Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nấm men Yarrowia Lipolytica PO1G có khả năng sinh tổng hợp chất béo

The yeast Yarrowia lipolytica has ability to use sugarcane bagasse hydrolysate SCBH as carbon source for lipid biosynthesis.. This study consists of twoparts: investigates the effects of

t v n

Ngày nay, th gi i ang ph i i m t v i hi n t ng bi n i khí h u và kh ng ho ng n ng l ng H n th n a, ngu n d tr d u m ang c n ki t, giá thành cao gây b t n v an ninh n ng l ng và nh h ng x u n môi tr ng Vì v y, các nhà khoa h c ã n l c không ng ng tìm ki m các gi i pháp thay th các d ng n ng ng i t nguyên li u hóa th ch b ng các d ng n ng l ng m i xanh h n, s ch n, thân thi n v i môi tr ng và c bi t có th tái t o c Trong ó, nghiên c u phát tri n nhiên li u sinh h c là m t h ng i ti m n ng giúp gi i quy t m t ph n nào v n nan gi i này c a th gi i, v a m b o an ninh n ng l ng v a áp ng nhu c u n ng l ng c a t ng qu c gia [1],[2]. d ng nhiên li u sinh h c mang l i nhi u l i ích nh gi m thi u s ph thu c vào d u m và gi m thi u ô nhi m Do trong quá trình s d ng, nhiên li u sinh h c ít phát sinh các ch t c h i gây ô nhi m môi tr ng nh l u hu nh, carbon monoxit, polyaromatic M t khác, nhiên li u sinh h c có t c phân h y sinh h c cao, nhanh h n so v i nhiên li u hóa th ch Chính vì th d n n s bùng s n xu t nhiên li u sinh h c [3],[4] Biodiesel là nhiên li u sinh h c có thành ph n hóa h c ch y u là methyl este c a các axit béo Biodiesel c s n xu t t quá trình chuy n hóa este gi a các triglyceride ( ây là thành ph n chính có trong u th c v t ho c m ng v t) và methanol v i xúc tác axit ho c baz [2].

Nguyên li u truy n th ng s n xu t biodiesel bao g m d u h t c i, d u h t ng d ng, d u u nành, d u c , d u chiên ã qua s d ng, m ng v t [1],[5].Tuy nhiên, n u s d ng d u ng th c v t làm nguyên li u t ng h p biodiesel s cho chí phí cao và có th nh h ng n v n an ninh l ng th c [6] M t s nghiên c u ã s d ng d u n ã qua s d ng nh ngu n nguyên li u ây là m t cách hay gi m chi phí [5],[7] Tuy nhiên, nh ng ngu n nguyên li u này còn h n ch , không áp ng c nhu c u n ng l ng [8] Nh ng b t l i nêu trên ã làm giá thành biodiesel còn cao nên vi c s d ng nhiên li u này còn h n ch Vì v y, th gi i ã và ang tìm ki m các ngu n d u m i s n xu t biodiesel Trong s ó, d u vi sinh v t hay d u n bào (single cell oil) ang thu hút s quan tâm c a th gi i [9],[10] Vi sinh v t cho d u có kh n ng tích l y ch t béo trong t bào t s trao i ch t c a các ngu n carbon khác nhau, v i m t s loài vi sinh v t có th tích l y ch t béo kho ng 87% kh i l ng t bào khô ây là ngu n nguyên li u ti m n ng t ng h p biodiesel Do chúng có m t s thu n l i nh không b nh h ng theo mùa hay th i ti t, thành ph n c a ch t béo t ng t nh các lo i d u n c, có th s n xu t t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau v i th i gian s n xu t ng n, d dàng m r ng quy mô công nghi p [11]. m men Yarrowia lipolytica có kh n ng tích l y m t l ng l n ch t béo và có th dùng s n xu t d u sinh h c Hàm l ng ch t béo trong n m men này tùy thu c vào s phát tri n và u ki n nuôi c y Ngu n carbon khác nhau s cho kích và thành ph n ch t béo khác nhau M t s công trình nghiên c u trên th gi i s ng glucose làm ngu n carbon s n xu t ch t béo [10],[12] Tuy nhiên, do giá a glucose khá cao s nh h ng n giá thành s n ph m Vì v y, các ngu n carbon thay th có giá m m h n ã c nghiên c u nh glycerol công nghi p, pectin và lactose, th y phân các ch t b i [12],[13] Trong ó, ng thu c t th y phân nguyên li u lignocellulose là ngu n carbon ti m n ng, r ti n s n xu t u vi sinh v t [14].

Bã mía là m t trong nh ng ngu n lignocellulose khá ph bi n các n c nhi t i, trong ó có Vi t Nam Thông th ng, mía sau khi tr i qua quá trình xay xát s c dùng làm th c n cho trâu bò, cung c p nhi t, n cho nhà máy mía ng ho c k t h p v i các ph gia khác s n xu t ván sàn ép, phân bón Nh ng bi n pháp x lý này ch a khai thác h t ti m n ng c a bã mía, ôi khi s gây ô nhi m môi tr ng [15],[16] Vì v y, n u chúng ta tìm c cách s d ng bã mía m t cách h p lý s em l i nhi u l i ích v kinh t , môi tr ng và nâng cao giá tr cây mía.

Vi c nghiên c u s d ng ngu n lignocellulose giàu h p ch t carbonhydrate nh bã mía làm nguyên li u s n xu t biodiesel v i s h tr c a vi sinh v t là t h ng i úng n, y ti m n ng và có hi u qu ó c ng là lý do mà tài ng d ng bã mía th y phân nuôi c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g có kh ng sinh t ng h p ch t béo” c a chúng tôi mu n óng góp m t ph n nh vào b c tranh nhiên li u sinh h c c a th gi i.

M c tiêu

c ích chung c a tài: nghiên c u kh n ng tích l y ch t béo c a n m men Yarrowia lipolytica Po1g trong môi tr ng bã mía th y phân. c tiêu c n t c trong tài:

– Nghiên c u tìm ra u ki n thích h p cho quá trình th y phân bã mía ng axit loãng thu c dung d ch th y phân có hàm l ng ng cao nh t.

– Nghiên c u tìm ra u ki n thích h p cho quá trình lên men v i kh ng tích l y ch t béo cao nh t.

N i dung nghiên c u

Các n i dung chính c n ph i th c hi n t c m c tiêu nêu trên

– Kh o sát nh h ng c a th i gian n quá trình th y phân.

– Kh o sát nh h ng c a n ng axit n quá trình th y phân.

– Kh o sát nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n quá trình th y phân.

– Kh o sát nh h ng c a nhi t n quá trình th y phân.

– Kh o sát nh h ng c a th i gian n s sinh tr ng và tích l y ch t béo a n m men.

– Kh o sát nh h ng c a ngu n carbon n s sinh tr ng và tích l y ch t béo c a n m men.

– Kh o sát nh h ng c a ngu n nit n s sinh tr ng và tích l y ch t béo c a n m men.

– Kh o sát nh h ng c a nhi t n s sinh tr ng và tích l y ch t béo a n m men.

– Kh o sát nh h ng c a n ng ng t ng n s sinh tr ng và tích y ch t béo c a n m men.

D u vi sinh v t

u vi sinh v t hay d u n bào (single cell oil, SCO) c nh ngh a là các lo i d u có th n c thu c t vi sinh v t, có hình thái và thành ph n t ng t nh d u th c v t hay m ng v t Hàm l ng d u cao c tìm th y trong nhi u loài vi khu n, n m men, n m và vi t o Ngày nay, d u vi sinh v t c xem nh s n ph m công ngh sinh h c óng vai trò quan tr ng trong vi c cung c p chính các axit béo không bão hòa a (axit docosahexaenoic (DHA), axit arachidonic (AA) và axit γ-linolenic (GLA),…) – ây là các ch t dinh d ng c n thi t cho s phát tri n c a con ng i [17]. u vi sinh v t c s n xu t u tiên vào tr c chi n tranh th gi i th hai, khi d u và ch t béo r t khan hi m Nh ng n m sau ó, do thi u các ngu n cung c p axit béo không bão hòa t th c ng v t nên d u n bào c xem nh m t m c tiêu th ng m i i v i vi sinh v t, ch t béo c tích l y trong nh ng c quan t bào c bi t c g i là h t ch t béo Nó bao g m các triacylglycerol và steryl este (SE) mà chúng c bao quanh b i m t l p phospholipid n v i m t vài protein ng vào [17] Do d u vi sinh v t r t có ti m n ng trong t ng lai vì có th s n xu t a trên ngu n nguyên li u là r m, r , bã mía – ây c xem là ph ph ph m nông nghi p có th gây nh h ng n môi tr ng n u không có h ng x lý hi u qu Ngoài ra, do có tính ch t t ng t nhau (B ng 2.1) nên d u vi sinh v t c xem nh là m t ngu n ch t béo thay th ch t béo truy n th ng nh d u ng th c t trong s n xu t biodiesel và là ngu n th c n nuôi tr ng th y s n [11],[18]. ng 2.1 Thành ph n ch t béo c a vi sinh v t cho d u và d u ng th c v t

Vi khu n 8 – 10 10 – 11 11 – 12 25 – 28 14 – 17 – – u ng v t bò 24 4 19 43 3 1 6 heo 26 3 14 44 10 – 3 u th c v t u oliu 13 1 3 71 10 1 1 u u nành 11 – 4 54 7 – – u u ph ng 11 – 2 48 32 – 1

Ch t béo

Triacylglycerol và các h p ch t liên quan

Triacylglycerol (triglyceride) là trieste c a glycerol v i 3 axit carboxylic dây dài Khi th y gi i v i dung d ch ki m, triglyceride t o ra glycerol và 3 axit béo Ba axit này không nh t thi t ph i gi ng nhau G n nh t t c d u th c v t và m ng t th ng m i th ng là h n h p c a nhi u triacylglycerol (TAG) Diacylglyerol (DAG) và monoacylglyerol (MAG) là este c a glycerol v i hai ho c m t axit béo ng ng DAG và MAG hi m khi có m t trong mô t i c a ng th c v t nh ng có th hình thành t s th y phân c a TAG [22],[23],[24].

Hình 2.1 C u trúc c a TAG, DAG và MAG [24]

Sterol và sterol este

Cholesteol là h p ch t ph bi n nh t c a các sterol trong mô ng v t. Cholesteol t n t i d ng t do (có vai trò quan tr ng trong vi c duy trì tính linh ng c a màng t bào) và d ng este hóa (cholesteol este) Các sterol khác ( d ng do và este hóa) c ng có m t trong các mô ng v t nh ng v i hàm l ng r t th p(cholestanol, coprostanol) Trong th c v t, cholesteol là hi m khi có m t nh ng m t sterol khác th ng c tìm th y và th c hi n m t ch c n ng t ng t(ergosterol, stimasterol) [23],[24].

Sáp

Sáp là este c a r u m ch dài v i axit béo phân t l ng cao và có s nguyên carbon ch n Sáp c tìm th y trong ng th c v t và các mô c a vi sinh v t v i các ch c n ng khác nhau nh ch ng th m, bôi tr n, [23],[24]

Axit béo

Axit béo là nh ng m ch dài các nguyên t carbon, có nhóm –COOH m t u Các axit béo th ng m ch th ng, có s carbon s ch n, có th no (axit béo bão hòa) ho c không no (axit béo không bão hòa n và axit béo không bão hòa a – tùy thu c vào s l ng n i ôi trong m ch carbon) Tuy nhiên, có nh ng axit béo ngoài nhóm ch c axit còn ch a nh ng nhóm ch c khác nh keton, r u, m ch carbon có vòng hay nhánh Liên k t ôi c a axit béo trong mô t bào ng v t có t

1 – 6, i v i t o không quá 5, th c v t b c cao thì hi m khi nhi u h n ba, còn trong vi sinh v t th nh tho ng nhi u h n m t [23],[24].

Hình 2.3 C u trúc c a vài axit béo quan tr ng [24]

Các phospholipid

Là thành ph n chính c a màng t bào th c ng v t Các phospholipid có công th c hóa h c g n gi ng triacylglycerol ch có khung s n glycerol n i qua hai i este v i hai axit béo và n i este th ba v i axit phosphoric Nhóm phosphat luôn i v i m t aminoalcol nh cholin ho c etanolamin [22].

Các ch t béo khác

Glycoglycerolipids, sphingolipids có t m quan tr ng trong s trao i ch t nh ng ch có m t l ng nh trong h u h t các mô [23],[24].

Vi sinh v t cho d u

Vi sinh v t cho d u là nh ng vi sinh v t có kh n ng tích l y ch t béo h n 20% sinh kh i khô Chúng c tìm th y trong các loài vi khu n, n m, n m men và vi t o (B ng 2.2) [18]. a s vi khu n có hàm l ng ch t béo th p kho ng 10% sinh kh i khô Tuy nhiên, m t s loài nh Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus có th tích y ch t béo lên n 30 – 40% và Arthrobacter sp tích l y 80% nh ng t c phát tri n ch m, có th gây ng c, d ng, khó trích ly ch t béo, làm cho vi khu n không c xem nh m t ngu n cung c p d u Ng c l i, hàm l ng ch t béo trong vi t o t ng i cao kho ng 20 – 40% sinh kh i khô, có m t s loài tích l y lên n 80% Nh ng s d ng vi t o không ph i lúc nào c ng có tính kh thi v kinh vì yêu c u v u ki n sinh tr ng c ng nh thi t b thu ho ch c bi t Trong khi ó, n m men có t c sinh tr ng nhanh, hàm l ng ch t béo cao, d nuôi c y và có th m r ng quy mô công nghi p, u này cho th y n m men là m t ng c viên ti m n ng s n xu t biodiesel M c dù có nhi u lo i vi sinh v t cho d u nh ng không ph i t t c trong s chúng có th dùng s n xu t biodiesel Nguyên nhân là do thành ph n d u c a chúng có nhi u n i ôi không thích h p làm nguyên li u t ng h p biodiesel [9],[18],[25]. ng 2.2 M t s loài vi sinh v t cho d u và hàm l ng d u [19]

Rhodotorula glutinis 72 Mucor alpine-peyron 38

Trong vi sinh v t cho d u, các y u t di truy n quy t nh kh n ng và m c tích l y ch t béo khác nhau c a các loài khác nhau, ngay c gi a các ch ng trong cùng m t loài Các loài vi sinh v t cho d u khác nhau và u ki n nuôi c y khác nhau s cho hàm l ng và thành ph n d u khác nhau [25].

Thành ph n ch t béo trong vi sinh v t cho d u r t phong phú và a d ng, tùy thu c theo t ng loài (B ng 2.1) M t vài ch t béo n hình nh TAG, DAG, MAG,… Ch t béo trong vi khu n th ng ch a các chu i axit béo phân nhánh, axit béo hydroxy Axit béo không bão hòa a, ch t béo phân c c là thành ph n ch y u trong ch t béo c a vi t o Trong n m men, axit oleic, axit linoleic, axit palmitic chi m hàm l ng nhi u nh t [18],[26]. tích l y ch t béo, yêu c u trong môi tr ng ph i có s d th a ngu n carbon và ngu n nit b gi i h n Vi sinh v t cho d u s b t u tích l y ch t béo khi ngu n dinh d ng ch y u (thông th ng là nit ) b gi i h n Khi ngu n nit ã n ki t, vi sinh v t s ti p t c ng hóa ngu n carbon, nh ng t bào không sinh tr ng n a vì nit c n thi t cho s t ng h p protein và axit nuleic Sau ó, carbon c dùng t ng h p ch t béo (TAG) bên trong t bào Các vi sinh v t không cho u trong cùng u ki n s tích l y các polysaccharide (glycogen, glucan và manna) [20],[27].

N m men cho d u

m men phân b r ng rãi trong môi tr ng t nhiên ngay c nh ng n i có u ki n kh c nghi t Trong h n 1500 loài n m men thu c 100 chi ch có kho ng

30 loài có kh n ng tích l y ch t béo h n 25% kh i l ng sinh kh i khô M t s loài có kh n ng tích l y ch t béo 70% kh i l ng sinh kh i khô [25].

Các n m men cho d u c nghiên c u nhi u nh t thu c các chi Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporodium, Cryptococcus và Lypomyces Do các vi sinh v t này có hàm l ng d u cao (B ng 2.2) và thành ph n ch t béo t ng t nh u th c v t u này cho th y ngu n d u này có th xem nh ngu n nguyên li u ti m n ng s n xu t biodiesel thay th cho các ngu n d u khác (d u m , d u th c ng v t) [8],[25] Hàm l ng ch t béo c a m t s n m men cho d u và d u th c t c trình bày trong b ng 2.3. ng 2.3 Thành ph n ch t béo c a n m men cho d u và d u th c v t [11],[20]

Thêm vào ó, n m men cho d u th phát tri n trên nhi u ngu n carbon khác nhau (m t r , glucose, các ph ph m công nông nghi p,…) T ó, có th t n d ng các ngu n ph th i n m men phát tri n, v a t o ra ch t béo v a x lý ch t th i,

Trichosporon beigelii 12 - 22 50 12 - - u th c v t ca cao 26 - 35 35 3 - 1 u oliu 13 1 3 71 10 1 1 u h t c i 4 - 2 62 22 10 - u hoa h ng ng 7 - 5 19 68 1 - u u nành 11 - 4 54 7 - - u b p 11 - 2 28 58 1 - u h t cotton 22 1 3 19 54 1 - n ch ô nhi m môi tr ng Tuy nhiên, c i thi n ch t l ng ch t béo hay làm ng n ng su t c n ph i u t , nghiên c u thêm [4],[18],[26].

