OKNGUYEN V T LIEU, HÓA CHAT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU
3. NGHIÊN CUU CÁC YEU TO ANH HUONG VA DONG HỌC PHAN UNG CHUYEN HOA SACCHAROSE THANH FOS BANG ENZYME
PR&Tông hop FOS tir saccharose bang enzyme Fqp
Qu trình tong h p FOSt saccharose bang enzyme FTS ¢ a Vi n Công nghỉ p thực phẩm đư c thực hi n như sơ đồ hình 3.1.
Chuẩn bị dung dịch saccharose có
nông d và pH theo yêu c u
ì Ũ
X cđịnh lư ng enzyme c n sử dụng Gia nhi t dung dịch saccharose đến
phùh pv ityl enzyme theo yêu c u nhì tđ theo yêuc u
Ỷ Ỷ
Phối tr nlư ng enzyme c n thiết vào dung
dịch saccharose đã chuân bị
Ỷ
Gif dung dịch ph nứng ở nhi tđ thch
h p trong thời gian ph n ứng
Ỷ
Dun sôi 3-5 phút dé b t hoạt enzyme
Ỷ
Lọc
X c định hoạt luc enzyme FTS
Hình 3.1. Quy trình tong hop FOS từ saccharose bang enzyme FTS Trong th nghi m tong h p FOS để nghiên cứu c c yếu tố nh hưởng, sử dung 10ml đường saccharose có nồng đ và pH x c định, thời gian ph n ứng là 15 giờ.
3.2. Nghiên cứu các yếu to ảnh hướng đến quá trình tong hop FOS từ saccharose bằng enzyme FTS
Như đã phân t ch trong ph n 1.2.2, nhi t d , pH, nông đ saccharose ban đ u, ty
1 enzyme xúc t c và thời gian lên men là những yếu tố quan trọng nh hưởng đến qu trình chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS. Sự nh hưởng c a thời gian đến nồng đ cơ ch t và s n phẩm tuân theo quy lu t qua 2 giai đoạn là pha d ng
và pha sau d ng. Do v y, tru chết c n xem x t nh hưởng c a4 yếu tổ là nhitd ,
pH, nồng đ saccharose ban đ u,tỷ 1 enzyme xúc t c qua vi c xây dựng phương trình
to nhọc môt sự nh hưởng c ac c yếu tổ này đến hi u su ttốngh p FOS.
ĐIŒWŒ họn khoảng vác định có ý nghĩa công nghệ của các yếu tổ nhiệt độ, pH,
nông độ saccharose ban dau, ty lé enzyme
Kho ng x c định có ý nghĩa công ngh c acc yếu tố nh hưởng đến qu trình tong h pEOSt saccharose băng enzyme FTS c a Vi n Công nghỉ p thực phẩm du c chọn dựa theo kết qu đã công bố c a những công trình nêu trong ph n tổng quan [25]
và điều ki n biên c a qu trình, cụ thể là:
e Nhi td :40-— 50°%C
e pH:4-6
e Nong d saccharose ban đ u: 500 — 700g/L
e Tyl enzyme: 6 —9U/g saccharose
P2.2. Xây dựng phương trình hoi quy mô ta sự phụ thuộc của hiệu suất tổng hop FOS vào nhiệt độ, pH, nông độ saccharose ban đầu, ty lệ enzyme
Chọn c c yếu tố kh os tbao gồm: nhi td Zi (°C), pH (22). nông d saccharose ban đ u Zs (g/L) và tỷ | enzyme Za (U/g saccharose). C ¢ biến mã hóa tương ứng c a
Z1, 22, Z4. Z4 là XI, Xa, Xã, X4.
Chon ham mục tiêu là hi u su t tong h p FOS dựa trên lư ng saccharose ban đ u Yros (%). Công thức x c định hi usu t tng h p FOS du c trình bày trong phụ lục 1.
