Các đặc tính trên của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA rất phù hợp cho các ứng dụng quan trọng trong Y sinh như việc sử dụng triblock copolymer phân hủy sinh học nhạy cảm nhiệt PCLA-PEG-
TỔNG QUAN
Tổng quát về hydrogel
Trong những thập niên qua, sự nghiên cứu trên hydrogel đã có những bước phát triển đáng kể do có nhiều nhà khoa học trong nhiều lĩnh vững khoa học khác nhau cùng tham nghiên cứu về hydrogel Hydrogel có nhiều ứng dụng phổ biến do nó thể hiện được tính chất trung gian giữa vật liệu rắn và vật liệu lỏng
Hydrogel với cấu trúc mạng lưới polymer 3 chiều ưa nước, với cấu trúc này làm cho hydrogel không hòa tan trong nước nhưng có thể trương tốt trong nước Do tính chất ưa nước của chuỗi polymer nên hydrogel có khả năng giữ lại một lượng lớn nước bên trong cấu trúc, cộng với tính chất bề mặt khá mềm dẻo đã tạo cho hydrogel có được tính tương thích sinh học cao Hydrogel còn là một loại vật liệu đa năng với các tính chất lý hóa, cơ học, sinh học của chúng có thể biến đổi dễ dàng bằng cách điều chỉnh quy trình, phương pháp tổng hợp hoặc các tác nhân kích thích của môi trường Điển hình như các loại hydrogel phản ứng lại với sự tác động kích thích bởi các tác nhân môi trường như: pH, nhiệt độ, điện trường, từ trường các đặc tính quan trọng đó đã làm cho hydrogel có khoảng ứng dụng rộng lớn từ dược phẩm, thiết bị y sinh cho đến các ứng dụng công nghiệp khác
Trong tất cả các ứng dụng của hydrogel, hệ thống vận chuyển và phân phối dược phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của hydrogel Hydrogel là chất nền có tính tương thích sinh học tốt đối với các protein, tế bào sống và các dịch trong cơ thể Hydrogel được ứng dụng trong y dược đầu tiên là hydrogel poly(2- hydroxyethyl methacrylate ) được phát minh bởi hai nhà khoa học Wichterle và Lim vào năm 1960 Đến nay, hydrogel đã và đang phát triển cho rất nhiều ứng dụng như y sinh, dược phẩm, hệ thống vận chuyển và phấn tán dược phẩm/ protein, các chất hoạt động sinh học
Hydrogel là vật liệu đa dạng về cấu trúc, tính chất nên việc phân loại chúng không thể dựa vào chỉ một tiêu chuẩn nhất định được Tiêu chuẩn để phân loại hydrogel phụ thuộc vào phương pháp tổng hợp và các tính chất hóa lý của chúng
Một số hydrogel được phân loại như bảng 1.1
Tổng hợp Hàm lượng nước/ độ trương Độ trương thấp Độ trương trung bình Độ trương cao Siêu hấp thụ
Microporous Macroporous Superporous Liên kết ngang Liên kết hóa học (cộng hóa trị)
Phân hủy sinh học Phân hủy sinh học
Không phân hủy sinh học
Hydrogel có thể được tổng hợp từ nguyên liệu tự nhiên và cả nguyên liệu tổng hợp Các polymer tự nhiên như protein, polysaccharide, axit deoxyribonucleic (DNAs) chúng có khả năng tạo liên kết ngang để hình thành dạng cấu trúc hydrogel
Tuy nhiên, khả năng tạo liên ngang của các polymer tự nhiên rất thấp và khó thực hiện, như quá trình polymer hóa của các amino axit, cacbohydrat và các axit nucleic Khác với polymer tự nhiên, polymer tổng hợp dễ dàng tạo liên kết ngang trong quá trình polymer hóa các monomer của chúng Các hydrogel được tổng hợp từ các monomer nên chúng có các tính chất đa dạng và có thể tiên đoán được tính chất của hydrogel tạo thành dựa vào tính chất của monomer ban đầu Cũng có thể kết hợp giữa hydrogel tự nhiên và hydrogel tổng hợp để tạo nên một hydrogel mới mang tính chất ưu điểm của hai hydrogel trên Như hydrogel tự nhiên có khả năng phân hủy sinh học tốt khi được kết hợp với hydrogel tổng hợp sẽ cho hydrogel mới vừa có khả năng phân hủy sinh học vừa có khả năng tạo liên kết ngang dễ dàng
Dựa vào loại liên kết ngang, hydrogel được chia làm hai loại : Hydrogel vật lý và hydrogel hóa học Khi các chuỗi polymer của hydrogel liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị thì hydrogel đó được gọi là gel hóa học vì các chuỗi polymer đang liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị và chúng không thể trở lại hình dạng như ban đầu được Và cũng vì thế mà hydrogel hóa học hay hydrogel liên kết hóa học còn được gọi là hydrogel nhiệt rắn Gel vật lý được xem như là sự liên tục, không trật tự và gel tạo thành một mạng lưới không gian ba chiều dưới tác dụng của các lực liên kết khác liên kết cộng hóa trị như liên kết hydro, tương tác kỵ nước, ion complex… Sự kết hợp của các lực liên liên kết trên tạo ra vùng liên kết giữu các chuỗi polymer không giống liên kết điểm của liên kết cộng hóa trị Các liên kết này mang tính chất thuận nghịch do đó hydrogel vật lý tạo thành bằng các liên kết này cũng mang tính thuận nghịch, nghĩa là hydrogel có thể hòa tan hoặc chảy lỏng trở lại khi làm lạnh hay khi gia nhiệt do đó hydrogel vật lý còn được gọi là hydrogel nhiệt dẻo
Hydrogel có chứa các lổ trống trong cấu trúc mạng thì có khả năng trương cao hơn và nhanh hơn không có lổ trống Lổ trống trong cấu trúc mạng hydrogel có thể tạo ra bằng nhiều phương pháp như : Kỹ thuật porosigen, tách pha, tạo liên kết giữu các hạt hydrogel riêng lẻ, thổi khí hay tạo bọt Tùy thuộc vào kích thước lổ trống, hydrogel được chia thành microporous (10 – 100nm), macroporous (100nm – 10àm), và superporous (10 – 100àm)
Khả năng trương của hydrogel trong dung dịch nước là một đặc tính quan trọng cho các ứng dụng của hydrogel Độ trương được xác định thông qua khả năng hấp thụ nước của hydrogel hoặc dung dịch nước của chúng Cách đơn giản để xác định động học trương và điểm trương cân bằng là đo khối lượng của hydrogel đã trương Tỷ lệ trương (Rs) là thông số thường dùng để chỉ khả năng trương của hydrogel, Rs được xác định theo công thức
Rs = (Ws – Wd)/Wd Trong đó : Ws và Wd là khối lượng hydrogel đã trương và hydrogel sau khi sấy khô
Tính trương của hydrogel phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại và thành phần monomer, mật độ liên kết ngang, các tác nhân môi trường như nhiệt độ, pH, lực ion Mật độ liên kết ngang của hydrogel có quan hệ chặt chẽ với các tính chất khác của hydrogel như độ bền cơ, khả năng thấm ướt của hydrogel Và cơ tính của hydrogel cơ bản nó cũng phụ thuộc vào thành phần và cấu trúc của monomer Do đó, hydrogel trương nở chứa hàm lượng nước cao thì cơ tính của nó sẽ yếu, nhưng khi ta làm tăng độ bền cơ của hydrogel lên bằng cách tạo nhiều liên kết ngang trong mạch hoặc đồng trùng hợp với các comonomer kỵ nước, với cách này thì nó sẽ làm giảm khả năng trương của hydrogel