Hình 2.5 Các t bào c a n m men cho d uRhodosporidium toruloides(A),

Cryptococcus curvatus (B) và Yarrowia lipolytica(C) ch p t kính hi n vi n t

[11],[20],[28]. c dù, Yarrowia lipolytica ch có th tích l y ch t béo 36% sinh kh i khô, th p h n nhi u so v i các lo i n m men cho d u khác Nh ng Yarrowia lipolytica có kh n ng phát tri n trên m t lo t các ch t n n k n c khác nhau và ã tr thành t mô hình vi sinh v t do các công c di truy n hi n nay d dàng thao tác gen trên lo i n m men này [17].

N m men Yarrowia lipolytica

S tích l y ch t béo

Ch t béo có th c tích l y b ng hai con ng khác nhau (i) t ng h p de novo liên quan n s t ng h p các ti n thân axit béo trong u ki n quy nh và s hòa nh p chúng trong quá trình sinh t ng h p ch t béo; (ii) con ng tích l y ex novo liên quan n s h p thu các axit béo, d u và TAG t môi tr ng nuôi c y và tích l y này có ho c không có s thay i hình th c t bào [36] Ngoài ra còn các enzyme chính tham gia vào hai con ng này (B ng 2.5). ng 2.4 Các gen liên quan n s tích l y ch t béo trongYarowia lipolytica[36]

GPD1 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD(+))

SCT1 Glycerol-3-phosphate acyl transferase

SLC1 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase

ARE1 Acyl-CoA:sterol acyltransferase

ARE2yl Acyl-CoA:sterol/Diacylglycerol acyltransferase

MFE1 Multifunctional beta-oxidation protein

(i) Con ng t ng h p ch t béo de novo

T ng quan v các con ng tham gia trong t ng h p axit béo và trong vi c u tr và suy thoái ch t béo không phân c c T ng h p các ch t béo không phân c (SE và TAG) c n sterol, acyl-CoA và glycerol-3-phosphate (G-3-P) T ng h p các axit béo c n Acyl-CoA [36].

Acyl-CoA c xúc tác b i các enzym t ng h p axit béo t các kh i c b n acetyl-CoA và malonyl-CoA thông qua các chu k dài G-3-P có th c t o ra ng m t trong hai cách: t glycerol b ng các enzyme glycerol c mã hóa b i gen GUT1 ho c t glucose theo con ng chuy n i dihydroxyacetone (DHAP) i dehydrogenase glycerol-3-phosphate c mã hóa b i gen GPD1 G-3-P có th oxy hóa thành DHAP b i dehydrogenase glycerol-3-phosphate c mã hóa b i gen GUT2 [36]. ng h p SE c xúc tác b i các enzyme SE synthase mã hóa b i ARE1 và ARE2 t ng h p TAG, ba acyl c thêm vào x ng s ng G-3-P qua các b c enzyme:

– c 1: m t acyl c thêm vào v trí sn-1 c a G-3-P b i m t G-3-P acyltransferase t o ra LPA (gen SCT1) [36].

– c 2: m t acyl th hai c thêm vào v trí sn-2 b i m t 1-acyl G- 3-P acyltransferase (gen SLC1) t o ra axit phosphatidic (PA), sau ó c dephosphoryl b i m t phosphatase phosphatidate (PAP) t o ra DAG [35].

– c 3: acyl th ba có th c thêm vào v trí sn-3 b ng m t trong hai cách: con ng ph thu c vào acetyl-CoA (tr c ti p t Acyl-CoA) b i acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGA1) và acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase/acyl-CoA: cholesteol acyltransferase(ARE1, ARE2) ho c b ng con ng c l p acetyl-CoA (t m t glycerophospholipid, PL) b i các phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (LRO1) [36].

TGL1, TGL3 và TGL4 tham gia vào s c nh SE và TAG Sau ó, các axit béo t do có th b suy thoái b ng con ng oxy hóa , có liên quan n acyl-CoA oxidase (POX), multifunctional beta-oxidation protein (MFE1) và thiolase (THOI1) Trong Yarowia lipolytica, sáu gen (POX1 – POX6) mã hóa acyl-CoA oxidase có liên quan n b c th hai c a oxy hóa và ch có m t l ng nh SE c t ng h p (2 – 5%) [36].

Hình 2.8 S v các con ng t ng h p ch t béode novo [36]

(ii) Con ng tích l y ch t béo ex novo

Yarrowia lipolyticalà n m men duy nh t có kh n ng làm suy gi m ch t n n n c hi u qu thông qua c ch trao i ch t Ngh a là n m men trong môi tr ng k n c s ti t ra liposan, làm gi m kích th c các gi t ch t n n k n c. Các gi t ch t n n này s g n v i ph n nhô ra c a b m t t bào, sau ó chúng s i vào bên trong t bào Khi vào bên trong t bào, chúng s c s a i theo vài cách nh oxi hóa , oxi hóa , l u tr hình thành các triglyceride (ch t béo) Cu i cùng, nh TAG sau khi th y phân b ng lipase [35]. ây là tính ch t n i b t nh t c aYarrowia lipolytica, s ph c t p và a d ng gen giúp n m men này có th s d ng nhi u ch t n n k n c khác nhau và kh ng tích l y ch t béo Yarrowia lipolytica có nhi u h gen tham gia vào quá trình trao i ch t giúp n m men có kh n ng s d ng các ch t n n k n c khác nhau, trong ó có 6 gen mã hóa enzyme acetyl-CoA (l ng enzyme acetyl-CoA d th a là y u t quan tr ng s t ng h p ch t béo c a vi sinh v t cho d u) [17],[35].

Hình 2.9 S s h p thu các ch t n n k n c c aYarrowia lipolytica[35]

Hóa sinh và s u ch nh kh n ng tích l y ch t béo

Trong th i gian chuy n ti p gi a giai n t ng tr ng (t ng tr ng t o ra sinh kh i) và giai n tích l y ch t béo (t c t ng tr ng gi m do ch t dinh d ng b n ch và ngu n carbon d th a t ng h p ch t béo), m t s con ng b ng n ch n (t ng h p protein và axit nuleic) và nh ng con ng khác xu t hi n (t ng p TAG và axit béo) Trong giai n tích l y, t ng h p ch t béo c n có các ti n thân (acetyl-CoA, malonyl-CoA and glycerol) và n ng l ng (ATP, NADPH) [36] Vai trò c a các enzyme quan tr ng trong u ch nh kh n ng tích l y ch t béo c mô t nh sau:

Khi nit trong môi tr ng b c n ki t s kích ho t AMP deaminase trong giai n phát tri n c a vi sinh v t cho d u [35],[36] AMP deaminase xúc tác ph n ng sau:

→IMP NH 4 AMP kích ho t AMP deaminase làm gi m n ng AMP trong ty th và n ng amonium trong t bào t ng N ng AMP gi m s c ch isocitrate dehydrogenase, ng n ch n các chu trình axit citric c p isocitrate Aconitase u ch nh s tích l y citrate trong ty th , v i l i ra t ty th c u ch nh b i chu k citrate/malate [35],[36].

Ph n ng này cung c p m t l ng l n acetyl-CoA t ng h p ch t béo. Acetyl-CoA c t o ra nh s phân c t citrate t ty th b ng ATP-citrate lyase (ACL) trong bào t ng ACL phân c t citrate t o ra oxaloacetate và acetyl-CoA [36].

Citrate + HS-CoA + ATP acetyl-CoA + oxaloacetate + ADP + Pi

Hai gen ACL1 và ACL2 mã hóa các enzyme ACL Enzyme này c n ph i có t ion amonium kích ho t và ph thu c vào adenosine monophosphate và adenosine diphosphate Tuy nhiên, ion amonium ang khan hi m vì trong môi tr ng ã c n ki t ngu n nit , do s c m ng c a AMP deaminase [36].

Ngoài acetyl-CoA, t ng h p ch t béo c n cung c p liên t c malonyl-CoA và NADPH Malonyl-CoA có th c t o ra t acetyl-CoA trong ph n ng c xúc tác b i acetyl-CoA carboxylase (Acc1p) [36].

Acetyl-CoA + HCO 3 − + ATP malonyl-CoA + ADP + Pi

Trong Yarowia lipolytica, gen Acc1 mã hóa enzyme này NADPH c n thi t cho ch c n ng c a enzyme synthase axit béo Ho t ng c a các enzyme malic (ME) u khi n n ng NADPH [36] Trong Yarowia lipolytica, enzyme này c mã hóa b i gen MAE1 và c xúc tác theo ph n ng d i ây:

Ti m n ng s d ng c a Yarrowia lipolytica

Ti m n ng c a n m men này ã c nh n ra t lâu nh ng nh ng n m g n ây chúng m i c quan tâm, khai thác Chúng có kh n ng s d ng các ngu n carbon khác nhau nh axit béo d bay h i, n-alkan, glucose,… phát tri n và có kh n ng s n xu t các s n ph m có giá tr cao nh :

– n xu t thu c: Yarrowia lipolytica kích thích bài ti t m t s protein nh protease, lipase và RNA ây là ch t trung gian quan tr ng trong con ng t n h p các lo i thu c gi m au vì chúng có kh n ng ch n l c l p th cao [17].

– n xu t các axit dicarboxylic hay diaxit mà ây là nguyên li u ban u t ng h p polyamide, poly este, ch t bôi tr n, [17].

– n xu t ra các ch t nh : lipase, axit citric và các enzym khác nhau nh protease, esteaza, phosphatase…, c s d ng trong cu c s ng [10],[37],[38]. t s công trình trên th gi i nghiên c u kh n ng phát tri n c a Yarrowia lipolytica trên các ngu n carbon khác nhau nh glucose th ng m i, glycerol, stearin, axit béo d bay h i, n c th i nhà máy d u olive,… v i kh n ng tích l y ch t béo khác nhau t 4,9 – 59,9% Qua ó cho th y ti m n ng ng d ng c a n m men trong l nh v c công ngh sinh h c tr ng [27],[33],[37],[38],[39],[40],[41].

N m men Yarrowia lipolytica Po1g

Po1g là ch ng n m men tái t h p xu t phát t ch ng hoang d i W29 M t s n gen không c n thi t ho c b t l i cho ch ng n m men tái t h p nh URA3, LEU2 kìm hãm quá trình sinh t ng h p ch t béo, XPR2 và AXP ti t ra protease s t các enzyme c n thi t cho quá trình sinh t ng h p H th ng vector chuyên bi t pBR (pBR322) ã t o ra s thay th trao i chéo cho URA3 b ng SUC2 t

Chính s c i t o gi ng n m men này b ng k thu t t o dòng t o ch ng n m men tái t h p và t bi n nh h ng ã t o nên ch ng Po1g, ch ng c xem nh là ngu n s n xu t SCO [42]. ng 2.5 Lo i gen và ki u hình c aYarrowia lipolytica Po1g [42]

Ch ng n m men Lo i gen Ki u hình

Leu-, AEP, AXP, Suc+, pBR platform

Các y u t môi tr ng nh h ng n s sinh tr ng c a n m men

Nhi t

Nhi t là y u t quan tr ng nh h ng nhi u n s sinh tr ng c a n m men M i loài n m men có gi i h n nhi t và ph m vi t ng tr ng khác nhau. u h t n m men là loài u m, phát tri n t t nh t trong kho ng nhi t t 20 n

30 o C M t nghiên c u bao g m kho ng 600 ch ng c a h n 100 loài n m men bao m các chi Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida,… ch ra r ng nhi t gi i h n sinh tr ng trên c a h n 98% n m men là 20 – 48 o C, m t s ít th p n 24 o C nh ng không có loài nào trên 50 o C, nhi t gi i h n d i kho ng 5 –

10 o C i v i n m men a l nh, nhi t phát tri n t i thi u kho ng -1 – 4 o C và i a là 20 o C nh h ng c a nhi t có th ng t góc sinh hóa gi i thích V c b n, t t c các chuy n i hóa h c x y ra trong t bào u c n các enzyme xúc tác Enzyme là các protein – nh ng axit amino chu i dài g p l i thành ng không gian ba chi u ph c t p Enzyme c g i là xúc tác vì chúng làm t ng c ph n ng hóa h c mà t c này ph thu c vào nhi t Trong m t ph m vi nh t nh, nhi t cao làm t ng ho t ng c a enzyme Tuy nhiên, protein s b bi n tính nhi t cao h n gi i h n cho phép Tóm l i, n m men là m t lo i c bi t c a n m, phát tri n nhanh chóng b ng các phân chia t bào Khi g p nhi t nh, n m men s ng còn nhi t m h n thì s gi t ch t n m men [43]. ng 2.6 Nhi t phát tri n t i thích c a m t vài loài n m men [43]

Dinh d ng

Ngu n carbon và n ng l ng quan tr ng nh t cho n m men phát tri n là carbohydrate, ch y u là các lo i ng nh hexose, oligosaccharide,… Nhi u loài m men s d ng glucose và vài lo i ng n khác lên men và oxi hóa M t lo t các ngu n carbon khác nhau (các lo i r u, axit h u c ,…) ch có th chuy n hóa khi hô h p hi u khí Tuy nhiên, không ph i t t c các carbohydrate u c s ng vì t bào n m men thi u enzyme chuy n i chúng hay kh n ng v n chuy n carbohydrate qua màng t bào vào trong bào t ng [43].

Nhìn chung, khi t ng n ng ng s t ng t c phát tri n c a n m men. ng th p s h n ch s t ng tr ng c a n m men vì t bào có kh phát tri n t t n n a n u nhi u carbohydrate Nh ng n u n ng này quá cao thì t c t ng tr ng c a n m men s ch ng l i và gi m d n do n ng ng v t quá kh n ng ng hóa c a t bào và gây c ch s sinh tr ng c a n m men [34],[43]. t c n m men u có th s d ng ngu n nit vô c nh các lo i mu i amonium, mu i phosphate Các ngu n nit h u c (axit amino, urê,…) c ng c m men s d ng M t s n m men có th phát tri n mà không c n ngu n vitamin,trong khi s khác yêu c u ph i có biotin, thiamin, axit nicotinic phát tri n[34],[43].

pH

Nhìn chung, n m men a thích môi tr ng h i axit (pH kho ng 4,5 – 5,5).Chúng phát tri n d dàng trong môi tr ng có pH t 3 n 10 N m men có th ch u ng c m t kho ng pH r ng, th m chí có m t vài loài phát tri n trong môi tr ng axit m nh (pH = 1,5) Vùng pH th c t cho s phát tri n c a các loài tùy thu c vào lo i axit phân ly trong môi tr ng Axit axetic th ng gây c ch h n axit lactic, propionic, citric và các lo i axit h u c , axit vô c khác Các t bào c a m men có th phát tri n và trao i ch t t t trong kho ng pH nh t nh Y u t pH nh h ng n t c v n chuy n các phân t vào trong t bào Khi u ki n pH kh c nghi t s làm h màng t bào và làm ch t t bào [43].

Nguyên li u lignocellulose

Cellulose

Cellulose là m t polyme m ch th ng có công th c hóa h c (C 6 H 10 O 5 ) n Cellulose th ng c xem nh là polyme c a D-Glucose, các phân t này liên k t i nhau b ng liên k t -1,4 glucoside gi a nguyên t carbon C1 và C4 c a hai phân t glucose li n k Các nhóm OH hai u m ch có tính ch t hoàn toàn khác nhau, c u trúc t i C1 có tính kh , trong khi ó OH t i C4 có tính ch t c a r u. Trong m ch cellulose có hai vùng c u trúc chính là vùng k t tinh và vùng vô nh hình (liên k t hydro và liên k t Van Der Waals) Trong vùng k t tinh, các phân t D-glucose c liên k t ch t ch v i nhau b ng liên k t hydro theo chi u ngang, vùng này khó b t n công b i enzyme và hóa ch t Ng c l i, trong vùng vô nh hình, cellulose liên k t không ch t v i nhau nên d b t n công Cellulose là v t li u ng i hút m, không tan trong n c ngay c dung d ch axit loãng nhi t th p hòa tan c a nó tùy thu c vào m c th y phân Cellulose khá b n v ng i tác ng c a vi sinh v t và hóa ch t, do nó c bao b c b i hemicellulose và lignin [45],[46],[47].

Hemicellulose

Hemicellulose là m t lo i polyme ph c t p và phân nhánh, th ng có công th c hóa h c (C5H8O4)n và trong s tr ng h p là (C6H10O5)n Hemicellulose là polyme không ng nh t, g m ng 6 (glucose, mannose, galactose) và ng 5(xylose và arabinose) Xylose là thành ph n ph bi n nh t trong hemicellulose, các phân t xylose liên k t v i nhau b ng liên k t -(1,4) Thành ph n ph bi n th hai trong hemicellulose là arabinose M t s thành ph n nh khác nh mannose, galactose và axit uronic c ng có m t Liên k t hình thành x ng s ng c a polyme, còn liên k t th ng hình thành các m ch nhánh C u trúc c a hemicellulose r t a ng tùy vào nguyên li u i v i g m m, D-Mannose chi m t l cao nh t, trong khi ó D-Xylose l i chi m u th trong g c ng Hemicellulose c a bã mía có m ch th ng là xylose, m ch nhánh là glucose và arabinose Mannose và xylose th ng hình thành liên k t este v i C c a lignin ch ng th m n c và s t n công c a ký sinh trùng Do hemicellulose có m ch nhánh nên t n t i d ng vô nh hình và d th y phân Hemicellulose không tan trong n c nhi t th p Nhi t b t u th y phân c a hemicellulose th p h n cellulose Khi có s hi n di n c a axit giúp i thi n kh n ng hòa tan c a hemicellulose trong n c [48],[49],[47].