Bang 3.1. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tổ trong quá trình chuyển hóa saccharose thành FOS sử dụng enzyme FTS
Yếu to Các mức Khoảng
Mức trên, +1 Mức cơ sở, 0 Mức dưới, -1 biến thiên
Z1,°C 50 45 40 5 Z2 6 5 4 1 Z3, g/L 700 600 500 100 Z1, U/g saccharose 12 9 6 3 Xây dựng ma tr n thực nghi m. Phuong n quy hoạch thực nghĩ m du c chọn là
phương n quay b c hai Box — Hunter v i nhân là TYT 2, 8 th nghi m ở điểm sao
(c nh tay đòn sao œ = 2) và 7th nghĩ m ở tâm. Mô hình to n học du c chọn là:
¥ = botb1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b14Xx1xX4+b23x2x3+b24Xx2X4+
ba4XaX4+ bi1X17+ baaX2^+ba3X3”+ba4X4Z (3.1)
Ma tr n thực nghi m và kết qu th nghi m du c trình bày trong b ng 3.2.
Bang 3.2. Kết quả thực nghiệm theo ma trận TYT 2!
STT XI X2 X4 X4 Yi Y> Y3 Yrs
1 1 1 1 1 60.33 60,57 6138 60,76
2 -1 -1 1 1 57,90 56,56 56,57 57,01
3 1 -1 -1 1 52,29 52,03 5132 51,88
4 -1 1 -1 1 61,59 61,18 59,18 60,65
5 1 -1 1 -1 52,99 51,92 51,78 52,23
6 -1 1 1 -1 60,11 60.45 61.07 60,54
7 1 1 -1 -1 60,98 60.46 60,87 60,77
8 -1 -1 -1 -1 52.87 53,16 51,02 52,35
9 1 -] 1 1 55,16 55,21 31.03 54,80
10 -1 1 1 1 62.18 6138 63 84 62,47
11 1 1 -1 1 58.01 58,48 58,17 58,22
12 -1 -1 -1 1 55,24 55,04 53.97 54,75
13 1 1 1 -1 60,89 61,48 60.39 60,92
14 -1 -1 1 -1 52,80 53,21 50,59 52,20
15 1 -1 -1 -1 52,17 51,93 5121 51,77
16 -1 1 -1 -1 6134 61,01 60.30 61,05
17 -2 0 0 0 60,71 60.47 60.93 60,70
18 2 0 0 0 58,16 58,76 57,05 58,19
19 0 -2 0 43 38 43 89 4161 43,96
20 0 2 0 0 58,88 59,13 57,73 58,58
21 0 0 -2 0 58.01 59.23 58,24 58,49
22 0 0 2 0 60,35 61,28 61,08 60,90
23 0 0 0 -2 56.01 56,18 55,87 56,02
24 0 0 0 2 58,08 57,56 5938 58,34
25 0 0 0 0 59,89 60.91 5965 60,15
26 0 0 0 0 59,67 59,59 60,52 59,93
27 0 0 0 0 59,83 59.03 60,66 59,84
28 0 0 0 0 58,78 58,96 60.61 59,45
29 0 0 0 0 59,19 59.45 61.03 59,89
30 0 0 0 0 5938 58.95 60.32 59,55
31 0 0 0 0 59,18 60.45 5965 59,76
Chú thích: Y1, Y2, Y3 là hi usu t tongh pFOSc abal nth nghỉ m song song tại mỗi điểm th nghi m. Yrs là hi u su t tong h p FOS trung bình tại mỗi điểm th
nghi m.
X cđịnhh số c a phương trình hồi quy [96]:
N k ON
by = a Dy — ay) 2„XuỜi
j= j=l 1 ĩ
N
b, =4;> x„y,.j=l:k
i=l
N
bạ = dy > Xi Xi; „l#J;J,l=1:k
i=l
k N N
b= as XY, +46), Vx - a>, 3;
i=l j=l i=l
Gi tric c hang SỐ a1, a2, a3, a4, a5,a6,a7du ctrat b ng PL2.1 (Phu luc 2).
