Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và pectinase theo kĩ thuật CLEA

— Khảo sát tính chất của enzyme cô định dạng CLEA thu nhận từ vi sinh vật, bao gồm: câu trúc của khối CLEA, khả năng tái sử dụng đối với cơ chất riêng biệt của từng enzyme, khả năng hoạt

TRẢN THỊ LINH GIANG

NGHIÊN CỨU THU NHAN VÀ CÓ ĐỊNH ENZYMEGLUCOAMYLASE VÀ PECTINASE THEO KĨ THUẬT

CLEA (CROSS-LINKING ENZYME AGGREGATES)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh hocMã số: 60 42 80

LUẬN VÁN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, thang 8 năm 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA — ĐHQG — HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : TS Huỳnh Ngọc Oanh

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Tién Thắng

5 Ủy viên hội đồng: TS Huỳnh Ngọc Oanh.Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Thị Linh Giang MSHV: 12310727.Ngày, thang, năm sinh: 18/12/1989 Nơi sinh: Daklak.Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60 42 80.I TÊN DE TAI:

Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và pectinase theo kithuật CLEA.

Il NHIEM VỤ VÀ NOI DUNG:Nhiém vu:

— Tìm hiểu và thực hiện ki thuật cố định CLEA trên hai đối tượng làglucoamylase va pectinase.

— Đồng thời khảo sát tính chat của enzyme cô định dang CLEA.Nội dung:

— Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định enzyme glucoamylase vàenzyme pectinase thu nhận từ nam mốc Aspergillus niger bang kĩ thuậtCLEA, bao gồm các yếu tố: nồng độ tay gan glutaraldehyde, nhiệt độcô định, thời gian cô định

— Khảo sát tính chất của enzyme cô định dạng CLEA thu nhận từ vi sinh

vật, bao gồm: câu trúc của khối CLEA, khả năng tái sử dụng đối với cơ

chất riêng biệt của từng enzyme, khả năng hoạt động dưới ảnh hưởngcủa pH và nhiệt độ.

— Bước đầu ứng dụng enzyme dạng CLEA xử lý hai loại dịch quả là củnăng và thơm, đánh giá dựa trên hai chỉ tiêu hàm lượng đường và độđục của sản phẩm

Ill NGÀY GIAO NHIỆM VU: 20/01/2014

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 20/06/2014v CÁN BỘ HƯỚNG DAN: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Tp HCM, ngày 6 tháng § năm 2014CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TS Huỳnh Ngọc Oanh

TRUONG KHOA(Họ tên va chữ ky)

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Ngọc Oanh.Em cảm thay thật hạnh phúc và may măn khi được thực hiện luận văn với sựhướng dẫn tận tình của Cô Xin cảm ơn Cô đã dành nhiễu thời gian, công sứcvà luôn giúp em có được định hướng đúng dan trong thời gian thực hiện đề tài.Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tat cả Thay Cô và anh chị trong phòngthí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Dai học Bách khoa Thanhphố Hồ Chí Minh đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiệndé tài

Cảm ơn em Trương Thủy Tiên, sinh viên ngành Công nghệ Sinh học khóa2010, đã không quản ngại khó khan, thời gian để đồng hành, hỗ trợ tôi thựchiện các nghiên cứu.

Xin cảm ơn các bạn trong lớp cao học Công nghệ Sinh học khóa 2012 đã quantâm, đóng góp ý kiến và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian làm thínghiệm.

Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Ban Giám hiệu Trường Đạihọc Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng Đào tạo Sau đại học và cácphòng ban chức năng khác của Trường; đặc biệt là Khoa Kĩ thuật Hóa học đãtạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện dé tài nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sựkhuyến khích, ủng hộ đã danh cho tôi trong chặng đường dai để hoàn thànhđược dé tài nghiên cứu này

Chân thành cám ơn!

TP.HCM, ngày 6 tháng 8 năm 2014

Học viên thực hiện

Trần Thị Linh Giang

2 =

TOM TATĐề tài được thực hiện với mục tiêu tìm hiểu va thực hiện kĩ thuật cố địnhCLEA trên hai đối tượng là glucoamylase và pectinase Đồng thời khảo sáttính chất của enzyme cô định dạng CLEA

Trong nghiên cứu, chung tôi đã ứng dụng kĩ thuật CLEA để cố định hai loạienzyme, glucoamylase và pectinase, từ dich enzyme thô thu nhận từ moitrường nuôi cấy nắm mốc Aspergillus niger Kết quả nghiên cứu cho thấy: khibồ sung vào dịch enzyme ethanol 96° với tỉ lệ 2:1 (tác nhân tủa:dịch enzyme),ở 3 —5°C trong 15 phút va 7% glutaraldehyde, khuấy đều giữ ở nhiệt độ 5°Ctrong 2 giờ; hiệu suất có định protein là 45,06% và hiệu suất cố định enzymeglucoamylase là 37,85%

Việc khảo sát tính chất của enzyme cô định dạng CLEA được thực hiện dựavào hình chụp SEM của khối enzyme dạng CLEA, khảo sát khả năng tái sửdụng và khảo sát khả năng ôn định hoạt tính dưới ảnh hưởng của pH/ Kếtqua từ hình chụp SEM cho thấy kích thước các khối glucoamylase CLEA dat 5— 20 wm Enzyme cô định từ dịch nuôi cay sử dụng đến lần thứ 8 vẫn còn giữđược 70% hoạt tính Tai pH 8, hoạt tính glucoamylase cô định từ dịch nuôi câylà 40% Glucoamylase cố định từ môi trường nuôi cấy có khả năng 6n địnhhoạt tính tốt khi phản ứng ở nhiệt độ cao

Quá trình cố định enzyme pectinase từ dịch nuôi cây VỚI nồng độglutaraldehyde là 10%, cũng thu được kết quả khả quan: hiệu suất cố địnhprotein là 66,67% và hiệu suất cố định enzyme pectinase là 57,61% Kíchthước pectinase CLEA đạt 5 — 50m Enzyme pectinase cố định từ dichenzyme thu nhận từ môi trường nuôi cay cũng cho thay khả năng tái sử dụngvà khả năng ôn định hoạt tính dưới ảnh hưởng của pH/nhiet độ tốt Pectinasecô định từ dịch nuôi cấy sau 6 lần sử dụng vẫn còn trên 95% hoạt tính

Kết quả bước dau ứng dụng enzyme cô định dạng CLEA trong xử lý nước quảcho thấy hàm lượng đường của dịch quả tăng lên và độ đục giảm đi sau khi xửlý với enzyme cô định dạng CLEA Ở lần sử dụng thứ 6, hoạt tính của enzymeglucoamylase cố định từ môi trường nuôi cay vẫn còn biểu hiện cao, hàmlượng đường tăng trên 70% so với lượng đường tăng ở lần sử dụng đầu tiên.Enzyme pectinase cố định từ dịch nuôi cấy cho thay ở lần sử dụng thứ 6, độ

đục giảm trong nước quả vẫn đạt khoảng 40% so với độ đục giảm ở lần sửdụng đầu tiên.

Kết qua thí nghiệm đã cho thay kĩ thuật CLEA hiệu qua hơn đối với nguồnenzyme chưa trải qua quá trình tinh sạch Làm nỗi bật lên điểm quan trọng củakĩ thuật CLEA là kết hợp quá trình thu nhận và cô định enzyme vào cùng mộtbước, bỏ qua bước tinh sạch, lam tăng hiệu quả cô định enzyme

The thesis was conducted to find out and carry out CLEA method on objects,glucoamylase and pectinase At the same time, we survey properties ofenzyme in CLEA.