Hình 2.14 M t s lo i ng trong hemicellulose [49]

Lignin

Lignin là m t i phân t polyphenol phân nhánh c hình thành trong thành bào th c v t C u trúc c a lignin r t a d ng, ph c t p tùy thu c vào nguyên li u, tu i c a nguyên li u và liên k t ch y u là liên k t ete Lignin c hình thành i 3 monome khác nhau: p-hydroxyphenylpropane, guaiacylpropane và syringylpropane i v i g c ng, guaiacylpropane và syringylpropane là thành ph n ch y u c a lignin và m t l ng nh p-hydroxyphenylpropane Còn trong g m, lignin ch y u là guaiacylpropane Trong các lo i c , lignin bao g m guaiacylpropane và syringylpropane Trong t nhiên, lignin c xem là ch t liên t gi a các t bào th c v t, liên k t ch t ch v i cellulose và hemicellulose, b o v th c v t kh i s t n công c a vi khu n b n c a nh ng liên k t này ph thu c vào b n ch t liên k t và c u trúc c a lignin, các lo i ng n tham gia liên k t Vì y, thành ph n và s phân b c a lignin là các y u t quan tr ng nh t xác nh ph ng pháp th y phân phá v thành t bào kiên c này, r t khó có th tách lignin ra.

Nhóm ch c nh h ng n ho t tính c a lignin là nhóm phenolic hydroxyl t do, methoxy, benzylic hydroxyl, benzyl alcohol và nhóm carbonyl Lignin tan t t trong dung môi dioxane, acetone, pyridine và dimethyl sulfoxide C u trúc c a lignin r t d thay i nhi t cao và pH th p nhi t cao h n 200 o C, lignin b t kh i thành ph n riêng bi t và tách ra kh i cellulose [45],[47].

Hình 2.16 Các monome trong lignin [45]

Trong nguyên li u lignocellulose, có 4 liên k t chính c xác nh bao g m liên k t ete, liên k t este, liên k t carbon - carbon và liên k t hydro B n liên k t này hình thành các liên k t gi a các phân t ng t o thành các polyme (cellulose, hemicellulose và lignin) và liên k t gi a các polyme t o thành lignocellulose [45]. Sau ây là b ng tóm t t m i liên h c a các lo i liên k t: ng 2.8 Các lo i liên k t trong các polyme [45]

Cách liên k t Lo i liên k t Các polyme ch a liên k t

Liên k t carbon - carbon Lignin Liên k t hydro Cellulose Liên k t gi a các phân t ng t o thành polyme

Hemicellulose – lignin Liên k t este Hemicellulose – lignin Liên k t gi a các polyme

Bã mía

Mía là m t lo i c s ng d i, thân y u, thân r mang các thân cây m c trên m t t cao t 2 – 5 m, ng kính 2 – 5 cm Lá c ng, th ng, hình dài nh n, g c h p, u kéo dài, buông th ng, m t d i và mép lá u ráp, gân gi a n i rõ nh ng ng n, gân bên dày c n i rõ m t d i và có màu tr ng; b lá dài, giòn, bao b c g n h t thân, có lông, ráp, dày; l i b r t ng n, m m, có lông mi C m hoa hình chùy ng n thân, mang hoa dày c Thân có t, gi a các t ch a nhi u sacarosa Có nhi u lo i mía: mía thân nh g y và th p, mía b u thân to và cao, mía v tr ng hay tím Hàm l ng ng thay i tùy theo t ng lo i mía [50]. lâu, con ng i ch tr ng mía ép l y ng mà ch a t n d ng h t ph n ph ph m th i ra Mà nh ng n m g n ây, công ngh ngày càng phát tri n giúp t o ra các s n ph m s ch và có th tái t o t ph ph m Chính vì v y, ph m vi s d ng cây mía ngày càng a d ng v i các s n ph m có giá tr nh : ng, n sinh h c, nh a sinh h c, các h p ch t hydrocarbon sinh h c (x ng, diesel,…) [15],[48],[51].

Mía là cây d tr ng thích h p v i t phù sa, n ng su t cao Di n tích mía t p trung nhi u ng b ng sông C u Long, ông Nam B , duyên h i Nam Trung B và B c Trung B Vi t Nam c ánh giá là n c có ti m n ng phát tri n cây mía, do nó phù h p v i u ki n th i ti t, khí h u và t ai n c ta Thông th ng, ng i ta tr ng mía ép l y ng [52],[53]. ng B ng Sông C u Long 21%

Trung du và mi n núi phía B c 10% ng B ng Sông H ng 1%

Tây Nguyên 16% ông Nam B 14% c Trung B và duyên h i mi n Trung

Hình 2.17 Phân b các vùng tr ng mía n c ta.

Hi n nay, m i n m n c ta s n xu t kho ng 1,3 tri u t n ng (quy mô công nghi p và dân t ch bi n), t ng ng có kho ng 3 tri u t n bã mía c th i ra[15] Theo B Nông nghi p và Phát tri n nông thôn, v s n xu t mía ng 2011-

2012, c n c thu ho ch c 17,5 tri u t n mía ây là ngu n nguyên li u lignocellulose ph bi n và d i dào Vi t Nam, thích h p cho s n xu t nhiên li u sinh h c

Trong quá trình ch bi n ng, s n ph m ph l n nh t v kh i l ng là bã và n mía Bã mía chi m kho ng 25% kh i l ng cây mía em ép và hàm l ng carbonhydrate trong bã mía cao kho ng 60 – 80% Bã mía ép th công l ng ng còn l i trong bã mía khá cao Còn bã mía công nghi p có l ng ng th p, lignin cao (> 20%) [15].

M c dù bã mía là ngu n ph ph m nông nghi p phong phú nh ng ch a c d ng hi u qu n c ta Thông th ng, mía sau khi tr i qua quá trình xay xát s c dùng làm th c n cho trâu bò, cung c p nhi t, n cho nhà máy mía ng ho c k t h p v i các ph gia khác s n xu t ván sàn ép,… Nh ng bi n pháp x lý này ch a khai thác h t ti m n ng c a bã mía, ôi khi s gây cháy và làm ô nhi m môi tr ng [15],[16] N u có th t n d ng bã mía s n xu t ra biodiesel s giúp gi i quy t v n v môi tr ng, h giá thành s n ph m và nâng cao giá tr cây mía.

Thành ph n bã mía và kh n ng chuy n i cellulose, hemicellulose thành ng là các y u t giúp ngu n nguyên li u tái t o này c s d ng s n xu t nhiên li u sinh h c [51]. ng 2.9 Thành ph n c a bã mía [48],[51]

Ph ng pháp th y phân lignocellulose

Th y phân b ng hóa h c

Th y phân hóa h c là s ti p xúc c a nguyên li u lignocellulose v i hóa ch t trong kho ng th i gian và nhi t nh t nh, t o ra các phân t ng t cellulose và hemicellulose Axit c s d ng r ng rãi trong th y phân hóa h c Axit sunphuric là axit thông d ng nh t dùng trong quá trình th y phân lignocellulose, k n là axit hydrocloric, axit nitric, axit photphoric,… Th y phân b ng axit c chia thành hai nhóm: th y phân b ng axit m c và th y phân b ng axit loãng. t s thu n l i c a th y phân b ng axit là axit có th xâm nh p vào lignin mà không c n b t k ph ng pháp ti n x lý nào, t c ph n ng nhanh h n th y phân b ng enzyme [56],[57],[58].

Hình 2.18 Ph n ng th y phân hemicellulose [57]

Hình 2.19 Ph n ng th y phân cellulose [58]

Th y phân lignocellulose b ng H 2 SO 4 hay HCl m c là quá trình th y phân ng i c do ông Braconnot khám phá vào n m 1819 [56] Th y phân b ng axit m c cho hi u qu chuy n hóa ng cao h n th y phân b ng axit loãng Thêm vào ó, quá trình này c th c hi n nhi t th p (kho ng 40 o C) Tuy nhiên, ng axit trong quá trình này r t cao (30 – 70%) làm cho thi t b ph n ng d b n mòn Vì v y, yêu c u thi t b ph n ng ph i là nh ng h p kim t ti n ho c nh ng v t li u phi kim c bi t Ngoài ra, trung hòa axit c n m t l ng l n th ch cao và thu h i axit là m t quá trình yêu c u nhi u n ng l ng Chi phí u t và b o trì r t l n Vì nh ng lý do này làm cho ti m n ng và kh n ng ng d ng c a quá trình này trong l nh v c công nghi p r t th p M c dù có nh ng b t l i nêu trên nh ng th y phân b ng axit m c v n c quan tâm ó là quá trình biosulfurol c tìm ra b i m t nhóm nghiên c u Hà Lan Trong quá trình này, sinh kh i ti p xúc v i axit H 2 SO 4 70%, sau ó ti n hành th y phân b ng cách thêm n c vào Axit c thu h i m t ph n b ng màng anion, m t ph n b ng quá trình x lý n c th i khí d i d ng H 2 S [55],[56],[58].

2.10.1.2 Th y phân b ng axit loãng

T nh ng h n ch này, th y phân b ng axit loãng c nghiên c u r ng rãi và có kh n ng áp d ng quy mô l n Quá trình này có m t s thu n l i nh n gi n, nhanh chóng, không yêu c u thu h i dung môi Th y phân nguyên li u lignocellulose b ng axit loãng, cellulose và hemicellulose u c th y phân áng u ki n th c hi n t ng i nh nhàng nh n ng axit t 1 n 10%, nhi t ph n ng v a ph i (trong kho ng 100 – 150 o C) trong th i gian ng n Các polysaccharide liên k t v i lignin b ng liên k t este nên d b th y phân Th t v y, liên k t gi a hemicellulose và lignin d b th y phân nhi t nh khi có s hi n di n c a axit hay baz m t nhi t nh t nh, ph n ng phân h y liên t c x y ra, d n n s hình thành m t vài lo i furan (furfural, 5-hydroxymethylfurfural), axit formic và axit levulinic, Các ph n ng này làm gi m hi u su t chuy n hóa ng trong quá trình th y phân H n n a, các s n ph m không mong mu n này s c ch s lên men vi sinh v t T nh ng u nêu trên cho th y th i gian, nhi t ph n ng và n ng axit là nh ng y u t quan tr ng nh h ng m nh n quá trình th y phân Chính vì v y, c n ph i tìm ra các u ki n t i u cho quá trình th y nguyên li u lignocellulose M t s nghiên c u ng h c th y phân bã mía b ng axit loãng cho th y r ng thành ph n ng chính trong dung d ch sau th y phân là xylose, glucose, arabinose và các ch t c ch nh fufural, 5-hydroxymethylfurfural, axit axetic Quá trình th y phân c th c hi n các u ki n khác nhau nh thay i nhi t t 90 – 120 o C, n ng axit t 1 – 6% Th y phân v i các lo i bã mía và axit khác nhau (H 2 SO 4 , HCl, HNO 3 , H 3 PO 4 ) Hi u su t chuy n hóa ng c a hemicellulose khá cao h n 80% trong các u ki n nêu trên [44],[59],[60],[61].

Th y phân b ng enzyme

Th y phân b ng enzyme là quá trình chuy n hóa cellulose và hemicellulose thành các lo i ng n b ng các enzyme c bi t Ph ng pháp này r t c quan tâm nghiên c u, có th thay th ph ng pháp th y phân b ng axit u m a th y phân b ng enzyme là hi u su t chuy n hóa ng cao, không t o ra ch t c ch , không n mòn thi t b , u ki n th c hi n nh (pH 4,5 – 5 và nhi t 40 –

50 o C), tiêu th n ng l ng th p, không c h i, ít nh h ng n môi tr ng Tuy nhiên, do th i gian ph n ng dài (kho ng vài ngày) và giá thành c a enzyme cao làm cho ph ng pháp này không th m r ng quy mô công nghi p Bên c nh ó, ng enzyme trong quá trình th y phân s gi m i áng k n u có s hi n di n c a lignin vì nó c xem là v t li u h p thu enzyme Và enzyme r t khó t n công vào u trúc cellulose do nó c bao b c b i hemicellulose và lignin Chính vì v y,nguyên li u ph i x lý s b tr c khi th y phân t ng t c ph n ng [44],[56].

Cellulase c dùng b gãy liên k t trong cellulose t o ra glucose. Cellulase là h n h p c a 3 lo i ezyme: endo-glucanase, exo-glucanase và - glucosidase; c t o thành t các vi khu n, n m (Trichoderma, Penicillium và

Aspergillus,…) Các enzyme này có tác d ng khác nhau trong quá trình th y phân.

Endo-glucanase t n công vào c u trúc bên trong c a cellulose Nó phân c t liên k t liên k t -1,4 glucoside c a c u trúc cellulose các v trí ng u nhiên t o ra các chu i t do Exo-glucanase t n công các v trí c th (các u không kh trong cellulose) t o cellobiose ho c glucose -glucosidase chuy n i cellobiose thành glucose [44].

Hình 2.21 S ph n ng th y phân cellulose b ng enzyme cellulase [44]

Hemicellulose là h n h p các polyme c a pentose (xylose và arabinose), hexoses (mannose) Xylan là thành ph n chính c a hemicellulose Thành ph n chính trong xylan bao g m xylose, L-arabinose, và axit D-glucoronic Th y phân hoàn toàn xylan c n có enzyme endo -1,4 xylanase, -xylosidase và m t s ho t ng enzyme ph ki n nh -L-arabinosidase và -glucoronidase Endo-xylanase n công c u trúc xylan m t cách ng u nhiên -xylosidase th y phân xylooligosacharide thành xylose Các enzyme -L-arabinosidase và -glucoronidase th y phân xylan thành arabinose và axit 4-O-methylglucuronic [44]. ng 2.10 So sánh các ph ng pháp th y phân [56],[62]

Ph ng pháp th y phân u m Khuy t m

– Nhi t ph n ng th p – Hi u su t chuy n hóa ng cao

– Tiêu hao nhi u axit – Thi t b ch ng n mòn – n nhi u n ng l ng cho quá trình thu h i axit

– Th i gian ph n ng dài (2 –

Th y phân b ng axit loãng

– Tiêu th ít axit – Th i gian ph n ng ng n

– Nhi t ph n ng cao – Hi u su t chuy n hóa ng th p h n – Thi t b ch ng n mòn – Hình thành các ch t c ch

– Nhi t ph n ng th p – Hi u su t chuy n hóa ng cao – Không có ch t c ch

– Th i gian ph n ng dài (vài ngày)

Ch t c ch

Các s n ph m thoái hóa ng

M c trùng h p th p và tính ch t vô nh hình c a cellulose, hemicellulose ng trong quá trình th y phân d n n phóng thích ra hexose (glucose, galactose và mannose) và pentose (arabinose và xylose) vào ph n tan c trong n c Khi u ki n ph n ng khá kh c nghi t, pentose b kh n c hình thành furfural, t ng t 5- hydroxymethylfurfural (HMF) c t o thành t s kh n c c a hexose Furfural và HMF gây c ch tr c ti p n các enzyme nh alcohol dehydrogenase (ADH), pyruvate dehydrogenase (PDH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH) ây là các enzyme c n thi t cho s trao i ch t c a vi sinh v t HMF ít c h i h n furfural và n ng c a chúng th p trong th y phân cellulose và hemicellulose Nghiên c u ng h c ch ra r ng s hình thành các ch t c ch này t ng m nh khi ph n ng nhi t cao và th i gian dài [54],[55].

Hình 2.23 Các s n ph m thoái hóa ng có th hình thành trong quá trình th y phân b ng axit [54]

Các s n ph m thoái hóa lignin

Các h p ch t nh aromatic, polyaromatic, phenolic và aldehyde c hình thành t s suy thoái lignin Các h p ch t phenolic gây c ch áng k và c h i n furfural và HMF ngay c n ng th p Chúng gây ra s phân vùng và m t tính toàn v n c a màng t bào làm gi m s phát tri n t bào và ng hóa ng.

Th i gian và nhi t ph n ng là hai y u t chính nh h ng n s hình thành các ch t c ch này [54],[55].

Các h p ch t có ngu n g c t c u trúc lignocellulose

Ngoài các ch t c ch nêu trên, chính b n thân lignocellulose c ng có ch t c ch t nhiên (nh a có tính axit, taninic, các axit terpen, sáp, các h p ch t ch ng oxi hóa,…) Các h p ch t này có ngu n g c t s t v c a cây ch ng l i s t n công a vi sinh v t, sâu h i Thành ph n c a các ch t c ch t nhiên r t ph c t p và thay i tùy theo t ng lo i cây, gi a các cây cùng lo i và các b ph n khác nhau a cây Axit axetic có ngu n g c t các nhóm acetyl trong hemicellulose c phóng thích trong quá trình th y phân Nó khu ch tán vào trong t bào làm pH bên trong gi m gây c ch ho t ng t bào c tính này thay i tùy theo u ki n lên men Ch t chi t tách ít c h n các d n xu t t lignin và axit axetic.

S hình thành các ch t c ch t nhiên và axit axetic là u không th tránh kh i trong th y phân lignocellulose, có th lo i b hay làm gi m nh h ng c h i a chúng b ng cách nâng cao pH hay chuy n i chúng thành nh ng s n ph m không c h i [54],[55].

Ion kim lo i n ng

Các ion kim lo i n ng (s t, crom, niken, ng,…) có th xu t hi n do s n mòn thi t b th y phân Chúng c ch các enzyme trong quá trình trao i ch t c a vi sinh v t [54],[55].

Ph ng pháp kh c

Bay h i

Bay h i b ng chân không ch có th lo i b m t s h p ch t d bay h i nh axit axetic, furfural và vanilin Các ch t c h i không d bay h i (các ch t c ch nhiên và các d n xu t t lignin) v n không thay i [55],[54],[66].