Hydrogel phân hủy sinh học thường xảy chậm và dần dần bị loại khỏi cơ thể sống là loại vật liệu đang được đặc biệt chú trọng cho ứng dụng làm hệ thống vận chuyển và phân tán dược phẩm/protein Cơ chế phân hủy được sử dụng để kiểm soát quá trình phân tán thuốc từ hydrogel mang thuốc Sự phân hủy sinh học xảy ra thông qua quá trình thủy phân cơ bản hoặc thủy phân với xúc tác enzym Các polymer phân hủy sinh học như: polylactic (PLA), polyglycol (PGA), poly ε-caprolacton (PCL),… chúng đang mở ra nhiều hướng ứng dụng mới như kỹ thuật nuôi cấy mô, thay thế khớp xương, chất nền trong hệ vận chuyển thuốc
Thông thường thì các polymer phân hủy sinh học nó có tính kỵ nước, không hòa tan trong dung dịch nước, nên chúng không thể trực tiếp tạo nên cấu trúc hydrogel được Tuy nhiên, với sự phát triển công nghệ tổng hợp hydrogel, có thể kết hợp polymer kỵ nước với polymer ưa nước để tạo ra hydrogel phân hủy sinh học lại có khả năng trương tốt trong môi trường nước
1.1.3 Phương pháp tổng hợp hydrogel [8]
Hình 1.1 Các phương pháp tổng hợp hydrogel
Có nhiều phương pháp để tổng hợp hydrogel, thông thường để tổng hợp hydrogel hóa học có 2 phương pháp như chỉ ra ở hình 1.1
Hydrogel hóa học được tổng hợp bằng phản ứng polymer hóa tạo liên kết ngang từ dung dịch monome với sự có mặt của các tác nhân tạo liên kết ngang Các nhóm chức tạo liên kết ngang như vinyl, hydroxyl , amine và carboxyl
Hydrogel vật lý được tạo nên bằng cách tạo liên kết vật lý giữa các monome nhưng không xảy ra phản ứng hóa học Các liên kết vật lý tạo thành thông các tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể và liên kết siêu phân tử
1.1.4 Hydrogel nhạy cảm môi trường [1, 8]
Hydrogel được tạo ra với các tính chất phản ứng lại các thay đổi của môi trường như Nhiệt độ, pH, ánh sáng, các phân tử đặc biệt như gluco Như vậy hydrogel phải trải qua quá trình chuyển pha thuận nghịch hoặc quá trình chuyển pha sol -gel dưới sự thay đổi nhỏ của điều kiện môi trường Với tính chất này nên hydrogel được gọi là hydrogel nhạy cảm môi trường hay hydrogel thông minh
Hình 1.2 Mô hình phân tán thuốc từ hydrogel nhạy cảm nhiệt độ và pH
Copolymer hydrogel nhạy cảm nhiệt độ PCLA-PEG-PCLA
Các nghiên cứu về hydrogel copolymer trong hơn 25 năm đã dẫn đến sự ra đời của nhiều loại hydrogel có tính chất ưu việt, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược như sản xuất thuốc, cấy ghép dưới da, nuôi cấy mô và trong các thiết bị y học.
Hydrogel nhạy cảm nhiệt độ chúng có khả năng tương thích với dược phẩm và dung dịch nước của hydrogel nhạy cảm nhiệt độ có khả năng chuyển từ trạng thái sol sang trạng thái gel phụ thuộc vào sự thay đổi của nhiệt độ Do đó chúng có thể tạo ra được dạng gel liên kết chặt chẽ với dược phẩm và quá tình phân tán dược phẩm được kiểm soát dễ dàng
PCLA-PEG-PCLA là một triblock copolymer hydrogel phân hủy sinh học nhạy cảm với nhiệt độ Nó được tổng hợp từ poly(ethylene glycol) (PEG) và ε- caprolactone (CL) với D,L lactide Cấu trúc phân tử của hydrogel này được thể hiện trong Hình 1.14.
Hình 1.14 : Công thức phân tử của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA là một trong những hydrogel nhạy cảm nhiệt độ đặc trưng, chúng chứa các block ưa nước (PEG) ở trung tâm (core) và các block kỵ nước (PCLA) ở phần cuối của chuỗi polymer Những block kỵ nước (PCLA) này đóng vai trò như một phần nhạy cảm nhiệt và phân hủy sinh học, tính kỵ nước của chúng tỷ lệ thuận với độ tăng nhiệt độ Do đó, trạng thái chuyển pha sol-gel của dung dịch nước của hydrogel này phụ thuộc vào vào sự thay đổi nhiệt độ Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA này có khả năng tạo liên kết chặt chẽ với dược phẩm/protein và có khả năng ứng dụng như là một hệ thống vận chuyển- phân phối dược phẩm dưới dạng tiêm dưới da
Polyme có khối lượng phân tử cao thường là sản phẩm của phản ứng polymer hóa mở vòng của các monome tuần hoàn Phản ứng xảy ra ở trạng thái polyme nóng chảy, dung dịch hoặc dạng nhủ tương Xúc tác cho phản ứng polyme hóa mở vòng là các axit, muối của kim loại như thiếc, kẽm, nhôm, sắt các chất xúc tác thường được sử dụng cho phản ứng polyme hóa mở vòng loại này như : Stannous octoate, Stannous chloride, iron oxide, Aluminum triisopropoxide, CaH 2 , Zn, Lithium chloride, tris(2,6-di-tert-butylphenolate) Đối với các polyme được ứng dụng trong y dược thì 2 loại xúc tác được phép sử dụng là 2 muối của thiếc Stannous (II) chloride và stannous (II) 2-ethylhexan octoate Ngoài ra 2 loại muối này cũng được ứng dụng trong thực phẩm Stannous (II) 2-ethylhexan octoate là chất xúc tác có hiệu quả cao cho phản ứng polyme hóa lactic Để kiểm soát tốc độ phản ứng cũng như khối lượng phân tử trong bình của polymer thu được, thông thường người ta sử dụng các hợp chất có chứa gốc hydroxyl tự do Nước, acid hydroxy hoặc ester và các alcohol khác nhau đã được sử dụng trong loại phản ứng này
Cơ chế phản ứng polymer hóa mở vòng lactic với xúc tác stannous octoate xảy ra như hình 1.15 dưới
Hình 1.15 : Cơ chế phản ứng polymer hóa mở vòng lactic
Copolymer PCLA-PEG-PCLA là một triblock copolymer hydrogel phân hủy sinh học nhạy cảm với nhiệt độ, được tổng hợp từ poly(ethylene glycol) (PEG) và ε-caprolactone (CL) với D,L lactide Copolymer này được tổng hợp bằng phản ứng polymer hóa mở vòng lactic và Caprolactone ở nhiệt độ trong khoảng 130 0 C - 150 0 C và trong khoảng thời gian từ 12 - 48 giờ, với xúc tác stannous octoate
Triblock copolymer này được tạo nên bởi block ưa nước PEG và block kỵ nước PCLA
PEG là hợp chất được sử dụng phổ biến trong y học do tính không độc hại và ưa nước Cấu trúc cơ bản của PEG gồm các đơn vị etylen oxit (-CH2-CH2-O-) liên kết với nhóm -OH hoặc -CH3 ở hai đầu mạch.