In the study, we applied CLEA method to immobilize two enzymes,glucoamylase and pectinase, from crude enzyme solution obtained from semi-solid culture of Aspergillus niger Research results showed: when addedethanol 960 to crude enzyme solution with a 2:1 ratio (precipitation agent:enzyme solution), in 15 minutes at 3 — 5°C and 7% glutaraldehyde, stirred,kept at 5°C in 2 hours; Protein immobilization yield was 45.06% and enzymeimmobilization yield was 37.85%.

Survey the properties of enzyme in CLEA was based on image of enzyme inCLEA by SEM, reuse and activity stability under the influences of pH andtemperature abilities Size of immobilized glucoamylase in CLEA was 5-20um Immobilized enzyme from the culture medium could be retained 70%activity after using 8 times At pH 8, activity of glucoamylase immobilizedfrom the culture medium was 40% Activity stability of glucoamylaseimmobilized from the culture medium was good at high temperatures.

Immobilization pectinase from the culture medium with 10% glutaraldehydealso obtained good results: Protein immobilization yield was 66.67% andenzyme immobilization yield was 57.61%; Size of immobilized pectinase inCLEA reached 5 - 50um The enzyme pectinase immobilized from culturemedium also showed reuse and structural stability under the influences of pHand temperature abilities well Immobilized enzyme from the culture mediumcould be retained 95% activity after using 6 times.

Initial results of application immobilized enzyme (CLEA) in treatment fruitjuice showed that the sugar content of the juice increased and _ turbiditydecreased after treatment with immobilized enzyme in CLEA In the 6th timeuse, the enzyme glucoamylase immobilized from culture medium still madesugar content of juice increased over 70% compared to the increasing contentof sugar in the first use Pectinase immobilized from the culture medium alsoshowed good results, at 6th time use, juice’s reducing turbidity was achievedby 40% compared with reducing turbidity in first time use.

Experimental results showed that CLEA method expressed more effectivenesswith crude enzyme Highlight the important feature of this method iscombining enzyme precipitation and immobilization into the step and skipingenzyme purification, the enzyme can be immobilized directly from crudeenzyme solution high-effectively.

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập — Tự do — Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của học viên Trần Thị LinhGiang với sự hướng dẫn của TS Huỳnh Ngọc Oanh Các số liệu và kết quảtrình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tácgiả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận văn

TS HUỲNH NGỌC OANH TRAN THỊ LINH GIANG

MỤC LỤCMO ĐẦU 5 << HH 0 0 0h nhe 1

I Tính cấp thiết của dé tài <- << <5 << x99 E95 9 2x se esee 2

2 Mục tiêu nghiên CỨU co G < G G5 S6 S8 6 966 96 9.99 9.9.4.9 9999.04.9989 868 08606696996 23 Nội dung nghiÊn CỨU co G 2G G G5 5S 6 666 966996 9.9 9.9.4.9 9999.09.9990 668 08606096996 3

4 Y nghĩa khoa hỌC <- 2c << << s5 SE 9E 5E E3 955 4 1 5 s.es se 35 Y nghĩa thực tiỄNn - << 5< << E399 E25 95 5 51.95 x.ee se 3CHƯƠNG I: TONG QUAIN 5-5 5< s44 4 HE 41.1 Enzyme €6 địnhh << << «<< <5 6S 5E 9S 25 e5 3 5e 5 se 51.1.1 Khái niệm enzyme cố định - << << se + <ees se se se seesessssese 51.1.2 Đặc điểm cúa enzyme CO định << «<< ss << se se esesessses 51.1.3 Các phương pháp cố định enzyme <- 5 <5 << «=< se e<ses=ese«e 61.2 Có định enzyme bằng phương pháp cross-linking enzyme aggregates(CLUEA)) 00G G G0000 0.0 00000104 0 000000004 06.05 00 000000000000 96 7

1.2.1 Phương pháp cross-linking enzyme aggregates ( CLUEA) 71.2.2 Liên kết giữa glutaraldehyde với enzyIme - 5< « << sesese«e 91.2.3 Phạm vi ứng dụng của kĩ thuật có định CLEA < - 121.2.4 Một số công trình nghiên cứu về kĩ thuật CL/EA s - 131.3 Đối tượng liên quan trong nghiên €ỨU -5 <5 << e<se<eesesee seeses 151.3.1 Tổng quan về nam mốc Aspergillus Niger 5-<=5c<<<sesesesses 151.3.2 Enzyme glucoamylase co o0 Go o G %5 66 9 9 060.0 09000660606 088 171.3.3 Enzyme D€CẨÏIASC c 7G 5G G05 6 0.9980 66.9 0 9000600 4.90966606906099 088 19CHUONG II: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 242.1 VAt lỆU G0 G5 5 5 0 0001.00.90 0000000000 400 00 0000000000 252.1.1 Chúng vi sinh vật dùng trong nghiÊn CỨU <sss<ss «se sss 252.1.2 Enzyme thương IM4Ì - so SG SG S 9 996 96 9.99 660609 9 6860666699696 25

2.1.3 Nguyên lIỆU œ5 5S S6 96 9 66 9.99 9.9.9.9 999.999.9908 0606699699609999966 25

2.1.4 Hóa ChẤT 5 << s4 HH 7.107.100 01.00.00.008E 252.2 Phương phátp -oo << s5 S 96.6.0000 00.90 000 4.0 00000 4.0 00000904.0006080996 25

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng DFOf€ÏTI 55555 ss s« s«« 25

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ølucoamylase 26

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase 26

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng glutaraldehyde 26

2.2.5 Phương pháp xác định độ duc của mẫu dịch quả - 26

2.2.6 Cách tính các đại lượng trong kết quả -.-< << 5< =ese<=se<ses 262.3 NOL TUG Cố 27

2.3.1 Khao sát điều kiện cố định enzyme bang kĩ thuật CLEA 28

2.3.2 Khảo sát tính chat của enzyme có định dạng CLEA 30

2.3.3 Bước đầu ứng dụng hai enzyme glucoamylase và pectinase đã đượccô định theo kĩ thuật CLEA trong sản xuat nước Quả << 5< <s< 31CHUONG III: KET QUÁ VA BIEN LUẬN 2-5 5-5 5 5< << ssssssssss 333.1 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme thu nhận từ môi trườngnuôi cầy NAM MOC ASpergVillUs THỢ©F co o0 0 9 66.96 9 96.909 0909969696 868068 343.2 Khao sát quá trình cô định enzyme glucoamylase 5 -<=e<- 353.2.1 Khao sát kha năng tua enzyme từ dich enzyme bới các tác nhân tua— ẦỐẦỐẦỐẦỐ.Ố.Ố.Ốốố 353.2.2 Khảo sát anh hưởng của nông độ glutaraldehyde đến quá trình cốđịnh enzyme glucoamylase bang kĩ thuật CLEA < 36

3.2.3 Khao sát ảnh hưởng cúa thời gian cô định đến quá trình cố địnhenzyme glucoamylase băng kĩ thuật CLEA - 5< «<< se<: 393.2.4 Khao sát ảnh hưởng cúa nhiệt độ cố định đến quá trình cô địnhenzyme glucoamylase băng kĩ thuật CLEA - 5< «<< se<: 413.2.5 Khao sát khối glucoamylase CLEA dưới kính hién vi điện tử quét 42

3.2.6 Khao sat kha nang tái sử dung cua glucoamylase dang CLEA 443.2.7 Khao sát kha năng hoạt động của enzyme glucoamylase dang CLEA

dưới ảnh hướng của PH và nhiet dO - «5< s55 5555695 47

3.3 Khao sát quá trình cố định enzyme pec(inase -s s5 << se «<< se<e S03.3.1 Khảo sát anh hưởng nồng độ của glutaraldehyde đến quá trình cố