Trung hòa

Sau khi th y phân, n ng axit trong dung dich r t cao Do ó, trung hòa là c c n thi t cho quá trình lên men ây là ph ng pháp r ti n và hi u qu v i ng nh các ch t c ch nh fufural, HMF và axit axetic KOH và NaOH là hai lo i ki m th ng dùng trong quá trình trung hòa (pH 6 – 7) Sau khi trung hòa, các t t a t o thành t ch t c ch và mu i c lo i b d dàng b ng cách l c chân không [63],[64],[66].

Than ho t tính

Than ho t tính có kh n ng lo i b các h p ch t trong pha l ng Tuy nhiên, ph ng pháp này ph thu c vào nhi u y u t nh nhi t , pH, th i gian ti p xúc, l than ho t tính so v i dung d ch kh c ây là ph ng pháp hi u qu t hi u su t cao mà không nh h ng n n ng ng trong dung d ch Than ho t tính p th t t các axit y u trong môi tr ng có pH th p và baz y u trong dung d ch pH cao [54],[63],[66].

Nh a trao i ion

Nh a trao i ion d s d ng và b o trì Kh c b ng nh a trao i ion có hi u qu lo i b các ch t c ch d n xu t t lignin, axit axetic và fufural Bên c nh ó, nh a trao i ion có th tái sinh và tái s d ng giúp gi m chi phí cho quá trình.Tuy nhiên, s d ng nh a trao i ion s d n n hao h t m t l ng ng áng k[55],[65],[66].

Enzyme

Kh c b ng enzyme là s d ng các enzyme c bi t có tác d ng v i các ch t c ch hi n di n trong môi tr ng th y phân b ng axit n c nh s d ng enzyme laccase lo i b có ch n l c và hoàn toàn các monome phenolic và axit phenolic nh ng nó không nh h ng n axit axetic và các h p ch t furan u m a ph ng pháp enzyme là thân thi n v i môi tr ng, ít có ph n ng ph , ít tiêu n n ng l ng [64],[66].

Overliming

M i ph ng pháp kh c u có nh ng u, nh c m khác nhau Trong ó, overliming c xem là ph ng pháp kh c chi phí th p và hi u qu cho quá trình th y phân sinh kh i lignocellulose b ng axit loãng Ki m hóa c s d ng thông d ng nh t, giúp c i thi n quá trình lên men Ph ng pháp này có th chuy n i furan thành các h p ch t ít c h i h n Trong ph ng pháp này, Ca(OH)2 khan c thêm vào t t pH t ng lên 10 – 12, gi nguyên u ki n t vài phút n vài ngày, sau ó gi m pH xu ng 5 – 6 N ng ch t c ch d bay h i nh fufural, HMF gi m m nh khi pH, nhi t và th i gian t ng Tuy nhiên, nó không tác d ng i axit axetic Ph n k t t a sau khi kh c có th t n d ng làm thành các s n ph m có giá tr nh th ch cao ( n n t ng, bó x ng) H n ch c a ph ng pháp này là gây hao h t ng kho ng 10% sau khi kh c [64],[65]. ng 2.11 Các ph ng pháp kh c khác nhau áp d ng cho ph ng pháp th y phân lignocellulose b ng axit [55],[65],[66]

Ph ng pháp kh c thay i thành ph n ch t c ch s i Than ho t tính Lo i b các h p ch t phenolic (95,4%) m r t lúa lúa mì

Nh a trao i ion và overliming

Lo i b các h p ch t furan (90,36%), phenolic (77,44%) và axit axetic (96,29%)

Cây d ng lá rung Bay h i Lo i b các h p ch t furfural (100%), axit axetic (54%) và vanillin (29%). Cây

Lo i b các h p ch t furan (41,75%) và phenolic (33,21%) Hao h t ng (7,61%)

Bã mía Enzyme laccase Lo i b các h p ch t phenolic (80%).

Ph ng pháp trích ch t béo

Nh ng n m g n ây, ch t béo c a vi sinh v t cho d u r t c quan tâm, do có nhi u ti m n ng ng d ng th ng m i nh s n xu t biodiesel, d c ph m dinh ng, d c ph m và th c n cho nuôi tr ng th y s n Vì v y, các nhà khoa h c nghiên c u c g ng phân l p và t i u hóa quá trình chi t tách t các ch ng vi sinh t này M c tiêu c a trích ly ch t béo là tách ch t béo ra kh i t bào mà không làm thay i thành ph n ch t béo Hi u qu c a quá trình chi t tách ph thu c vào s phân c c c a ch t béo so v i dung môi Các ch t béo phân c c (glycolipid, phospholipid,…) tan t t trong dung môi phân c c Ng c l i, ch t béo không phân c (triacylglycerol,…) tan t t trong dung môi không phân c c S th t là các ch t béo khác nhau có phân c c khác nhau nên không th ch n m t dung môi h u c duy nh t chi t tách t t c ch t béo trong t bào Vì v y, yêu c u dung môi chi t tách ph i có tính hòa tan cao vào trong ch t béo kh n ng lôi kéo ch t béo ra kh i màng t bào, lipoprotein và glycolipid [23],[67] Các ph ng pháp trích ly ch t béo hi u qu và ng d ng ph bi n:

Chi t tách b ng dung môi d a trên kh n ng hòa tan c a các ch t vào nhau.

Vi c l a ch n dung môi r t quan tr ng trong k thu t này u m c a ph ng pháp này là chi phí th p nh ng nó là m t quá trình không liên t c và t n nhi u lao ng [23].

Ph ng pháp chi t Soxhlet c mô t b i Soxhlet vào n m 1879 ây là ph ng pháp trích ly bán liên t c thông d ng nh t dùng trong chi t tách ch t béo t th c n và c hi p h i các nhà hóa phân tích chính th ng (AOAC) công nh n là ph ng pháp chu n phân tích ch t béo thô Theo mô t c a Soxhlet, d u và ch t béo t m u r n c chi t tách b ng cách r a m u liên t c l p i l p l i nhi u l n i dung môi h u c (th ng là hexan hay ete d u h a) thông qua ng ch y tràn. Trong ph ng pháp này, m u ph i c s y khô, nghi n nh và t trong ng cellulose, sau ó t ng cellulose vào tr chi t Phía d i tr chi t g n v i bình ch a dung môi, phía trên g n v i ng sinh hàn Dung môi c gia nhi t n nhi t sôi Các ch t c n chi t s c dung môi lôi kéo ra kh i m u Tr chi t c thi t k sao cho khi dung môi ngâm m u v t quá m t m c nh t nh, nó s ch y tràn xu ng bình ang un sôi phía d i Khi k t thúc, bình ch a dung môi và ch t béo s c cô quay lo i b dung môi và cân kh i l ng ch t béo trong bình Tính ph n tr m ch t béo trong kh i l ng m u ban u [23],[67],[68].

Hình 2.24 H th ng chi t Soxhlet [68]

Chi t Soxhlet c áp d ng cho các m u có hàm l ng ch t béo cao Ph n trích ly c có l n t p ch t nên c g i là ch t béo t ng hay d u thô u m a chi t soxhlet là m u c ti p xúc liên t c v i dung môi, giúp lôi kéo hoàn toàn các ch t c n chi t ra kh i m u, d th c hi n, dung môi có th thu h i và tái s d ng.

Hi u su t chi t t ng i cao do nhi t trong h th ng cao h n nhi t phòng, giúp ch t béo và dung môi t ng tác t t h n Tuy nhiên, chi t Soxhlet có m t s n ch nh th i gian chi t dài, m t s ch t có th b phân h y, l ng dung môi s ng l n Chính vì v y, có th s d ng m t s d ng n ng l ng h tr rút ng n th i gian và hi u qu chi t tách nh chi t soxhlet có h tr c a vi sóng, chi t soxhlet có h tr c a sóng siêu âm,…[23],[67]

Chi t tách ch t l ng siêu t i h n là m t l a ch n y h a h n và ti m n ng V b n, k thu t này t ng t nh chi t Soxhlet ngo i tr dung môi s d ng là ch t ng siêu t i h n Dùng ph ng pháp này giúp h n ch s d ng dung môi h u c , làm gi m các v n v l u tr và x lý chúng Bên c nh l i ích sinh thái, kh n ng khu ch tán c a ch t l ng siêu t i h n l n h n nhi u so v i dung môi thông th ng, làm t ng t c trích ly và h n ch s phân h y các ch t trong m u Ph ng pháp trích ly b ng ch t l ng siêu t i h n có th thay th các ph ng pháp trích ly truy n th ng CO2 là dung môi c dùng ph bi n nh t trong ph ng ph ng pháp trích ly này vì nó r ti n, tinh khi t cao, an toàn khi s d ng, không gây cháy, không c, thích h p v i các s n ph m không n nh nhi t (b o v ch t béo không b oxy hóa) Nh ng n u ch s d ng duy nh t CO2là dung môi chi t tách ch trích ly các ch t béo không phân c c Vì v y, m t s dung môi phân c c (methanol,enthanol,…) c thêm vào CO 2 siêu t i h n nh là ch t ng dung môi c i thi n hi u qu trích ly ch t béo Tuy nhiên, chi phí u t và v n hành cho ph ng pháp này r t cao [67].

Ph ng pháp xác nh l ng ng

nh l ng ng kh b ng ph ng pháp DNS

Ph ng pháp này d a trên ph n ng t o màu gi a ng kh v i thu c th axit 3,5 dinitrosalicylic (DNS) C ng màu c a h n h p ph n ng t l thu n i n ng ng kh trong m t ph m vi nh t nh So màu b c sóng 540nm. a theo th ng chu n c a glucose tinh khi t v i thu c th DNS s tính c hàm l ng ng kh c a m u nghiên c u ây là ph ng pháp n gi n, d th c hi n xác nh t ng l ng ng kh trong dung d ch th y phân [69],[70].

Hình 2.25 Ph ng trình ph n ng t o màu gi a ng kh và DNS

Ph ng pháp xác nh thành ph n ng

Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao th ng c dùng phân tích thành ph n ng trong lignocellulosic Xylose, glucose, arabinose là các ng c a lignocellulosic sau khi th y phân [16],[69],[65],[71] S c ký l ng hi u n ng cao là t ph ng pháp chia tách trong ó pha ng là ch t l ng và pha t nh là ch t r n. Quá trình này d a trên c ch h p ph , phân b , trao i ion hay phân lo i theo kích (rây phân t ) ây là ph ng pháp c s d ng r ng rãi và ph bi n hi n nay i m t s u m nh t c nhanh, nh y cao, tách cao, thích h p cho vi c tách các h p ch t khó bay h i ho c d b phân h y b i nhi t [72],[73].

Ph ng pháp xác nh thành ph n ch t béo

Ph ng pháp s c ký khí th ng c dùng phân tích thành ph n c a ch t béo Các axit béo chính trong ch t béo c tích l y trong n m men này là axit oleic, axit linoleic [6],[10],[18],[74] S c ký khí là ph ng pháp s c ký mà pha t nh là ch t r n ho c l ng và pha ng là ch t khí ây là m t ph ng pháp phân l p,phân tích và nh danh các h p ch t hóa h c [23],[72].

I DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

N i dung nghiên c u

Quá trình th y phân

Th c hi n ph n ng th y phân, kh o sát m t s y u t nh h ng n quá trình th y phân nh th i gian, n ng axit, t l bã mía và dung d ch axit, nhi t u sau khi ph n ng:

– Xác nh l ng ng thu c b ng ph ng pháp xác nh hàm l ng ng kh

– Xác nh thành ph n hóa h c c a ng b ng ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC).

Quá trình nuôi c y

m men Yarrowia lipolytica Po1g c t ng sinh – nhân gi ng trong môi tr ng YPD, sau ó ti n hành nuôi c y trong môi tr ng bã mía th y phân ã kh c Kh o sát m t s y u t nh h ng n s sinh tr ng c a n m men và hàm ng ch t béo thu c Xác nh thành ph n hóa h c c a ch t béo và axit béo ng ph ng pháp s c ký khí (GC).

Ph ng ti n và a m thí nghi m

Ph ng ti n nghiên c u

3.2.1.2 Thi t b và d ng c u nhi t Huber s y Memmert

JSSI - 100C c y vô trùng Clean bench

Cân n t Satorius Cân s y m Satorius p khu y t Satorius Máy o UV-VIS Cary 50 Conc Thi t b chi t Soxhlet Barnstead a Petri ng nghi m l n, nh Bình tam giác 500 mL

Nguyên li u là bã mía c thu gom t ch bán n c mía trên ng Tr ng nh, ph ng An C , qu n Ninh Ki u, thành ph C n Th và nhà máy ng

Ph ng Hi p, a ch : s 10, ng 1 tháng 5, ph ng Hi p Thành, th xã Ngã B y, nh H u Giang.

Ch ng n m men Yarrowia lipolytica Po1g t công ty YEASTERN Biotech

Co.Ltd s d ng trong nghiên c u này c cung c p b i phòng thí nghi m K thu t sinh h c, i h c Công ngh Qu c gia ài Loan.

a m thí nghi m

Phòng thí nghi m h u c - Khoa Công Ngh - Tr ng i h c C n Th

Phòng thí nghi m vi sinh - Khoa Môi Tr ng và Tài Nguyên - Tr ng i h c n Th

Th i gian th c hi n: 6 tháng.

Ph ng pháp nghiên c u

Ti n x lý

Tr c khi th y phân, bã mía ph i c r a s ch em s y khô nhi t 50 o C trong 24 gi , sau ó c t nh kho ng 0,5 cm và xay nhuy n, sàng v i kích th c nh n 0,71 mm M c ích c a quá trình này giúp cho axit d dàng ti p xúc vào c u trúc bã mía, phá v liên k t gi a cellulose, hemicellulose và lignin Bã mía sau khi lý s l u tr trong t l nh 4 o C, khi nào c n s l y ra s d ng.

Hình 3.2 S quá trình ti n x lý bã mía a s ch

Sàng Kích th c nh h n 0,71 mm Xay khô u tr

Hình 3.3 Bã mía ép th công (A) và bã mía t nhà máy (B)

Hình 3.4 Bã mía sau khi s y (A) và bã mía c t nh (B)

Hình 3.5 Máy xay bã mía

Quá trình th y phân bã mía

c tiêu c a quá trình th y phân bã mía là thu c dung d ch có n ng ng cao nh t Các y u t nh th i gian, n ng axit, t l bã mía và dung d ch axit, nhi t nh h ng n quá trình th y phân Vì v y, ti n hành thí nghi m kh o sát m c nh h ng c a chúng.

Cách th c hi n: a Kh o sát nh h ng c a th i gian th y phân n n ng ng t ng thu c: cân 1g bã mía và hút 20 mL H 2 SO 4 3% b ng pipet cho vào ng nghi m l n, t ng nghi m vào b u nhi t 90 o C, th y phân các th i gian 2, 4, 6, 8 gi o t k t qu và ch n th i gian thích h p. b Kh o sát nh h ng c a n ng axit n n ng ng t ng thu c: cân 1g bã mía và hút 20 mL H2SO4 b ng pipet v i các n ng axit 1, 2, 3, 4% cho vào ng nghi m l n, t ng nghi m vào b u nhi t 90 o C Th y phân th i gian t t nh t c a thí nghi m tr c o t, ánh giá k t qu và ch n n ng axit thích h p. c Kh o sát nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n n ng ng t ng thu c: cân 1g bã mía và hút H 2 SO 4 b ng pipet các m c dung d ch axit khác nhau (15, 20, 25, 30 mL), cho vào ng nghi m l n, t ng nghi m vào b u nhi t 90 o C Th y phân th i gian t t nh t c a thí nghi m (a) và n ng axit t t nh t c a thí nghi m (b) o k t qu và ch n t l bã mía/dung d ch axit thích h p. d Kh o sát nh h ng c a nhi t th y phân n n ng ng t ng thu c: cân 1g bã mía và hút H2SO4 b ng pipet, cho vào ng nghi m l n, t ng nghi m vào b u nhi t các m c nhi t 60, 70, 80, 90 o C Th y phân th i gian t t nh t c a thí nghi m (a), n ng axit t t nh t c a thí nghi m (b) và l ng axit t t nh t c a thí nghi m (c) o t k t qu và ch n nhi t thích h p.

Sau khi th y phân, thu c h n h p r n và l ng, sau ó l c chân không lo i ph n bã r n này Ph n l ng thu c em i o n ng ng t ng b ng ph ng pháp DNS Ph n dung d ch thu c sau khi lo i b bã r n g i là dung d ch bã mía th y phân T các thí nghi m trên, tìm c u ki n t t nh t v th i gian, ng axit, t l bã mía/dung d ch axit và nhi t

Quá trình kh c

Sau khi th y phân, dung d ch ph i c kh c lo i b các ch t c ch ng th i nâng pH lên giúp n m men phát tri n t t h n Ph ng pháp vôi hóa (overliming) c áp d ng trong nghiên c u này.

– Cho t t 20 g Ca(OH)2 vào 700 mL dung d ch bã mía th y phân, khu y u.

– Khi pH t ng n 10 thì ng ng khu y, yên trong 30 phút.

– u ch nh pH xu ng kho ng 6,5 b ng H2SO4.

– Dung d ch sau khi kh c ph i c l c chân không 2 l n lo i b h t t t a, l u tr dung d ch 4 o C cho n khi c s d ng.

Quá trình nuôi c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g

Sau giai n th y phân bã mía, ti n hành kh o sát các y u t nh h ng n phát tri n c a n m men và hàm l ng ch t béo thu c.

