CÓ ĐỊNH ENZYME GLUCOAMYLASE TRÊN GEL NATRIALGINATE VÀ ỨNG DỤNG THỦ NGHIỆM THỦY PHÂN TINH BỘT KHOAI MÌ TẠO SẢN PHÂM ĐƯỜNG GLUCOSE

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ********* KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOAMYLASE TRÊN GEL NATRIALGINATE VÀ ỨNG DỤNG THỦ NGHIỆM THỦY PHÂN TINH BỘT KHOAI MÌ TẠO SẢN PHẨM ĐƯỜNG GLUCOSE Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 1/2011 Sinh viên thực hiện: PHẠM HÙNG ANH LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, kính ghi ơn ông bà, cha mẹ sinh thành nguồn động viên, khích lệ cho chúng trình học tập suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Để hoàn thành đề tài này, cố gắng thân, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Trường đại học Tơn Đức Thắng hết lịng truyền đạt cho em kiến thức quý báu trình em học trường Em xin cảm ơn thầy cô quản lý phịng thí nghiệm viện sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài Em xin chân thành: Gởi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng , CN Đỗ Thị Tuyến tận tình hướng dẫn em Trong suốt trình thực hiện, thầy cô nhắc nhở, sửa chữa sai sót khơng ngừng động viên tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng luận luận chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận góp ý từ thầy bạn để khóa luận hồn thiện TP Hồ Chí Minh, tháng 1năm 2011 Sinh viên Phạm Hùng Anh MỤC LỤC Lời cảm ơn Nhận xét giáo viên hướng dẫn Nhận xét giáo viên phản biện Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình đồ thị Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược enzyme 2.2 Sơ lược hệ enzyme amylase 2.3 Sơ lược enzyme cố định 14 2.4 Cơ chất thường sử dụng làm môi trường bán rắn 15 2.5 Tổng quan nấm mốc Aps.Kawasaki 17 2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp glucoamylase 18 2.7 Tổng quan khoai mì tinh bột khoai mì 20 2.8 Tổng quan đường glucose 24 2.9 Sơ lược sắc ký lọc gel 27 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 29 3.2 Nguyên liệu hóa chất 29 3.3 Thiết bị dụng cụ 30 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 31 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nuôi cấy Asp.kawasaki môi trường bán rắn 53 4.2 Kết định lượng mốc giống 53 4.3 Kết xác định hoạt tính Termamyl 53 4.4 Kết định lượng proterin 54 4.5 Kết so sánh hoạt tính glucoseamylase 55 4.6 Kết tinh diện di glucoamylase kết điện di 58 4.7 Kết xác định ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh tới enzyme cố đinh 63 4.8 Kết cố định glucoamylase gel natrialginate 66 4.9 Kết xác định độ Brix thủy phân tinh bột khoai mì 69 4.10 Kết tối ưu hóa thực nghiệm q trình đường hóa 70 4.11 Sản phẩm đường glucose dạng rắn 75 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 76 Đề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp làm đệm acetate Phụ lục 2: Phương pháp làm đệm phosphat Phụ lục 3: Đường chuẩn protein Phụ lục 4: Đường chuẩn glucose Phụ lục 5: Biểu đồ sắc ký enzyme glucoamylase chuẩn hãng AMONO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Asp : Aspergillus a : hỉ số hoạt độ nước (activity water) DE : Dextrose Equivalent (đương lượng glucose) DNS : Thuốc thử axit Dinitrosalixilic U : Unit International, đơn vị quốc tế HT : Hoạt tính h : Giờ (thời gian) GA : Glucoamylase SSF : Solid State Fermentation (lên men bán rắn) STT : Số thứ tự TN : Thí nghiệm t : Nhiệt độ VSV : Vi Sinh Vật MW : Trọng lượng phân tử FR : ructionation range (phậm vi tách) WR : Water regain (độ ngậm nước) w DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt lịch sử phát triển cơng nghệ emzyme Bảng 2.2: Khả hoạt động glucoamylase từ số loài vi sinh vật Bảng 2.3: Một số tính chất glucoamylase từ vi sinh vật Bảng 2.4: Thành phần dinh dưỡng khoai mì 100g nguyên liệu Bảng 2.5: Phân bố sử dụng glucose lĩnh vực mỹ 1992 Bảng 3.4: Các bước xác định hoạt tính amylase Bảng 4.1: Kết hoạt tính hàm lượng enzyme trước sắc kí Bảng 4.2: Kết ảnh hưởng pH tới enzyme hòa tan Bảng 4.3: Kết ảnh hưởng nhiệt độ tới enzyme hòa tan Bảng 4.4: Kết độ bền nhiệt enzyme hòa tan Bảng 4.5a: Xác định hàm lượng hoạt tính mẫu sau sắc ký Bảng 4.5b: Hiệu suất tinh Bảng 4.5c: So sánh độ tinh hiệu suất enzyme trước sau sắc ki Bảng 4.6: Kết tái sử dụng enzyme cố định Bảng 4.7: Hoạt tính hàm lượng protein dịch cịn lại sau cố định Bảng 4.8: Kết ảnh hưởng pH tới enzyme cố định Bảng 4.9: Kết ảnh hưởng nhiệt độ tới enzyme cố định Bảng 4.10: Kết độ bền nhiệt enzyme cố định Bảng 4.11a: Độ Brix giai đoạn dịch hóa Bảng 4.11b: Các độ Brix nồng độ tinh bột 30%, 0,02ml Termamyl Bảng 4.12a: Tóm tắt mức khảo sát thủy phân sau: Bảng 4.12b: Ma trận TYT 24 Bảng 4.12c: Các số liệu sử lý tâm Bảng 4.12d : Hệ số bj theo phương trình tuyến tính Bảng 4.13: Kết kiểm định Student Bảng 4.14: Thơng số tối ưu DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Hoạt động hệ enzyme amylase Hình 2.2: Sơ đồ thủy phân tinh bột  - amylase Hình 2.3: Sơ đồ tác dụng thuỷ phân  - amylase Hình 2.4: Cấu trúc phân tử glucoamylase Hình 2.5: Sơ đồ thủy phân glucid glucoamylase Hình 2.6: Cấu trúc phân tử amylose Hình 2.7: Cấu trúc phân tử amilopectin Hình 2.8: Cấu trúc glycogen Hình 2.9: Hệ sợi nấm mốc Asp.kawasaki thời điểm 40 Hình 2.10: Cây khoai mì Hình 2.11: Sơ đồ quy trình đại sản xuất tinh bột khoai mì Hình 2.12: Cấu trúc phân tử glucose Hình 2.13: Cấu trúc phân tử glucose dạng D Hình 2.14: Tách phân tử lọc gel Hình3.1: Quy trình sản xuất glucoamylase Hình 3.2: Quy trình trích ly enzyme Hình 3.3: Bộ máy chạy sắc ký lọc gel Hình 3.4: Sơ đồ xác định ảnh hưởng pH tới hoạt tính glucoamylase Hình 3.5: Sơ đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính glucoamylase Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt glucoamylase Hình 3.7: Quy trình cơng đoạn tạo sản phẩm glucose dạng rắn Hình 3.8: Dung dịch đường qua cột Cation Anion Hình 4.1: So sánh hoạt tính loại enzyme glucoamylase Hình 4.2: Biểu đồ thể tác động pH tới enzyme hịa tan Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme hịa tan Hình 4.4: Sơ đồ phản ánh độ bền nhiệt enzyme hòa tan Hình 4.5: Hoạt tính số lần tái sử dụng enzyme cố định Hình 4.6: Các hạt enzyme cố định Hình 4.7: Số lần tái sử dụng enzyme cố định Hình 4.8 Biểu đồ thể tác động pH tới enzyme cố định Hình 4.9: Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme cố định Hình 4.10: Sơ đồ phản ánh độ bền nhiệt enzyme cố định Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.3 ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa cho sinh trưởng, phát triển sinh vật mà cịn đóng vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp chế biến thực phẩm, y học, chăn nuôi, bảo vệ môi trường… Hiện nay, giới lượng enzyme sản xuất theo quy mô công nghiệp lớn Giá trị enzyme công nghiệp tăng hàng năm từ 10 - 15% Năm 2005, tổng doanh thu từ sản phẩm enzyme đạt 3,5 tỷ USD, riêng glucoamylase hàng năm thu 40 triệu USD [12] Việc sử dụng enzyme hòa tan q trình thủy phân thường phải tốn chi phí lớn cho trình tinh sản phẩm, tái sử dụng enzyme vấn đề dễ dàng Với việc sử dụng enzyme cố định thay enzyme hòa tan khắc phục điểm yếu Tuy nhiên việc nghiên cứu khả ứng dụng thủy phân enzyme cố định hạn chế hoạt tính enzyme thấp thời gian thủy phân thường kéo dài Kết vài nghiên cứu cho thấy glucoamylase tạo từ chủng nấm mốc Asp.kawasaki, nuôi môi trường bán rắn tạo suất hoạt tính cao Tuy vậy, việc cố định enzyme glucoamylase từ chủng mốc ứng dụng chúng chưa nghiên cứu Mặt khác, khoai mì có hàm lượng tinh bột cao sử dụng làm thức ăn gia súc, phần sử dụng công nghiệp tinh bột thực phẩm cho người Điều làm cho giá trị kinh tế loại thấp Cho nên, việc tạo sản phẩm có giá trị kinh tế cao từ khoai mì cần thiết Vì vậy, việc cố định enzyme glucoamylase, khảo sát điều kiện thủy phân ứng dụng enzyme cố định thủy phân tinh bột khoai mì vấn đề nên quan tâm nghiên cứu 1.4 MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU 1.4.1 Mục đích - Thu nhận enzyme glucoamylase từ việc nuôi cấy nấm mốc Asp.kawasaki môi trường bán rắn SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang Luận văn tốt nghiệp - Cố định enzyme glucoamylase gel natrialginate - Dùng enzyme cố định thử nghiệm thủy phân tinh bột khoai mì tạo sản phẩm đường glucose 1.4.2 Yêu cầu - Nuôi nấm mốc Asp kawasaki mơi trường bán rắn có tỷ lệ cám gạo bã khoai mì 3:1 - Trích ly enzyme nước cất tỷ lệ sinh khối nước cất 1:4 - Tủa dịch enzyme trích ly cồn 960 với tỷ lệ dịch enzyme cồn 1:3, thu nhận enzyme hòa tan - Cố định enzyme hòa tan