngh cô định tế bao Aspergillus

japonicus (có hoạt t nh B-D-fructofuranosidase) đã du c nghiên cứu v i ch t mang là

gluten (Chien, 2001) và lõi bắp (Mussatto, 2009) Chien và c ng sự chứng minh rằngtoc d ph nứng tăng theo nồng đ tế bảo trong mạng gluten và gi trị tối ưu đạt du ckhi nồng đ tế bao là 20% (w/w), nồng đ ban đu c a dung dịch saccharose là400g/L, thời gian ph n ứng 5 giờ, hi usu t tong h p FOS đạt 61% [21], [35] Kết quthực nghi m khi cô định Aspergillus japonicus ATCC 20236 trên lõi bap cho th y v inồng đ saccharose ban đ u là 200g/L, hi u su t tong h p FOS cao hơn so v i khidùng tế bào tự do, đạt 0,66¢/g dựa trên tong cơ ch t, 0,73g/g dựa trên co ch t tiêu thu

[34].

Những thông số quan trong nh hưởng đến qu trình chuyển hóa saccharosethành FOS là nhi t đ , pH, nồng đ saccharose ban đ u, tỷ | enzyme xúc t c và thời

gian lên men.

Vi c lựa chọn nhi td va pHthchh p cho ph n ứng phụ thu c vào nguồn gốcenzyme C c điều ki n tối ưu du c khuyến c ocho qu trình tổng h p FOS 1a nhỉ t đ

55°C, pH 5,5 v i enzyme t Aureobasodium pullulans; nhit d 60°C, pH 5 v 1enzyme t Aspergillus niger; nhit d 55 — 65°C, pH 5,0 — 6,0 v i enzyme tAspergillus japonicus [49]; nhì td 40 — 50°C,pH 4—6 v ienzymet Aspergillus

flavipes [25] Hi usu tly thuyétc aqu trình tong h p là 75% nếu chỉ tạo thành FOS.Tuy nhiên, do enzyme xúc t c bị ức chế bởi glucose du e gi i phóng ra nên hi u su tthực tế th p hơn nhiều [50], chỉ đạt kho ng 60% khi dùng enzyme t Aspergillus nigerATCC 20611 [1], [44] t 53 đến 59% v i enzyme t Aureobasidium sp [46] và 54.3%

v ienzymet Aspergillus flavipes [25].

Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu cho rang nên chon nồng đ saccharose ban đ ucao dé gi mhoạtđ nu c,vìv y làm gi m nguy cơ nhiễm vi sinh trong qu trình tổngh p và làm gi m chỉ ph cô dacs n phẩm sau nay [9], [49]

Quá trình tổng h pFOSt saccharose có thé đư c thực hi n theo phương thứcliên tục bang enzyme cô định hoặc phương thức không liên tục bang enzyme tự do(enzyme hòa tan) Vi e sử dụng enzyme tự do có m t số như c điểm như bị tốn th thoạt t nh enzyme trong qu trình v n hành, ph ib t hoạt enzyme sau khi chuyển hóa,

hoạt t nh th y phân cao d n đến tạo nhiều fructose, gi mđ tỉnh khiết c a FOS Điều

này làm tăng chi ph s n xu t FOS [10], [21] Tuy nhiên, hi n nay sử dung enzyme tự

do dé tổng h p FOS v n là phương ph p phố biến nh t

1.2.2.1 Sứ dụng enzyme tu doEnzyme tự do -fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) c a Aspergillus sp 27H phan

| pt dt đã du c Fernandez vac ng sự (2004) [51] sử dụng dé tong h p FOS Điềuki n tối ưu cho hoạt t nh chuyển fructose là pH 5,5 — 6,0 và 60°C, trong khi hoạt t nhth y phân cao nh t tại pH 4,0 va 55°C Ở nồng đ saccharose th p (10g/L), có sựchuyển hóa nhanh saccharose thành glucose và fructose, nồng d FOS thu du crtth p Ở điều ki n nồng đ saccharose 615g/L, tỷ l enzyme 20 U/g saccharose, nhỉ td 40°C, pH 5,5, nông d FOS dat gi trị tối đa 376g/L (234g/L 1-kestose và 142g/L

nystose).

Enzyme ÿ-D-fuctofuranosidase (EC 3.2.1.26) du i dạng chế phẩm enzyme

thương mai Pectinex Ultra SP-L ca hãng Novozymes mang hoạt tnh

fructosyltransferase đã du c nghiên cứu dé tong h p FOS t_ saccharose [52] và tdich ma [53] T saccharose (nồng d 450g/L), sau 14 giờ ph n ứng ở 65°C trongd m natri acetate 0,05mol/L (pH 5,6), Hang Y.D [52] đã thu du c FOS có néng đ272g/L (224g/L kestose va 48g/L nystose) v ¡hi u su t chuyển hóa hơn 70% dựa trênlu ng saccharose tiêu thụ Trong đó, FOS, saccharose, glucose và frucrose chiếm56.5%, 19.4%, 23,4% và 0.7% tong lu ng duong co trong s n pham Còn v 1 cơ ch tlà saccharose t dich ma, hoạt lực chuyén hóa c a chế phẩm enzyme Pectinex Ultra

SP-L là 58,1U/ml, nhi t d 40°C, pH 5,6 và ty | enzyme/dich đường m a là 2:100

(v/v), dung dich FOS sau tong h p có thành ph n gồm: FOS 50,4%; saccharose

10,4%; fructose 3,9% va glucose 35,3% [53].