N m men c l u gi trong môi tr ng YPDA (Yeast extract peptone dextrose agar) nhi t 4 o C T ng sinh – nhân gi ng trong môi tr ng YPD (Yeast extract peptone dextrose) YPD là m t môi tr ng phát tri n n m men Sau ó, a n m men vào môi tr ng nuôi c y v i t l th tích 1/10, chúng sinh tr ng và phát tri n trong môi tr ng này Ti n hành thí nghi m kh o sát m t s u t nh h ng n quá trình nuôi c y.

Cách th c hi n: a Kh o sát nh h ng c a th i gian nuôi c y n n ng sinh kh i và hàm ng ch t béo thu c: cân 1,5 g cao n m men và 1,5 g pepton hòa tan vào 300 mL dung d ch bã mía th y phân ã kh c (20 g/L) Chi u UV môi tr ng nuôi y kho ng 30 – 45 phút Th c hi n nuôi c y t 1 n 7 ngày, nhi t 26 o C và c l c 160 vòng/phút o t k t qu t ng ngày và ch n ra th i gian nuôi c y thích h p. b Kh o sát nh h ng c a các ngu n carbon khác nhau n n ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo thu c: cân 1,5 g cao n m men và 1,5 g pepton hòa tan vào 300 mL các dung d ch D-Glucose (20 g/L), bã mía th y phân ch a và ã kh c 20 (g/L) Chi u UV môi tr ng nuôi c y kho ng 30 – 45 phút Th c hi n nuôi c y th i gian t t nh t c a thí nghi m tr c, nhi t 26 o C và t c l c 160 vòng/phút o t k t qu và ch n ra ngu n carbon thích h p. c Kh o sát nh h ng c a các ngu n nit khác nhau n n ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo thu c: cân 1,5 g cao n m men vào 300 mL dung d ch bã mía th y phân ã kh c 20 (g/L) Cân 1,5 g pepton vào môi tr ng v a pha.

Th c hi n t ng t i v i urê, NH4NO3, (NH4)2SO4 Chi u UV môi tr ng nuôi y kho ng 30 – 45 phút Ti n hành nuôi c y th i gian t t nh t c a thí nghi m (a), nhi t 26 o C và t c l c 160 vòng/phút o t k t qu và ch n ra ngu n nit thích h p. d Kh o sát nh h ng c a nhi t nuôi c y n n ng sinh kh i và hàm ng ch t béo thu c: cân 1,5 g cao n m men và 1,5 g ngu n nit thích h p c a thí nghi m (c) hòa tan vào 300 mL dung d ch bã mía th y phân ã kh c (20 g/L). Chi u UV môi tr ng nuôi c y kho ng 30 – 45 phút Ti n hành nuôi c y th i gian t nh t c a thí nghi m (a), t c l c 160 vòng/phút và các nhi t 20, 26, 30,

37 o C o t k t qu và ch n ra nhi t thích h p. e Kh o sát nh h ng c a n ng ng t ng n n ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo thu c: cân 1,5 g cao n m men và 1,5 g ngu n nit thích h p a thí nghi m (c) hòa tan vào 300 mL dung d ch bã mía th y phân ã kh c các n ng ng t ng khác nhau Chi u UV môi tr ng nuôi c y kho ng 30 – 45 phút Ti n hành nuôi c y th i gian t t nh t c a thí nghi m (a), nhi t t t nh t a thí nghi m (d) và t c l c 160 vòng/phút o t k t qu và ch n ra n ng ng t ng thích h p.

C y chuy n n m men trên YPDA

Cách pha môi tr ng YPDA

Pha 300 mL môi tr ng YPDA ( D-Glucose 20 g/L, cao n m men 10 g/L, pepton 10 g/L, agar 20 g/L).

– Cân 6 g D-Glucose hòa tan vào 100 mL n c c t thu c dung d ch D- Glucose (dung d ch A) Thanh trùng dung d ch A. m men Yarrowia lipolytica Po1g

Môi tr ng th y phân bã mía

Kh o sát y gi ng ng sinh – Nhân gi ng

– Cân 3 g cao n m men và 3 g pepton hòa tan vào 200 mL n c c t (dung ch B) Kh trùng dung d ch B ngu i.

– Tr n dung d ch A và B l i v i nhau trong bu ng c y Chi u UV kho ng 30 – 45 phút. y chuy n

– d ng các a Petri vô trùng kích th c b ng nhau 30 mL môi tr ng ã c ngu i t bình tam giác 500 mL vào a cho th ch r n l i.

– Chi u UV kho ng 30 – 45 phút.

– y ch ng n m men lên a v a chu n b : t kim c y trên ng n èn c n, qu t m t ít n m ngu n r i quét lên a nh ng ng th ng.

Hình 3.8 Quá trình c y chuy n n m men trên YPDA

Làm ngu i Chi u UV a Petri Môi tr ng YPDA

Làm ngu i (45 – 50 o C) + Dung d ch D-Glucose ã c thanh trùng) Cao n m men

Dung d ch p kh trùng (121 o C, 30 phút) y n m men

T ng sinh – nhân gi ng trong môi tr ng YPD

Cách pha môi tr ng YPD (D-Glucose 20 g/L, pepton 10 g/L, cao n m men

10 g/L) t ng t nh pha YPDA ây là môi tr ng l ng nên không có agar. ng sinh – nhân gi ng

– Sau khi h p kh trùng, môi tr ng YPD c ngu i trong bu ng c y. – Chi u UV kho ng 30 – 45 phút.

– y kim c y ( ã h qua l a) qu t m t ít n m gi ng trên n n th ch YPDA vào trong các bình tam giác này.

Hình 3.10 N m men phát tri n trong YPD

Ph ng pháp xác nh hàm l ng ng

L ng ng kh c xác nh d a trên vi c o m t quang c a ph c màu s m c tr ng c t o ra gi a ng kh và thu c th DNS b c sóng 540 nm C ng màu c a h n h p ph n ng t l thu n v i n ng ng kh

– Thu c th DNS ặ Cõn 4 g NaOH hũa tan vào 50 mL n c c t thu c dung dich NaOH (dung dich A). ặ Cõn chớnh xỏc 2,5 g DNS hũa tan vào dung d ch A trong b u nhi t

70 o C. ặ Pha 75 g Postassium sodium tartrate tetrahydrate vào trong 100 mL c c t, khu y u trong b u nhi t 70 o C (dung d ch B). ặ Tr n dung d ch A và B l i v i nhau, thờm n c c t d nh m c 250 mL ặ Thu c th DNS ph i ng trong bỡnh t i 4 o C N u th i gian l u tr có th làm DNS m t kh n ng kh , do ó ch nên s d ng thu c th trong 1 tháng sau khi pha.

– D-Glucose chu n 3 g/L: ặ Cõn chớnh xỏc 6 g D-Glucose hũa tan vào 200 mL n c c t. ặ dung d ch v a pha vào bỡnh nh m c 500 mL. ặ Thờm n c c t vào bỡnh nh m c. ng ng chu n và xác nh hàm l ng ng

– T dung d ch D-Glucose chu n 3 g/L, xây d ng ng chu n v i D- Glucose chu n có n ng t 0 – 3 g/L.

– Th c hi n m t lo t 6 ng nghi m nh theo b ng 3.1 ng nghi m 0 1 2 3 4 5 6

OD 540nm ng 3.1 Các b c ti n hành d ng ng chu n D-Glucose

– ng nghi m s ch và khô c b c gi y b c tránh DNS b phân h y b i ánh sáng.

– Cho 1mL dung d ch D-Glucose chu n vào các ng nghi m ã c chu n tr c ó, thêm 3 mL thu c th DNS.

– o m t quang b c sóng 540 nm v i ng i ch ng là n c c t.

– V ng chu n D-Glucose v i tr c tung là m t quang (OD), tr c hoành là n ng ng v i b c sóng 540 nm Trong ó: OD = OD ng m u – OD ng ki m tra Tìm ph ng trình bi u di n ng chu n d ng y = ax + b.

– Ph n ng c a dung d ch c n phân tích v i thu c th DNS c th c hi n ng t nh trên.

– D a vào ng chu n, tính n ng ng kh trong m u.

Ph ng pháp xác nh n ng sinh kh i

T bào vi sinh v t khi hi n di n trong môi tr ng s c n tr ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng t i và làm cho môi tr ng tr nên c c t l thu n i m t t bào Vì v y, s l ng t bào vi sinh v t trong môi tr ng có th xác nh gián ti p nh ph ng pháp o m t quang b c sóng 600 nm, thông qua c. h p thu là s o l ng sinh kh i ch không ph i là s l ng t bào Kích th c t bào c ng thay i tùy thu c vào các môi tr ng nuôi c y khác nhau Vì y, ng cong chu n ph i c xây d ng theo t ng môi tr ng nuôi c y và t ng ch ng vi sinh v t riêng bi t N u m t t bào quá cao s làm m t chính xác c a h p thu Vì v y, khi xác nh m t t bào b ng máy o UV-VIS, dung d ch huy n phù t bào c n ph i pha loãng n nh ng n ng thích h p có c p thu chính xác. ng ng chu n sinh kh i

– Rà h p thu môi tr ng YPD c a máy UV-VIS.

– Pha loãng môi tr ng YPD thành các môi tr ng có c khác nhau c sóng 600 nm t các giá tr g n b ng 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8.

– o OD 600 nm c a các môi tr ng v a pha, ghi s li u th c t

– M u ã pha c ly tâm, r a v i n c c t 2 l n, cân kh i l ng sinh kh i thu c.

– V ng chu n sinh kh i v i tr c tung là n ng sinh kh i, tr c hoành là t quang v i b c sóng 600 nm Trong ó: OD = OD ng m u – ODYPD Tìm ph ng trình bi u di n ng chu n d ng y = ax + b. o m u thí nghi m o c c a môi tr ng c n xác nh T giá tr OD o c suy ra hàm ng sinh kh i t ng chu n.

Ph ng pháp chi t Soxhlet

Ch ng c t h i l u liên t c m u v i dung môi h u c , làm ch t c n phân tách trong m u tan vào dung môi h u c Ch t c n phân tách ph i tan t t vào trong dung môi h u c trích ly hoàn toàn ch t béo t nguyên li u Do có l n t p ch t, ph n trích ly c g i là ch t béo t ng hay d u thô Hàm l ng ch t béo t ng có th tính ng cách cân tr c ti p l ng d u sau khi ch ng c t lo i s ch dung môi ho c tính gián ti p t kh i l ng m u sau khi chi t.

Dung môi c un sôi n nhi t bay h i, lên n ng sinh hàn g p l nh i ng ng t l i, ch y xu ng tr chi t Dung môi th m d n vào trong m u, lôi kéo u ra ngoài Hàm l ng d u chi t c t ng theo th i gian nh ng ch y tràn thông gi a tr chi t và bình c u Quá trình này c th c hi n liên t c tu n hoàn.

– y khô sinh kh i n kh i l ng không i 50 o C.

– Cho kho ng 150 mL h n h p dung môi hexan/methanol t l th tích 2/1 vào bình c u (dung môi chi m 2/3 th tích bình c u) a m u vào tr chi t.

– p h th ng chi t Soxhlet Cho n c l nh ch y vào ng sinh hàn.

– un t t bình c u trên b p Ti n hành trích béo trong 4 gi Yêu c u trong t gi dung môi ch y t tr chi t v bình c u không ít h n 5 – 6 l n và không nhi u h n 8 – 10 l n.

– Ki m tra m u ã chi t hoàn toàn ch t béo ch a b ng cách l y vài gi t dung môi trong tr chi t nh lên gi y l c n u không có v t loang thì coi nh ã chi t xong.

– n h p sau khi chi t c cô quay lo i b dung môi.

Ph ng pháp kh sáp và gum

Ch t béo sau khi trích ly c g i là d u n bào thô hay d u vi sinh v t thô. u n bào thô c kh sáp và kh gum tr c khi phân tích GC Acetone và c nóng c dùng phân tách sáp và gum t d u vi sinh v t thô Ph i ti n hành kh sáp và gum vì ây là các thành ph n không mong mu n trong s n xu t biodiesel, thêm vào ó nó có th làm h c t trong máy s c ký khí Ngoài ra, các h p ch t này mà n u không tách lo i ra s làm cho d u thành ph m không trong su t và có h i cho s c kh e con ng i.

– c chân không phân tách ph n l ng (gum) và ph n r n.

– Ph n r n c hòa tan trong acetone 60 o C, khu y u b ng b p t trong

– t m u trong t l nh 4 o C trong 24 gi cho m u k t tinh.

Xác nh thành ph n ng

u c phân tích tr ng i h c Công ngh Qu c gia ài Loan N ng D-Glucose, D-Xylose và L-Arabinose c xác nh b ng HPLC (Jasco, Nh t B n) i máy b m PU-1580, b kh khí DG-4400, u dò Alltech ELSD 2000 và c t Zorbax NH2 (kớch c h t 5 àm, 250 mm ì 4,6 mm, Agilent Technologies, M ). u ki n phân tích: nhi t u dò 80 o C, t c dòng khí nit 2 mL/phút, nhi t c t 25 o C Pha ng là h n h p c a acetonitrile và n c (80/20, v/v) v i t c 1 mL/phút.

Xác nh thành ph n ch t béo

u c phân tích tr ng i h c Công ngh Qu c gia ài Loan Phân tích thành ph n hóa h c c a d u vi sinh v t b ng máy s c ký khí (GC-17A,Shimadzu, Nh t B n) v i u dò ion hóa ng n l a (FID) và c t mao qu n DB-17HT(30 m × 0,32 mm, Agilent Technologies, M ) Ch ng trình nhi t phân tích m u:nhi t u 80 o C, gia nhi t 10 o C /phút cho n 365 o C, gi 29 phút T c dòng khí mang (N2) 30 cm/s.

Chu n b bã mía

Hình 4.1 Bã mía ép th công (A) và bã mía nhà máy (B) sau khi ti n x lý

Bã mía sau khi ti n x lý có d ng b t m n.

– Bã mía ép th công: màu tr ng s a, t kích c h t kho ng 0,122 mm, m 6,86%.

– Bã mía nhà máy: màu xám tro, t kích c h t kho ng 0,248 mm, m 6,56%.

Quá trình th y phân

nh h ng c a th i gian n n ng ng

Th i gian là y u t quan tr ng nh h ng n n ng ng thu c trong quá trình th y phân bã mía Vì th , quá trình th y phân c kh o sát v i các kho ng th i gian khác nhau t 2 n 8 gi , nhi t 90 o C, n ng axit 3%, t l bã mía/dung d ch axit là 1/20 và s n ph m th y phân c minh h a hình 4.2.

Hình 4.2 Bã mía th y phân theo th i gian

K t qu phân tích hàm l ng ng trong s n ph m th y phân c trình bày trong b ng 4.1 N ng ng t ng t ng theo th i gian th y phân t 2 n 6 gi i n ng t ng ng là 15,44; 20,33 và 23,39 g/L (Hình 4.3) Khi t giá tr c c i thì n ng ng b t u gi m xu ng 22,22 g/L 8 gi S suy gi m này có th gi i thích là do khi th i gian ph n ng dài thì các lo i ng hexose và pentose phân h y thành HMF và furfural ây là s n ph m ph không mong mu n và ng là ch t c ch s phát tri n c a n m men. ng 4.1 nh h ng c a th i gian n n ng ng

Th i gian, gi ng n g, g/L ng ng t ng D-Xylose D-Glucose Arabinose

Hình 4.3 th bi u di n nh h ng c a th i gian n n ng ng

Nh v y, th i gian th y phân bã mía hi u qu nh t là 6 gi cho n ng ng ng là 23,39 g/L, bao g m xylose là thành ph n ng chính có n ng là 13,32 g/L, glucose 7,35 g/L và arabinose 2,72 g/L.

nh h ng c a n ng axit n n ng ng

Ngoài th i gian, n ng axit c ng nh h ng nhi u n n ng ng t ng trong quá trình th y phân Do ó, ti n hành kh o sát v i các n ng axit khác nhau

0 n 4% trong 6 gi nhi t 90 o C, t l bã mía/dung d ch axit là 1/20 S n ph m th y phân c minh h a hình 4.4.

Hình 4.4 Bã mía th y phân theo n ng axit t qu phân tích n ng ng trong s n ph m th y phân c trình bày trong b ng 4.2 N ng ng t ng thu c khi th y phân b ng H2SO41% và 2% th p h n khi so v i H 2 SO 4 3% và 4% (Hình 4.5) Khi n ng axit t ng t 1% n 3% thì n ng ng t ng t ng nhanh t 14,42 n 23,61 g/L Nh ng khi ti p t c ng n ng axit lên 4%, l ng ng gi m xu ng còn 21,77 g/L Xu h ng t ng ã c quan sát xylose, glucose và arabinose u này cho th y axit là m t tác nhân nh h ng m nh n quá trình th y phân T k t qu cho th y có th s ng axit loãng phá v c u trúc các cellulose và hemicellulose t o thành các phân t ng Ngoài ra, khi dùng n c th y phân c ng thu c ng nh ng hàm l ng không áng k (2,05 g/L) Các công trình nghiên c u quá trình th y phân nguyên li u lignocellulosic c ng cho th y xu h ng t ng t N ng ng ng t ng theo th i gian và n ng axit, khi t c giá tr t i u thì l ng ng t u gi m d n Lý do là khi th y phân n ng axit cao trong th i gian dài s hình thành các s n ph m ph không mong mu n. ng 4.2 nh h ng c a n ng axit n n ng ng ng axit

0 1 2 3 4 ng axit, % ng ng , g /L ng ng t ng D-Xylose

Hình 4.5 th bi u di n nh h ng c a n ng axit n n ng ng

Vì v y, n ng axit t t nh t cho quá trình th y phân bã mía trong tài này là3% cho n ng ng t ng là 23,62 g/L, bao g m xylose 13,68 g/L, glucose 7,81 g/L và arabinose 2,1 g/L.

nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n n ng ng

Bên c nh th i gian và n ng axit, t l bã mía và dung d ch axit c ng nh ng n n ng ng thu c Quá trình th y phân c th c hi n trong 6 gi , H2SO43%, nhi t 90 o C v i các t l bã mía/dung d ch axit khác nhau L a ch n t l bã mía/dung d ch axit b t u t 1/15 do t l này, dung d ch axit v a ng p bã mía S n ph m th y phân c minh h a hình 4.6.