định enzyme pectinase băng kĩ thuật CLEA < 5 << se<<s 503.3.2 Khao sát ảnh hưởng cúa thời gian cô định đến qua trình cố định

enzyme pectinase băng kĩ thuật CLEA 5-< <5 << «<< se e<se<e 53

3.3.3 Khao sát ảnh hưởng cúa nhiệt độ cố định đến quá trình cô định

enzyme pectinase băng kĩ thuật CLEA 5-< <5 << «<< se e<se<e 543.3.4 Khao sát khối pectinase CLEA dưới kính hién vi điện tử quét 55

3.3.5 Khao sát kha năng tai sw dung của pectinase dang CLEA 573.3.6 Khao sát hoạt động cua enzyme pectinase dang CLEA dưới anh

hướng của PH và nhiet dO << Go Go G G555 560666 6699609569569666 S9

3.4 Bước đầu ứng dụng hai enzyme glucoamylase và pectinase đã được cổđịnh theo ki thuật CLEA trong sản xuat nước QUả e< << << 55565 5 << esee 61

3.4.1 Xác định hàm lượng đường và độ đục ban dau của dich qua 613.4.2 Khả năng tái sử dung của enzyme cô định dạng CLEA trong xứ lý

CICH 0) 0 ốỐỐốỐốỐốỐốỐỐốỐốỐốỐốốố 62KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ 2- 2° 2 s2 sư Sư s52 66L IKết luận - (<< SE SE SE 0.0 09 1g 672 Kiến nghị << G5 hư mg g0 0x2 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các phương pháp cô định enzyme ¿ - +52 2 s£+z+szz£zc+2 6Hình 1.2: Minh hoa các tiến trình xảy ra trong cố định enzyme bang kĩ thuậtCLEA woo ốốỐố 7Hình 1.3: Cấu tạo phân tử của (poly)glutaraldehyde -5-55 IIHình 1.4: Phản ứng tạo liên kết giữa glutaraldehyde và enzyme IIHình 1.5: Quá trình hình thành khối enzyme CL/EA -. -: 55555: 12Hình 1.6: Phản ứng chuyển đối benzaldehyde thành acid S-mandelic 13Hình 1.7: Nam mốc Aspergillus niger 5 555252 3E EESEErErrreeeered 16Hình 1.8: Sơ đỗ phân giải của glucoamylase - - ¿55+ 52552525 cscs 17Hình 1.9: Sơ đỗ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase -. - 5-55: 18Hình 1.10: Mô hình hoạt động của hệ enzyme pectinase - 21Hình 2.1: So đỗ các bước tiễn hành thi nghiệm oo cesses 27Hình 2.2: Quy trình cố định enZyme ¿5-2 252 S2 ++E+EeEvEvEeEcEcezsrereree 28Hình 3.1: Dich enzyme pectinase (a) và glucoamylase (b) thu nhận từ môitrường nuôi cây nắm mốc Aspergillus NIGEL 5 +52 cc+s+s+2£2£sEzezzsrscse 34Hình 3.2:Anh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố địnhBjI)Ie9ì00j)xaadddaâẳdâaâAâlaẳdlaẢ4 37Hình 3.3: Glucoamylase và pectinase sau quá trình kết tủa - 38Hình 3.4: Enzyme glucoamylase dang CLEA từ môi trường nuôi cấy 38Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian cố định đến khả năng cố địnhBjI)Ie9ì00j)xaadddaâẳdâaâAâlaẳdlaẢ4 40Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên kha năng cô định glucoamylase 42Hình 3.7: Hình ảnh CLEA của glucoamylase dưới kính hiển vi điện tử quét(SEM) ẴẶẴẶS.ốốÓỒỒŨỒỔ 43Hình 3.8: Glucoamylase thương mại sau khi cố định 2 giờ và enzyme CLEA

Hình 3.9: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của glucoamylase cố định dạngCLEA woo ốốỐố 45Hình 3.10: Khả năng tái sử dụng liên tục của glucoamylase cố định dạngCLEA woo ốốỐố 46Hình 3.11: Kha năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dướiảnh hưởng Của pH - s5 5 5 T000 0 0v v0 48

Hình 3.12: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dướiảnh hưởng của nhiỆt độ Q11 1101 9 H1 vớ 49Hình 3.13: Ảnh hưởng của nông độ glutaraldehyde đến khả năng cố địnhD€CẨITIAS€ Gì Thìn 99 51Hình 3.14: Enzyme pectinase cố định bằng kĩ thuật CLEA từ môi trường nuôi7 52Hình 3.15: Anh hưởng của thời gian cố định lên khả năng cố định pectinase 53Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ cô định đến khả năng có định pectinase 55Hình 3.17: Hình anh CLEA của pectinase dưới kính hiển vi điện tử quétHình 3.18: Pectinex sau 2 giờ cô định và tha CLEA thu được 56Hình 3.19: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của pectinase cố định dạng CLEA 58Hình 3.20: Khả năng hoạt động của pectinase cô định dạng CLEA dưới ảnhNUON CUA PH 59Hình 3.21: Kha năng hoạt động cua pectinase cô định dạng CLEA dưới ảnhhưởng của nhiỆt đỘ - - - - E11 S919 nh nh 60Hình 3.22: Lượng đường trong dịch củ năng trước và sau khi xử lý với enzymeglucoamylase CO định ¿+ + 2191939121 121 1 12111 211111111 2x 63Hình 3.23: Lượng đường trong dịch thơm trước và sau khi xử lý với enzymeglucoamylase CO định ¿+ + 2191939121 121 1 12111 211111111 2x 63Hình 3.24: Độ đục của dịch củ năng trước và sau khi xử lý với enzymepectinase cố định dạng CLEA - 5 2222222222 EE2EEEEEEEEEEErErkrkrkrerereee 64Hình 3.25: Độ đục của dịch thơm trước và sau khi xử lý với enzyme pectinasecô định dạng CLEA :: < Sẻ E339 51151 5151111151515 5115010111111 11 1101 grrkg 65

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1: Các enzyme được cô định thành công bang kĩ thuật CLEA 12Bảng 2.1: Các nghiệm thức tiễn hành khảo sát khả năng tủa enzyme 29Bang 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong dịch enzyme thô 3⁄4Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khả năng tủa enzyme glucoamylase và pectinasecủa ethanol 96°, polyethylene glycol và (NHx)sSÖ¿, - 55-55: 35Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nông độ glutaraldehyde đến khả năng cố địnhBjI)Ie9ì00j)xaadddaâẳdâaâAâlaẳdlaẢ4 36Bảng 3.4: Hàm lượng glutaraldehyde trong nước rua của glucoamylase dang

BjI)Ie9ì00j)xaadddaâẳdâaâAâlaẳdlaẢ4 40Bang 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ có định đến khả năng có định glucoamylaseBang 3.7: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của glucoamylase cố định theo kithuật CHLEA SH 0 0t re 4Bảng 3.8: Khả năng tái sử dung liên tục của glucoamylase cố định theo ki00180) 0 57220007 AạBaiióóii ii 46Bang 3.9: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dướiảnh hưởng Của pH - s5 5 5 T000 0 0v v0 47Bảng 3.10: Khả năng hoạt động của glucoamylase cô định dạng CLEA dướiảnh hưởng của nhiỆt độ Q11 1101 9 H1 vớ 49Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố địnhD€CẨITIAS€ Gì Thìn 99 50Bang 3.12: Ham lượng glutaraldehyde trong nước rua cua pectinase dạng005.11 ẽ 52Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian có định đến khả năng cố định pectinase

ỠÃỂiiiiẳẳẳẳiiiiiiẳiiiiiiiiiitiiiiiiẳẳáẦ 53

Bang 3.14: Anh hưởng của nhiệt độ cố định đến khả năng cố định pectinase 54Bang 3.15: Kha năng tai sử dụng của pectinase cố định theo kĩ thuật CLEA 57Bang 3.16: Khả năng hoạt động của pectinase cô định dạng CLEA dưới ảnhNUON CUA PH 59

Bang 3.17: Khả năng hoạt động cua pectinase cô định dạng CLEA dưới ảnhhưởng của nhiỆt đỘ - - - - E11 S919 nh nh 60Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm lượng đường và độ đục ban đầu của dịch quảBảng 3.19: Hàm lượng đường của dịch quả trước và sau khi xử lý vớiglucoamylase có định dạng CLEA :- ¿525252 2 E+EEEvEvEeErEeererererees 62Bảng 3.20: Độ đục của dịch quả trước và sau khi xử lý với pectinase cô địnhang 0) BI 0 64

CAC CHỮ VIET TAT

A.niger: Aspergillus niger.CLEA: cross-linking enzyme aggregates.CLEC: cross-linking enzyme crystals.Erm: enzyme thương mại.

Eru: enzyme thô thu nhận từ môi trường nuôi cay nâm moc Aspergillus niger.PE: pectinesterase.

PEG: polyethylene glycol.PEL: pectate lyase.

PG: polygalacturonase.PL/PNL: pectin lyase.PME: pectinmethylesterase.Rh delemar: Rhizopus delemar.SEM: scanning electron microscope.TB: trung binh.

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tàiHạn chế trong việc sử dụng enzyme cho các xúc tác sinh học đó là giá thànhrất đất (tương tự như các xúc tác hóa học) Vì vậy enzyme cố định được sửdụng Thông thường sự cô định sẽ cho hiệu quả tốt hơn đối với các enzyme cósự ôn định về hoạt tính Việc có định enzyme thường thực hiện bởi sự liên kếtcủa enzyme với mạng lưới, hoặc nhốt trong khuôn gel Nhưng nhược điểm củacác phương pháp trên là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất:chất mang che lấp làm giảm hoạt tính enzyme, ví dụ như trong phương phápnhốt thì enzyme ở lớp vỏ ngoài gel sẽ hoạt động tốt hơn bên trong Bên cạnhđó, enzyme sau khi đã tinh sạch rồi mới bắt đầu cô định hoạt tính sẽ giảm đirat đáng kể, bởi vì thông thường qua mỗi bước tinh sạch thì một phan củaenzyme như các tiểu cấu tử bị tách ra hoặc những yếu tố đồng hỗ trợ cho hoạtđộng của enzyme bị mất đi làm giảm hoạt tính của enzyme Kĩ thuật cross-linking enzyme aggregates (CLEA) ra đời trên lý thuyết đã giải quyết đượcnhững bat lợi này vì kĩ thuật này đã kết hop được quá trình tủa và quá trình cỗđịnh vào cùng một bước, bỏ qua bước tinh sạch, giữ được hoạt tính cuaenzyme sau khi cố định và qua các lần tái sử dụng, ngoài ra kĩ thuật này còngiúp enzyme gia tăng sự 6n định về mặt hoạt tính khi pH và nhiệt độ thay đối,bên hon với sự tổn tại của tác nhân phân giải protein.

Trong công nghiệp sản xuất nước quả hay rượu vang, glucoamylase vàpectinase đóng vai trò rất quan trọng và được ứng dụng rất nhiều, hai enzymenày có tác dụng làm tăng hàm lượng đường và giảm độ đục cũng như giảm sựlắng cặn trong sản phẩm Do đó, việc cô định glucoamylase và pectinase đồngthời vẫn bảo đảm giữ được hoạt tính cao trong công nghiệp thực phẩm là rấtcần thiết

Vì vậy, dé tài “Nghiên cứu thu nhận và có định enzyme glucoamylase vàpectinase theo kĩ thuật CLEA” đã được tiến hành

2 Mục tiêu nghiên cứuMục tiêu của việc thực hiện đề tài này là:

— Tìm hiểu và thực hiện kĩ thuật cố định CLEA trên hai đối tượng làglucoamylase va pectinase.

— Đồng thời khảo sát tính chat của enzyme cô định dang CLEA

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung đề tài:— Khảo sát các điều kiện tối ưu để cô định enzyme glucoamylase và enzyme

pectinase thu nhận từ nam mốc Aspergillus niger bang kĩ thuật CLEA, baogdm các yếu tố:

+ Nông độ tay gan glutaraldehyde.+ Nhiệt độ cô định

+ Thời gian cô định.— Khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA thu nhận từ vi sinh vật,

bao gồm: cau trúc của khối CLEA, kha năng tái sử dụng đối với cơ chấtriêng biệt của từng enzyme, khả năng hoạt động dưới ảnh hưởng của pH vànhiệt độ.

— Bước đầu ứng dụng enzyme dạng CLEA xử lý hai loại dịch quả là củ năngvà thơm, đánh giá dựa trên hai chỉ tiêu hàm lượng đường và độ đục củasản phâm.

4 Y nghĩa khoa họcKĩ thuật cố định CLEA là một phương pháp cố định mới không cần chấtmang, bên cạnh đó phương pháp này còn đem lại hiệu suất cao hơn nếu cốđịnh enzyme từ dich enzyme thô, rút ngắn được quy trình tinh sạch enzyme,vừa giảm thao tác thực hiện, vừa giúp enzyme có cau trúc 6n định, đảm bảođược hoạt tính, đây là một hướng đi mới cho công nghệ enzyme hiện đại.

5 Y nghĩa thực tiễnPhương pháp CLEA có nhiều thuận lợi hơn các phương pháp có định khác khiđưa vào sản xuất theo quy mô công nghiệp, bởi vì phương pháp này đơn giản,dễ thực hiện, linh hoạt và được tối ưu hóa, ngoài ra, nguyên liệu còn rẻ tiên, dễkiếm Phương pháp này được áp dụng với nhiều loại enzyme khác nhau, kế cảenzyme thô, sản phẩm sau CLEA có hoạt tính ôn định, kha năng tái sử dụng vàduy trì được hoạt tính của enzyme cao, chính vì vậy góp phần làm tăng hiệusuât và giảm chi phí sản xuât.

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN

1.1 Enzyme cố định [9, 11, 19]Enzyme là những protein có cau tạo phức tap và đóng vai trò xúc tac sinh học,có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo chocác phản ứng xảy ra theo một chiêu hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàngtrong cơ thé sống.

1.1.1 Khái niệm enzyme cố địnhEnzyme có định (hay enzyme không tan) là enzyme có sự tham gia hoạt độngtrong một không gian bị giới hạn Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt củaenzyme băng cách gắn enzyme vào một pha cách ly tách rời khỏi pha lỏng tựdo và ở đó enzyme vẫn có khả năng tiếp xúc với các phân từ cơ chất Pha gắnenzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưanước.

Loi ích của việc sử dụng enzyme cô định:Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một kiểuphản ứng xúc tác, chế phẩm bên hơn trong các điều kiện pH, nhiệt độ, áp suấtthấm thấu tối uu, tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự độnghóa cao.

Tạo enzyme cô định tương đối dễ, đầu tư vào xây dựng và sản xuất tương đối

ít, sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme (chỉ một số ít bị rửa trôi theodòng chảy của tác nhân), có thé dễ dàng tô chức sản xuất các sản phẩm lênmen bang enzyme ngoại bao như: ethanol, acid hữu co, aminoacid, vitamin.Từ hai đặc điểm trên cho thay, sử dung enzyme không hòa tan có ý nghĩa kinhtế hon sử dung enzyme hòa tan nhiều lần

1.1.2 Đặc điểm của enzyme cố địnhKhi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặcđiểm khác hắn enzyme hòa tan

Hoạt tính của enzyme không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt tính riêng củaenzyme hòa tan cùng loại.