Hình 1.16 : Công thức phân tử của PEG Trong đó, R là H hoặc nhóm alkyl chứa từ 1-5C và n = 11-45
Khối lượng phân tử trung bình của PEG thường được sử dụng để tổng hợp các polymer y sinh nằm trong khoảng 1000 - 5000 để polymer thu được có các đặc tính pha như mong muốn Khi khối lượng trung bình của PEG nhỏ hơn 1000 hoặc lớn hơn 5000 thì copolymer thu được không có các đặc tính chuyển pha sol - gel như mong muốn, hoặc có sự chuyển pha sol - gel nhưng độ bền của trạng thái gel rất yếu Do đó, không thể áp dụng làm vật liệu nền cho hệ phân phối thuốc được
Thành phần phân hủy sinh học của triblock copolymer này thường là các polyester béo, và sự có mặt của các polyester này chúng làm ảnh hưởng hay quyết định đến đặc tính nhạy cảm nhiệt của của triblock copolymer Các polyester thường dùng như: polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), polycaprolactone (PCL), copolymer random của poly( caprolactone-lactide) (PCLA), copolymer random của poly(caprolactone-glycolide) (PCGA), copolymer random của poly(lactide- glycolide) (PLGA) Để có các đặc tính ưu việt ứng dụng cho hệ thống phân phối thuốc, thì tỷ lệ các thành phần trong triblock copolymer đóng vai trò rất quan trọng để đạt được đặc tính đó thì tỷ lệ ưa nước/ kỵ nước (PEG/PCLA) trong copolymer thường nằm trong khoảng 1.1 - 1.3 (tỷ lệ khối lượng) khi tỷ lệ này nhỏ hơn 1.1 thì trạng thái gel không thể hình thành hoặc khi tỷ lệ này lớn hơn 1.3 thì thành phần kỵ nước tăng lên quá cao và do đó copolymer tạo thành không thể hòa tan hay trương nở trong môi trường nước được
Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA được tổng hợp theo sơ đồ phản ứng dưới đây
Hình 1.17 : Sơ đồ phản ứng tổng hợp Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA
1.2.3.1 Tính chất nhạy cảm nhiệt độ
Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA là một hydrogel đặc biệt, hydrogel phân hủy sinh học nhạy cảm với nhiệt độ do phân tử polymer được tạo thành từ hai thành phần chính: Block của polymer kỵ nước (PCLA ) có tính chất nhạy cảm nhiệt độ ( khi nhiệt độ tăng lên thì nó chuyển sang ưa nước) và phân hủy sinh học kết hợp với block của polymer có tính ưa nước (PEG) Do đó, Triblock copolymer PCLA- PEG-PCLA vừa thể hiện khả năng trương nở tốt trong dung dịch nước do chứa block ưa nước PEG, khả năng trương nở này lại thay đổi theo nhiệt độ môi trường do chúng chứa block nhạy cảm nhiệt độ PCLA trong cấu trúc phân tử Đồng thời, block kỵ nước PCLA này chúng là cho hydrogel còn thể hiện tốt khả năng phân hủy sinh học Đặc tính trương nở của Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA thể hiện rõ ràng nhất qua trạng thái pha của hydrogel này Do triblock copolymer PCLA-PEG- PCLA có cấu trúc mạng lưới ba chiều và là chất nền ưa nước nên chúng có thể hấp thụ một lượng lớn nước trong khi chúng vẫn không hoà tan được trong dung dịch nước Những cấu trúc kỵ nước tham gia tạo liên kết trong cấu trúc phân tử polymer làm cho dung dịch nước của hydrogel thể hiện khả năng chuyển pha giữa sol-gel theo sự thay đổi của nhiệt độ và có thể kiểm soát dễ dàng bằng hai phương pháp in vitro và in vivo
Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA có cấu trúc dạng micell với phần lõi ưa nước và phần vỏ kỵ nước Phần kỵ nước đóng vai trò cảm biến nhiệt, chúng trở nên kỵ nước hơn khi nhiệt độ tăng, dẫn đến sự thay đổi độ tan của triblock copolymer phụ thuộc vào nhiệt độ.
Cơ chế của sự chuyển pha sol-gel của copolymer này được chỉ ra ở hình 1.18
Hình 1.18 : Sự chuyển pha sol-gel của copolymer hydrogel nhạy cảm nhiệt
PCLA - PEG - PCLA PCLA - PEG - PCLA Ở nhiệt độ thấp, PCLA đóng vai trò như một block kỵ nước yếu nên nó làm tăng khả năng hoà tan (solubility) của copolymer Do đó, tất cả các phân tử copolymer được hoà tan trong dung dịch nước, còn các phân tử tạo thành cấu trúc micell với block kỵ nước của PCLA ở trong nhân (core) còn các phân tử ưa nước của PEG nằm ở lớp cấu trúc bên ngoài (shell) Kết quả dung dịch copolymer ở trạng thái sol Khi nhiệt độ tăng lên, các phân tử kỵ nước của PCLA tạo thành nhiều hơn để chống lại với sự thay đổi nhiệt độ của block này Vì thế, hầu hết các phân tử của copolymer tạo thành cấu trúc micell Tại nơi tập trung cao của dung dịch copolymer, có nhiều cầu nối giữa các micell được hình thành do các tương tác kỵ nước giữa các block PCLA Cấu trúc này hấp thụ một lượng lớn nước và nó thể hiện cả hai hình thái ưa rắn và ưa lỏng (liquid-like-solid-like) Kết quả là dung dịch nước của copolymer chuyển từ trạng thái sol sang trạng thái gel Tuy nhiên, PCLA trở nên quá kỵ nước khi nhiệt độ tăng lên ở mức cao, nó làm cho khả năng hoà tan của copolymer này giảm xuống Hơn nữa, tương tác kỵ nước làm tăng cầu nối micell lên quá lớn làm cho cấu trúc gel bị tập trung lại và làm cho copolymer này chuyển sang trạng thái lắng đọng (kết tủa) Nhiệt độ lúc dung dịch copolymer chuyển từ trạng thái sol sang trạng thái gel gọi là nhiệt độ dung dịch tới hạn dưới (LCST) và nhiệt độ dung dịch tới hạn trên (UCST) là nhiệt độ khi dung dịch copolymer chuyển pha ngược lại
Giản đồ pha điển hình của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA trong dung dịch nước thể hiện như hình 1.19
Hình 1.19: Giản đồ pha của polymer hydrogel phân hủy sinh học nhạy cảm nhiệt độ
Vùng gel trên giản đồ pha này có thể được điều khiển bằng cách thay đổi khối lượng phân tử của PEG, tỷ lệ khối lượng PCLA/PEG và nồng độ dung dịch copolymer
1.2.3.2 Tính chất phân hủy sinh học
Triblock copolymer hydrogel PCLA-PEG-PCLA được tạo nên từ hai thành phần, block ưa nước PEG và block kỵ nước PCLA, và block kỵ nước PCLA là một copolymer của các polyester poly(D,L-Lactide) và poly(ε-caprolactone) chúng quyết định tính chất phân hủy sinh học của triblock
Poly(D,L-Lactide) và poly(ε-caprolactone) thuộc polyester béo là loại polymer có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học tốt Trong môi trường của cơ thể sống các polymer có thể phân hủy thành CO2 và H2O, từ các chuỗi polymer dễ dàng bị phân hủy, bị cắt mạch bởi enzym, thủy phân hoặc các tác nhân khác trong cơ thể con người Trong điều kiện môi trường pH=7.4 và nhiệt độ 37 0 C thì PLA có khả năng phân hủy nhanh hơn PCL, và copolymer của PLA và PCL có thể phân hủy hoàn toàn trong 14 tuần khi tỷ lệ LA/CL là 50:50 Khả năng phân hủy sinh học của triblock PCLA-PEG-PCLA phụ thuộc rất lớn vào các thành phần có mặt trong cấu trúc phân tử, tỷ lệ giữa các thành phần, khi tỷ lệ PCLA/PEG càng cao thì khả năng phân hủy sinh học càng lớn và tốc độ phân hủy của triblock này lại phụ thuộc vào tỷ lệ PLA/PCL Đặc biệt là khả năng phân hủy của triblock này có thể kiểm soát được thông qua các tỷ lệ của các thành phần trong cấu trúc
Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới
Polymer sinh học được sử dụng khá nhiều trong y dược, như dùng để chuẩn đoán và trị bệnh hoặc dùng thay thế một số bộ phận cơ thể Hiện nay, hệ phân phối thuốc được kiểm soát dựa vào quá trình chuyển pha sol-gel của vật liệu mang bằng cách thay đổi cấu trúc của hệ như sử dụng polymer phân hủy sinh học, polymer vừa có tính ưa nước vừa mang tính kỵ nước hoặc polymer có cấu trúc hydrogel, cấu trúc này cho phép polymer trương tốt trong nước nhưng lại không hòa tan trong nước
Hydrogel đã và đang được chú trong nghiên cứu phát triển trong những năm gần đây
US pat No 6,004,573 Đã đưa ra một triblock copolymer có khối lượng phân tử thấp, có khả năng phân hủy sinh học Copolymer này được cấu trúc bởi 2 phần, phần kỵ nước là copolymer của PLA và PGA và phần ưa nước là PEG Đặc tính trạng thái pha của copolymer này phụ thuộc vào tỷ lệ thành phần kỵ nước/ ưa nước trong cấu trúc Trong điều kiện nhiệt độ từ 5 0 C - 25 0 C thì thành phần kỵ nước tăng lên và chiếm ưu thế lúc này copolymer này tồn tại ở trạng thái dung dịch (sol) trong suốt Sau đó copolymer sẽ tự động chuyển sang trạng thái gel, có cấu trúc hydrogel ngậm nước khi copolymer được đưa vào cơ thể ứng với nhiệt độ 37 0 C, và chúng giữ ở trang thái gel trong suốt thời gian tồn tại trong cơ thể Với đặc tính đó thì copolymer này đã được sử dụng làm hệ phân phối thuốc ở dạng thuốc nhả chậm
US Pat No 2008/027 4190A1 Báo cáo block copolymer nhạy cảm nhiệt độ và pH Đây là một polymer ưa nước phân hủy sinh học có cấu trúc dạng micell Tâm (Core) của micell là block ưa nước PEG và shell là block kỵ nước là copolymer của PCL và PLA Hai block này tạo thành triblock nhạy cảm nhiệt độ PCLA-PEG-PCLA Kết hợp với thành phần nhạy cảm pH của copolymer này được tạo nên từ oligome của PU, để tạo nên pentablock copolymer PU-PCLA-PEG-PCLA-PU vừa nhạy cảm nhiệt độ và pH ở điều kiện nhiệt độ 37 0 C, nhiệt độ cơ thể sống và pH 7.0 - 7.4 thì copolymer này tồn tại ở trạng thái gel, ngoài điều kiện trên thì copolymer này tồn tại ở trạng thái (sol) dung dịch Do đó, copolymer này được sử dụng trong hệ phân phối thuốc dưới dạng tiêm vào cơ thể Hỗn hợp thuốc phân tán trong chất nền là copolymer PU-PCLA-PEG-PCLA-PU được tiêm vào cơ thể ở nhiệt thấp (< 37 0 C và pH < 7.0), tức dung dịch copolymer này được tiêm ở trạng thái lỏng (sol) Khi được tiêm vào cơ thể, trong điều kiện nhiệt độ 37 0 C và pH = 7.4 thì dung dịch copolymer này chuyển sang trạng thái gel, không hòa tan, đồng thời bị phân hủy sinh học chậm theo thời gian để thực hiện quá trình nhả thuốc.
NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
Về mặt hòa tan, Poly(ethylene glycol) (PEG) có đặc tính ưa nước, giúp chúng tan dễ dàng trong môi trường nước Ngoài ra, PEG còn có khả năng hòa tan trong một số dung môi hữu cơ khác, bao gồm metylen clorua, etanol, toluen và axeton.
PEG có khối lượng phân tử từ 1500 đến 2000 thì ở dạng rắn màu trắng
Nhiệt độ chảy : > 67 0 C phụ thuộc vào khối lượng phân tử PEG gồm các loại sau: M = 1500, 2000, 1750 của hãng Sigma-Aldrich Co
Poly(ethylene glycol) (PEG) được kết tinh lại trong n-hexane và sấy khô chân không trong 3 ngày trước khi dùng
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử của ε-caprolactone (CL) ε-caprolactone ở điều kiện thường là chất lỏng không màu, có thể trộn lẫn với hầu hết các dung môi hữu cơ
Nhiệt độ chảy : -1 0 C Nhiệt độ sôi : 253 0 C Khối lượng riêng : 1.030g/cm 3 ε-caprolactone (CL) của hãng Sigma-Aldrich Co
Hình 2.3: Cấu trúc phân tử của D,L-lactide (LA)
D,L-lactide (LA) là chất rắn tinh thể màu trắng Công thức phân tử : C6H8O4
Nhiệt độ chảy : 96,5 0 C - 99,5 0 C D,L-lactic (LA) của hãng Polyscience Biohringer Ingellheim
Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của Stannous Octoate [Sn(Oct)2]
Công thức phân tử :[CH3(CH2)3CH(C2H5)COO]2Sn Chất lỏng màu vàng nhạt
Nhiệt độ sôi : 202 0 C Khối lượng riêng : 1.25g/cm 3
Stannous Octoate [Sn(Oct)2] của hãng Sigma chemical Co
2.1.1.5 Các dung môi và hóa chất khác
Chloroform Diethyl ether Các hóa chất cần thiết khác
- Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100ml - Van khóa 3 chiều
- Tủ sấy chân không - Máy khuấy từ
- Bộ thiết bị phản ứng gồm: Bể điều nhiệt gia nhiệt bằng dầu silicon, Máy khuấy từ
- Thiết bị chứa khí Nitơ
Hình 2.5 Bộ thiết bị phản ứng
Qui trình thực nghiệm
Kết tinh lại bằng Diethyl ether Làm lạnh đến Nhiệt độ phòng
2.2.2 Diễn giải quy trình tổng hợp
Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA được tổng hợp bằng cách polymer hóa mở vòng D,L-lactide (LA) Phản ứng này xảy ra ở khoảng nhiệt độ từ 130 0 c đến 150 0 C trong 12 đến 24 giờ Bắt đầu bằng nhóm OH ở cuối phân tử PEG với xúc tác thiếc octoate (Sn(Oct)2) [1,14-16] Tổng hợp triblock copolymer này chúng tôi sử dụng các loại PEG có khối lượng phân tử khác nhau, cụ thể là: PEG có M00, 1750 và 2000 Thành phần và khối lượng phân tử của triblock copolymer kiểm soát sự cân bằng giữa tỷ lệ kỵ nước/ưa nước của PCLA/PEG và tỷ lệ mol CL/LA Quy trình tổng hợp triblock copolymer có thể được tiến hành như sau: Cho PEG và stannous octoate cho vào một bình cầu 2 cổ và sấy trong môi trường chân không ở 110 0 C trong 2 giờ Sau đó làm lạnh đến 60 0 C Thêm CL và LA vào, CL, LA đã được sấy khô trong môi trường khí Nitơ và tỷ lệ mol CL/LA được giữ cố định ở tỷ lệ 2.0:1 Hỗn hợp phản ứng được sấy trong môi trường chân không ở 60 0 C trong vòng 1 giờ và sau đó tăng nhiệt độ lên từ từ tới 130 0 C Phản ứng mở vòng được thực hiện trong 18 giờ Sản phẩm phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng trước khi hòa tan trong dung dịch chloroform Và sau đó dung dịch được kết tủa lại bằng diethyl ether dư Sản phẩm kết tủa lại được sấy chân không ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ
Khối lượng các chất phản ứng của 8 mẫu xem phụ lục 1 trang 66
Phản ứng tổng hợp triblock copolymer như sau :
Hình 2.6 Phản ứng tổng hợp triblock copolymer
Phương pháp đánh giá thực nghiệm
Phổ 1H-NMR được đo trên máy Varian-Unity Inova 500NB ở tần số 500MHz để xác định cấu trúc và thành phần của block copolymer Dung môi sử dụng là CDCl3 chứa 0,03% (v/v) Tetramethylsilane (TMS) Hàm lượng của mỗi block được tính dựa trên tổng hợp các đỉnh proton đặc trưng của PEG, LA và CL thu được từ phổ 1H-NMR.