Năm 2007, Yoshikawa và c ng sự [50] sử dung chế phẩm enzyme thô

j-fructofuranosidase thu nh nt Aureobasidium pullulans DSM 2404 trong các nghiên

cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và da đạt hi u su t tong h p FOS 62% Gi_ trị

này cao hơn so v 1 khi dùng c cch ng Aureobasidium sp khác (53 — 59%).Ngoài ra, xúc t c là inulinase t Kluyveromyces marxianus cũng đã dư c Risso

(2009) [54] và Santos (2007) [55] nghiên cứu thông qua vi c x c định c c điều ki n tối

uuc aqu trinh tong h pFOSt saccharose (nhi tđ , pH, nồng đ saccharose, hoạtt nh inulinase, ty | dung môi hữu co) bang phương ph p quy hoạch thực nghi m Hi usu t chuyển hóa FOS tối đa đạt 16,7+1,1% (w/w) đối v ih nu c— dung môi hữu cơ(ở nhi td 40°C; pH 6,0; nông đ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml;ty 1 dung môi hữu co/tong h_ thống là 25/100), đạt 12,8+1,0% (w/w) đối v ih nu c(ở nhi td 40°C; pH 5,0; nông đ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml)[54] Trong thiết bị ph n ứng coc nh khu yc a Santos vac ng sự (2007), ở điều ki ntối ưu (nh td 50°C; pH 6,0; nông đ saccharose 450g/L; hoạt lực enzyme inulinase4U/ml) thu du cs n phẩm cuối cùng bao gồm fructose (155g/L), glucose (155g/L),

saccharose (I32g/L) va FOS (50¢/L) [55].

Tai Vi n Công nghi p thực phẩm, enzyme fructosyltranferase đã đư c Trịnh ThịKim Vân và c ng sự [25] nghiên cứu sinh tổng h pt n m mốc Aspergillus flavipesVVTP84 và ứng dụng trong s n xu t FOS Tegi đã tối ưu hóa c c thông số côngngh theo mô hình b e 1 v ic c biến là nồng đ saccharose, tỷ | enzyme, thời gianph n ứng (cố định nhi t d 50°C, pH5) và hàm mục tiêu là nồng d FOS tạo thành.Kết qu thu du cs n phẩm FOS pho thông có đ tỉnh khiết cao nh t 54,3% khi dùng

cơ ch t là saccharose 54%, ty | enzyme 8U/g saccharose, thời gian ph n ứng 12 giờ.

Dựa trên phương ph p kh o s tt ng yếu tố, Nguyễn Hoàng Anh (2008) [56]cũng đã x c định điều ki n tối thch cho qu trình s nxut FOSt dich ma bangenzyme FTS c a Vi n Công nghi p thực phẩm là thời gian 15 gid, tý | enzyme 0.02,nhitđ 50°C, pH 5,0 S n phẩm FOS thu du c gồm: FOS (61,48%), saccharose

(10,10%), glucose (26,29%), fructose (2,13%).

Ở quy mô công nghỉ p, FOS du ctongh pt saccharose du it c dụng xúc † c

c aenzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) hoặc B-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26)thu nh nt cc loại vi sinh v t như Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, (Hình 1.3) Enzyme du c thêm vào dung dich saccharose 50 — 60% (w/v) ở pH 5,5 —

6 Sau ph nimgt 4-20 giờ ở nhi td 50—60°C, hénh p đường chứa FOS, glucoseva saccharose du đư c gia nhi tt i 90°C trong 30 phút dé b t hoạt enzyme; làm ngu ixuống dư ¡ 50°C; lọc; khử mau, mùi bằng than hoạt t nh; khử muối bang c t nhựa traođối ion và cô đặc chân không t i 75% ch t khô FOS phổ thông thu đư c là NeosugarG có đ tỉnh khiết 60% (w/w) [3]

So đồ hình 1.3 là quy trình s n xu t FOS phố thông (s n phẩm Neosugar G có đtỉnh khiết c a FOS dat 60% w/w) và FOS cao đ (s n phẩm Neosugar P có đ tinhkhiết c a FOS đạt 95% w/w).

Dung dich saccharos=

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống san xuất FOS pho thông (Neosugar G) và FOS cao độ

(Neosugar P) sử dụng phương pháp lọc gel [3]

1.2.2.2 Sứ dung enzyme cô địnhC c nghiên cứu về cố định enzyme và ứng dụng trong tổng h p FOS đã du cthực hi n v i nhiều loại enzyme t nguồn vi sinh v t kh e nhau như Pectinex Ultra

SP-L (t Aspergillus aculeafus) [36], enzyme fructosyltransferase (t Aureobasidium

pullulans) [57], enzyme B-fructofuranosidase (t Aspergillus oryzae) [58] Kếtqu choth yc c điều ki n tối ưu như pH, nhi td không bị nh hưởng do vi c cố định enzymevà s n phẩm FOS thu du c khi dùng enzyme cố định giống như khi dùng enzyme hòatan Mặt kh c, enzyme cô định ôn định hơn ở pH, nhi td cao [57], [59]