Enzyme không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì đãđược bảo vệ bởi chất mang

Enzyme không hòa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặcacid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan chứ không trùng với pH tối ưu củaenzyme hòa tan cùng loại.

Enzyme không hòa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme cùng loại

- _ Ta có thé tái sử dụng enzyme không hòa tan nhiêu lần Trong khi đó, enzymehòa tan chỉ có thể sử dụng một lần Đặc điểm này rất có ý nghĩa về kinh tế khita tiến hành các phản ứng theo quy mô công nghiệp.

1.1.3 Các phương pháp cô định enzyme

Các phươngpháp cô định

Phuong phap Phương pháp a ~nhôt enzyme tạo liên kết Tạo dân xuât

= Nhốt enzyme Tao lién kétTao lién két 4 Khong dẫn xuất

lên kết đồng hóa

1

Hình 1.1: Các phương pháp cô định enzyme

1.2 Có định enzyme băng phương pháp cross-linking enzymeageregates (CLEA)

1.2.1 Phuong pháp cross-linking enzyme aggregates ( CLEA)* Định nghĩa phương pháp CLEA [43]

Sản phẩm của phương pháp CLEA là các enzyme được gan kết lại với nhaubởi những liên kết chéo với tác nhân gan nhị chức dialdehyde, sau khi đã đượctập hợp lại gan nhau, và có thé tái sử dụng được Những năm gần đây, cácnghiên cứu đã cho thay khả năng xúc tác rat mạnh của các enzyme liên kêtchéo này.

XS m 2 Crile} — A)NH — aggregation «= pp |p | { cross limkimg [ex] e —

Hình 1.2: Minh hoa các tiễn trình xảy ra trong cô định enzyme bằng ki thuật

CLEA

* Lich sử phát triển của kĩ thuật có định CLEA [42]Các phương pháp cô định enzyme có thé được chia thành ba loại: liên kết vớichất mang, vi gói trong gel vô cơ hoặc hữu cơ và liên kết chéo giữa các phântử enzyme Liên kết với chất mang chắc chắn sẽ làm giảm hoạt động xúc táccủa enzyme do một lượng lớn enzyme nam phía trong không tham gia xúctácvì bị chất mang che khuất không tiếp xúc được với cơ chất Dạng cô địnhnày làm giảm năng suất sản phẩm tăng thời gian và không gian xử lý cơ chấtvới enzyme vì khả năng xúc tác của enzyme thấp hơn Ngược lại, cố địnhenzyme qua liên kết chéo giữa các phân tử enzyme bởi tay gan nhị chức là mộtphương pháp cố định không cần chất mang và kết quả xúc tac đảm bảo gannhư là 100% enzyme cô định đều hoạt động

Kĩ thuật liên kết chéo enzyme, thông qua phản ứng của tay gắn, ví dụ nhưglutaraldehyde với nhóm -NH; trên bề mặt enzyme, đã được phát triển cáchđây 40 năm Tuy nhiên, các enzyme liên kết chéo lại cho thấy khả năng duy trìhoạt động thấp, khả năng tái sử dụng kém và ôn định cơ học thấp, và vì bản

chất keo của enzyme có định này nên rất khó dé thao tác Do đó, phương phápcô định enzyme liên kết với chất mang phố biến hơn phương pháp liên kếtchéo Sau đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng phương pháp CLEC(liên kết chéo giữa các tinh thể enzyme) như là một chất xúc tác công nghiệp,được phát triển vào đầu những năm 1990 và sau đó được thương mại hóa bởiAltus Biologics Phương pháp này áp dụng đối với phố enzyme rộng vàenzyme dạng CLEC thể hiện khả năng ôn định tốt với nhiệt độ, dung mồi hữucơ và các quá trình phân giải enzyme hơn là enzyme hòa tan hoặc enzyme bộtđông khô tương ứng Chính vì khả năng ôn định hoạt động tốt, kích thước hạtdễ kiểm soát và dễ tái sử dụng, kết hợp với hoạt tính xúc tác cao và năng suấtsản phẩm lớn, làm cho enzyme dang CLEC trở thành phương tiện chuyển hóasinh học lý tưởng cho công nghiệp.

Nhưng điều kiện của phương pháp CLEC cần phải là enzyme tinh thé, mộttiền trình rất mat thời gian và đòi hỏi enzyme phải có độ tinh khiết cao Cácnhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và thay rằng, nếu như bố sung thêm mudi,dung môi hữu cơ hoặc polymer không ion vào dịch enzyme hòa tan dẫn đếnhiện thượng tủa vật lý, các phân tử enzyme tập hợp lại với nhau bang liên kếtkhông cộng hóa tri mà không làm ảnh hưởng đến cau trúc bậc 3 của enzyme.Điều này được lý giải răng liên kết chéo của các chất kết tủa vật lý sẽ làm choenzyme vĩnh viễn không hòa tan trong khi vẫn duy tri được siêu cau trúc nhưban dau, kế cả hoạt động xúc tác Nghiên cứu này đã tạo tiền dé để phát triểnmột phương pháp cố định enzyme mới, đó là CLEA Chính vì phương pháptủa thường được sử dụng để làm sạch enzyme, nên CLEA đã kết hợp được quátrình làm sạch và quá trình cố định vào một bước duy nhất

Nghiên cứu cô định penicillin G amidase (EC 3.5.1.11 ) bằng kĩ thuật CLEAđược tiến hành, đây là một enzyme công nghiệp quan trọng được sử dụngtrong quá trình sản xuất penicillin bán tổng hợp và kháng sinh cephalosporin.Các enzyme tự do bị giới hạn trong khả năng ôn định hoạt tính khi nhiệt độthay đổi và khả năng chịu được dung môi hữu cơ thấp, vì thé enzyme nàylàmột ứng cử viên lý tưởng cho nghiên cứu cô định bằng kĩ thuật CLEA Thatvậy, penicillin G midase dạng CLEA (tủa với ammonium sulfate hoặc t-butanol) được chứng minh là chất xúc tác hiệu quả cho quá trình tổng hợpampicillin Dang chú ý là năng suất của enzyme CLEA thậm chí còn cao hơnSO với các enzyme tự do, và cao hơn đáng kê so với của CLEC Tương tự, các

enzyme CLEA penicillin G amidase cũng duy trì hoạt tính cao trong dung môihữu cơ hơn là enzyme CLEC tương ứng.

Glutaraldehyde được sử dụng là tay gan trong phương pháp cố định enzymebăng liên kết chéo vì hợp chất này rẻ tiền và có sẵn trong thương mại với sốlượng lớn Tuy nhiên, với một SỐ enzyme, ví dụ nitrilase, đôi khi nhận đượckết quả là hoạt tính rất thấp hoặc không còn hoạt động khi dùngglutaraldehyde làm tay gắn Các nhà khoa học cho rang điều này có thé là dophản ứng của tay gắn với amino acid là rất quan trọng cho hoạt động củaenzyme Chính vì một lý do đặc biệt và có ảnh hưởng rất nghiêm trọng củaglutaraldehyde là có khả năng phản ứng rất mạnh và kích thước lại nhỏ,glutaraldehyde có thé chen vào trong cấu trúc nội tại của enzyme làm anhhưởng tới trung tâm hoạt động Để khắc phục van dé này, polyaldehyde côngkênh đã được sử dụng để thay thế glutaraldehyde, hợp chất này được thu nhậntừ quá trình oxy hóa periodate dextran, tiếp theo cho tác dụng với natriborohydride dé tạo thành mối liên kết amin không thé đảo ngược Việc thaythế này giúp khối CLEA đem lại kết quả cao hơn nhiều so với khi thử nghiệmtay gan glutaraldehyde Kết quả thu được cũng 4n tượng khi ứng dụng vớinitrilase khác Liên kết chéo với glutaraldehyde tạo thành khối CLEA hoàntoàn không hoạt động trong khi với dextran polyaldehyde thì duy trì được hoạttính khoảng 50-60% (chưa tôi ưu)

1.2.2 Liên kết giữa glutaraldehyde với enzyme1.2.2.1 Giới thiệu về glutaraldehyde [29, 30]

% Đặc điểm— Cong thức phân tử: CsHgQO>.— Khối lượng phân tử: 100,12 g/mol.— Thành phan nguyên t6:C:59,98%; H: 8,05%; O: 31,07%.— Danh pháp IUPAC: Pentane- [,5-dial.