C ch sốc aphương trình hồi quy có gi trị như sau:
bo=59/771l bị=-0/613 ba=3,654 b3=0597 b4=0,556 biz=0,099 bịa=0,ló6 bị¿= -0,548
b23 =-0,093. bạ¿= -0,692 bz¿= 0,599 bịi=-0/221 bạaz=-2,262 b33 = -0,158 bag = -0,787
Kiểm định su đồng nh te ac c phương sai theo tiêu chuẩn Cochran v i mức ý
nghĩa p = 0,05 [96]:
2
G=—TM =0,115
s.i
Gœ
MeiIlran
Tra b ng b ng PL2.2 (Phu luc 2), thu du c Gi-p(fi, f2) = 0,194, trong đó fi=m-l =2;f2=N=31.
Do G <G¡; (f¡ f2) nên c e phương sai đồng nh t.
X c định phương sai t i hi n [96]:
ys im-DY SI,
2 i— — th
Sin = — —
N (m-I)N fi, s° = 0,555
th
Phương saic ac ch số [O6]:
2 =0,079 sẽ =0,023 sĩ = 0,085 s
J
2
S = 0,019bị
Kiểm định ý nghĩa c ac ch số phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student
v imuc ý nghĩa p = 0,05 [96]:
z hy
to=21226ó3 tị=4,027 t=24014 t=3,922 t4=3,657 ti2 = 0,533 t3=0,889 ti4=2,940 t3=0500 toa=3,716 t34=3,215 ti: = 1,588 too = 16,248 t33=1,136 t44=5,652
Tra b ng b ng PL2.3 (Phu lục 2) thu du c toos(62) = 2,00. C ch số không có nghĩa bị loại khỏi phương trình hồi quy là: biz, bis, baa, bis, bss.
Khi đó phương trình hồi quy có dạng:
¥ = 59,771-0,613x1+3 ,654x2+0,597x3+0,556x4-0,548x1x4-0 ,692x2x4 +0,599x3x4-2 ,262x27-0,787x4" (3.2) Trong phương trình hồi quy (3.2), c ch số b c 2 là bịi và bạa đã bị loại, vì v y
ph itnh lạ cch số theo phương ph p bình phương cực tiểu, kết qu thu du c phương trình hồi quy có dạng như sau:
¥ = 59,731-0,613x1+3 ,651x2+0,596x3+0 556x4-0,548x1x4-0,693x2x4 +0,599x3x4-2 ,104x27-0,626x.7 (3.3) Kiểm định sự tương th ch c a phương trình hồi quy v i thực nghỉ m theo tiêu chuẩn Fisher v i mức ý nghĩa p = 0,05 [96]:
sậ =—P = 7 = 0,186
N-] H
s”
E=Š = 033 Sin
Tra b ng PL2.4 (Phu lục 2) thu du c Fiằ (fi,f2) = 1,65 trong đú f; = N- 1 = 21; f2 = N(m-1) = 62;
F< Eip (f¡ f2), do đó phương trình hồi quy (3.3) tương th ch v ¡ thực nghỉ m.
P2.3. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nông độ saccharose ban dau,
ty lệ enzyme đến hiệu suất tổng hợp FOS thông qua hệ số hôi quy
Phương trình hồi quy (3.3) môt mức d nh hưởng c a nhi t d , pH, nồng đ saccharose ban đ u, ty | enzyme đến hi usu t tongh p FOS.
¥ = 59,731-0,613x1+3 ,651x2+0,596x3+0 556x4-0,548x1x4-0,693x2x4 +0,599x3x4-2,104x27-0,626x4" (3.3) Vicđnhgi mức đ và chiều hư ngt cd ngc ac c yếu tổ đến hi usu t tong
h pEOS có thé dựa vào duc ac ch sO vagi trịtuy tdéic achúng:h số hồi quy nào có gi trị tuy t đối I n hơn thì nh hưởng c a biến tương ứng đến hi u su t tong
h p FOS citing! n hơn.
Tru chết,x th sob cle ac c biến là bị, ba, bạ và bạ. Th y rang:
|b›| > [b:| > |bs] > |b!