M t số nhà nghiên cứu đã chứng minh enzyme -D-fructofuranosidase (EC3.2.1.26) dư i dạng chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L c a hãngNovozymes có thé du c cố định hi uqu trên c c ch t mang như Sepabeads EC-EP3,Sepabeads EC-EP5 [36] và Eupergit C [59] mà không c n thêm muối hoặc dung dịchđ m Khi cô định trên polymer polymethacrylate (Sepabeads-EC) hoạt hóa v i nhóm

epoxy như Sepabeads EC-EP3, Sepabeads EC-EP5, v 1 cơ cht là dung dịch

saccharose nồng đ 630g/L, nông đ FOS dat gi trị tối đa 387g/L sau 36 giờ (240g/LI-kestose, 144g/L nystose và 3g/L IF- fructofuranosyl nystose) [36] Nghiên cứu vềch t mang Eupergit C e a Tanriseven va Aslan (2005) [59] cho th y sau khi có định,hoạt t nh tương đối c a enzyme đạt 96%, c c điều ki n tối ưu như pH 5,5 — 6,5, nhi td 65°C không bị nh hưởng do vi c cố định enzyme Enzyme cố định không gi mhoạt t nh sau 20 | n ph n ứng gi n đoạn Néng đ FOS tổng h p du c trong nghiêncứu này đạt kho ng 57% (w/w) v ¡ nồng đ dung dịch saccharose ban d u là 60%

(w/v), tương đương v ivi c sử dung enzyme Pectinex Ultra SP-L ở dạng tự do.

Yun vac ng sự (1996) [57] đã tong h p FOS liên tụct saccharose v ¡xúc t claenzyme FTS t Aureobasidium pullulans cỗ định trên nhựa có t nh xốp cao, DiaionHPA 25 Ở e c điều ki n tối ưu tương tự như khi sử dụng enzyme tự do (nhi t đ55°C, pH 5,5, nồng đ saccharose ban đ u là 600g/L), s n phẩm thu du c khi dùngenzyme cô định giống như khi dùng enzyme tự do Kho ng 8% hoạt t nh e a enzymecố định bi tổn th t sau 30 ngày v n hành liên tục, năng su t đạt du c là 1174¢/L.h

Trong m t nghiên cứu kh c c a Kurakake và c ng sự (2010) [58], enzyme

B-fructofuranosidase (sinh tổng h pt Aspergillus oryzae) du c cỗ định trên nhựa traođối anion (WA-30; polystyrene v i amine b c ba) T dung dịch saccharose 60%,nhi td ph nứng 55°C, thu du c FOS có đ tỉnh khiết 51,9% Hoạt tnh enzyme cố

định duy trì đư c trong 984 giờ.

1.3 Động học phản ứng chuyền hóa saccharose thành FOS bang enzyme cqp1.3.1 Cơ chế phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS

Ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS r t phức tạp.Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về cơ chế c a ph n ứng chuyển hóa này nhưng cho

đến nay v n chưa có kết qu thống nh t.H u như c c cơ chế ph n ứng đã công bố đều dựa trên 3 ph n ứng chuyển hóa(1.1), (1.2), (1.3) do Jung và c ng sự [60] công bố vào năm 1989 thông qua qu trìnhnghiên cứu ph nứng tổngh p FOS bang enzyme FTS v i nhiều cơ ch t kh c nhau

( 2GF —-> GFa+G (1.1)

4 2GEa > GF3 + GE (12)| 2GF3 —> Ga + GFo (1.3)

Chú thích: G là glucose, GF là saccharose, GF2 là [-kestose, GF3 là nystose, GF4là fructofuranosyl nystose.

Jung đã nh nth y khi dung glucose, fructose làm cơ ch t thi không có ph n ứngenzyme x y ra Khi saccharose (GF) du c dung lam co ch t cho ph n tng enzyme(ph nứng 1.1), chi có glucose (G) và 1-kestose (GF2) du c tạo thành Ty | glucose/1-

kestose là 1/1 chứng tỏ cơ chế ph n ứng không đối xứng, nghĩa là saccharose đóng c

vai trò ch t cho và ch t nh n nhóm fructosyl Do đó 1 mol glucose và 1 mol 1-kestose

du c tạo thành đồng thời t 2 mol saccharose Tương tự v i cơ ch t kh c như kestose và nystose (ph n ứng 1.2, 1.3), saccharose (GF) và nystose (GF3) đư c tổng

1-hpt I-kestose (GF2), trong khi 1-kestose (GF2) và fructofuranosyl nystose (GF4)du c tạo thanh t nystose (GF3) Ph n ứng enzyme v 1 fructofuranosyl nystose là cơ

ch t không x y ra, có lẽ la do gi trivn tốc cực dai Vmax nhỏ va gi tri hang sốMichaelis — Menten Km 1 n [60] Vì v y, có thể trình bay tổng qu t c c ph n ứngchuyền fructosyl như sau:

GFn + GFn —> GFn+1 + GFn+ , trong đó n=1-3 [60], [61] (1.4

Tuy nhiên, cơ chế c a Jung dé xu t không gi ¡th ch du c sự tạo thành m tlu ngnhỏ fructose trong qu trình tổng h p FOS trên thực tế Vì v y, ngoài 3 ph n ứngchuyển hóa nêu trên, m t số nhà khoa học đã bổ sung c c ph n ứng th y phân vào cơchế ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS, tiêu biểu là 4 ph nứng v ¡cơ chế e a Rocha [62] và 1 ph nứng th y phân v ¡ cơ chế c a Duan [63]

Khi nghiên cứu về | p mô hình đ ng học qu trình lên men tổng h p FOS, Rocha

[62] mot 7ph nứng ch nh, trong đó có 4 ph nứngth y phân (1.5, 1.6, 1.7, 1.8).