gel natrialginate 3% - Xác định hàm lượng hoạt tính enzyme glucoamylase hòa tan enzyme glucoamylase cố định - Khảo sát ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh lên enzyme glucoamylase - Tinh xác định hoạt tính enzyme glucoamylase - Khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu thủy phân tinh bột khoai mì Termamyl giai đoạn dịch hóa glucoamylase cố định giai đoạn đường hóa - Từ điều kiện thủy phân tối ưu thử nghiệm tạo sản phẩm đường glucose SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang Luận văn tốt nghiệp Hoạt tính Thời gian enzyme cố (giờ) định % U t U t (U) 7.07 7.07 ”” 20 7.13 0.37 100 40 7.79 0.19 54.62 60 7.19 0.13 35.48 80 7.54 0.09 26.44 100 6.94 0.07 19.47 120 6.82 0.06 15.94 140 6.83 0.05 13.68 160 6.92 0.04 12.13 Từ kết bảng ta lấy giá trị cột vẽ đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt n nhieä nhiêṭ tcủ cu enzyme cớ dị nh Đơ Độ̣ bê bề̀ n ả aenzyme cố định ́ đ ị nh enzyme cơđịnh enzyme cố Hoạ t tí nh % 150 100 50 0 50 100 150 200 Thời gian (phú t) Hình 4.10: Sơ đồ phản ánh độ bền nhiệt enzyme  Nhận xét: Nhìn vào biểu đồ bảng ta thấy rằng: Enzyme h sau 60 phút enzyme cố định giảm cịn 35.48% Sau 120 phút hoạt tính enzyme cố định 15.94% Vậy, Enzyme cố định có độ bền nhiệt cao enzyme hịa tan, điều xảy enzyme cố định bảo vệ lớp màng gel natrianginate SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 68 Luận văn tốt nghiệp 4.9 Kết khảo sát độ Brix thủy phân tinh bột khoai mì Từ việc dùng 100 ml hồ tinh bột khoai mì 30% thủy phân ml termamyl, 900C, sau thời gian 20 phút thu kết trình dịch hóa bảng sau: Bảng 4.11a: Độ Brix giai đoạn dịch hóa STT Nồng độ Tinh bột (%) Termamyl (ml) Brix TN1 25 0,03 19.75 TN2 30 0,03 23.50 TN3 35 0,03 24.94 TN4 25 0,04 22.33 TN5 30 0,04 27.80 TN6 35 0,04 26.39 TN7 25 0,06 19.65 TN8 30 0,06 21.88 TN9 35 0,06 25.64 Tại thí nghiệm 5, độ Brix 27.80 lớn nhất, lặp lại thí nghiệm lần thu kết có độ Brix sau: Bảng 4.11b: Các độ Brix nồng độ tinh bột 30%, 0,04ml Termamyl Stt Nồng độ tinh bột Termamyl (ml) Độ Brix 30% 0.04 25.50 30% 0.04 26.01 30% 0.04 25.90 Sử lý thống kê theo phần mềm Minitab thu độ Brix 27.80 hợp lý (chấp nhận)  Nhận xét: Tại thí nghiệm (TN5) với nồng độ tinh bột khoai mì 30% thủy phân 0,04 ml Termamyl, nhiệt độ 900C, sau 20 phút cho độ Brix cao Ta thử dung dịch với thuốc thử không thấy có phản ứng màu xanh với iod điều chứng tỏ khơng cịn tinh bột SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 69 Luận văn tốt nghiệp Từ điều kiện thủy phân tối ưu ta áp dụng giai đoạn dịch hóa thủy phân tinh bột 30% thành dextrin trước đường hóa nhờ enzyme glucoamylase cố định 4.10 Kết tối ưu hóa thực nghiệm q trình đường hóa Thơng số muốn tối ưu hóa hàm lượng glucose (y) yếu tố ảnh hưởng đến thông số tối ưu gồm: Nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ thời gian thủy phân Đặt biến sau: x1 : Nồng độ enzyme x2 : pH x3 : Nhiệt độ (0C) x4 : Thời gian (h) Mơ hình chọn để tối ưu mơ hình tuyến tính, có phương trình hồi quy dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b4x4 + b12x12 + b13x13 + b14x14+ b23x23 + b34x34 + b123x123+ b124x124 + b134x134 + b234x234 + b1234x1234 Bảng 4.12a: Tóm tắt mức khảo sát thủy phân sau: Mức khảo sát Các yếu tố ảnh hưởng x1 x2 x3 x4 Mức sở 20 4,5 45 Khoảng biến thiên 10 0,5 Mức (+) 30 5,0 50 Mức (-) 10 4,0 40 (xj) Bố trí thí nghiệm theo cánh tay địn thực nghiệm là: N = 24 = 16 thí nghiệm thí nghiệm mức sở (tâm) lặp lại lần Vậy, số thí nghiệm tiến hành khảo sát 19 thí nghiệm (TN) Mỗi thí nghiệm khảo sát 100 ml dung dịch khảo sát thủy phân tối ưu nhờ Termamyl mục (4.9) Các lọ đựng dung dịch thủy phân điều chỉnh pH trước cho vào bể ổn nhiệt để giữ nhiệt độ cần khảo sát Tiến hành thí nghiệm: Theo ma trận quy hoạch thực nghiệm sau SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 70 Luận văn tốt nghiệp STT Bảng 4.12b: Ma trận TYT 24 x1 x2 x3 x4 x0 y TN1 + - - - - 218.088 TH2 + + - - - 222.522 TN3 + - + - - 208.456 TN4 + + + - - 247.156 TN5 + - - + - 232.297 TN6 + + - + - 215.151 TN7 + - + + - 234.145 TN8 + + + + - 233.152 TN9 + - - - + 249.245 TN10 + + - - + 221.708 TH11 + - + - + 241.516 TN12 + + + - + 234.245 TN13 + - - + + 261.504 TN14 + + - + + 186.064 TN15 + - + + + 191.647 TN16 + + + + + 194.111 Giá trị y hàm lượng glucose đo sau thủy phân, giá trị phản ánh tác động qua lại giữ yếu tố ngoại cảnh Thí nghiệm tâm (nồng độ enzyme cố định 20g; pH = 4,5; nhiệt độ 450C; thời gian giờ) lặp lại lần Kết sử lý số liệu tâm (y0) Bảng 4.12c : Các số liệu sử lý tâm STT TB u Y Y 285.290 Y u 1 261.749 261.861 TB  269 633 SVTH: PHẠM HÙNG ANH (Yu0  YTB0 ) (Yu0 YTB0 )2  (YU0  YTB0 ) u 1 -15.657 245.142 7.884 62.157 7.772 60.403 122.567 Trang 71 Luận văn tốt nghiệp Xác định phương sai tái hiện: N (Y Sth2  U 1 U  YtTB )  n 1 122.567  61.284 1 Với n = số thí nghiệm tâm S bj2  S th2 61 284   3,830 N 16  S bj  1,9 Các hệ số tuyến tính tính dựa vào cơng thức sau: N S jl   i 1 ( x j xl )i yi N Bảng 4.12d : Hệ số bj theo phương trình tuyến tính bj Hệ số bj Hệ số bj Hệ số b0 224.437 b1 -17.674 b2 b3 b4 -23.557 -5.929 -1.933 b34 b13 b14 b23 b24 -6.215 -8.299 -3.861 -5.741 -8.245 b124 31.074 b134 1.444 b234 b12 9.287 b123 2.470 b1234 -4.467 4.734 Ta có phương trình hồi quy: Y = 224.437- 17.674x1 - 23.557x2 – 5.929 x3 – 1.9335x4 + 9.287x12 –6.215x13 – 8.299x14 – 3.861x23 – 5.741x24 – 8.245x34 + 2.470x123 + 31.04x124 + 1.444x134 – 4.467x234 + 4.734x1234  Kiểm định ý nghĩa hệ số hồi quy theo chuẩn Student Với Sbj = 1,8 Theo công thức: t j  SVTH: PHẠM HÙNG ANH bj S bj ta tính giá trị sau Trang 72 Luận văn tốt nghiệp Bảng 4.13: Kết kiểm định Student STT bj Sbj tj 