— lên khác: Pentanedial, glutardialdehyde, glutaric acid dialdehyde, glutaricaldehyde, glutaric dialdehyde, | ,5-pentanedial.

* Tinh chat* Tính chat vật ly— Là chất lỏng màu vàng.— Có mùi đặc trưng.— Tan nhiều trong nước.— Ty trọng: 1,06 g/ml.

— Điểm nóng chảy: -14°C, 259K, 7°F— Điểm sôi: 187°C, 460K, 369°F

+ Tinh chất hóa hocTính chất hóa học của glutaraldehyde do nhóm chức aldehyde quyết định

Tính chất của nhóm aldehyde bao gồm những phản ứng đặc trưng sau:

Hình 1.3: Cấu tạo phân tử cua (poly)glutaraldehyde(A) 3 dạng cầu tạo cua phân tử mono glutaraldehyde, (B) Phan ứng polymer

hóa glutaraldehyde

Gốc amin của các phân tử protein sẽ liên kết với gốc aldehyde trong phân tửglutaraldehyde và tách ra một phân tử nước Đối với enzyme, phan còn lại củaenzyme vẫn giữ được hoạt tính, đồng thời enzyme còn được cố định trên phântử glutaraldehyde Như vậy nếu có (n+1) phân tử enzyme tham gia phan ứngthì sẽ có (n+1) phân tử nước được tách ra, và có (n+1) liên kết chéo được hìnhthành giữa enzyme va glutaraldehyde.

Khả năng xảy ra của kĩ thuật CLEA bao gom sự kết tha và các bước liên kếtchéo trong suốt quá trình phản ứng, tạo thành những hạt lớn dan.

free enzyme aggregate CLEA

hờ, N Hà, ° $ s1 b +0 #$ 1fe ee ks x 2 °° ’ by ee \ AS # 9 * b 8 ; é

Bang 1.1: Các enzyme được cô định thành công bằng kĩ thuật CLEA.Penicillin acylases Glucose oxidase R-Oxynitrilase

Aminoacylase Galactose oxidase Pyruvate decarboxylase

Pig Liver Esterase Laccase

Lipases Catalase D-Deoxyribose aldolaseNitrilases Alcohol

dehydrogenase

Galactosidase Formate

dehydrogenaseProtease (trypsin)

Phytase

1.2.4 Một số công trình nghiên cứu về kĩ thuật CLEA+ Nghiên cứu cúa R.A Sheldon và cộng sự: “Cross-linked enzymeageregates (CLEA): Một phương pháp có định enzyme tân thời và linhhoạt”, nam 2005 [43].

Cố định enzyme băng kĩ thuật CLEA và các ứng dụng của enzyme dangCLEA trong chuyển hóa sinh học công nghiệp rất được quan tâm Chế phẩmCLEA chịu ảnh hưởng của quá trình tủa enzyme từ dung dịch đệm cùng vớitác nhân cross-linking nhị chức, thường là một dialdehyde như glutaraldehydehay dextran polyaldehyde.

Kĩ thuật này là khá đơn giản và được áp dụng rộng rãi CLEA đem lại rấtnhiều lợi ích khi được ứng dụng trong công nghiệp xúc tác sinh học Thời giansử dụng của enzyme cố định bang kĩ thuật CLEA được tăng lên đáng kế vahoạt tinh cũng được 6n định, dé dàng phục hồi và tái sử dụng, hoàn toàn ồnđịnh khi tây rửa trong môi trường nước Kĩ thuật CLEA su dụng được cho rấtnhiều loại enzyme, ví dụ như các loại enzyme hydrolase, oxidoreductase vàlyase trong công nghiệp xúc tác sinh học Đồng tập hợp và liên kết chéo haihay nhiều loại enzyme còn gọi là combi-CLEA rất có ý nghĩa đối với việc xúctác trong cùng một nôi phan ứng, tiễn trình phản ứng dây chuyên enzyme nốitiếp, ví dụ như ứng dụng thành công ba tầng combi-CLEA bao gồmhydroxynitrile lyase, nitrilase và amidase trong quá trình chuyển đổibenzaldehyde thành acid S-mandelic đạt 96% chuyển đổi trong 99% đồngphân đối quang

OHCONH,OH

được tiến hành với enzyme thương mại, Pectinex Ultra SP-L, có chứapectinase, xylanase và cellulase CLEA có thể sử dụng với bất kì enzyme hoạtđộng nao CLEA được m6 tả băng một hệ thống các tham số động lực học,nghiên cứu về khả năng chịu nhiệt và mức độ liên kết thành mạng lưới của baloại enzyme trên Thực hiện tủa ba enzyme hoạt động với n-propanol, thựchiện liên kết chéo với glutaraldehyde (5mM) để hoạt hóa các enzyme, đồngthời giữ lại các enzyme sau khi thực hiện các liên kết chéo Giá trịVmax/Kmax tăng từ 11, 75 và 16 đến 14, 80 và 19 cho enzyme pectinase,xylanase, và cellulase tương ứng Ở nhiệt độ khảo sát là 50°C, 60°C, 70°C,thời gian bán hủy từ 17, 22 va 32 phút tăng lên 180, 82 va 91 phút chopectinase, xylanase, va cellulase tương ứng Ca ba loại enzyme trong CLEAđều có thé tái sử dung đến lần thứ ba ma không giảm hoạt tính Mỗi don vị cóthé xúc tác nhiều biến đổi sinh học, cho cả ba phản ứng độc lập và khác nhau:phản ứng thủy phân pectin, phản ứng thủy phân xylan, phản ứng thủy phâncellulose Các phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ cao hơn so với enzyme tựdo.

+ Nghiên cứu cô định enzyme glucoamylase bằng kĩ thuật CLEA củaZhang Qian va cộng sự năm 2008 [52].

Đề khắc phục những nhược điểm của glucoamylase tự do, phương pháp gankết các phân tử glucoamylase lại với nhau thông qua liên kết chéo (CLEA),một kĩ thuật cô định mới, đã được nghiên cứu để áp dụng vào trong sản xuất,phương pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng glutaraldehyde như là cầunoi liên kết sau khi glucoamylase tự do được kết tủa bởi tác nhân tủa thíchhợp Các điều kiện tối ưu để cố định glucoamylase theo kĩ thuật CLEA thuđược như sau: các khối glucoamylase sau khi cố định có thé được tạo thànhkhi được bổ sung tert-butyl alcohol vào dung dịch enzyme glucoamylase (5g/1và pH 5,6) ở 20°C Cac điều kiện cố định tối ưu được trình bày như sau: nôngđộ glutaraldehyde sử dụng là 10%, cố định trong thời gian là 120 phút, cáckhối CLEA thu được sau thao tác ly tâm và rửa Hoạt tính của enzyme cố địnhlà 40,4% hoạt tính của glucoamylase tự do ban dau

+ Nghiên cứu có định subtilisin bang kĩ thuật CLEA của K Sangeethavà cong sự năm 2008 [36].