( 2GF->GFa+G (1.1)

2GF > GF3 + GF (1.2)2GE > GF4 + GF (1.3)

< GF >G+F (1.5)

GFa > GF+F (1.6)GF3 > GFo + F (1.7)| GF: > GF + F (1.8)Chu thich: F la fructose

Bang vi c chứng minh du c rằng hoạt t nh th y phân c a saccharose và

1-kestose r t nhỏ, có thé bỏ qua (do nồng đ c a những cơ ch t này đều > 5% trong h uhết thời gian ph n ứng) nhưng không bỏ qua hoạt t nh th y phân c a nystose du c,Duan và c ng sự [63] đã dé xu t cơ chế ph n ứng tong h p FOS gồm 3 ph n ứngchuyển hóa (t 1.1 đến 1.3) và 1 ph nứng th y phân nystose GF3 (ph nứng 1.7)

( 2GEF > GF2 + (1.1)2GF2 > GF3 + GF (1.2)2GF3 > GF4 + GF2 (1.3) GF3 > GF2 + F (1.7)

Ngoài c e cơ chế ph n ứng do Jung, Duan, Rocha dé xu t, Nishizawa [64] da duara cơ chế gồm 6 ph n ứng chuyển fructosyl (ph n ứng 1.2, 1.2, 1.3, 1.9, 1.10, 1.11).Tuy nhiên, giống như cơ chế do Jung mô t , cơ chế ¢ a Nishizawa cũng không gi ith ch du c sự có mặt c a fructose trong s n phẩm sau tong h p

z2GE > GEa + G (1.1)

2GF > GE + GF (1.2)2GE > GFy + GFa (1.3)GF + GF: > GF3+ G (1.9)GF + GF; > GE4+ G (1.10)\ GF) + GFs > GF4 + GF (1.11)

1.3.2 Các nghiên cứu về động học phan ứng chuyển hóa saccharose thành FOSbang enzyme FTS

C c nghiên cứu về đ ng hoc ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bangenzyme FTS thường bao gồm hai ph n:

e Xc định điều ki n tối ưu (pH, nhi t đ ) vac c thông số đ ng học c a

enzyme (Km, Ki, Vmax).

e Xây dựng mô hình to n học mô t qu trình chuyển hóa dựa vào co chế

ph nứng vad ng học Michaelis — Menten.

Ở điều ki n pH, nhi td thchh p,c cph nứng tổngh pFOSv it ng cơ ch †

khác nhau (saccharose, l-kestose, nystose) du c kh o s t thực nghi m, sử dụng

phương ph p đồ thị Lineweaver — Burk nhằm x c định thông số đ ng học c a enzyme

FTS.

Thông số đ ng học c a m t số enzyme thường sử dụng trong nghiên cứu xâydựng mô hình to n học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS đư c tổng h ptrong b ng 1.3 C c kết qu thực nghi m nay cũng cho th y, vi c tăng số đơn vịfructose trong cơ ch td n đến gi m Vmax và tăng Km.

Bang 1.3 Thông số động học của một số enzyme FTS

+ Kms là hăng số Michaelis-Menten (chuyền hóa) c a saccharose+ Km là hằng số Michaelis-Menten (chuyển hóa) c a kestose.+ Kim là hằng số Michaelis-Menten (chuyển hóa) c a nystose.+ Kies là hăng số ức chế cạnh tranh c a glucose (cơ ch t là saccharose).+ Kiek là hang số ức chế cạnh tranh e a glucose (cơ ch t là kestose).+ Kien là hằng số ức chế cạnh tranh c a glucose (co ch t là nystose).+ Vins là tốc đ chuyển fructosyl tối đa (cơ ch t là saccharose).+ Vink là tốc d chuyền fructosyl tối đa (co ch t là kestose).+ Vim là tốc d chuyền fructosyl tối đa (co ch t là nystose).+ Vmmn là tốc đ th y phân tối đa (cơ ch t là nystose)

Mô hình ức chế cũng du c nghiên cứu băng c ch thực hi nth nghi m ức chếcạnh tranh, ức chế không cạnh tranh c a cc cht khc nhau đến hoạt tnhfructosyltransferase c a enzyme FTS Kết qu th nghỉ m c a Nishizawa [64] đãchứng minh mô hình ức chế không cạnh tranh không phù h p v i dữ li u thực nghỉ mthu du c C cth nghi m tương tự cũng du c nhiều nhà khoa học tiễn hành dé x c

định sự ức chê cạnh tranh c a glucose, saccharose, 1-kestose, nystose, fructofuranosyl

nystose Những nghiên cứu nay cho th y ức chế cạnh tranh c a glucose 1a rõ rang, cònnh hưởng ¢ a sự ức chế cạnh tranh do những thành ph n kh c là nhỏ, có thé bỏ qua

[60], [62], [63], [65].Jung cùng c ng sự (1989) [60] đưa ra mô hình to nhọc mot qu _ trình tao thànhFOS t saccharose du i xúc tc enzyme fructosyltransferase t Aureobasidium

pullulans lah 5 phương trình vi phân m6 t tốc d ph nứng c a mỗi thành ph n

(saccharose, glucose, |-kestose, nystose, fructofuranosyl nystose) trong ph n ứng

enzyme, sử dung phương trình Michaelis — Menten du c hi u chỉnh dé bao gồm sự ứcchế cạnh tranh c a glucose v ico ch t saccharose