Xác định khối lượng phân tử và sự phân bố khối lượng phân tử của copolymer bằng phương pháp sắc ký thấm gel (Gel Permeation Chromatography) bằng máy Waters Model 410 với 2 thỏp Styregel 4àm nối trực tiếp với nhau 500 đến 10Å
Tetrahydrofuran được dùng làm dung môi rửa giải hấp với tốc độ chảy là 1ml/phút
Sử dụng poly(ethylene glycol) để hiệu chỉnh máy, khoảng đo của máy có khối lượng phân tử từ 420 đến 22100 Với một chỉ số khúc xạ của detector (shodex, RI- 101) Mỗi phép đo kéo dài trong vòng 45 phút
2.3.3 Khảo sát quá trình chuyển pha sol-gel của triblock copolymer
Trạng thái chuyển pha sol (chảy)-gel (không chảy) của triblock copolymer trong môi trường nước được xác định bằng phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Inverting test method) sử dụng ống nghiệm loại 4ml, đường kính ống 10mm Block copolymer được hòa tan trong dung dịch đệm PBS với một nồng độ cho trước ở 1 0 C và pH của mẫu được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH (5M) Dung dịch sau khi hòa tan hoàn toàn được giữ ổn định ở 0 0 C trong vòng 1-2 ngày trước khi đem khảo sát Sự chuyển pha sol-gel ở mỗi nhiệt độ được xác định bằng góc ngang của ống nghiệm sau khi giữ nó ở một nhiệt độ không đổi trong vòng 10 phút
Hình 2.7 Trạng thái chuyển pha sol -gel của triblock copolymer
2.3.4 Khảo sát khả năng phân hủy sinh học theo in Vitro (trong điều kiện phòng thí nghiệm)
Quá trình phân hủy sinh học của copolime khối ba trạng thái gel được xác định bằng cách theo dõi sự thay đổi khối lượng phân tử theo thời gian Quy trình phân hủy gel trong ống nghiệm bao gồm 0,5 mg dung dịch copolime (nồng độ 25% ở pH = 7,4) vào ống nghiệm 4 ml Sau khi đặt ống nghiệm trong bể điều nhiệt ở 37 độ C đến khi dung dịch chuyển sang trạng thái gel, tiếp tục thêm 3 ml dung dịch đệm PBS (PBS có nhiệt độ 37oC, pH = 7,4) vào ống nghiệm và giữ nguyên trong bể điều nhiệt Sau x ngày, lấy ống nghiệm ra khỏi bể điều nhiệt, sấy thăng hoa để thu được mẫu gel trắng, sau đó đo GPC để xác định khối lượng phân tử.
Quy trình thử in vitro
Hình 2.8 Mô phỏng quy trình thử In Vitro
2.3.5 Khảo sát khả năng phân hủy sinh học theo in vivo ( trong cơ thể sống)
Sự phân hủy in vivo của gel được tiến hành trên chuột bạch cái (SD), loại có trọng lượng từ 25g-30g Sử dụng 200àl dung dịch copolyme 30 wt% ở pH=7.4 và nhiệt độ 10 0 C được tiêm vào dưới da ở vùng lưng của chuột SD sau 1 thời gian x tuần mổ vùng lưng của chuột (vị trí tiêm) ra để kiểm tra kích thước của gel Căn cứ vào kích thước gel để đánh giá khả năng phân hủy của triblock
Quy trình thử in vivo trên chuột
Hình 2.9 Mô phỏng quy trình thử In Vivo
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đặc điểm cấu trúc của copolymer hydrogel PCLA-PEG-PCLA
Copolyme Triblock PCLA-PEG-PCLA được tổng hợp thông qua phản ứng polyme hóa mở vòng lactide và ε-caprolactone, trong đó PEG đóng vai trò dẫn đầu phản ứng với sự xúc tác của stannous octoate (Sn(Oct)2) Các đặc tính về cấu trúc, khối lượng phân tử trung bình và phân bố khối lượng phân tử của copolyme triblock được xác định bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và sắc ký thấm gel (GPC) Khối lượng phân tử trung bình của copolyme được tính toán dựa trên phổ 1H-NMR và khối lượng phân tử trung bình已知 của PEG.
3.1.1 Kết quả phân tích GPC
Khối lượng phân tử trung bình và sự phân tán khối lượng phân tử của triblovk copolymer PCLA-PEG-PCLA được xác định bằng Phương pháp sắc ký gel (Gel Permeation Chromatography) trờn mỏy Waters Model 410 với 2 thỏp Styregel 4àm nối trực tiếp với nhau 500 đến 10Å Tetrahydrofuran được dùng làm dung môi rửa giải hấp với tốc độ chảy là 1ml/phút Sử dụng polyethylene glycol) để hiệu chỉnh máy, khoảng đo của máy có khối lượng phân tử từ 420 đến 22100 Mỗi phép đo kéo dài trong vòng 45 phút Kết quả các phổ GPC được chỉ ra ở các hình sau
Hình 3.1 : Phổ GPC của PEG có M 00
Hình 3.2 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với PEG 2000
Phổ GPC của tất cả các mẫu triblock copolymer đều cho thấy chỉ xuất hiện một peak có chân rộng đặc trưng và là peak duy nhất Ở hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy phổ GPC của poly (ethylen glycol) (PEG) có khối lượng phân tử bằng 2000 và phổ GPC của triblock PCLA-PEG-PCLA của M PEG = 2000 Peak của triblock xuất hiện ở thời gian tách t 20,416 phút và peak của PEG xuất hiện ở t = 22,700 phút, chứng tỏ khối lượng phân tử của triblock PCLA-PEG-PCLA cao hơn khối lượng phân tử của PEG phù hợp với lý thuyết Điều này cùng có nghĩa là triblock PCLA-PEG-PCLA đã được tổng hợp thành công
Ngoài ra, độ phân tán khối lượng phân tử của các mẫu nằm trong khoảng 1.199 đến 1.300 cho thấy triblock PCLA-PEG-PCLA tổng hợp được có độ tinh khiết tương đối cao
Hình 3.3 cho thấy các đường cong xuất hiện trong phổ là duy nhất Đồng thời đường cong phổ GPC của triblock PCLA-PEG-PCLA dịch sang trái so với đường cong phổ GPC của PEG2000 và có diện tích peak cũng lớn hơn Các điều này cũng chứng tỏ tricblock PCLA-PEG-PCLA đã được tổng hợp thành công
Hình 3.3 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA và PEG 2000
Hình 3.4 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với PEG 1500
Hình 3.5 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với PEG 1750
Hình 3.6 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với PEG 2000 Các phổ GPC của triblock copolyme được chỉ ra ở hình 3.4 đến hình 3.6 cho thấy, Khi khối lượng phân tử của PEG trong cấu trúc triblock tăng lên từ 1500 - 2000 thì peak của triblock có xu hướng dịch chuyển về phía có thời thời gian giải hấp nhỏ dần Cụ thể, peak của triblock với PEG có M PEG 00 xuất hiện ở thời gian giải hấp t = 20,866 phút, M PEG = 1750 ứng với t = 20,433 phút và M PEG = 2000 ứng với t = 20,416 phút Xu hướng này càng dễ thấy hơn khi ghép các đường cong GPC của các mẫu lên cùng một đồ thị như hình 3.7 ở dưới
Hình 3.7 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với M PEG khác nhau