Hình 4.6 Bã mía th y phân theo t l bã mía và dung d ch axit t qu th y phân c th hi n trong b ng 4.5 Khi t l bã mía và axit t ng 1/15 n 1/30 thì n ng ng t ng gi m d n t ng ng v i n ng ng là 30,62; 23,74; 22,10 và 16,20 g/L (Hình 4.7) Nh ng l ng ng th c t thu c trên 1 g bã mía thì t ng nhanh t 230 n 464 mg, sau ó gi m còn 395 mg t ng ng v i t l nguyên li u/dung d ch axit là 1/15, 1/20, 1/25 và 1/30 (Hình 4.8) Th t y, khi dùng m t l ng dung d ch axit v a ph i th y phân bã mía giúp cho axit ti p xúc t t h n v i nguyên li u i v i t l 1/20 và 1/25 n ng ng thu c thay i không nhi u nh ng l ng ng th c t thu c có s khác bi t l n. ng 4.3 nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n n ng ng l bã mía/dung ch axit (g/mL) ng ng t ng (g/L)

1/15 .1/20 .1/25 .1/30. l bã mía/dung d ch axit, g/mL ng ng, g/L

Hình 4.7 th bi u di n nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n n ng ng thu c.

1/15 .1/20 .1/25 .1/30. l bã mía/dung d ch axit, g/mL

Kh i l n g n g th u c mg /g bã m ía

Hình 4.8 th bi u di n nh h ng c a t l bã mía và dung d ch axit n l ng ng th c t thu c.

Do ó, t l bã mía/dung d ch axit thích h p là 1/25 (g/mL).

nh h ng c a nhi t n n ng ng

Nhi t c ng là y u t quan tr ng nh h ng n n ng ng thu c trong quá trình th y phân bã mía Do ó, ti n hành kh o sát v i các nhi t khác nhau t 60 n 90 o C trong 6 gi v i t l bã mía/dung d ch axit là 1/25 (g/mL). t qu phân tích n ng ng trong s n ph m th y phân c trình bày trong b ng 4.4 T hình 4.9 cho th y n ng ng t ng các nhi t th y phân

60, 70 và 80 o C th p h n nhi u khi so sánh v i nhi t 90 o C Khi nhi t t ng cao thì n ng ng t ng t ng nhanh t 3,73 n 22,45 g/L T ng t , hàm l ng xylose, glucose và arabinose thu c t ng nhanh khi nhi t t ng d n Nh ng n u ti p t c th y phân nhi t cao h n 90 o C thì n ng ng t ng thu c không chênh l ch nhi u Thêm vào ó, n u th c hi n ph n ng trong th i gian dài s x y ra hi n t ng caramen hóa và ng b phân h y thành carbon Gi ng nh nhi u ph n ng th y phân nguyên li u lignocellulose khác, ph n ng th y phân b ng axit ch u nh h ng nhi u b i nhi t T c ph n ng t ng theo nhi t t ng ng i l ng ng sinh ra Tuy nhiên, n khi t c m t m c nhi t nh t nh thì t c ph n ng s gi m d n và b phân h y. ng 4.4 nh h ng c a nhi t n n ng ng

Nhi t , o C ng ng, g/ L ng ng t ng D-Xylose

Hình 4.9 th bi u di n nh h ng c a nhi t n n ng ng

Vì v y, d a vào k t qu thí nghi m trên thì có th k t lu n nhi t phù h p cho quá trình th y phân bã mía là 90 o C v i n ng ng t t nh t là 22,45 g/L,trong ó xylose 12,69 g/L, glucose 6,85 g/L và arabinose 2,91 g/L.

So sánh n ng ng t ng thu c khi s d ng lo i axit và lo i bã mía khác nhau

Sau khi tìm c u ki n t t nh t c a quá trình th y phân này, chúng tôi ti n hành so sánh lo i axit và lo i mía. ỉ Theo lo i bó mớa

Ti n hành so sánh hai lo i bã mía khác nhau v i u ki n th c hi n là: th y phân bã mía trong 6 gi 90 o C, H 2 SO 4 3% v i t l bã mía/dung d ch axit là 1/25 (g/mL) S n ph m th y phân c minh h a hình 4.10.

Mía 1: bã mía ép th công Mía 2: bã mía nhà máy

Hình 4.10 Bã mía th y phân theo lo i bã mía

Khi s d ng bã mía t nhà máy th y phân cho n ng ng t ng và hàm ng các s n ph m th y phân th p h n so v i s d ng bã mía ép th công (B ng 4.5) u này có th gi i thích là do bã mía t nhà máy dính cát, b i b n. ng 4.5 nh h ng c a lo i bã mía n n ng ng

Lo i bã mía ng ng t ng

1: Bã mía ép th công 2: Bã mía nhà máy ỉTheo lo i axit

Ti n hành th y phân bã mía v i hai lo i axit khác nhau trong 6 gi 90 o C, ng axit 3%,t l bã mía/dung d ch axit là 1/25 (g/mL) S n ph m th y phân c minh h a hình 4.11.

Hình 4.11 Bã mía th y phân theo lo i axit ng ng t ng và ng n trong dung d ch khi th y phân b ng H2SO4 và HCl chênh l ch không nhi u (B ng 4.6) Do ó có th l a ch n m t trong hai lo i axit này th y phân bã mía. ng 4.6 nh h ng c a lo i axit n n ng ng

Lo i axit ng ng t ng

Tóm l i, u ki n t t nh t cho quá trình th y phân bã mía: H 2 SO 4 3%, 90 o C, 6 gi , t l 1/25 g/mL So sánh k t qu thu c v i các công trình nghiên c u trên th gi i (B ng 4.7). ng ng t ng trong tài này cao h n m t chút khi so v i nghiên c u a Tsigie [14] (21,38 g/L), A Rodr guez-Chong[60] (21,96 g/L) và th p h n trong nghiên c u c a R Aguilar [61] (25,10 g/L) Tuy th i gian ph n ng c a tài dài n các nghiên c u khác nh ng u ki n ph n ng t ng i nh , d th c hi n, có th ng d ng trong quy mô công nghi p, cho th y nghiên c u này có tính kh thi cao. ng 4.7 So sánh k t qu th y phân v i các nghiên c u khác

Lo i nguyên li u u ki n t t nh t ng ng t ng (g/L) Tài li u tham kh o

Bã mía HCl 2,5%, 121 oC, 45 phút 21,38 [14]

Bã mía HNO 3 6%, 122 oC, 9,3 phút 21,96 [60]

Bã mía H2SO4 2%, 122 oC, 24 phút 25,10 [61]

Quá trình kh c dung d ch bã mía th y phân

tr thành môi tr ng dinh d ng cho n m men phát tri n, c n ph i kh c lo i b các ch t c ch t n t i trong dung d ch bã mía th y phân Trong quá trình kh c, c m i 1000 mL dung d ch bã mía th y phân c n kho ng 29 g Ca(OH) 2

A: Dung d ch bã mía tr c khi kh c B: Dung d ch bã mía sau khi kh c

Hình 4.12 Dung d ch bã mía th y phân ch a và ã kh c

Sau khi kh c, x y ra th t thoát m t ít ng Tuy nhiên, s th t thoát này không áng k (B ng 4.8) S thay i n ng ng này c th hi n trong hình 4.13. ng 4.8 nh h ng c a kh c n n ng ng t ng

Bã mía th y phân N ng ng t ng (g/L)

Bã mía th y phân ng ng, g/L

Hình 4.13 th bi u di n nh h ng c a s kh c n n ng ng t ng

Quá trình nuôi c y

nh h ng c a th i gian nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích

Th i gian là y u t quan tr ng nh h ng n s phát tri n và kh n ng tích y ch t béo c a Y lipolytica Po1g trong quá trình nuôi c y N m men c nuôi y t 1 n 7 ngày trong môi tr ng g m bã mía th y phân ã kh c (20 g/L), cao n m men (5 g/L), pepton (5 g/L) u ki n nuôi c y c th c hi n nhi t

26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.14.

Hình 4.14 Sinh kh i thu c theo th i gian t ngày 1 n ngày 7 (t trái qua ph i)

K t qu nuôi c y c th hi n trong b ng 4.9 Ngày u tiên, l ng sinh kh i ít (1,97 g/L) (Hình 4.15) Trong giai n này, n m men ang m i b t u thích nghi trong môi tr ng m i, t bào chu n b phân chia Sau ó, n m men b t u sinh tr ng m nh t ngày th 2 vì ngu n carbon và nit b t u c s d ng Và vào ngày th 4 thì t giá tr c c i, n ng sinh kh i là 11,60 g/L Trong giai n này, n m men t tr ng thái cân b ng ng t c là t c sinh tr ng b ng v i c ch t i c a t bào K ó, ngày th 5 vi sinh v t b c vào giai n suy vong, sinh kh i b t u gi m Nguyên nhân do khi ngu n dinh d ng ang d n c n ki t làm gi m s trao i ch t c a n m men và x y ra s c nh tranh th c n d n n ch t hàng lo t c a t bào Ngày th 7, sinh kh i t ng l i Khi ngu n dinh d ng trong môi tr ng ã h t, t bào b t u s d ng ch t béo tích l y c nh là ngu n dinh d ng.

Cùng v i s phát tri n c a n m men theo th i gian, n ng ng t ng trong môi tr ng c ng c quan sát, ngày u l ng ng gi m nh Sau ó, b t u gi m m nh theo th i gian và n ngày th 5 thì n ng ng gi m còn kho ng 76,45%, ây là lúc ngu n dinh d ng trong môi tr ng tiêu th g n h t. n ngày th 7, l ng ng g n nh b ng không u này phù h p v i nh n xét trên v vi c s d ng ngu n dinh d ng c a n m men.

Song song ó, hàm l ng ch t béo thu c c ng c th c hi n Ngày u tiên c a nuôi c y, l ng d u tích l y th p kho ng 19,67% T ngày th 2 n ngày th 4, hàm l ng d u thu c t ng nhanh t 22,56 lên 34,33% Nguyên nhân do ngu n nit ã h t và b t u kích thích các enzyme tích l y d u ho t ng Vì v y, ng d u thu c t ng nhanh và t c c i vào ngày th 4 Nh ng ngày k ti p, ng d u gi m d n t 34,33% xu ng còn 25,14%. ng 4.9 nh h ng c a th i gian n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo a n m men

Sinh kh i (g/L) ng ng t ng (g/L)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 ng sinh kh i ng ng

Hàm l ng ch t béo ng si nh kh i, g/L ng ng t ng, g/L H àm l n g ch t béo, %

Hình 4.15 th bi u di n nh h ng c a th i gian n ng ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

V y th i gian t t nh t nuôi c y n m men là 4 ngày v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 11,60 g/L và 34,33%.

nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh n ng tích l y

Kh o sát nh h ng c a các ngu n cung c p carbon khác nhau nh dung d ch bã mía th y phân ã kh c (A), D-Glucose tinh khi t (B) và dung d ch bã mía th y phân không kh c (C) n s phát tri n và hàm l ng ch t béo thu c c a m men Môi tr ng nuôi c y g m: ngu n carbon 20 g/L, cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L u ki n th c hi n: th i gian lên men là 4 ngày nhi t 26 o C v i c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.16.

Hình 4.16 Sinh kh i thu c c a các ngu n carbon khác nhau

K t qu c trình bày trong b ng 4.10 N m men phát tri n t t trên trong dung d ch bã mía th y phân ã kh c và D-Glucose v i l ng sinh kh i thu c ng ng là 11,86 g/L và 10,40 g/L (Hình 4.17) ng th i, hàm l ng ch t béo trong 2 môi tr ng này c ng c kh o sát và k t qu t c l n l t là 33,63% và 31,57% K t qu nuôi c y trong 2 môi tr ng này ít chênh l ch Vì v y, bã mía th y phân có th thay th D-Glucose nuôi c y n m men t o ra sinh kh i và d u vi sinh v t Thêm vào ó, khi xét v tính kinh t thì n m men sinh tr ng trong dung d ch bã mía th y phân ã kh c có l i h n, vì t n d ng c ngu n nguyên li u b i, trong khi D-Glucose tinh khi t r t m c ti n i v i dung d ch bã mía th y phân ch a kh c, n m men phát tri n r t kém u này cho th y kh c là c trung gian c n thi t cho quá trình nuôi c y n m men Nguyên nhân là do s có t c a ch t c ch HMF, furfural và pH trong môi tr ng nuôi c y quá th p. ng 4.10 nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men Ngu n carbon Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

A: Bã mía th y phân ã kh c B: D-Glucose

C: Bã mía th y phân ch a kh c

Ngu n cacbon ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng sin h kh i, g/L H àm l ng c h t b é o, %

A: Bã mía th y phân ã kh c B: D-Glucose

C: Bã mía th y phân ch a kh c

Hình 4.17 th bi u di n nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh ng tích l y ch t béo c a n m men y, dung d ch bã mía kh c là ngu n carbon r ti n nuôi c y Y lipolytica

Po1g v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là11,86 g/L và 34,79%.

nh h ng c a ngu n nit n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Ngoài ngu n carbon, ngu n nit c ng nh h ng n quá trình nuôi c y Vì y, ti n hành kh o sát s nh h ng các ngu n nit khác nhau nh (NH 4 ) 2 SO 4 ,

NH4NO3, urê, pepton s phát tri n c a n m men c ng nh s tích l y ch t béo ây là nh ng ngu n nit ph bi n Môi tr ng nuôi c y g m: dung d ch bã mía th y phân ã kh c 20 g/L, cao n m men 5 g/L, ngu n nit 5 g/L u ki n ti n hành: th i gian lên men là 4 ngày nhi t 26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.18.

Hình 4.18 Sinh kh i thu c c a các ngu n nit khác nhau

K t qu c trình bày trong b ng 4.11 Khi pepton c s d ng nh ngu n nit , n m men phát tri n t t nh t v i l ng sinh kh i là 11,91 g/L và 34,68% ch t béo thu c Trong khi, dùng (NH 4 ) 2 SO 4 , urê, NH 4 NO 3 làm ngu n nit thì n ng sinh kh i thu c t ng ng là 9,57; 8,53 và 6,40 g/L và hàm l ng ch t béo thu c l n l t là 30,28; 26,88; 24,17% (Hình 4.19) Trong môi tr ng ch a NH 4 NO 3 ho c (NH4)2SO4, n m men t ng tr ng và tích l y ch t béo kém h n, có th gi i thích là trong quá trình phát tri n ã hình thành axit HNO3 ho c H2SO4 làm pH trong môi tr ng gi m xu ng gây c ch n m men sinh tr ng Hai môi tr ng này có pH o c là 4,03 và 4,73 u này ch ng minh gi i thích này phù h p Ngoài ra, k t qu c ng ch ra r ng s d ng ngu n nit h u c giúp n m men phát tri n và tích l y ch t béo t t h n khi s d ng ngu n nit vô c Mà k t qu này t ng t v i nghiên c u c a Zhu et al., (2008) Pepton là ngu n nit h u c t t nh t cho Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n và NH 4 NO 3 là ngu n nit vô c t nh t. ng 4.11 nh h ng c a ngu n nit n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men Ngu n nit Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

Ammonium sulphate Ngu n nit ng ô sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng sinh kh i, g/L H àm l ng ch t bé o, %

Hình 4.19 th bi u di n nh h ng c a ngu n nit n s sinh tr ng và kh ng tích l y ch t béo c a n m men

V y, pepton là ngu n nit thích h p nuôi c y Y lipolytica Po1g v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 11,91 g/L và34,68%.

nh h ng c a nhi t nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích

Bên c nh ó, nhi t môi tr ng c ng là y u t quan tr ng nh h ng n quá trình nuôi c y Do ó, kh o sát nh h ng c a các nhi t khác nhau n n ng sinh kh i c ng nh s tích l y ch t béo Do nhi t sinh lý c aY lipolytica có th phát tri n trong kho ng 20 – 40 o C, m t s n c thì u ki n nuôi c y có th a vào u ki n t nhiên t ng hi u qu kinh t ó là lý do ch n nghi m th c dao ng t 20 – 37 o C Môi tr ng nuôi c y g m: dung d ch bã mía th y phân ã kh c 20 g/L, cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L Th i gian nuôi c y là 4 ngày v i c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.20.