Dựa trên kết qu nay, Duan cùng c ng su (1994) [63] đã ph t triển cơ chế ph nứng chuyển saccharose thành FOS bang enzyme B-fructofuranosidase t Aspergillusjaponicus bằng c ch thêm ph n ứng th y phân nystose kết h pc c ph n ứng chuyểnhóa Thông qua vi c hi u chỉnh phương trình Michaelis — Menten dé bao gồm sự ứcchế c a cơ ch t và sự ức chế cạnh tranh c a glucose v icc cơ cht kh c nhau(saccharose, glucose, I-kestose, nystose), Duan đã xây dựng mô hình to n học gém 6phương trình vi phân nhằm dự đo n sự biến đổi c a nồng đ saccharose, glucose,fructose, 1-kestose, nystose, fructofuranosyl nystose Kiểm chứng thực nghi m choth y có sự phù h p tương đối giữa mô hình (đường liên nét) và thực nghỉ m (điểm)

_, | y Se 2 4 TƯ100 a 50 |- | aan

[7 i © © © © es °—, mm ell + lý ⁄ - đấ — ¬ ——

0D !0 2 30 40 50 0“

——————_—.-A 10 15 20 25

Thời gian (giò) Thời gian (giờ)

(a) (b)

Hình 1.4 So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình toán học và thực nghiệm

(a) Nghiên cứu của Jung [60] (b) Nghiên cứu của Duan [63]

V ico chế và mô hình to n học tương tự như Duan, Alvarado-Huallanco [65] đãnghiên cứu đ ng học ph n ứng tong h p FOS băng enzyme FTSt_ Rhodorurola sp tựdo và cô định C c kếtqu cho th y mô hình to n học đã đưa ra phù h p thực nghỉ mv ih số tương quan R là 0,92.

Năm 1999, Lee vac ng sự [61] đã nghiên cứu mô hình hóa đơn gi nqu trình

tong h p FOS bang enzyme fructosyltransferase t Aspergillus japonicus cô định Dựatrên cơ chế c a Jung, kết qu dự do n nồng đ cân băng c a tong FOS, glucose,saccharose theo mô hình du e so s nhv ¡ thực nghỉ m và thé hi n trong hình 1.5

Nong độ (g/L)

0 5 10 15 20 25

Thời gian (gid)

Hình 1.5 So sánh kết qua giữa dự đoán theo mô hình của Lee và thực nghiệm với

nông độ saccharose ban dau là 400¢/L [61]Trên cơ chế gồm 3 ph n ứng chuyển hóa và 4 ph n ứng th y phân, Rocha vac ng sự [62] đã thiết | p mô hình đ ng học tổng qu te aqu trình tổng h p FOS tsaccharose v ¡ch ngn m Aspergillus sp Nhóm t c gi đã x c định du c 27 thông sốc amô hìnht số li u thực nghi m, đồng thời tiến hành nhiều th nghi m để so s nhkết qu thực nghi m v i kết qu dự đo n theo mô hình (hình 1.6) Kết qu cho th ymô hình đ ng học đã đưa ra có thé sử dụng dé dự đo nqu trình s nxu t FOS

Hình 1.6 So sánh kết qua dự đoán theo mô hình của Rocha và thực nghiệm [62]1.4 Các phương pháp nâng cao độ tỉnh khiết của FOS

FOS phổ thông thu du c trong qu trình tong h pt saccharose dư it c dụngc avi sinh v t hoặc enzyme thường chỉ dat đ tinh khiết 50 — 60%, còn lại hơn 40 —45% là saccharose, fructose va glucose, trong đó glucose chiếm kho ng 25 — 30%.Nguyên nhân là glucose, s n phẩm phụ c a ph nứng, có kh năng ức chế hoạt t nhc aenzyme FTS d n đến gi mđ tỉnh khiết c a FOS Vì thế muốn thu đư c FOS cód tỉnh khiết cao (FOS cao đ ) hoặc FOS tinh khiết, c n ph it ch bỏ hoặc chuyển hóalu ng glucose, fructose và saccharose trong dung dich sau tong h p [25] Đã có nhiềunghiên cứu trên thế gi ¡ về vi c nâng cao đ tinh khiếtc a FOS bằng c c phương ph pkh c nhau, trong đó có thé chia thành 2 nhóm ch nh: phương ph p sinh hóa học

(phương ph p lên men, phương ph p enzyme) và phương ph p v t lý (phương ph p

sắc ký lọc gel, phương ph p lọc nano)

1.4.L Các phương pháp sinh hóa học1.4.1.1 Phương pháp lên men

Phương pháp nay du c thực hi n thông qua vi c sử dụng vi sinh v t, thường là

n m men, để lên men saccharose, glucose, fructose có trong dung dịch FOS sau tongh p Qu trình lên men bang vi sinh v t để loại bỏ saccharose, glucose, fructose có thểthực hi n đồng thời hoặc tiếp sau qu trình tong h p FOS [66]

M tsố ch ng vi sinh v t đã đư c sử dụng để nâng cao đ tỉnh khiết c a FOS là

Pichia pastoris [Ø7], Issatchenkia hanoiensis |68|, Zymomonas mobilis [69].