Khi tăng tỷ lệ kỵ nước/ưa nước (PCLA/PEG) trong cấu trúc của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA thì khối lượng phân tử của triblock cũng tăng lên theo, và các peak trên phổ GPC cũng có xu hướng dịch sang trái như chỉ ra ở các hình từ 3.8 đến 3.10 Phổ GPC của các triblock PCLA-PEG-PCLA của PEG 1750 ứng với các tỷ lệ PCLA/PEG từ 1.9 đến 2.4
Hình 3.8 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLE với PCLA/PEG = 1.9
Hình 3.9 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLE với PCLA/PEG = 2.4 Khi tỷ lệ PCLA/PEG tăng từ 1.9 lên 2.4 thì thời gian giải hấp giảm tương ứng từ 20,650 phút xuống 20,433 phút
Hình 3.10 Phổ GPC của Triblock PCLA-PEG-PCLA với PCLA/PEG khác nhau
Từ kết quả phân tích GPC có thể định tính được rằng sản phẩm thu được có cấu trúc tương đồng với cấu trúc của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA và sản phẩm có độ tinh khiết tườn đối cao
3.1.2 Kết quả phân tích 1H-NMR
Phổ cộng hưởng tư nhân proton (1H-NMR) dùng để xác định cấu trúc phân tử và thành phần của block copolymer và đây là một trong những phương pháp đặc biệt dùng để định lượng cho phản ứng tổng hợp hữu cơ hiện nay Sản phẩm Triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA được phân tích 1H-NMR trên máy Varian-Unity Inova 500NB ở 500MHz, sử dụng CDCl3 là dung môi chứa 0,03%(v/v) Tetramethylsilane (TMS) Hàm lượng của mỗi block được tính toán dựa trên cơ sở tổng hợp các peak proton đặt trưng của PEG, LA và CL từ phổ 1H-NMR Kết quả phân tích phổ 1H-NMR được chỉ ra ở các như các hình bên dưới
Hình 3.11 : Phổ 1H-NMR của PCLA-PEG-PCLA Từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của các triblock copolymer (hình 3.11) cho thấy sự xuất hiện các peak đặc trưng cho từng nhóm có mặt trong cấu trúc của triblock copolymer tương ứng với các độ chuyển dịch hóa học sau:
Peak ở δ = 3.647ppm (A, A ’ ) và δ = 4.20ppm (D) đặc trưng cho hydro của nhóm metylen ở giữa và hai đầu của chuổi etylen oxit (EO)
Peak ở δ = 5.16ppm (B) và δ = 1.40ppm (H) đặc trưng cho hydro của các nhóm metylen của lactide (LA)
Peak ở δ = 2.35ppm (C), δ = 1.66ppm (F) và δ = 3.48ppm (E) đặc trưng cho các hydro tương ứng của nhóm metylen ở đầu, 3 nhóm metylen ở giữa và nhóm metylen ở cuối của ε-caprolactone (CL)
Thành phần cấu trúc của triblock copolymer thu được thông qua việc tính toán các peak trên phổ 1H-NMR, phù hợp với mô tả trong các bài báo trước [1,5] về đặc điểm cấu trúc của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA
Hình 3.12 : Phổ 1H-NMR của PCLA-PEG-PCLA với PEG 1500
Hình 3.13 : Phổ 1H-NMR của PCLA-PEG-PCLA với PEG 1750
Hình 3.14 : Phổ 1H-NMR của PCLA-PEG-PCLA Với PEG 2000 Các hình từ 3.12, 3.12, 3.14 lần lượt là phổ 1H-NMR của các triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA tương ứng với các PEG1500, PEG1750 và PEG2000 Các peak đặc trưng xuất hiện trong các phổ này cùng ở các độ chuyển dịch hóa học tương ứng như trong phổ ở hình 3.11 ở trên Điều này khẳng định rằng tất cả các mẫu triblock copolymer tổng hợp được có cấu trúc phân tử phù hợp cấu trúc được chỉ ra ở hình bên dưới
Hình 3.15 : Cấu trúc phân tử của PCLA-PEG-PCLA Các thành phần cấu trúc trong triblock copolymer được xác định dựa vào diện tích các peak tương ứng của phổ 1H-NMR Cách tính khối lượng phân tử trung bình của triblock copolymer và các thành phần xem phụ lục 2 trang 66 Độ phân tán của khối lượng phân tử của triblock copolymer được xác định từ phổ GPC Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1 bên dưới
Bảng 3.1 Khối lượng phân tử và độ phân tán khối lượng phân tử của các triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA PCLA-PEG-PCLA
1.300 a Khối lượng phân tử trung bình của PCLA-PEG-PCLA được tính từ phổ 1H-NMR b Aldrich cung cấp; c Đo được bằng GPC
Giản đồ trạng thái pha sol-gel của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA
Tất cả các mẫu triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA tổng hợp được đều cho thấy trạng thái pha của chúng trong dung dịch nước đều phụ thuộc vào sự thay đổi của nhiệt độ môi trường Giản đồ trạng thái pha của copolymer đều cho thấy có 3 vùng khác nhau tương ứng với 3 trạng thái pha khác nhau của copolymer: Trạng thái thứ nhất là trạng thái sol ở nhiệt độ nằm dưới nhiệt độ tới hạn gel dưới (LCGT), trạng thái thứ hai là trạng thái gel là vùng trạng thái có nhiệt độ nằm giữa LCGT và nhiệt độ tới hạn gel trên (HCGT) và trạng thái thứ ba là trạng thái sol (dạng lắng kết) khi nhiệt độ tăng trên HCGT Đặc biệt ở vùng trạng thái gel, quá trình gel hóa của triblock copolymer xảy ra hai giai đoạn, giai đoạn gel trong và giai đoạn gel trắng đục Cụ thể như trong hình 3.16 và hình 3.17 ở dưới
Hình 3.16 : Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA ( PEG 1500,
Hình 3.17 : Trạng thái pha của dung dịch copolymer PCLA-PEG-PCLA ở các nhiệt độ khác nhau
Hình 3.18 cho thấy sự chuyển pha sol-gel của dung dịch copolymer nhạy cảm nhiệt độ trong điều kiện thử In Vivo Dung dịch copolymer (ở nhiệt độ 10 0 C, pH 7.4) tồn tại ở trạng thái sol trong xilanh ngay trước khi tiêm vào chuột, và chuyển sang trạng thái gel khi tiêm vào dưới da của chuột sau 2 giờ
Hình 3.18 : Sự chuyển pha sol-gel của triblock PCLA-PEG-PCLA trong thử nghiệm In Vivo