Điều nay có nghĩa là trong 4 yếu tô thì x2 gây t c đ ng mạnh nh t đến $, tiếp đến
là x1, xa và cuối cùng là x4.C ch số b e2 cũng cdc ch phân t ch tương tự.
Điều nh nx t trên đây qua mô hình to n học cũng hoàn toàn đồng nh tv ico sở
ly lu nc a ph nứng enzyme: pH là yếu tố nhạy b nnh t nh hưởng đến hoạt lực enzyme, tiếp đến là nhi td . Khi hai yếu t6 này thay đối m t lu ng nhỏ cũng d n đến
m t sự thay đối đ ng kế c a hoạt lực enzyme FTS, do đó làm thay đổi hi u su t tong
h p FOS.
H số hồi quy c a yếu tổ nhi td là -0,613 (x1) và -0,548 (x1xa) cho th y nhỉ t
d nh hưởng đến hi u su t tong h p FOS theo xu hư ng kết mức cơ b n (45°C), nếu nhỉ td tiến xuống ec n dư i (40°C) thì hi u su t tong h p FOS tăng vi xị lúc này
có gi trị âm.
Tương tự,h số hồi quy c a yếu tố nồng đ saccharose ban đ u là 0,596 (x3) và 0.599 (x3x4) cho th y khi nồng đ saccharose band ut mức cơ b n (600g/L) tiễn đến
c n trên (700g/L) thì hi usu t tong h p FOS tăng.
Ty | enzyme cũng có nh hưởng đ ng két ¡hi usu ttổngh pFOSv icch
số hồi quy là +0,556 (xa); -0.548 (x1x4); 0.693 (x2x4); 0,599 (x3x4); 0,626 (x42). Do
có sự tương t c nh hưởng c aty!l enzyme vac c yếu tố kh c (nhi td , pH, nông đ saccharose) nên ty | enzyme tối th ch cho qu trình tổng h p FOS bằng enzyme FTS
c nđư cx c định bằng c ch tìm cực tric a phương trình hồi quy (3.3).
P24. Xác định điều kiện tối wu quá trình tổng hop FOS bang enzyme FTS thu
nhận từ Aspergillus flavipes
Tìm cực trị c a phương trình (3.3) bang ph n mềm Excel — Solve cho kết qu
phương trình đạt gi tri cực đại tại (x1,x2,x3,x4) = (-1, 0,708, 1, 0,968).
V y hi usu t tong h p FOS dat gi tril n nh t là 63,06% tại nhi td 40°C; pH 5,7; nong đ saccharose ban đ u 700g/L; ty 1 enzyme 11,9U/g saccharose.
Sos nhv ic ckét qu đã công bố về hi usu t tong h p FOS bang enzyme FTS thu nh nt Aspergillus flavipes (Vi n Công nghỉ p thực phẩm) c a Trịnh Thi Kim Vân [25] là 54.3% và Nguyễn Hoang Anh [56] là 61,48%, có thé th y thông qua quy
hoạch thực nghi m theo mô hình b c 2 c a Box — Hunter, chúng tôi đã đạt hi u su t
tong h p FOS cao hơn. Điều này có thé lý gi i như sau:
e Nghiên cứuc a Nguyễn Hoàng Anh du c thực hi n theo phương ph p kh o
s t cô điển, kh o s t sự biến thiên e at ng yếu tô khi cố địnht te yếu tố
kh c. C ch kh os t này không xem x t du c sự nh hưởng choc acc
yếu tố. Phương trình (3.3) cho th y rõ có sự nh hưởng ch o d ng kế c a
c c yếu tô nhỉ td —tỷl enzyme, pH—ty1 enzyme, nồng đ saccharose —
ty | enzyme.
e Trịnh Thi Kim Vân đã cô định pH. nhi td dựa vào kết qu kh os tsơb
và tiễn hành tối ưu hóa theo mô hình b c 1 v ic c biến nồng đ saccharose,
ty | enzyme. C c lý lu n trong ph n 3.2.3 đã chứng minh pH và nhi td là
hai yếu tô có nh hưởng I nnh t đến hi usu t tong h p FOS. Điều nay cho
th y vi e bỏ qua hai thông số pH và nhỉ td trong qu trình tối ưu hóa e a
t cgi này là không phù h p, d n đến hi u su t tong h p FOS tối ưu chưa
cao.