T đặc điểm c a Pichia pastoris có thé lên men monosaccharides nhưng không

lên men disaccharides va oligosaccharides, Yang Y va c ng sự (2008) [67] đã nghiên

cứu thiết 1 p “phương ph p hai bu c” để c ithi nđ tỉnh khiết FOS: tong h p FOS

v ixuct c là B-fructofuranosidase ngoại bao c a Aspergillus japonicus va sau đó c y

Pichia pastoris vào hỗn h p N m men Pichia pastoris du cc y vào sé sử dung g nhết c c đường don sau 12 giờ ở 30°C làm tăng đ tinh khiết c a FOS, phục hồi hoạtt nh B-fructofuranosidase do không còn glucose có t e dụng ức chế Ð tỉnh khiết e a

FOS tang t 56,55 t 1 64,45% (26,4% 1-kestose và 57,98% nystose) và kho ng 10%

glycerol du c tạo ra trong qu trình nudic y Kết qu nghiên cứu cho th y phương

ph p này cókh năng p dụng ở quy mô công nghi p.Ch ng n m men HB1.3.13 Ussatchenkia hanoiensis) đã du c Trịnh Thi Kim

Vân [68] sử dung để loại bỏ đường glucose trong dịch đường FOS phổ théng T bsưu t p giống c a Vi n Công nghỉ p thực phẩm, nhóm nghiên cứu đã tuyển chon du cch ng n m men HBI.3.13 (/ssafchenkia hanoiensis) đặc hi u có kh năng đồng hóaglucose trong dịch đường FOS phổ thông Thông qua vi ex c định điều ki n nuôi c ythu nh n sinh khối n m men va dùng chúng dé tinh sạch dich FOS phổ thông, kết qulà đã tăng d tinh khiétc aFOSt 50% lênx p xỉ 70%

Vi khuẩn Zymomonas mobilis lên men ch yếu saccharose, glucose va fructose.Nó không có enzyme carbohydrase nên không thé th y phân h u hết oligosaccharides

Zvmomonas mobilis lên men nhanh glucose và fructose thành ethanol và carbon

dioxide v irt tsn phẩm phụ C c tế bào Zymomonas mobilis cỗ định đã du cCrittenden và c ng sự (2002) [69] nghiên cứu sử dung để loại du c 91% glucose rakhỏi hỗn h p oligosaccharides sau 12 giờ S n phẩm phụ e a qu trình lên men là

ethanol (14%), CO2 vàm tlư ng nhỏ sorbitol Ethanol du c tạo ra trong qu trình lên

men có thể duc loại bỏ kh dễ dàng trong qu trình sy cc sn phẩm

oligosaccharides FOS không bị nh hưởng trong qu_ trình lên men.

Phương ph p lên men bang vi sinh v t có ưu điểm là thiết bị và v n hành đơngin, hi uqu kinh tế cao Tuy nhiênh thống hoạt đ ng gi n đoạn, thời gian lên menđể tinh sạch dài (>12 giờ) nên năng su t không cao và s n phẩm có | n tạp ch t

(glycerol, ethanol), có mùi vi lạ [66], [67] [69].

1.4.1.2 Phương phap enzyme

M t trong c e phương ph p nâng cao đ tinh khiết c a FOS du c nghiên cứunhiều là dùng enzyme chuyển mono- va disaccharides thành m t dang kh c để có thétách dé dàng ra khỏi hỗn h p FOS Có hai loại enzyme du c sử dung để phân gi i

glucose là glucose isomerase (GI) va glucose oxidase [70].Sử dung enzyme GI

Trong phương ph p nay enzyme GI xúc t e chuyển hóa glucose thành fructose.Vé1 thuyết, fructose m i sinh ra lai gan kết v i saccharose để tạo thành FOS Nhungthực tế cho th y fructose m i tạo ra không có kh năng gan kết v i saccharose, 1-kestose hoặc nystose Do đó vi c sử dung enzyme GI chi có thé lam gi m glucosetrong trong dung dich FOS sau tổng h p chứ không nâng cao đ tinh khiết c a FOS

du c [25], [71].

Yoshikawa [50] đã nghiên cứu sử dung enzyme GI dé nâng cao đ tinh khiết c aFOS Chế phẩm enzyme thô j-ffuctofuranosidase thu nh n t Aureobasidiumpullulans chuyén hóa du c saccharose thành FOS phổ thông v i hi u su t tong h pFOS đạt 62% Khi tiến hành ph n ứng có bồ sung glucose isomerase (GI) v ity 1 B-fructofuranosidase/GI là 1/2, hi u su t tong h p FOS dat 69%

Sử dung enzyme GOD

Đây là loại enzyme có hi u qu nh t trong vi e chuyển hóa glucose trong s nxu t FOS Dư it c dụng c aenzyme glucose oxidase, glucose chuyên hóa thành acidgluconic va du ct ch ra bằng phương ph p trao đổi ion (Yung và c ng sự, 1993),hoặc kết t a bang calcium carbonate (Sheu và c ng sự, 2002).ĐÐ_ tinh khiết FOS cóthé dat 90% [72], [73]

Tuy nhiên s n phẩm phụ H;O› ¢ a qu_trinh chuyển hóa glucose bang xúc t cGOD lại ức chế hoạt đ ng c a enzyme GOD Vì v y, có thể két h ph enzymeglucose oxidase — catalase (GOD — CAT) để nâng cao đ tinh khiết c a FOS v i vaitrò c a GOD là chuyển hóa glucose va CAT là loại bỏ H2O2 Trong m tnh nhc a đềtaic p Nha nu c mã số KC 04-07, Trịnh Thị Kim Vân [25] đã nghiên cứu sử dụng henzyme GOD/CAT để nâng cao d tinh khiết c a FOS V i nồng đ saccharose banđ u 32%, nồng d enzyme GOD là 17U, ty | GOD/CAT là 0,085, nhi t d 30°C, pH5, thời gian 13 giò,đ tinh khiétc a FOS du cnângt 54,3% lên 78%