Sự chuyển pha của copolymer PCLA-PEG-PCLA từ trạng thái sol sang gel và từ gel sang dạng lắng kết có thể giải thích như sau Ở nhiệt độ thấp (10 0 C), PCLA đóng vai trò như một block kỵ nước yếu nên nó làm tăng khả năng hoà tan (solubility) của copolymer Do đó, tất cả các phân tử copolymer được hoà tan trong dung dịch nước, còn các phân tử tạo thành cấu trúc micell với block kỵ nước của PCLA ở nhân (core) Các phân tử ưa nước của PEG nằm ở lớp cấu trúc bên ngoài (shell) Do đó, dung dịch copolymer ở trạng thái sol Khi nhiệt độ tăng lên (37 0 C), các phân tử kỵ nước của PCLA tạo thành nhiều hơn để chống lại với sự thay đổi nhiệt độ môi trường Vì thế, hầu hết các phân tử của copolymer tạo thành cấu trúc micell Tại nơi tập trung cao của dung dịch copolymer, có nhiều cầu nối giữa các micell được hình thành do các tương tác kỵ nước giữa các block PCLA Cấu trúc này hấp thụ một lượng lớn nước và nó thể hiện cả hai hình thái ưa rắn và ưa lỏng (liquid-like-solid-like) Kết quả là dung dịch nước của copolymer chuyển từ trạng thái sol sang trạng thái gel Và như ở hình 3.16 và hình 3.17 ta thấy, khi dung dịch copolymer chuyển từ trạng thái sol sang gel khi nhiệt độ tăng từ nhiệt độ dưới LCGT lên đến nhiệt độ HCGT thì dung dịch copolymer này chỉ tồn tại 1 pha duy nhất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên trên nhiệt độ HCGT thì dung dịch copolymer này lại cho thấy chúng bị tách thành 2 pha rất rỏ ràng Do khi nhiệt độ tăng lên ở mức cao (54 0 C) thì làm cho block PCLA trở nên quá kỵ nước, chúng làm cho khả năng hoà tan của copolymer này giảm xuống Hơn nữa, tương tác kỵ nước làm tăng số lượng cầu nối micell lên quá lớn làm cho cấu trúc gel bị tập trung lại và làm thay đổi trạng thái từ gel sang trạng thái lắng kết Đồng thời khi nhiệt độ tăng lên làm cho enthalpy của nước tăng lên, phân tử nước sẽ dao động tự do mạnh hơn và thắng được lực hút của các hydrogel và chúng tách ra khỏi phân tử hydrogel Kết quả dung dịch copolymer lúc này bị tách thành 2 pha rất rõ ràng như trạng thái lắng kết của dung dịch
Kết quả khảo sát quá trình chuyển pha sol-gel của triblock copolymer thu được các dữ liệu được nêu ra trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Nhiệt độ chuyển pha Sol - Gel của các triblock copolymer PCLA-PEG-
% Polymer PCLA/PEG = 2.1/1 PCLA/PEG = 2.3/1 PCLA/PEG = 2.4/1 (%wt) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C)
% Polymer PCLA/PEG = 1.94/1 PCLA/PEG = 2.4/1
(%wt) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C)
% Polymer PCLA/PEG = 2.0/1 PCLA/PEG = 2.2/1 PCLA/PEG = 2.4/1 (%wt) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C) LCGT( 0 C) HCGT( 0 C)
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển pha sol-gel của copolymer
3.3.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG
Hình 3.19 : Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA (PCLA/PEG = 2.4/1) với PEG có các khối lượng phân tử khác nhau
Giản đồ pha sol-gel (hình 3.19) của triblock PCLA-PEG-PCLA với các khối lượng phân tử PEG khác nhau (1500-1750-2000) cho thấy nồng độ gel tới hạn (CGC), nhiệt độ gel tới hạn dưới (LCGT) và nhiệt độ gel tới hạn trên (HCGT) của dung dịch copolymer Từ giản đồ pha cho thấy, khi cố định tỷ lệ PCLA/PEG 2.4/1 và thay đổi khối lượng phân tử PEG từ 1500 đến 2000 thì nồng độ gel tới hạn của dung dịch copolyme thay đổi rất ít không, và CGC nằm vào khoảng 12%wt
Trong khi đó, nhiệt độ gel tới hạn (LCGT, HCGT) thay đổi một lượng tương đối lớn Cụ thể xét dung dịch copolyme 25%wt ở pH = 7.4, Khi khối lượng phân tử PEG tăng từ 1500 đến 2000 thì LCGT tăng từ 31 0 C (PEG 1500) lên 40 0 C (PEG 2000) Và HCGT tăng từ 47 0 C (PEG 1500) lên 54 0 C (PEG 2000) Từ kết quả trên cho thấy rằng, ta không thể kiểm soát được nồng độ gel tới hạn (CGC) của triblock copolyme PCLA-PEG-PCLA theo khối lượng phân tử của PEG nhưng đối với LCGT và HCGT của block copolyme này thì có thể kiểm soát được LCGT và HCGT tỷ lệ thuận với khối lượng PEG
3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ kỵ nước/ ưa nước PCLA/PEG
Hình 3.20 : Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA (PEG = 1500) với các tỷ lệ PCLA/PEG khác nhau
Hình 3.21 : Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA (PEG 00) với các tỷ lệ PCLA/PEG khác nhau
Từ Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA ( hình 3.20, 3.21) cho thấy rằng khi khối lượng phân tử PEG giữ cố định và thay đổi tỷ lệ thành phần kỵ nước/ưa nước (PCLA/PEG) của copolyme thì cả CGT, LCGT và HCGT của copolyme cũng thay đổi theo Xét PEG có khối lượng phân tử 1500, khi tăng tỷ lệ PCLA/PEG từ 2.1/1 lên 2.4/1 thì CGC giảm từ 18%wt xuống 12%wt Trong khi đó, khoảng nhiệt độ giữa LCGT và HCGT tăng từ 6 0 C lên 16 0 C, LCGT thay đổi rất nhiều từ 31 0 C lên 39 0 C nhưng HCGT lại ít thay đổi hơn từ 45 0 C lên 47 0 C với dung dịch copolyme 25%wt ở pH = 7.4 Đối với PEG 2000 cũng xảy ra tương tự PEG 1500
3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ copolymer hydrogel PCLA-PEG-PCLA
Nồng độ dung dịch copolyme ảnh hưởng lớn đến trạng thái pha của triblock copolymer Đối với hệ thống triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA cùng MPEG = 1750, giản đồ pha được thể hiện ở Hình 3.22 với các nồng độ dung dịch copolyme khác nhau tại pH = 7,4.
Hình 3.22 : Giản đồ pha sol-gel của PCLA-PEG-PCLA (PEG 50) với các tỷ lệ PCLA/PEG khác nhau
Giá trị khoảng cách nhiệt độ giữa LCGT (nhiệt độ chuyển sang pha tinh thể lỏng) và HCGT (nhiệt độ chuyển sang pha tinh thể lỏng có trật tự cao) tỷ lệ thuận với nồng độ của dung dịch copolymer Điều này cho thấy khi nồng độ copolymer tăng, khoảng cách nhiệt độ giữa hai pha chuyển pha cũng tăng lên.
Khi nồng độ Polymer tăng từ 15%wt lên 30%wt, khoảng cách LCGT và HCGT tăng từ 8 độ C lên 19 độ C khi tỷ lệ PCLA/PEG là 2,4/1 và chỉ tăng 2 độ C khi tỷ lệ PCLA/PEG là 9,2/1.
(Sedimentationl) lên 9 0 C ứng với tỷ lệ PCLA/PEG = 1.9/1 Cũng từ giản đồ trên ta thấy khoảng nhiệt độ mà dung dịch tồn tại ở trạng thái gel càng mở rộng khi nồng độ dung dịch càng tăng.
Khảo sát khả năng phân hủy sinh học theo phương pháp in ViTro
Khả năng phân hủy sinh học của triblock copolyme ở trạng thái gel được xác định theo sự thay đổi của khối lượng phân tử theo thời gian Thực nghiệm phân hủy của gel được tiến hành theo phương pháp In Vitro Dung dịch copolyme (25wt% , pH=7.4) được giữ ổn định ở 37 0 C trong bể điều nhiệt đến khi dung dịch chuyển sang trạng thái gel Thêm 3ml dung dịch đệm PBS (PBS được giữ ở nhiệt độ 37 0 C, pH=7.4) vào ống nghiệm và tiếp tục giữ ống nghiệm ở 37 0 C trong bể điều nhiệt
Sau khi ủ mẫu trong điều kiện nhiệt độ nhất định trong thời gian x, ống nghiệm được lấy ra khỏi bể điều nhiệt và đưa vào máy đông khô thăng hoa, thu được mẫu vật ở dạng gel trắng Quy trình thử nghiệm in vitro và kết quả thu được được minh họa ở Hình 3.23 và Bảng 3.4.