Tiến hành th nghi m kiểm chứng tại điểm tối ưu và thu đư c kết qu hi u su t chuyển hóa FOS đạt 63,01%. Như v y, kết qu tối ưu điều ki n chuyển hóa FOS băng phương ph p quay b c 2 Box - Hunter hoản toàn phù h p v i thực nghi m. Có thé
th y rằng vi cđ nhgi định lư ngmức đ nh hưởng c ac c yếu tố trong qu trình tong h p FOS thông qua phương trình hồi quy đã cho ph px c định du c điều ki n chuyền hóa tốt nh t dé dat du c hi usu ttổngh p FOS cao. Khi mor ng quy mô th nghỉ m lên 5L/mẻ, kết qu thu đư c tương tự như quy mô th nghỉ m 10ml ở trên.
3.2.5, Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp FOS bằng
004 cựp
Tiến hành kh o s t nh hưởng c a thời gian đến hi u su t tong h p FOS bang
c ch thực hi ne cth nghi m chuyển hóa FOS ở điều ki n tối ưu đã x c định (nhi t đ 40°C; pH 5,7; nồng đ saccharose ban đ u 700g/L; ty | enzyme 11,9U/g saccharose)
và thời gian ph nứng thay đổit 0 đến 24 giờ. Két qu du c thé hi n trong b ng 3.3.
Bang 3.3. Anh hưởng của thời gian phan ứng đến quá trình tong hop FOS bang enzyme FTS
Thoi gian Nông độ (g/L) tổng hợp (ứ1ỏ) GF G F GF. GF; GF, FOS FOS(%)
0 70621 000 000 000 000 0,00 0/00 0,00
2 372,13 7880 1,98 22868 2450 0,00 25318 35.86
4 23306 11620 3,16 30681 46,10 0,00 35291 50,03
6 149.01 15332 425 334.70 6449 1,04 400,23 56,62
S 104,63 16431 591 32612 10268 268 43148 6109
10 $3.66 179,02 584 30506 13005 288 437,99 6199
ll 7910 17834 666 295.79 14094 507 441,80 62/59
12 7768 180,00 532 281.76 14858 1081 441,15 6265
13 7455 181,96 526 26749 16184 1090 440,23 62,71
14 7089 183.23 650 26331 169,71 1092 443,94 63,01
15 70,58 180,66 644 260,16 17633 1088 44737 6345
16 70.24 17892 756 24768 19108 1087 449,63 63,66
17 6569 182,71 685 21415 20782 2946 451,43 63,88
18 65.79 18658 516 22853 199,60 21,67 449,80 63,59
19 6536 18637 628 22761 197,64 2298 448,23 63,47
20 6495 185.94 638 21630 20884 2249 44763 63,50
22 6428 189.99 681 202,56 21662 2601 445,19 63,03
24 60.94 19168 945 18946 22836 2752 44534 62,95
Theo kết qu trên, chúng tôi th y trong giai đoạn d u (0-6 gid), saccharose du c chuyển hóa r t nhanh, đồng thời s n phẩm chuyển hóa ch yếu là 1-kestose và glucose. Khi nồng đ I-kestose tăng lên, nỗng đ c a nystose cũng tăng do sự chuyển nhóm fructosyl t i 1-kestose. Ở giai đoạn cuối (sau 22 giờ), nồng đ nystose bang và sau đó tăng cao hơn nồng đ I-kestose. Nồng đ saccharose, glucose va FOS dat trạng
th iốn định sau 11 giờ. Do đó, có thé chọn thời gian ph n ứng là 11 — 12 giờ.