Tương tự như trường h p lên men bang vi sinh v t, có thé tiến hành chuyển hóaglucose bang enzyme GOD đồng thời hoặc sau khi tổng h p FOS phố thông bằngenzyme FTS Vi c sử dụng đồng thời FTS va GOD cho hi u qu tốt do t c nhân ứcchế hoạt đ ng c a enzyme FTS là glucose sẽ du c chuyển hóa ngay bằng enzymeGOD, nhờ đó enzyme FTS lại tiếp tục hoạt đ ng hi uqu để chuyển hóa saccharose

thành FOS.

Theo nghiên cứu c a Yun vac ng sự (1993) [74], có thé đạt du cđ tỉnh khiếtc a FOS là 90% khi sử dụng h enzyme hỗn h p fructosyltransferase va glucoseoxidase trong thiết bị có sục kh và đ otr nv inông đ saccharose 40% (w/v), tỷ |

enzyme là 10U fructosyltransferase và 10U glucose oxidase/g saccharose, thời gian 25giờ, nhi td 40°C va pH 5,5.

Sirisansaneeyakul va c ng su (2000) [75] nghiên cứu tăng hi u qu tong h pFOS t saccharose v i xúc tc là h hỗn h p enzyme B-fructofuranosidase (tAspergillus niger ATCC 20611) va glucose oxidase trong thiết bị ph n ứng có thé t ch2L v icc điều ki n nồng đ saccharose ban đ u 400g/L, ty l enzyme là 10U B-

fructofuranosidase và 15U glucose oxidase/g saccharose, nhi t d 40°C, pH 5,5; ty |

sục kh Ivvm va d o tr n 550 vòng/phút trong 32 giờ Kết qu hi u su t tong h p

kestose (Ycrys), nystose (Ycr3/s) và năng su t (Qcr/s và Qcr3s) là 0,44; 0,499/g va4,97; 5 A4 g/L.h.

Sheu và c ng sự (2001) [76] cũng nghiên cứu sử dung m th hỗn h p enzymegồm ÿ-fructofuranosidase (thu nh n t Aspergillus japonicus) và glucose oxidase(Gluzyme, Novo Nordisk) để tong h p FOS cao d t saccharose Ph nứng du c tiễnhành trong thiết bị ph n ứng có c nh khu y và suc kh, điều chỉnh pH 5,5 bang CaCOa.Glucose, ch t ức chế enzyme ÿ-fructofuranosidase, du c chuyển hóa thành acidgluconic dư i t c dụng c a enzyme glucose oxidase, sau đó du c kết t a thànhcalcium gluconate S n phẩm thu du c gồm FOS v id tỉnh khiết 90% (w/w), còn lại

la glucose, saccharose va m t t calcium gluconate.

Giống như tổng h p FOS phổ thông, công ngh tỉnh sạch FOS bang phương ph penzyme có thé thực hi n bằng hai phương ph p là có định và không cố định enzyme.H uhết c c nghiên cứu đã chon h enzyme FTS, GO và catalase (CAT), có định trênch t mang như calcium alginate và hạt trao đổi ion V i công ngh này Yun das n

xu tđư c FOS cod tinh khiết cao hơn 90 % [24], còn Bo Jiang đã kếth p cố định tếbào n m mốc Aspergillus niger AS0023 v i GO va GI để tạo thành FOS có đ tỉnhkhiết 72% [71] Ngoài ra, bằng phương ph p không liên tục v ih enzyme GO —CAT, Lamia cũng đã x c định điều ki n tối ưu cho hoạt d ng c ah enzyme trên vanâng cao du cđ tỉnh khiết c a FOS phố thông t 50% lên 82% [77] Trong m tnghiên cứu kh c, Lin và e ng sự (2008) [78] sử dụng tế bao Aspergillus japonicus

(mang hoạt tnh B-fructofuranosidase) va Aspergillus niger (có hoạt t nh glucose

oxidase) có định trong calcium alginate để s n xu tEFOS cao đ t saccharose Kết qud tỉnh khiếtc a FOS dat 90% (w/w), cao hơn nhiều so v id tỉnh khiét c a FOS phổthông là 55% nếu chi dùng Aspergillus japonicus

Sheu vac ng sự (2002) [73] còn nghiên cứu s n xu t FOS cao đ t dung dich

saccharose 30% (w/v) va pH 5,5 trongh thống thiết bi ph n ứng cób vi loc (MF)hoạt d ng liên tục (Œh complex cell) H thống dùng tế bao Aspergillus japonicus

CCRC 93007 hoặc Aureobasidium pullulans ATCC 9348 v i hoạt tnh fructofuranosidase va gluconobacter oxydans ATCC 23771 v i hoat tnh glucose

ÿ-dehydrogenase O điều ki n nhi td 30°C, mức đ thông kh 5vvm, đ tỉnh khiết c a

FOS đạt hon 80%, còn lại là glucose 5 — 7%, saccharose du 8 — 10% (t nh trên ch t

khô) và m t lu ng nhỏ calcium gluconate.H thống có thé hoạt d ng liên tục v i năngsu ttong h p FOS hơn 160g/L.h

Khi so s nhv ih hai enzyme gi n đoạn (không có lọc màng) có thé dat du c đtinh khiết c a FOS 90%, h thống phức h p chỉ tổng h p du c FOS có đ tỉnh khiết87%, nhưng ưu điểm nổi b tc ah thống nay là có thé hoạt đ ng liên tục và tiết ki menzyme, sức lao đ ng, có t nh kinh tế hơnh hai enzyme do hoạt t nh enzyme du c

duy trì trong 6 ngày [73].