Quy trình thử in vitro
Hình 3.23 Mô phỏng quy trình thử In Vitro Bảng 3.3 Kết quả thử phân hủy sinh học của triblock copolymer theo in vitro
Triblock copolymer hydrogel PCLA-PEG-PCLA được tạo nên từ hai thành phần, block ưa nước PEG không có khả năng phân hủy sinh học và block kỵ nước PCLA là một copolymer của hai polyester poly(D,L-Lactide) và poly(ε-caprolactone) có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học tốt
Block PCLA quyết định tính chất phân hủy sinh học của triblock PCLA-PEG- PCLA
Poly(D,L-Lactide) và poly(ε-caprolactone) thuộc polyester béo là loại polymer có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học tốt Trong môi trường của cơ thể sống các polymer này có thể phân hủy thành CO2 và H 2 O do các chuổi polymer này dễ dàng bị phân hủy, bị cắt mạch do enzym, do thủy phân hoặc các tác nhân khác trong cơ thể sống Như vậy, sự phân hủy của triblock copolymer PCLA- PEG-PCLA trong điều kiện vật lý của phương pháp thử in vitro (37 0 C, pH 7.4) thì chỉ có block kỵ nước PCLA phân hủy còn block ưa nước PEG không thay đổi khối lượng phân tử trong suốt quá trình thử nghiệm Theo hình 3.23 cho thấy, sự phân hủy của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA xảy ra tương đối chậm, sau 27 ngày thì khối lượng phân tử của triblock copolymer này giảm đi 452, tương ứng với độ giảm 8,8%
Hình 3.24 Sự thay đổi khối lượng phân tử theo thời gian trong In Vitro của triblock PCLA-PEG-PCLA (37 0 C, pH 7.4)
Khả năng phân hủy chậm của PCLA-PEG-PCLA là do tính kỵ nước của poly(ε-caprolactone) (PCL), ngăn cản sự xâm nhập của nước vào mạng hydrogel Ngược lại, poly(D.L -lactide) (PLA) phân hủy nhanh hơn, như trong hình 3.25, khối lượng phân tử của triblock PLA-PEG-PLA giảm đột ngột trong 3 ngày đầu Qua trình phân hủy mẫu 25%wt hoàn thành trong 3 ngày, trong khi mẫu 50%wt mất khoảng 8-9 ngày.
Hình 3.25 Sự thay đổi khối lượng phân tử theo thời gian trong In Vitro của triblock PLA-PEG-PLA ( 37 0 C, pH 7.4) [13]
Khả năng phân hủy sinh học của hydrogel phụ thuộc vào tỷ lệ block kỵ nước Khi tỷ lệ này tăng, khả năng phân hủy cũng tăng, vì PEG không phân hủy nhưng ghép block kỵ nước PCL, PLA hoặc PCLA vào tạo khả năng phân hủy Tuy nhiên, mức độ phân hủy tùy thuộc vào tính kỵ nước của các block ghép vào, trong đó PCL có tính kỵ nước mạnh hơn PLA và PGA, dẫn đến hydrogel chứa PCL phân hủy chậm hơn.
(37 0 C, pH 7.4), khối lượng phân tử của triblock này giảm rất nhanh trong khoảng 5 tuần đầu, sau đó giảm chậm và gần như không đổi khi đạt đến khối lượng phân tử của PEG
Hình 3.26 Sự thay đổi khối lượng phân tử theo thời gian trong In Vitro của triblock PLGA-PEG-PLGA (37 0 C, pH 7.4) [6]
Khi so sánh khả năng phân hủy sinh học của 2 triblock copolymer PCLA- PEG-PCLA và PLGA-PEG-PLGA cho thấy, sự phân hủy của triblock copolymer PLGA-PEG-PLGA xảy ra nhanh và xảy ra đột ngột ngay lúc đầu trong khi triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA xảy ra chậm và không xảy ra đột ngột Do trong triblock PLGA-PEG-PLGA có chứa cả hai block kỵ nước yếu PLA và PGA, còn trong triblock PCLA-PEG-PCLA cũng chứa hai block kỵ nước nhưng block PCL lại có tính kỵ nước mạnh và tỷ lệ CL/LA ở trong triblock này là 2.0/1 nên tính kỵ nước mạnh của PCL trội hơn hản PLA và PGA Do đó, PCL quyết định khả năng phân hủy sinh học của triblock PCLA-PEG-PCLA, làm cho quá trình phân hủy sinh học của triblock này xảy ra chậm theo thời gian Đặc tính này của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA rất phù hợp để ứng dụng làm chất nền cho hệ vận chuyển và phân phối thuốc dài hạn
Hình 3.27 cho thấy phổ GPC của các triblock PCLA-PEG-PCLA sau các ngày thử phân hủy sinh học trong điều kiện In Vitro Phổ GPC cũng cho thấy các đường cong trong phổ có xu hướng dịch sang phải khi thời gian thử In Vitro tăng lên, điều đó chứng tỏ rằng khối lượng phân tử của triblock giảm dần theo thời gian thử In Vitro
Hình 3.27 Phổ GPC của triblock PCLA-PEG-PCLA trong thử nghiệm In
Vitro sau các ngày khác nhau.
Khảo sát khả năng phân hủy sinh học theo in Vivo
Sự phõn hủy In Vivo của gel được tiến hành trờn chuột bạch (SD) 200àl dung dịch copolyme 30 wt% ở pH=7.4 và nhiệt độ 10 0 C được tiêm vào dưới da ở vùng lưng của chuột SD sau 1 thời gian mổ vùng lưng của chuột (vị trí tiêm) ra để kiểm tra kích thước của gel Căn cứ vào kích thước gel để đánh giá khả năng phân hủy của triblock
Kết quả được chỉ ra ở hình 3.28 Sự phân hủy của triblock copolymer PCLA- PEG-PCLA trong cơ thể chuột SD cho thấy quá trình phân hủy xảy ra chậm và đều, thể hiện qua kích thước của khối gel tiêm vào chuột giảm dần theo thời gian Và khối gel của triblock biến mất hoàn toàn sau 4 tuần thử
Vị trí tiêm ở lưng chuột SD không xảy ra tình trạng sưng tấy hay nhiễm trùng nào trong thời gian thử nghiệm, chuột vẫn sống khỏe mạnh và ổn định Điều này chứng tỏ khả năng tương thích sinh học tốt của triblock copolymer PCLA-PEG-PCLA.
Hình 3.28 Sự thay đổi kích thước gel PCLA-PEG-PCLA theo thời gian thử nghiệm In Vivo (30%wt, PEG1500, PCLA/PEG = 2.4/1)
1 Đã tổng hợp thành công triblock copolymer hydrogel sinh học nhạy cảm nhiệt độ PCLA-PEG-PCLA từ polyethylene glycol (PEG), ε-caprolactone (CL) và D,L lactide bằng phản ứng polymer hóa mở vòng Lactic và ε-caprolactone với xúc tác Sn(Oct) 2
2 Quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thuộc tính chuyển pha sol-gel của triblock copolymer hydrogel PCLA-PEG-PCLA cho thấy chúng phụ thuộc vào các yếu tố sau :
- Khối lượng phân tử của PEG: MPEG tỷ lệ thuận với nhiệt độ tới hạn gel của triblock copolymer
- Tỷ lệ kỵ nước/ưa nước (PCLA/PEG): Tỷ lệ PCLA/PEG tăng thì LCGT giảm trong khi HCGT gần như không đổi
- Nồng độ copolymer : Nồng độ copolymer tăng thì LCGT giảm trong khi HCGT tăng, diện tích vùng gel trên giản đồ pha tăng
3 Quá trình khảo sát khả năng phân hủy sinh học của triblock PCLA-PEG- PCLA trong điều kiện môi trường cơ thể ( pH 7.4, 37 0 C ) theo hai phương pháp In Vitro và In Vivo cho thấy:
- Sự phân hủy của triblock PCLA-PEG-PCLA xảy ra chậm và đều - Sự phân hủy In vivo xảy ra nhanh hơn In vitro
4 Trong tất cả các mẫu tổng hợp được, mẫu tổng hợp với các thông số : - MPEG = 1500
- PCLA/PEG = 2.4/1 (wt) - CL/LA = 2.0/1 (mol) cho thấy điều kiện môi trường chuyển pha sol-gel, phân hủy sinh học gần sát với điều kiện môi trường cơ thể Là mẫu có khả năng ứng dụng cao cho hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc trong y sinh
1 Nghiên cứu tổng hợp pentablock copolymer hydrogel nhạy cảm nhiệt độ và pH từ triblock PCLA-PEG-PCLA
2 Khảo sát quá trình phân hủy sinh học theo phương pháp In Vivo của triblock PCLA-PEG-PCLA khi được ngậm thuốc
3 Khảo sát khả năng ngậm và nhả thuốc từ triblock PCLA-PEG-PCLA đã được nghiên cứu trong điều kiện In Vitro và In Vivo.