3.3. Nghiên cứu động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng
enzyme FTS thu nhận từ é4i á7 \
ĐIDRVdÊ vuất cơ chếphan ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng FTS
Trên cơ soc c cơ chế ph n ứng đã phân t ch trong ph n 1.3.1, tiến hành xem x t
m tc ch tổng qu t cơ chế ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS gồm 3 ph n ứng chuyển hóa (t 3.4 đến 3.6) và 4ph nứng th y phân (t 3.7 đến
3.10) như sau:
( 2GF > GFa + G (3.4) 2GF2 > GF3 + GF (3.5) 2GE > GF4 + GF (3.6)
< GF >G+F (3.7)
GF, > GF+F (3.8) GF3 > GFo + F (3.9)
| GF4 > GPs + F (3.10) Trong 7 ph nungc ah ph nứng phức tap trên có những ph n ứng có quan h
v i nhau theo m t loại nh t định. Những ph n ứng nay du c gọi là ph n ứng phụ thu c. C c ph n ứng còn lại là ph n ứng không phụ thu c, hay còn gọi là ph n ứng
đelp.Vi ex c định số ph n ứng đ cl p cho ph p rút gọn số lu ng ph nứng cn môt cho qu trình chuyến hóa.
Theo [ỉ7], số ph nứng đ cl pdu cx cđịnh bang hạng c amatr n yi. Matr n yi; du cthanh! pgômh số tỷ lu nge ac ce u tử trong c c phương trình ph n ứng, trong đó hàng c a ma tr n biểu diễn c cph nứng vac tc amatr n biểu diễnc cc u
tử tham gia trongh . Matr nyjc ah 7ph nứng trên là:
GF GF. GF; G FGFs
Phaninmg] ( -2 | 0 | 0 0 >)
Phản ứng 2 | -2 | 0 0 0
` Phản ứng 3 0 | -2 0 0 |
GD E phan ứng 4 -Í 0 0 | | 0 (3.11)
Phan ứng 5 | -| 0 0 | 0 Phản ứng 6 0 | -| 0 | 0 Phaning7 \ 0 0 | 0 | toy
Hạng c a ma tr n yi = 4. Do đó, có thể mô t cơ chế ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS thông qua 4 ph n ứng đ cl p. Như v y ngoải 3 ph n ứng chuyển hóa (t 3.4 đến 3.6) e nph ix e định thêm 1 ph nứng đ c
1 pla1 ph nứng th y phân trong số c cph nứngt 3.7 đến 3.10.
Kếtqu nghiên cứu c a Duan vac ng sự [63] đã chứng minh đư c có thé bỏ qua
ph nứngth y phân saccharose, [-kestose và fructofuranosyl nystose.
T những phân tch trên, chúng tôi dé xu t cơ chế ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS gồm 3 ph n ứng chuyển hóa (t 3.4 đến 3.6)
và 1 ph nung th y phân nystose GF3 (ph n ứng 3.9) như sau:
( 2GF->GFa+G (3 4) 2GF2 > GF3 + GF (3.5) 2GHa > GF4 + GF2 (3.6) . GF3 > GF2 + F (3.9) Chú thích: G là glucose, F la fructose, GF la saccharose, GF2 là 1-kestose, GF3 là nystose, GF4 là fructofuranosyl nystose.
Ph n ứng (3.4) cho th y, khi saccharose (GF) du c dung làm cơ ch t cho ph n ung enzyme, chi có glucose (G) va 1-kestose (GF2) du c tao thành. Ty | glucose/1-
kestose là 1/1 chứng tỏ cơ chế ph n ứng không đối xứng, nghĩa là saccharose đóng c
vai trò ch t cho và ch t nh n nhóm fructosyl. Do đó 1 mol glucose và 1 mol 1-kestose
đư c tạo thành đồng thờit 2 mol saccharose.
Tương tự v 1ph n ứng (3.5), (3.6), saccharose (GF) và nystose (GF3) đư c tong
hpt 1-kestose (GF2), trong khi 1-kestose (GF2) và fructofuranosyl nystose (GF4)
du c tạo thanht nystose (GF3).