Subtilisin là một endopeptidase, xúc tác thủy phân liên kết peptide qua hìnhthành một chất trung gian acyl-enzyme, enzyme này hoạt động tại môi trườngtrung tính, pH kiểm nhẹ Subtilisin được ứng dụng trong công nghiệp chất tây

rửa hay tổng hợp hóa học Đề phù hợp sử dụng trong chất tây rửa enzyme phảiôn định với pH kiểm, 6n định với nhiệt độ cao tương đối.

Vì vậy 6n định enzyme là một trong những thách thức lớn trong quá trình tốiưu hóa xúc tác sinh học Subtilisin được kết tủa băng cách sử dụng amonisulfat và polyethylene glycol với các chất bề mặt như Triton X-100 và Tween20 Enzyme CLEA, kết quả của quá trình liên kết chéo giữa glutaraldehyde vàenzyme, là những khối enzyme không tan và có kha năng xúc tác Enzyme côđịnh CLEA cho thay kha năng hoạt động rộng lên tới pH 9 và nhiệt độ 70°C.Tái sử dụng và hình thái học bề mặt của các khối CLEA cũng được nghiêncứu CLEA của subtilisin có sự 6n định tốt trong các dung môi hữu cơ khôngphân cực, chang han như hexane, va cyclohexane và có kha năng chịu nhiệtcao lên đến 60°C và do đó có thể được sử dụng như một chất xúc tác để biếnđổi sinh học của các hợp chất không tan trong môi trường nước

Trong dé tài của chúng tôi, đối tượng enzyme được chọn dé áp dụng kĩ thuậtCLEA là glucoamylase và pectinase, hai loại enzyme có vai tro quan trọngtrong công nghệ thực phẩm

1.3 Các đối tượng liên quan trong nghiên cứu1.3.1 Tong quan về nam mốc Aspergillus niger1.3.1.1 Giới thiệu chung về nam mốc Aspergillus niger [26, 40]Aspergillus niger là loài phố biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãitrên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiềuvùng địa lý khác nhau trên thế giới Hiện nay, A niger được sử dụng chủ yếutrong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữucơ như acid citric hay acid gluconic, công nghiệp sản xuất enzyme (bao gồmcả hai enzyme glucoamylase và pectinase, đôi tượng nghiên cứu trong đề tai).

A niger thuộc:Ngành: AmastigomycotaNganh phu: AscomycotinaLớp: Ascomycetes

Lớp phụ: PlectomycetidaeBộ: Eurotiales

Họ: EurotiaceaeGiống: AspergillusLoài: Aspergillus niger

1.3.1.2 Dic điểm sinh lyAspergillus niger phan bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác bã thực vật,hoa quả và đặc biệt là có nhiều ở vùng khí hậu âm áp

Loài sinh vật này sống hiếu khí, sống hoại sinh hoặc ký sinh, không có khảnăng quang hợp tạo chất hữu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các loại chấthữu cơ có sẵn qua bé mặt khuẩn ty

1.3.1.3 Dac điểm sinh hóaCó kha năng đồng hóa các loại đường khác nhau: A niger đồng hóa tốt cácloại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose Đối với đườngsorbose, galactose, A niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đường lactose thìđồng hóa ở mức trung bình

Nguồn dinh dưỡng nitrogen: A niger có khả năng sử dung urea làm nguồn Nvà chất điều chỉnh pH, dưới tác dụng của enzyme urease, urea phân hủy thành

CO, và NHạ A niger đồng hóa được các muối amoni Việc sử dụng nguon Nhữu co, urea va các muối amoni đều gan liền với việc tách NH: ra rồi hấp thuvào cơ thé Như vậy, NH; là trung tâm của con đường dinh dưỡng N của A.

niger.

Khả năng sinh tong hop enzyme: A niger có kha năng sinh các enzyme nhưamylase, protease, pectinase va cellulase.

1.3.2 Enzyme glucoamylase1.3.2.1 Giới thiệu chung về glucoamylase [11]Amylase là một hệ enzyme rat pho biến trong thé giới sinh vat, va cũng là mộttrong số các hệ enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học vànhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác Bao gom các loại như a-amylase, B-amylase, glucoamylase, oligo-1,6-glucosidase,

Trong số những enzyme nay, glucoamylase được các nhà khoa học Nhat táchra lần đầu tiên từ Aspergillus awamori Sau đó được tìm thay ở Rhizopusdelemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật kháccũng như ở mô động vat.

Glucoamylase từ nam mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng daođộng rất lớn từ 27 000 đến 112 000 Da, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme

% Co chế tác động của glucoamylase [1]Enzyme glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân mạnh mẽ liên kết ơ-1 „4lẫn a-1,6 glucoside của phân tử tinh bột Enzyme glucoamylase xúc tác táchtuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Tee

Hình 1.8: Sơ đồ phân giải ticủa glucoamylase

% Tinh chất của glucoamylase [11]Glucoamylase là một exoenzyme, khi thủy phan tinh bột ngoài glucose còn cóthé tạo thành các oligosaccharide Ngoài các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucoside,enzyme này còn có thé thủy phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 glucoside.

Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide vàpolysaccharide bang glucoamylase của nam mốc, Backer và cộng sự thay rangsự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch”

oligosaccharide ầ + oligosaccharide

Kiểu Asp niger khácHình 1.9: Sơ đồ thủy phân tỉnh bột bởi glucoamylaseGlucoamylase là enzyme ngoại bao, đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loạienzyme “acid” Glucoamylase được thu nhận từ các loài nam mốc nhưRhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae.

%* Các yếu tố ảnh hưởng đến động hoc của glucoamylaseNhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tổ quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc táccủa enzyme, enzyme glucoamylase hoạt động trong khoảng 20°C — 75°C.Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme glucoamylase là 40°C — 65°C.pH: Khoảng pH mà enzyme glucoamylase hoạt động được là từ 2 — 8, pH tốiưu là 4 - 5,5.

Các chất ức chế: Enzyme glucoamylase sẽ ức chế bởi các ion kim loại nhưAlÊ*, Hg?*, Pb2*, Ni?*, Cu.

Các chất hóa học: Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như:chloroform, hexane, n — dodecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạttính glucoamylase lên 2 lần so với môi trường chỉ có nước là chất dung môiduy nhất Các chất 2,2’ — dipyridyl, iodoacetamide sẽ làm tăng hoạt tinhenzyme glucoamylase.

1.3.2.2 Ung dụng của enzyme glucoamylase [11]Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí đầu va đóng vai tròquyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường dé lên men.Người tathường dùng hỗn hợp canh trường bé mặt của Aspergillus usamii vàAspergillus balatae trong sản xuất rượu.

Glucoamylase được ứng dụng trong các quy trình đường phân tính bột sảnxuất glucose, để sử dụng trong các lĩnh vực y học, công nghiệp thực phẩm.Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bố sung vàomột số loại thuốc tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thê

Ngày nay, enzyme này còn được sử dụng kết hợp với các enzyme cellulase vàprotease dưới dạng canh trường nam mốc b6 sung vào trong thức ăn gia súc,làm tăng quá trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn

1.3.2.3 Một số công trình nghiên cứu về enzyme glucoamylase cố địnhĐã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về sinh tổng hợp glucoamylasetheo phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bán rắn trên cácchủng nắm mốc khác nhau Năm 1997, J.M.Zaldivar-Aguero và cộng sự đãnghiên cứu sự ảnh hưởng của phosphor trong quá trình sinh tong hopglucoamylase của Aspergillus awamori theo phương pháp nuôi cay bê sâu, kếtquả đạt được hoạt tính enzyme tăng từ 350U/I lên I200U/1 khi có bồ sungthêm phosphor Năm 2002, Ikram-ul-Haq và cộng sự sử dụng chungAspergillus niger GCUCM-36 nuôi cay trên môi trường cám mì thu

glucoamylase đạt hoạt tính enzyme 1180U/g/phút sau 48h nuôi cay [10].Ở Việt Nam cũng có một số tác giả đã có các nghiên cứu về cô địnhglucoamylase Năm 1995, Võ Tân Thiện đã nghiên cứu cô định glucoamylasetrên giá thể polyhydroxy ethyl methacrylat (PHEMA) bằng phương pháppolymer hóa bức xạ ở nhiệt độ thấp Năm 2007, tác giả Hoàng Bá Thanh Hảiđã tiễn hành nghiên cứu cố định glucoamylase trên các chất mang khác nhauđạt hiệu suất cố định 47,15% trên alginate canxi, 44,69% trên kaolin va36 49% trên chitosan [5].