224.437 114.684 -17.674 -9.031 -23.557 -12.037 -5.929 -3.029 -1.933 -3.783 12 9.287 4.746 13 -6.215 -3.176 14 -8.299 23 -3.861 -1.973 24 -5.741 -2.934 34 -8.245 -4.213 123 2.470 1.262 124 31.074 15.878 134 1.444 0.738 234 -4.167 -2.293 1.9 1234 4.734 -4.241 2.420 Tra bảng tp(f) với p = 0,05, f = n – = – = Ta có: t0,05(3) = 3,18 Với giá trị tj < tp(f) bị loại khỏi phương trình tuyến tính Tra bảng tp(f) với p = 0,05, f = m-1 = 4-1 = ta có t0,05(3) = 3,18  Nhận xét: Ta thấy giá trị t3 < tp(f), loại khỏi phương trình hồi quy Cho nên yếu tố nhiệt độ thay đổi từ 45 – 500C tác động tới trình phản ứng khơng đáng kể Vậy, phương trình tuyến tính có dạng: yˆ = 224.437 – 17.674x1 – 23.557x2 – 5.929x3 + 9.287x12 –6.215x13 – 8.299x14 – 3.861x23 – 5.741x24 – 8.245x34 + 31.074x124 - 4.x234 – 41,713x134 – 153,797x234 + 64,569x1234 Từ mơ hình tốn học ta rằng: Muốn tăng hàm lượng glucose thời gian ngắn tăng nồng độ enzyme ngược lại enzyme có hạn (ít) ta tăng thời gian thủy phân Đặc biệt thủy phân yếu tố pH quan trọng, muốn hàm lượng glucose tăng lên pH tăng từ 4,5 tới Trong yếu tố nhiệt độ dao động từ 400C – 500C tác động đến thủy phân không đáng kể SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 73 Luận văn tốt nghiệp  Tối ưu hóa thực nghiệm theo phương pháp đường dốc nhất, điểm mức sở Gồm mức sở sau: x1 = 20 x2 = 4,5 x3 = 45 x4 = Chọn bước chuyển yếu tố x2 2 = 0,1 Các bước chuyển lại là: 1    b1x1  17.674 x10  1.501  0,1  23.557 x0.5 b2 x2 3  2  b3 x3  5.929 x5  0,1   0.252 b2  x  23 557 x 0.5 4  2  b4 x  1.933 x  0,1   0.033 b2 x  23 557 x 0.5 Tiến hành thí nghiệm: Nồng độ enzyme tăng từ 21.051% tới 27.051%; pH tăng từ 4,6 tới 5,0; nhiệt độ giữ 450C thời gian thủy phân từ 4,03 tới 4.15 Bảng 4.14: Thông số tối ưu Mức sở Hệ số bj Khoảng biến thiên xj bjxj X1 X2 X3 X4 y 20 4,5 45 4,0 - -5.929 -1.933 - 5,0 2,0 - -29.645 -3.886 - -17.674 -23.557 10 0,5 -176.74 -11.779 j 1,501 0,10 0,252 0,03 - Thí nhiệm tối ưu Nồng pH Nhiệt Thời Hàm lượng độ Ecđ độ gian glucose (%) ( 0C ) (giờ) (mg) 21.501 4,6 45.3 4.03 155.343 23.002 4,7 45.5 4.06 176.826 24.503 4,8 45.8 4.09 266.952 26.004 4,9 46 4.12 235.859 27.505 5,0 46.3 4.15 199.798 SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 74 Luận văn tốt nghiệp Nhận xét: Ta thấy với enzyme cố định có khả chịu pH cao, thí nghiệm điểm tối ưu thí nghiệm cho hàm lượng đường glucose 266.952 cao Vậy, điều kiện thủy phân tối ưu enzyme glucose amylase cố định với chất tinh bột khoai mì sau:  Nồng độ enzyme 24.503%  pH = 4.8  Nhiệt độ 450 C   Thời gian thủy phân 4.11 Sản phẩm đường glucose dạng rắn Sau tìm điều kiện thủy phân tối ưu ta áp dụng thủy phân tinh bột khoai mì tạo sản phẩm đường glucose theo sơ đồ hình 3.7 mục 3.4.8.4 Kết thu sau cho than hoạt tính vào dung dịch đường glucose nhằm loại bớt chất gây màu protein