Hình 4.20 Sinh kh i thu c các nhi t khác nhau

K t qu nuôi c y c trình bày trong b ng 4.12 Khi nhi t t ng t 20 n

37 o C thì n ng sinh kh i gi m d n t 13,55 xu ng 9,91 g/L Hàm l ng ch t béo ng t 27,90 n 34,25% khi nhi t t ng t 20 n 26 o C Nh ng khi nhi t ti p t c t ng n 37 o C, ph n tr m ch t béo thu c b t u gi m d n t 34,25 xu ng 21,27% (Hình 4.21) Kh n ng tích l y ch t béo t ng khi nhi t t ng, nh ng n u t ng n m t nhi t nh t nh (nhi t t i u) thì kh n ng này b t u gi m và n m c tri t tiêu Khi nhi t môi tr ng cao, các enzyme c a n m men s b bi n tính làm gi m kh n ng sinh tr ng và tích l y ch t béo N u nhi t môi tr ng th p h n nhi t t i u, n m men ho t ng t t h n nh ng do s sinh tr ng quá nhanh s x y ra hi n t ng c nh tranh th c n d n n n m men ch t hàng lo t, nên ch t béo thu c c ng th p u này cho th y, t c sinh tr ng và kh n ng tích l y ch t béo ch u nh h ng l n c a nhi t ng 4.12 nh h ng c a nhi t n s phát tri n kh n ng tích l y ch t béo a n m men Nhi t ( o C) Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

Nhi t , o C ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng s in h k h i, g/ L Hàm l ng c h t b éo , %

Hình 4.21 th bi u di n nh h ng c a nhi t n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

D a vào k t qu thí nghi m có th k t lu n nhi t t t nh t nuôi c y

Y.lipolytica Po1g là 26 o C v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 12,39 g/L và 34,25%.

nh h ng c a n ng ng t ng trong môi tr ng nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y.lipolytica Po1g

Cu i cùng, kh o sát nh h ng c a n ng ng t ng n quá trình nuôi y D a vào m c tiêu th c ch t carbon nitrate c a vi sinh v t, tùy t ng ph ng pháp lên men khác nhau mà n ng ng có th dao ng t 20 – 100 g/L Môi tr ng nuôi c y g m cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L, dung d ch bã mía th y phân ã kh c v i n ng ng thay i t 20 n 40 g/L u ki n ti n hành: th i gian lên men là 4 ngày 26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.22.

Hình 4.22 Sinh kh i thu c các n ng ng t ng khác nhau

K t qu c trình bày b ng 4.13 Nhìn vào hình 4.23 d dàng nh n th y ng khi n ng ng t ng t ng t 20 n 30 g/L thì sinh kh i và hàm l ng ch t béo t ng N ng ng t ng s d ng là 30 g/L thì sinh kh i thu c là cao nh t 13,67 g/L, ng v i hàm l ng ch t béo thu c 46,48% sinh kh i Tuy nhiên, khi ng ng t ng t ng lên 40 g/L thì n ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo t u gi m xu ng v i giá tr t ng ng thu c là 9,79 g/L và 38,86% Nguyên nhân a ra là ngoài ch t c ch (HMF và furfural) hi n di n trong môi tr ng bã mía th y phân, n ng ng cao gây c ch s sinh tr ng c a n m men c ng nh kh n ng tích l y ch t béo ng th i v t quá kh n ng ng hóa c a t bào. ng 4.13 nh h ng c a n ng ng t ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men ng ng (g/L) Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

20 30 40 ng ng t ng, g/L ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng si nh kh i, g/ L Hàm ng c h t b é o , %

Hình 4.23 th bi u di n nh h ng c a n ng ng t ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

V y n ng ng t ng t t nh t trong quá trình nuôi c y là 30 g/L v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 13,67 g/L và 46,48%.

Sau khi kh o sát các y u t nh h ng n quá trình nuôi c y, tài ã tìm u ki n thích h p cho giai n này là th i gian 4 ngày, ngu n carbon: bã mía th y phân ã kh c, ngu n nit : pepton, nhi t : 26 o C và n ng ng t ng

30 g/L So sánh k t qu thu c v i các công trình nghiên c u trên th gi i Các ch t th i ph ph m công nông nghi p khác nhau có th c s d ng nh ngu n carbon nuôi c yYarrowia lipolytica c t ng h p trong b ng 4.14.

Hàm l ng ch t béo thu c c aYarrowia lipolytica Po1g phát tri n trong bã mía th y phân cao h n nhi u khi Candida lipolytica c nuôi c y trong 1% methanol [41], h n h p c a stearin, glucose và glycerol công nghi p [33], glucose th ng m i [38] và glucose [39], g n b ng khi Yarrowia lipolytica ng ch t n n là ch t béo công nghi p [27], nh ng th p h n trong môi tr ng m t r [40] T ó cho th y Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n t t trong môi tr ng bã mía th y phân i ngu n nit gi i h n, sinh t ng h p ch t béo b ng con ng tích l yde novo bên trong t bào Thêm vào ó, có th t n d ng bã mía (ngu n ph ph m nông nghi p) làm ngu n nguyên li u tái t o r ti n nuôi c y Yarrowia lipolytica Po1g, giúp gi m giá thành s n ph m. ng 4.14 So sánh k t qu nuôi c y v i các nghiên c u khác

Ch ng n m men Ngu n carbon

Candida lipolytica n h p c a stearin, glucose và glycerol công nghi p

Yarrowia lipolytica Ch t béo công nghi p 8,7 44 [27]

ACA-YC 5033 Glucose th ng m i 5,5 14 [38]

Po1g Bã mía th y phân 13,67 46,48 Nghiên c u

Phân tích ch t béo

Sau khi trích ly, kh sáp và gum, d u vi sinh v t c l u tr trong h bi y kín v i dung môi acetone, t trong t l nh.

Sau khi kh sáp và gum, thành ph n ch t béo c a d u vi sinh v t t t bào

Yarrowia lipolytica Po1g c phân tích b ng GC. t qu GC cho th y có kho ng 54,02 – 74,21% ch t béo trung tính là các axit béo t do (FFA), 3,20 – 29,32% MAG, 0,19 – 4,60% DAG, 2,84 – 27,11% TAG và nh ng ch t khác chi m 9,34 – 13,64% (B ng 4.15) Nh v y, ch t béo trung tính có hàm l ng cao nh t, k n là các glyceride.

Khi s d ng ngu n nit là pepton cho hàm l ng FFA cao nh t, k n là (NH4)2SO4, NH4NO3, urê Ti p n là các glyceride chi m kho ng 16,45 – 33,59%. Hàm l ng FFA, các glyceride g n b ng nhau trong môi tr ng nuôi c y s d ng ngu n carbon là D-Glucose và bã mía th y phân ã kh c u này cho th y, bã mía th y phân là ngu n carbon r ti n có th thay th D-Glucose, làm gi m chi phí n xu t biodiesel. ng 4.15 Thành ph n ch t béo c a SCO khi nuôi c y Yarrowia lipolytica

Po1g v i ngu n nit và carbon khác nhau.

Ph n tr m th tích (%) Thành ph n

FFA 56,23 68,90 54,02 70,16 74,21 MAG 4,08 10,56 29,32 11,82 3,20 DAG 2,40 1,95 0,38 0,19 4,61 TAG 27,11 4,95 2,84 6,84 8,64 Khác 10,18 13,64 13,44 10,99 9,34

A: NH 4 NO 3 , B: (NH 4 ) 2 SO 4 ,C: Urê, D: Glucose, E: Pepton ho c bã mía th y phân ã kh c.

Thành ph n axit béo ch y u c a t bào Yarrowia lipolytica Po1g là axit oleic

(C18:1), axit palmitic (C16:0), axit palmitoleic (C16:1), axit stearic (C18:0), axit arachidonic (C20:0), axit eicosenoic (C20:1) và nh ng axit béo không xác nh khác (B ng 4.16). t qu cho th y hàm l ng và thành ph n axit béo trong ch t béo khác nhau tùy thu c vào môi tr ng nuôi c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g Nuôi c y m men trong cùng m t ngu n carbon, khác ngu n nit cho k t qu khác nhau. Axit palmitic 36,14%, axit oleic 23,43%, axit stearic 7,64% chi m t l cao trong ch t béo trung tính khi s d ng (NH4)2SO4 là ngu n nit Trong khi dùng NH4NO3 là ngu n nit , axit oleic chi m t l cao nh t 51,02%, k n là axit palmitic 17,22%, axit palmitoleic 11,04% Trong 4 ngu n nit kh o sát, urê cho k t qu t nh t vì có nhi u thành ph n không xác nh c (66,58%) và các FFA ch chi m kho ng 33,42% Hàm l ng FFA trong môi tr ng s d ng pepton là ngu n nit ch y u là axit oleic 24,09%, axit palmitic 20,84%, axit arachidonic 20,28%, axit stearic 16,28% Hàm l ng axit oleic (51,21%), axit palmitic (13,89%), axit palmitoleic (10,33%) cao trong môi tr ng có D-Glucose là ngu n carbon. ng 4.16 Thành ph n axit béo t do v i ngu n nit và carbon khác nhau

Ph n tr m th tích (%) Thành ph n

A: NH 4 NO 3 , B: (NH 4 ) 2 SO 4 ,C: Urê, D: Glucose, E: Pepton ho c bã mía th y phân ã kh c

Hàm l ng axit béo bão hòa và không bão hòa n chi m h n 80%, làm cho ch t béo trung tính thu c t nuôi c y Yarrowia lipolytica Po1g là m t nguyên li u lý t ng s n xu t biodiesel Trong ó, ch t béo trung tính c trích ly trong môi tr ng bã mía th y phân ã kh c v i pepton là ngu n nit là thích h p nh t do hàm l ng FFA cao kho ng 92,22% và axit béo bão hòa trong ch t béo trung tính chi m kho ng 57,40% cao h n các ngu n carbon, nit khác.

K t lu n

Sau khi kh o sát quá trình th y phân bã mía và quá trình nuôi c y n m men

Yarrowia lipolyticaPo1g Chúng tôi ã thu c m t s k t qu nh sau:

– Các k t qu trong quá trình th y phân cho th y hàm l ng ng thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, n ng axit, t l bã mía/dung d ch axit và nhi t N ng ng t ng theo th i gian, n ng axit và nhi t Khi t giá tr c c i thì b t u gi m xu ng Các thông s t t nh t c a quá trình th y phân bã mía là: ặ Th i gian: 6 gi ặ ng axit: 3% ặ l bó mớa/dung d ch axit: 1/25 ặ Nhi t : 90 o C

– V i u ki n th y phân này, n ng ng t ng thu c là 22,45 g/L và thành ph n chính trong dung d ch th y phân là các lo i ng n nh xylose, glucose và arabinose u này ch ng t bã mía là nguyên li u lignocellulose ti m ng có th ng d ng trong hóa h c xanh.

– K t qu trong quá trình nuôi c y ch ra r ng kh i l ng sinh kh i và kh ng tích l y ch t béo c a n m men thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, ngu n carbon, ngu n nit , nhi t và n ng ng N ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo t ng theo th i gian và n ng ng t ng Khi t giá tr c i thì b t u gi m xu ng i v i nhi t , hàm l ng ch t béo thu c bi n i theo xu th nêu trên nh ng n ng sinh kh i l i gi m khi t ng nhi t Các thông s t t nh t c a quá trình nuôi c y là: ặ Th i gian nuụi: c y 4 ngày ặ Ngu n carbon: dung d ch bó mớa th y phõn ó kh c ặ Ngu n nit : pepton ặ Nhi t : 26 o C ặ ng ng: 30 g/L

– V i u ki n nuôi c y này, n ng sinh kh i thu c 13,67 g/L và hàm ng ch t béo tích l y là 46,48% t ng i cao, g n b ng v i k t qu c a các nghiên c u khác Thành ph n d u vi sinh v t bao g m các axit béo m ch dài C16, C18 và C20 no và không no, t ng t nh d u th c v t u này cho th y ch t béo n m men phù h p yêu c u nguyên li u t ng h p biodiesel Vì v y, có th s ng Y.lipolytica Po1g s n xu t d u vi sinh v t r ti n t bã mía th y phân ây là n m men cho d u ti m n ng có th ng d ng trong công ngh sinh h c tr ng.

– Qua ó cho th y bã mía th y phân là ngu n carbon r ti n s n xu t ch t béo t n m men, giúp gi m giá thành s n xu t d u vi sinh v t, nâng cao tính c nh tranh v i các ngu n nguyên li u truy n th ng T n d ng c ngu n ph ph m nông nghi p n c ta, giúp b o v môi tr ng, nâng cao giá tr c a cây mía.

Ki n ngh

ỉ Quỏ trỡnh th c hi n thu c k t qu kh quan nh ng tài cũn m t s h n ch sau:

– Ch a kh o sát c t ng b ph n c a cây mía nh m ánh giá, so sánh ch t ng và hi u qu kinh t

– Ch a th y phân bã mía b ng enzyme so sánh hàm l ng ng và tính kinh t

– Ch a phân tích c thành ph n các ch t c ch trong dung d ch bã mía th y phân tr c và sau khi kh c.

– Ch a phân tích các ch s hóa lý c a ch t béo. ỉ h n ch v m t th i gian và kinh phớ th c hi n nờn tài d ng l i cỏc t qu kh o sát trên, c n c vào k t qu thu c t quá trình thí nghi m và m t s t còn h n ch c a tài, chúng tôi xin a ra m t s ki n ngh nh sau:

– Phân tích thành ph n các ch t c ch trong môi tr ng nuôi c y hi u rõ nh h ng c a chúng n phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp kh c khác (than ho t tính, nh a trao i ion, enzyme,….) so sánh hi u qu kh c và tính kinh t c a t ng ph ng pháp.

– Ti n hành nuôi c y n m men trên các ngu n carbon khác (xylose, arabinose) giúp hi u rõ h n kh n ng tiêu th và tích l y ch t béo c a n m men trên ng lo i ng này.

– Kh o sát thêm các y u t nh h ng n quá trình nuôi c y (t l C/N, t c l c, pH) và các ph ng pháp nuôi c y (nuôi c y b , liên t c, bán liên t c) nh m thu c hàm l ng ch t béo nhi u nh t, nâng cao tính kh thi và hi u qu c a tài.

– Phân tích thành ph n trong môi tr ng sau khi nuôi c y và kh n ng t n ng c a chúng.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp ly trích hi n i khác (chi t soxhlet có h tr c a sóng siêu âm, chi t soxhlet có h tr c a vi sóng ho c CO2 ng siêu t i h n) k t qu kh o sát c phong phú h n.

– Nghiên c u t n d ng xác sinh kh i c a n m men (s n xu t bioethanol) và ph n k t t a trong kh c (làm th ch cao bó x ng, n n t ng) ti t ki m chi phí s n xu t.

– u tiên hàng u là nghiên c u t ng h p biodiesel t ngu n d u này.

[1] A Dufey, Biofuels Production, Trade and Sustainable Development: Emerging Issues: International Institute for Environment & Development,

[2] M Balat, "Global Bio-fuel Processing and Production Trends," Energy, Exploration & Exploitation,vol 25, pp 195-218, 2007.

[3] A Demirbas, "Progress and recent trends in biofuels," Progress in Energy and Combustion Science, vol 33, pp 1-18, 2007.

[4] P Fontanille, et al., "Bioconversion of volatile fatty acids into lipids by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica,"Bioresource Technology, vol 114, pp. 443-449, 2012.

[5] P Felizardo, et al., "Production of biodiesel from waste frying oils," Waste Management, vol 26, pp 487-494, 2006.

[6] L H H Yeshitila Asteraye Tsigie, Ibrahim Nasser Ahmed, Yi-Hsu Ju,

"Maximizing biodiesel production from Yarrowia lipolytica Po1g biomass using subcritical water pretreatment," Bioresource Technology, vol 111, pp. 201-207, 2012.

[7] A N Phan and T M Phan, "Biodiesel production from waste cooking oils,"

[8] Y Mulugetta, "Evaluating the economics of biodiesel in Africa," Renewable and Sustainable Energy Reviews, vol 13, pp 1592-1598, 2009.

[9] C Ratlege, et al., Biotechnology for the Oils & Fats Industry: Amer Oil

[10] J.-M Nicaud, "Yarrowia lipolytica,"Yeast,vol 29, pp 409-418, 2012.

[11] F Shahidi, "Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Volumes 5," 6 th ed:John Wiley & Sons, 2005.

[12] P Fickers, et al., "Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications," FEMS Yeast Research, vol 5, pp. 527-543, 2005.

[13] M E Guerzoni, et al., "Variability of the lipolytic activity in Yarrowia lipolytica and its dependence on environmental conditions," International Journal of Food Microbiology, vol 69, pp 79-89, 2001.

[14] C.-Y W Yeshitila Asteraye Tsigie, Chi Thanh Truong, Yi-Hsu Ju "Lipid production from Yarrowia lipolytica Po1g grown in sugarcane bagasse hydrolysate,"Bioresource Technology,vol 102, pp 9216-9222, 2011.

[15] T N X B PGS.TS.Lê c Ngoan, TS.Nguy n H u V n, Th c n cho gia súc nhai l i trong nông h mi n Trung Hà N i: Nhà xu t b n nông nghi p,

[16] B P Lavarack, et al., "The acid hydrolysis of sugarcane bagasse hemicellulose to produce xylose, arabinose, glucose and other products,"

Biomass and Bioenergy,vol 23, pp 367-380, 2002.

[17] T D r A Beopoulos, J Sabirova, J.-M Nicaud, Yarrowia lipolytica as a Cell Factory for Oleochemical Biotechnology: Springer-Verlag Berlin

[18] J Leman, "Oleaginous Microorganisms: An Assessment of the Potential," in

Advances in Applied Microbiology vol Volume 43, L N Saul and I L.

Allen, Eds., ed: Academic Press, 1997, pp 195-243.

[19] X Meng, et al., "Biodiesel production from oleaginous microorganisms,"

[20] C Ratledge and S G Wilkinson,Microbial lipids: Academic Press, 1989.

[21] M Mazza, et al., "Omega-3 fatty acids and antioxidants in neurological and psychiatric diseases: An overview," Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry,vol 31, pp 12-26, 2007.