Phương ph p enzyme có thé nâng cao đ tỉnh khiết c a FOS nhưng có như cđiểm là chỉ ph cao do glucose oxidase đắt tiền, dé bị m t hoạt t nh bởi nhi t [73] vas n phẩm bị | n tạp ch t (ngoài FOS còn lại là glucose, sacharose va m t lu ng nhỏcalcium gluconate) [76] Mặt kh c, khi glucose oxidase xúc † c qu trình chuyển hóaglucose thành acid gluconic, pH e a ph n ứng gi m nhanh, do đó ph i điều chỉnh pH

tự đ ng trong qu trình ph n ứng (phương ph p potentionmetric) [25].1.4.2 Các phương pháp vật lý

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lọc gel

Phuong ph p này đã du c đưa vào s n xu t ở quy mô công nghi p tạ Nh tB n

(hình 1.3) Sau sắc ký lọc gel, đ tinh khiết e a FOS tang t 60% w/w (s n phẩmNeosugar G) lên 95% w/w (s n phẩm Neosugar P) Dung dịch FOS sau chuyển hóa,

lọc, khử mau, khử muối du e bơm quac t (chứa c c hạt gel) v ¡ lưu lu ng không đổi.Glucose, fructose, saccharose do có k ch thu c nhỏ honk ch thư c lỗ gel nên có thé đivào trong c c lỗ trên hạt gel và bị giữ lại ở đó FOS có k ch thư c1 n hơn nhiều nênkhông thé đi vào c c lỗ gel, do đó sẽ đi ra khỏi c ttrư c trong qu trình rửa gi i C cph n tử kh c sẽ du c rửa gi ¡ ra sau Kết thúc qu trình thu du c FOS có đ tỉnh khiếtcao hon FOS sau khi tinh sạch bang loc gel du c dua khu mau, mui bang than hoatt nh, khử muối trong c t trao đổi ion, cô đặc chân không và s y phun dé thu du cs nphẩm FOS cao d 95% w/w [3]

Phuong ph p nay có ưu điểm nổi b t là đ tinh khiết c a FOS cao, có thé pdụng v ¡nồng đ nh pliukh cao, cókh năng tự đ ng hóa và dễ triển khai ở quymô công nghỉ p nhưng chi ph đ u tư, v n hành cao và đòi hỏi điều ki nv sinh, b otrì nghiêm ngặt Những b tl ic a phương ph p lọc gel là tốn thời gian, dung môi rửagi i, tốn nhiều năng lu ng, chi ph tinh sạch FOS cao [74], [79], [80]

1.4.2.2 Phương pháp lọc nano

Lọc nano là m t phương ph p có nhiều tiềm năng trong tỉnh sạch và cô đặc FOSở quy mô công nghỉ p Theo Goulas [81], ngoài phương ph p sắc ky du c dùng chyếu thì c c mang lọc k ch thư e nano cũng đã du c ứng dụng trong s n xu t FOSmạch ngăn ở Nh t Màng k ch thư e nano có gi i hạn khối lu ng phân tử (MWCO)trong kho ng 200 — 1000Da Đường k nh 16 e ah u hết c e màng k ch thư c nano

trong kho ng 0,6 — 2,0nm, trung bình 0,8 — 0,9nm [73] Duong knh ca

monosaccharides là 0,6 — 0,8nm [82] Viv y, màng k ch thu c nano có thé phân riêng

monosaccharides ra khoi disaccharides va oligosaccharides.

V imuc dch nâng cao đ tỉnh khiết c a FOS bang c ch t ch glucose liên tụckhỏi hỗn h p ph n ứng, Nishizawa và c ng sự (2001) [64] dung h thống bình ph nứng cótchh pb ph n loc màng gồm màng NTR-7410 (sulfonic polyether sulfone),

NTR-7450 (sulfonic polyether sulfone), NIFR-7250 (polyvinyl alcohol), NTR-729HF(polyvinyl alcohol) c a Nitto Denko Co va NF-45 (polyamide) c a Sanko Shokai.

Glucose di qua đư c mang, còn saccharose va FOS thì không qua mang D_ tinh khiếtc a FOS trong s n phẩm dat trên 90%, cao hơn nhiều so v i khi ph n ứng gi n đoạn(55 — 60%) và tương đương đ tinh khiết trong s n phẩm du c xử lý bằng phươngph p sắc ký

(er) P< © |Van chỉnh áp suất

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống thí nghiệm với bình phan ứng có tích hợp bộ phan lọc

màng trong nghiên cứu của Nishizawa và cộng sự [64]

C c thông số v n hành c a bình ph nứng cótchh pb ph n lọc màng là nồngd cơch t,nhi td , pH, nông d enzyme, di ntch hoạt đ ng c a màng, thể t ch bìnhph n tng, p su t xuyên mang và lưu lu ng nh p li u Tỷ l chuyển fructose và t nhth mc a glucose là những yếu t6 quan trọng nh te a bình ph n ứng do ph n ứng