cho dung dịch qua cột trao đổi Cation Anion, mang dung dịch đông khô sản phẩm glucose dạng rắn  Kết định lượng glucose mẫu đường sau thủy phân Lấy 1g sản phẩm xác định hàm lượng glucose có mẫu Thấy mẫu sản phẩm chứa 89,20% glucose Nhận xét: Sản phẩm tạo thành chứa hàm lượng glucose cao, với loại đường sử dụng làm thực phẩm như: Bánh, kẹo, nước giải khát… SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 75 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Đã thu nhận enzyme glucoamylase từ việc nuôi cấy nấm mốc Asp.kawasaki môi trường bán rắn với tỷ lệ thành phần chất môi trường gồm: Cám gạo Bã khoai mì tỷ lệ 3:2 , có bổ sung khống tối ưu, bổ sung 8% mốc giống, độ ẩm môi trường 40%  Xác định hoạt tính hàm lượng enzyme thơ enzyme hòa tan  Đã tinh enzyme glucoamylase phương pháp sắc ký lọc gel Xác định hoạt tính hàm lượng enzyme sau tinh từ tính hiệu suất tinh enzyme  Đã cố định thành cơng 5g enzyme glucoamylse hịa tan gel natrialginate 3% Xác định hoạt tính, số lần tái sử dụng, hiệu suất cố định  Xác định ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh nhiệt độ, pH, độ bền nhiệt tới enzyme glucoamylse hòa tan enzyme glucoamylase cố định  Đã lấy dung dịch tinh bột khoai mì thực dịch hóa enzyme Termamyl thu độ Brix = 33 tối ưu, sau đường hóa glucoamylase cố định xác định điều kiện thủy phân tối ưu  Từ điều kiện tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột khoai mì ứng dụng tạo đường glucose với hàm lượng đạt 89,2% 5.2 Kiên nghị Nếu có đủ thời gian, thiết bị hóa chất đầy đủ em xin có vài kiến nghi sau:  Cố định enzyme glucoamylase số chất mang khác Chitosan kết hợp natrialginate với số chất mang cố định enzyme glucoamylase  Dùng glucoamylase cố định thử nghiệm thủy phân số tinh bột khác như: Tinh bột bắp (ngơ), tinh bột mì…  Tìm biện pháp nâng cao hiệu suất tinh tinh sản phẩm sau thủy phân tinh bột khoai mì SVTH: PHẠM HÙNG ANH Trang 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt [1] Ts.Hoàng Kim Anh-PGS.Ts.Ngô Kế Sương-Nguyễn Xích Liên (2000), tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn, nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật [2] Ts.Hoàng Kim Anh, Ts.Hoàng Nghóa Sơn-Ts.Lê Chiến Phương-Ks.Phan Văn Dân (2006), nghiên cứu tạo chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc a.kawasaki kiểm tra tính ổn định chế phẩm, Viện Sinh Học Nhiệt Đới [3] Nguyễn Cảnh (2004), quy hoạch thực nghiệm, nxb.Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Thị Ánh Hồng, hóa phân tích, , 2003, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh, trang 104 [5] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên)-Cao Cường-Nguyễn nh Tuyết-Lê Thị Thủy Tiên-Tạ Thu Hằng-Huỳnh Ngọc Oanh-Nguyễn Thúy Hương-Phan Thi Hiền (2004), công nghệ enzyme, nxb Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh [6] Nguyễn Văn Mùi (2001), thực hành hóa sinh học, nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội, trang 42-43,117-119 [7] TS Nguyễn Tiến Thắng, thực tập sinh học phân tử,Viện sinh học nhiệt đới, Tp.Hồ Chí Minh, trang [8] PGS.Ts.Nguyễn Phùng Tiến-GS.Ts.Bùi Minh Đức-GS.Ts Nguyễn Văn Dịp (2003), vi sinh vật thực phẩm, nxb Y Học, trang 31-35,360,361 [9] Võ Viết Phi (2006), luận văn tốt nghiệp thạc só, ĐHBK Tp.Hồ Chí Minh [10] PGS.Ts Bùi Huy Như Phúc (2005), giáo trình thực tập công nghệ enzymeprotein, đại học Bình Dương,trang 8-9 Tài Liệu Tiếng Anh [11] Ashok Pandey (1994) Solid State Fermentation Wiley Eastern Limited New Age International Publishers [12] Dr Ashok Pandey, Industrial Biotechnology and inductrial enzyme, p524 [13 Dr Ashok Pandey, P Selvakumar, Carlos R Soccol and Poonam Nigam, Solid state fermentation for the production of industrial enzymes PHỤ LỤC Phụ lục 1: phương pháp làm đệm acetat Lấy 11.35 ml CH3COOh đậm đặc định mức lên 1000ml với nước cất ,được dung dịch x Lấy 27,2g CH3COONa hòa tan 60ml nước cất sau định mức lên 1000ml, dung dịch y Giá trị Ph dung dịch đệm tính phụ thuộc xào x ml y ml cho vào định mức lên 100ml theo bảng sau: x y pH x y pH 46.3 3.7 3.6 25.5 24.5 46.6 44.0 6.0 3.8 20.0 30.0 4.8 41.0 9.0 4.0 14.8 35.2 5.0 36.8 13.2 4.2 10.5 39.5 5.2 30.5 19.5 4.4 8.8 41.2 5.4 4.8 45.2 5.6 Phụ lục 2: Phương pháp làm đệm phosphat Lấy 27.8g NaH2PO4 hòa tan vào nước cất định mức lên 1000ml, dung dịch a Lấy 71,7g NaH2PO4.12 H2O hòa tan vào nước định mức lên 1000ml, dung dịch b Dung dịch đậm có pH cần phụ thuộc vào lượng dung dịch a b định mức nước cất lên 200ml theo bảng sau: a b pH a b pH 93.5 6.5 5.6 45.0 55.0 6.9 92.0 8.0 5.8 39.0 61.0 7.0 90.0 10.0 5.9 33.0 67.0 7.1 87.7 12.3 6.0 28.0 72.0 7.2 85.0 15.0 6.1 23.0 77.0 7.3 81.5 18.5 6.2 19.0 81.0 7.4 77.5 22.6 6.3 16.0 84.0 7.5 73.5 26.5 6.4 13.0 87.0 7.6 68.5 32.5 6.5 10.5 89.5 7.7 62.5 37.5 6.6 8.5 91.5 7.8 56.5 43.5 6.7 7.0 93.0 7.9 51.0 49.0 6.8 5.3 94.7 8.0 Phụ luc 3: ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN Phụ luc 4: ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOAMYLASE Phụ lục 5: SẮC KÝ CHUẨN GLUCOAMYLASE ... amylase bao gồm: -amylase, -amylase, -amylase, dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-lucanhydrolase cuối oligodextrin-6-glucanhydrolase thủy phân liên kết oligodextrin ? ?-1 ,6 glucozit Trong... amylase gồm , ,  -amylasa 2.2.2.1 ? ?- amylase (endo-1,4-a-D-glucan glucohydrolaza ) Enzym -amylase enzyme ngoại bào tan tốt nước, phân cắt cách ngẫu nhiên liên kết -D-1,4-glucozit mạch tinh... (oc ) 3, 0-6 ,0 5 5-6 0 Tối ưu 4, 5-5 ,0 Mất hoạt tính 90 C Aspergillu sawamori 2, 0-7 ,0 Tối ưu 3, 0-5 ,0 Rhizopus niveus 3, 0-6 ,0 Tối ưu 3, 0-5 ,5 o 5 5-6 5 Mất hoạt tính 85 C 5 5-6 0 o Mất hoạt tính 7 0-8 0 C Đa