O ph nứng 3.9, khi th y phân 1 mol nystose (GF3) sẽ tạo thành 1 mol 1-kestose
(GF2) và | mol fructose (F).
HD Xây dựng 4 động học phan tng chuyển hóa saccharose thành cl p bang enzyme FTS
Như ph n 1.3.2 đã trình bay, c e nghiên cứu về mô hình ức chế (ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh) c a e c ch t kh e nhau (glucose, saccharose, 1- kestose, nystose, fructofuranosyl nystose) đến hoạt tnh fructosyltransferase c a
enzyme FTS cho th y chỉ có ức chế cạnh tranh c a glucose là rõ ràng, còn nh hưởng
c a những ức chế kh c có thê bỏ qua [60], [62], [63], [65].
Do đó, chúng tôi xây dựng mô hình d ng học ph n ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bang enzyme FTS dựa theo nguyên tắc cân bằng v tch tc ac c ph nứng chuyển fructosyl và ph n ứng th y phân nystose đã trình bày trong cơ chế ph n ứng ở trên, kết h p sử dụng phương trình Michaelis — Menten hi u chỉnh dé bao gồm sự ức chế cạnh tranh c a glucose v ic c cơ ch tkh c nhau (saccharose, glucose, 1-kestose,
nystose).
Mô hình d ng hoc du cmôt bang h phương trình vi phân sau:
[ect ... ——+ 342 Vine LGF, | - (3.12)
dt ar}+K,,+24 259 (er, j+K,, +225K,,. igk
dt 234 era Kk q+1bh
Kn.
dF _ 180 Vay, AGFs1 (3.14)
dt 666 [GF,]+K,,,
dGF, _ 504 V, [GF] V„„.[GF,] 504 Vim [GF] 504 Vin: IGF]
“Tp: IS iG], * 2.666 [Gl ` 666 [GF,]+K
dt 232 loplrk (+) [GFj]+K (+) “6 [GR1+K,, (1+) —
Kgs Kự Kin
(3.15)
dGF, 666 V„..[GE, | : V„„.JGE, | — WuJGR] (3.16)
igk Kien
dGF, _ 828 Vian LGF; | = (3.17)
\ di 2666 lGF,I+K„„ú0+ 1h
ign
Chu thich:
+ G la glucose, F la fructose, GF la saccharose, GF2 là 1-kestose, GF3 là nystose, GF4
la fructofuranosyl nystose.
+ [G], [Fl], [GF], [GF2], [GF3], [GF4] là nong đ c a glucose, fructose, saccharose, 1-kestose, nystose, fructofuranosyl nystose, t nh bang g/L.
+ Kms là hăng số Michaelis-Menten (chuyền hóa) e a saccharose, t nh bằng g/L.
+ Km là hằng số Michaelis-Menten (chuyển hóa) c a kestose, t nh bằng g/L, + Km là hằng số Michaelis—Menten (chuyển hóa) c a nystose, t nh băng g/L, + Kmhn là hang số Michaelis-Menten (th y phân) c a nystose, t nh bang g/L.
+ Kigs là hang số ức chế cạnh tranh c a glucose (co ch t là saccharose), t nh bang g/L, + Kigx là hằng số ức chế cạnh tranh c a glucose (co ch t là kestose), t nh bang g/L, + Kien là hang số ức chế cạnh tranh c a glucose (co ch t là nystose), t nh bang g/L. + Vins là tốc đ chuyển fructosyl tôi đa (co ch t là saccharose), t nh băng g/L.h.
+ Vạ là tốc đ chuyén fructosyl tôi đa (cơ ch t là kestose), t nh bang g/L.h.
+ Vạm là tốc đ chuyén fructosyl tối đa (cơ ch t là nystose), t nh bằng g/L.h.
+ Vinin là tốc đ th y phân tối đa (cơ ch t là nystose), t nh bằng g/L.h.
+C cgi trị 180, 342, 504, 666, 828 là khối lu ng phân tử c a glucose, saccharose, 1-
kestose, nystose va fructofuranosyl nystose.