1.3.3 Enzyme pectinase1.3.3.1 Giới thiệu chung về pectinase [11]Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Vìvậy, những enzyme này có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảoquản trái cây và rau quả Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong

quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc

kiếm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thé điều chỉnh được độnhớt của sản pham.Vi vậy, pectinase dang được ứng dụng rộng rãi trong côngnghiệp thực phẩm và dược phẩm, nhất là trong công nghiệp sản xuất các loạinước ép trái cây.

* Cơ chế tác động của pectinase [11]Phá vỡ thành tế bào: Ở thành tế bào thực vật có chứa rất nhiễu pectin, các chấtpectin này được xem như là chất ciment gắn các tế bào lại với nhau Phá vỡ sựgan kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát khỏi tế bào.Làm trong nước quả: Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứanhiều chất khác nhau Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kế va pectinthường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước qua.

Trong chế biến nước quả người ta thường sử dụng các chế phẩm enzymepectinase với hai mục đích co bản là phá vỡ thành tế bào thực vật nhăm nângcao hiệu suất thu nước quả và làm trong, 6n định chất lượng nước qua

* Phân loại và tinh chất của pectinase [11]Là nhóm enzyme xúc tác phản ứng phân cắt pectin tạo thành acid galacturonic,glucose, galactose, arabinose, methanol và một số sản phẩm khác

Pectinesterase (PE) hay pectinmethylesterase (PME): Xúc tác sự thủy phâncủa các nhóm methyl ester Enzyme thường tấn công vào các nhóm methylester của don vị galacturonate năm kể đơn vị không bi ester hóa, phân cắt cácnhóm methoxy (COOCH;) đứng cạnh các nhóm —COOH tự do, tạo thành acidpectinic hoặc acid pectic và methanol.

Polygalacturonase (PG): Xúc tác sự thủy phân các mối liên kết glucoside Các exo-PG phân cắt từ các đầu không khử và endo-PG tan côngngẫu nhiên vào giữa mach cơ chat

o-1,4-Ngoài ra còn có một số loại pectinase như: Pectin lyase (PL hay PNL) xúc tácsự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bi ester hóa, pectate lyase (PEL) xúctác sự phân cắt các đơn vi galacturonate không bi ester hóa

Hình 1.10: Mô hình hoạt động cua hệ enzyme pectinase

% Các yếu tố ảnh hưởng đến động học của pectinase [11]- pH: PE từ vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,0 cho đến 9.0 Tuy nhiên, đối với các

PE từ nắm mốc, pH hoạt động tối ưu dao động trong khoảng hep từ 4.0 - 4.5.Còn PG chủ yếu bền ở pH từ 4,0 — 6,0

- _ Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PE dao động trong khoảng từ30 — 45°C, phu thudc vao nguồn enzyme Mặc dù vậy, trong điều kiệnthayđổi áp suất, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cũng thay đối Nhiệtđộ tối ưu của đa số PG là khoảng 40°C, ở nhiệt độ này PG bền vững, nhưngsẽ bị mất hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50 — 60°C

1.3.3.2 Ung dụng của enzyme pectinase [22, 23, 50]Trong nhiễu thé ky qua, enzyme pectinase đã được sử dụng trong nhiều loạithực phẩm cũng như các ngành công nghiệp khác Nhóm enzyme pectinase từvi sinh vật chiếm tỷ trọng từ 13% lên đến 25% trong số các enzyme thực phẩmtiêu thụ trên toàn câu

Các ứng dụng công nghiệp lớn nhất và lâu đời nhất của enzyme pectinaseđược biết đến trong lĩnh vực hỗ trợ chế biến, gia tăng hiệu quả trích ly và lamtrong nước quả.

Ngoài ra, pectinase còn được ứng dụng trong các ngành công nghiệp như dệt,xử lý sinh học cotton, xử lý nước thải, sản xuât thức ăn chăn nuôi,

1.3.3.3 Một số công trình nghiên cứu về enzyme pectinase cô địnhĐối với quá trình sinh tổng hợp pectinase, các nguồn phân lập giàu pectinthường rất được quan tâm Năm 2002, Rogaiza Al-Gasgari đã tiễn hành phânlập các loài nắm mốc có trong 26 loại nước quả ở Saudi Arabia và sử dụng cácnắm mốc sau phân lập lên men sinh pectinase Kết quả khảo sát cho thấy, A.niger có mặt ở hầu hết các nguồn phân lập và có mật số cao ở các loại cam haynước quả hỗn hợp, tuy nhiên không tìm thấy loại nằm mốc này trên hai mẫunước táo và một mẫu nước xoài Đồng thời khi so sánh khả năng sinhpectinase của A niger và các nam mốc khác, A niger cũng được xác nhận lànhóm có khả năng sinh enzyme pectinase hoạt tinh cao [44].

Ở Việt Nam, Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn Thùy Châu cũng đã bước đầunghiên cứu phân lập và tuyển chọn các dòng A niger có khả năng sinh enzymepectinase cao Với 50 dòng A niger được phân lập từ 80 mẫu nguyên liệu, chỉcó 4 dòng có khả năng sinh enzyme pectinase hoạt tính cao, đồng thời cácdòng này đều phân lập từ vỏ chanh, bưởi Dòng A niger được phân lập từ vỏthanh long hay cà phê đều cho hoạt tính enzyme pectinase kém [7]

Năm 2005, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu cố định pectinasebăng phương pháp nhốt trong gel Chất mang được sử dụng là natri alginate.Điều kiện cố định pectinase: 4 % natri alginate, 0,2% acid glutaric, 0,1 mol/lCaC1›, 0,50 ml pectinase Sau quá trình cô định hoạt tính của pectinase có thégiữ lại lên đến 95,2%, và sau 10 lần sử dụng thì hoạt tinh cua pectinase cô địnhvẫn còn hơn 76% [51]

Năm 2008, Ngô Minh Nhã va Đồng Thị Thanh Thu đã tiễn hành khảo sát khảnăng thu nhận và cố định enzym glucoamylase từ A niger và A awamori trênchất mang Kaolin Hoạt độ của chế phẩm enzym (CPE) glucoamylase thunhận từ A niger là 143325,62 UI/g-CPE va A awamori là 133418,20 UI/g-CPE Thời gian cô định enzym glucoamylase từ A niger đạt hiệu suất có địnhcao nhất (55,56%) sau 50 phút và đôi với A awamori là 40 phút với hiệu suấtcô định là 47,32% Khối lượng chất mang cho hiệu suất cố định enzymeglucoamylase cao nhất là 1¢/0,1g enzyme [15]

Dựa trên những thành tựu nghiên cứu về kĩ thuật CLEA trên thế giới, chúngtôi tiến hành nghiên cứu cô định hai enzyme glucoamylase và pectinase thunhận từ môi trường nuôi cấy nam mốc Aspergillus niger Chúng tôi muốnchứng minh rằng kĩ thuật CLEA có thể trực tiếp cố định enzyme từ dịchenzyme thô mà không cần phải trải qua quá trình tinh sạch vẫn đạt được hiệu