+ Gi + Gi + Gi + Gi + Gi hóa).
+ Gi + Gi + Gi
tri 342/(2.504) lah số chuyến đối cho g saccharose tạo rat 1g kestose.
trị 180/(2.342) lah số chuyến đối cho g glucose tao rat 1g saccharose.
tri 180/666 lah số chuyến đổi cho g fructose tao rat 1g nystose.
trị 504/(2.342) lah số chuyén đổi cho g kestose tao rat 1g saccharose.
trị 504/(2.666) làh số chuyến đổi cho g kestose tao rat 1g nystose (chuyển
trị 504/666 lah số chuyén đổi cho g kestose tạo rat 1g nystose (th y phân). tri 666/(2.504) lah số chuyén đổi cho g nystose tao rat 1g kestose.
tri 828/(2.666) lah số chuyến đổi cho g fructofuranosyl nystose t 1g nystose. Phương trình (3.12) mô t tốc đ chuyển hóa saccharose, trên co sở 2 mol saccharose tạo thành 1 mol glucose và 1 mol kestose (ph n ứng 3.4), đồng thời 2 mol
kestose tạo thành 1 mol saccharose (ph n ứng 3.5).
Phương trình (3.13) môt tốc đ tạo thành glucose, trên co sở 2 mol saccharose
tạo thành 1 mol glucose (ph n ứng 3.4).
Phương trình (3.14) môt tốc đ tạo thành fructose, trên co sở 1 mol nystose tao
thành 1 mol fructose (ph n ứng 3.9).
Phương trình (3.15) môt tốc đ tạo thành kestose, trên cơ sở 2 mol saccharose
tạo thành 1 mol kestose (ph n ứng 3.4), 2 mol kestose tạo thành 1 mol nystose và 1 mol saccharose (ph n ứng 3.5), 2 mol nystose tạo thành 1 mol kestose (ph n ứng 3.6),
1 mol nystose tạo thành | mol kestose (ph n ứng 3.9).
Phương trình (3.16) môt tốc đ tạo thành nystose, trên cơ sở 2 mol kestose tao
thành 1 mol nystose (ph n ứng 3.5), 2 mol nystose tạo thành | mol fructofuranosyl nystose va 1 mol kestose (ph n ứng 3.6), 1 mol nystose tạo thành 1 mol kestose và 1 mol fructose (ph n ung 3.9).
Phuong trình (3.17) môt tốc d tạo thành fructofuranosy! nystose, trên co sở 2
mol nystose tạo thành 1 mol fructofuranosyl nystose (ph n ứng 3.6).
3.3.3. Xác định các thông số động học của enzyme FTS bang phương pháp giải thuật di truyền GA
Thông thường, để x c định c c thông số đ ng học ¢ a enzyme như Km, Ki, Vimax,
ph i tiến hành hàng loạt th nghỉ m trực tiếp và sử dụng phương ph p đồ thị Lineweaver — Burk. Muốn dựng du ccc đồ thi Lineweaver — Burk có đ tin c y cao,
e n thăm dò, time cnéngd enzyme vac e nồng đ cơ ch tthchh p, tìm thời gian thchh p để x c định tốc đ band uc aph nứng enzyme, cũng như nh hưởng c a
thời gian trong qu trình ph nứng [98].
Trong m t số trường h p,v dụ như đối v ienzyme FTS thu nh nt Aspergillus flavipes đang nghiên cứu, vi c x e định 11 thông số đ ng học c a enzyme FTS (Km,
Kmk, Kim, Kigs, Kigk, Kign, Vins, Vmk, Win, Kmnn, Vmhn) theo phương ph p này r t phức
tạp và khó khăn. Dé gi i quyết v n dé này, chúng tôi dé xu t sử dụng phương ph p
gi i thu t di truyền nhằm x c định đồng thời 11 thông số đ ng học c a enzyme thông
qua đữ li u thực nghi m thu du c trong c cth nghi m theo dõi nh hưởng c a thời
gian đến qu trình tong h p FOS đã trình bay ở ph n 3.2.5.