[22] N K P Ph ng, Ph ng pháp cô l p h p ch t h u c : Nhà xu t b n i h c

Qu c gia TP H Chí Minh, 2007.

[23] C C Akoh and D B Min, Food lipids: chemistry, nutrition, and biotechnology: CRC Press/Taylor & Francis Group, 2008.

[24] W W Christie, Lipid Analysis: Isolation, Separation, Identification, and Structural Analysis of Lipids: Amer Oil Chemists Society, 2003.

[25] A A Maddalena Rossi, Stefano Raimondi and Alan Leonardi Getting Lipids for Biodiesel Production from Oleaginous Fungi: InTech, 2010.

[26] C Ratledge and Z Cohen, "Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils?,"Lipid Technology,vol 20, pp 155-160, 2008.

[27] S Papanikolaou, et al., "Kinetic profile of the cellular lipid composition in an oleaginous Yarrowia lipolytica capable of producing a cocoa-butter substitute from industrial fats," Antonie van Leeuwenhoek, vol 80, pp 215-

[28] K Gunkel, et al., "Selective peroxisome degradation in Yarrowia lipolytica after a shift of cells from acetate/oleate/ethylamine into glucose/ammonium sulfate-containing media,"FEBS Letters,vol 451, pp 1-4, 1999.

[29] G Barth and C Gaillardin, "Yarrowia lipolytica," inNonconventional Yeasts in Biotechnology, ed: Springer Berlin Heidelberg, 1996, pp 313-388.

[30] F M Kawasse, et al., "Morphological analysis of Yarrowia lipolytica under stress conditions through image processing," Bioprocess and Biosystems Engineering,vol 25, pp 371-375, 2003/07/01 2003.

[31] J A Cervantes-Chávez, et al., "Regulatory role of the PKA pathway in dimorphism and mating in Yarrowia lipolytica," Fungal Genetics and Biology, vol 46, pp 390-399, 2009.

[32] G M Walker,Yeast Physiology and Biotechnology: Wiley, 1998.

[33] S Papanikolaou, et al., "Accumulation of a Cocoa-Butter-Like Lipid byYarrowia lipolytica Cultivated on Agro-Industrial Residues," CurrentMicrobiology,vol 46, pp 0124-0130, 2003/02/01 2003.

[34] L Y Zhu, et al., "Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation," Bioresource Technology, vol 99, pp. 7881-7885, 2008.

[35] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica: A model and a tool to understand the mechanisms implicated in lipid accumulation," Biochimie, vol 91, pp. 692-696, 2009.

[36] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production,"

Progress in Lipid Research,vol 48, pp 375-387, 2009.

[37] S Papanikolaou, et al., "Citric acid production by Yarrowia lipolytica cultivated on olive-mill wastewater-based media," Bioresource Technology, vol 99, pp 2419-2428, 2008.

[38] S Papanikolaou, et al., "Biosynthesis of lipids and organic acids by Yarrowia lipolytica strains cultivated on glucose," European Journal of Lipid Science and Technology,vol 111, pp 1221-1232, 2009.

[39] G Aggelis and M Komaitis, "Enhancement of single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing in the presence of Teucrium polium L aqueous extract,"Biotechnology Letters,vol 21, pp 747-749, 1999/09/01 1999. [40] S E Karatay and G Dửnmez, "Improving the lipid accumulation properties of the yeast cells for biodiesel production using molasses," Bioresource Technology,vol 101, pp 7988-7990, 2010.

[41] J Rup , et al., "Cell lipids of the Candida lipolytica yeast grown on methanol,"Journal of Chromatography A, vol 755, pp 75-80, 1996.

[42] C Madzak, et al., "Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica," J Mol Microbiol Biotechnol,vol 2, pp 207-16, 2000.

[43] T Deak, "Environmental Factors Influencing Yeasts," in Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, G Péter and C Rosa, Eds., ed: Springer Berlin

[44] C.-H C a D F D Yong-Jae Lee, "Sugarcane bagasse oxidation using a combination of hypochlorite and peroxide," Bioresource Technology, vol.

[45] P F H Harmsen (2010, Literature review of physical and chemical pretreatment processes for lignocellulosic biomass.

[46] S I Mussatto and J A Teixeira, Lignocellulose as raw material in fermentation processes: Formatex, 2010.

[47] H Palonen and V t tutkimuskeskus, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose: VTT, 2004.

[48] S Walford, "Sugarcane bagasse: How easy is it to measure its constituents?,"

Proc S Afr Sug Technol Ass,pp 266 - 273, 2008.

[49] C E Wyman, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization: Production & Utilization: Taylor & Francis Group, 1996.

[50] T L i, Nh ng cây thu c và v thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Khoa h c & thu t, 1995.

[51] S M Azizin, Isolation of hemicellulose from sugarcane bagasse by alkaline extraction: Universiti Teknologi MARA, 2010.

[52] T t t L y L T c, Cây thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Nông nghi p

[53] Atlat a lý Vi t Nam: Nhà xu t b n Giáo d c Vi t Nam, 2011.

[54] J R Almeida, Modig, T., Petersson, A., Họhn-Họgerdal, B., Lidộn, G and Gorwa-Grauslund, M F , "Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae," J Chem. Technol Biotechnol,vol 82, pp 340–349, 2007.

[55] E Palmqvist and B Hahn-Họgerdal, "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates II: inhibitors and mechanisms of inhibition," Bioresource Technology,vol 74, pp 25-33, 2000.

[56] M J Taherzadeh and K Karimi, "Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review [Elektronisk resurs]." vol.2:3, s 472-499, ed: BioResources North Carolina State University, 2007.

[57] P L Dhepe and R Sahu, "A solid-acid-based process for the conversion of hemicellulose,"Green Chemistry, vol 12, pp 2153-2156, 2010.

[58] J.-P Lange, "Lignocellulose Conversion: An Introduction to Chemistry, Process and Economics," in Catalysis for Renewables, ed: Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co KGaA, 2007, pp 21-51.

[59] A Chandel, et al., "Dilute Acid Hydrolysis of Agro-Residues for the Depolymerization of Hemicellulose: State-of-the-Art," in D-Xylitol, S S da

Silva and A K Chandel, Eds., ed: Springer Berlin Heidelberg, 2012, pp 39- 61.

[60] A Rodr guez-Chong, et al., "Hydrolysis of sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessment," Journal of Food Engineering, vol 61, pp 143-

[61] R Aguilar, et al., "Kinetic study of the acid hydrolysis of sugar cane bagasse,"Journal of Food Engineering,vol 55, pp 309-318, 2002.

[62] M J Taherzadeh and K Karimi, "Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review.," BioResources, vol 2, pp. 707-738, 2007.

[63] K Y Foo and B H Hameed, "Detoxification of pesticide waste via activated carbon adsorption process," Journal of Hazardous Materials, vol.

[64] C Namasivayam, et al., "Removal of dyes from aqueous solutions by cellulosic waste orange peel," Bioresource Technology, vol 57, pp 37-43, 1996.

[65] A Martinez, et al., "Detoxification of Dilute Acid Hydrolysates of Lignocellulose with Lime," Biotechnology Progress, vol 17, pp 287-293, 2001.

[66] S S r d S a O V S Anuj K Chandel, "Detoxification of LignocellulosicHydrolysates for Improved Bioethanol Production, Biofuel Production-Recent Developments and Prospects," in Biofuel Production-Recent

Developments and Prospects, D M A D S Bernardes, Ed., ed: InTech,

[67] T N M N Tr n Bích Lam, inh Tr n Nh t Thu, Thí nghi m hóa th c ph m: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP H Chí Minh, 2011.

[68] M D Luque de Castro and F Priego-Capote, "Soxhlet extraction: Past and present panacea," Journal of Chromatography A, vol 1217, pp 2383-2389, 2010.

[69] W L Marsden, et al., "Evaluation of the DNS method for analysing lignocellulosic hydrolysates," Journal of Chemical Technology and Biotechnology,vol 32, pp 1016-1022, 1982.

[70] N V Mùi,Th c hành sinh hóa vol 5: NXB KH&KT Hà N i, 2002.

[71] T Foyle, et al., "Compositional analysis of lignocellulosic materials: Evaluation of methods used for sugar analysis of waste paper and straw,"

[72] N T T Vân, Phân tích nh l ng: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP.H Chí MINH, 2010.

[73] N X D ào H u Vinh, Tr n Th M Linh, Ph m Hùng Vi t, Các ph ng pháp s c kí: Nhà xu t b n Khoa h c k thu t, 1985.

[74] J Milanesio, Hegel, P., Medina-González, Y., Camy, S and Condoret, J.-S,

"Extraction of lipids from Yarrowia Lipolytica," Chemical Technology andBiotechnology,2012.

NG CHU N C A N NG NG KH

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng ng và m t quang o b c sóng 540nm y = 0,91732x + 0,07737 R 2 = 0,99927 Trong ó y: giá tr m t quang 540 nm (OD540) x: n ng ng (g/L)

NG CHU N C A N NG SINH KH I

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng sinh kh i và m t quang o b c sóng 600 nm y = 0,2601x + 0,0025 R 2 = 0,9906 Trong ó y: n ng sinh kh i (g/L) x: giá tr m t quang 600 nm (OD600)

OD600 ng sinh khi, g/L ng chu n c a n ng sinh kh i

PH L C 3 KÍCH C H T BÃ MÍA á Mía ép th công á Mía nhà máy

U VI SINH V T SAU KHI KH SÁP VÀ

GUM u vi sinh v t thu c theo th i gian u vi sinh v t thu c c a các ngu n carbon khác nhau u vi sinh v t thu c c a các ngu n nit khác nhau u vi sinh v t thu c các nhi t khác nhau u vi sinh v t thu c các n ng ng t ng khác nhau

PH GC PHÂN TÍCH THÀNH PH N CH T BÉO c ký c a ch t béo ã kh sáp và gum c a Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i pepton là ngu n nit

Peak Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i NH 3 NO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i (NH 4 ) 2 SO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i urê là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng D-Glucose i pepton là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Thành ph n ch t béo c a n m men cho d u và d u th c v t

Thêm vào ó, n m men cho d u th phát tri n trên nhi u ngu n carbon khác nhau (m t r , glucose, các ph ph m công nông nghi p,…) T ó, có th t n d ng các ngu n ph th i n m men phát tri n, v a t o ra ch t béo v a x lý ch t th i,

Trichosporon beigelii 12 - 22 50 12 - - u th c v t ca cao 26 - 35 35 3 - 1 u oliu 13 1 3 71 10 1 1 u h t c i 4 - 2 62 22 10 - u hoa h ng ng 7 - 5 19 68 1 - u u nành 11 - 4 54 7 - - u b p 11 - 2 28 58 1 - u h t cotton 22 1 3 19 54 1 - n ch ô nhi m môi tr ng Tuy nhiên, c i thi n ch t l ng ch t béo hay làm ng n ng su t c n ph i u t , nghiên c u thêm [4],[18],[26].

Hình 2.5 Các t bào c a n m men cho d uRhodosporidium toruloides(A),

Cryptococcus curvatus (B) và Yarrowia lipolytica(C) ch p t kính hi n vi n t

[11],[20],[28]. c dù, Yarrowia lipolytica ch có th tích l y ch t béo 36% sinh kh i khô, th p h n nhi u so v i các lo i n m men cho d u khác Nh ng Yarrowia lipolytica có kh n ng phát tri n trên m t lo t các ch t n n k n c khác nhau và ã tr thành t mô hình vi sinh v t do các công c di truy n hi n nay d dàng thao tác gen trên lo i n m men này [17].

Yarrowia lipolytica c bi t n v i tên g i làCandida lipolytic.Sau khi xác nh hình thái hoàn ch nh, n m men c phân lo i l i, u tiên là Endomycopsis lipolytica (1970), n là Saccharomycopsis lipolytica (1972) và cu i cùng là

Yarrowia lipolytica (1980) [29] Yarrowia lipolyticacó 3 d ng hình thái khác nhau: th n bào có hình tr ng (n m men), gi s i n m, s i n m có vách ng n ( a bào) (Hình 2.6) Thông th ng, Yarrowia lipolytica t n t i d ng s i n m có vách ng n. ng kính s i n m c aYarrowia lipolytica b ng kho ng 60 – 100% c a giai n th n bào Cỏc s i n m cú vỏch ng n r ng 3 – 5 àm và dài kho ng vài milimet. i n m phát tri n chi u dài theo ki u t ng tr ng ng n Ng n t bào th ng dài n 100 àm Hỡnh thỏi t bào thay i tựy thu c vào mụi tr ng (nhi t , ngu n nit ,…) [30],[31],[32].

Hình 2.6 Hình thái c a Yarrowia lipolytica i A: n m men và B: s i n m [10]

Yarrowia lipolytica là vi sinh v t hi u khí, l ng tính, th ng c cô l p t các s n ph m t s a nh pho mat, s a chua, b th c v t, xúc xích, th t heo,… ây c coi là loài không gây b nh vì nhi t t ng tr ng c a nó kho ng 32 – 34 o C và c công nh n là an toàn (GRAS) b i c c qu n lý th c ph m và d c ph m Hoa K (FDA) [29] Kh n ng tích t y ch t béo c aYarrowia lipolytica ã thu hút chú ý c a m t vài nhóm nghiên c u t cu i nh ng n m 1970 G n ây, kh n ng này c a n m men ã c t ng c ng nh nh ng ti n b c a k thu t di truy n. p oàn Genolevures ã xác nh c trình t b gen hoàn ch nh c a ch ng

Yarrowia lipolytica n b i vào n m 2000 Nhi u công c di truy n hi n nay giúp cho thao tác gen trên ch ng n m men này d dàng h n, d n n kh n ng tích l y ch t béo c c i thi n Khi khóa các gen POX làm t ng kh n ng tích l y ch t béo khi so sánh v i ch ng hoang dã [17].

Thành ph n ch t béo, protein và ki u hình c a Yarrowia lipolytica ph thu c nhi u u ki n môi tr ng (Hình 2.7) Ví d , khi thay i ngu n carbon t glucose thành axit oleic không ch làm t ng kích th c h t ch t béo mà còn làm thay i thành ph n ch t béo và protein [13],[33] T c sinh tr ng, kh n ng tích l y và thành ph n ch t béo c a n m men ph thu c vào nhi u y u t nh ngu n carbon,ngu n nit , t l C/N, nhi t , pH, n ng oxy,…[12],[34].

Hình 2.7 Ki u hình c aYarrowia lipolytica kính hi n vi n t [35]

A: Ch ng hoang d i, B: Ki u hình n m men m ng, C: Ki u hình n m men béo phì.

Ch t béo có th c tích l y b ng hai con ng khác nhau (i) t ng h p de novo liên quan n s t ng h p các ti n thân axit béo trong u ki n quy nh và s hòa nh p chúng trong quá trình sinh t ng h p ch t béo; (ii) con ng tích l y ex novo liên quan n s h p thu các axit béo, d u và TAG t môi tr ng nuôi c y và tích l y này có ho c không có s thay i hình th c t bào [36] Ngoài ra còn các enzyme chính tham gia vào hai con ng này (B ng 2.5). ng 2.4 Các gen liên quan n s tích l y ch t béo trongYarowia lipolytica[36]

GPD1 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD(+))

SCT1 Glycerol-3-phosphate acyl transferase

SLC1 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase

ARE1 Acyl-CoA:sterol acyltransferase

ARE2yl Acyl-CoA:sterol/Diacylglycerol acyltransferase

MFE1 Multifunctional beta-oxidation protein

(i) Con ng t ng h p ch t béo de novo

T ng quan v các con ng tham gia trong t ng h p axit béo và trong vi c u tr và suy thoái ch t béo không phân c c T ng h p các ch t béo không phân c (SE và TAG) c n sterol, acyl-CoA và glycerol-3-phosphate (G-3-P) T ng h p các axit béo c n Acyl-CoA [36].

Acyl-CoA c xúc tác b i các enzym t ng h p axit béo t các kh i c b n acetyl-CoA và malonyl-CoA thông qua các chu k dài G-3-P có th c t o ra ng m t trong hai cách: t glycerol b ng các enzyme glycerol c mã hóa b i gen GUT1 ho c t glucose theo con ng chuy n i dihydroxyacetone (DHAP) i dehydrogenase glycerol-3-phosphate c mã hóa b i gen GPD1 G-3-P có th oxy hóa thành DHAP b i dehydrogenase glycerol-3-phosphate c mã hóa b i gen GUT2 [36]. ng h p SE c xúc tác b i các enzyme SE synthase mã hóa b i ARE1 và ARE2 t ng h p TAG, ba acyl c thêm vào x ng s ng G-3-P qua các b c enzyme:

– c 1: m t acyl c thêm vào v trí sn-1 c a G-3-P b i m t G-3-P acyltransferase t o ra LPA (gen SCT1) [36].

– c 2: m t acyl th hai c thêm vào v trí sn-2 b i m t 1-acyl G- 3-P acyltransferase (gen SLC1) t o ra axit phosphatidic (PA), sau ó c dephosphoryl b i m t phosphatase phosphatidate (PAP) t o ra DAG [35].

– c 3: acyl th ba có th c thêm vào v trí sn-3 b ng m t trong hai cách: con ng ph thu c vào acetyl-CoA (tr c ti p t Acyl-CoA) b i acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGA1) và acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase/acyl-CoA: cholesteol acyltransferase(ARE1, ARE2) ho c b ng con ng c l p acetyl-CoA (t m t glycerophospholipid, PL) b i các phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (LRO1) [36].

TGL1, TGL3 và TGL4 tham gia vào s c nh SE và TAG Sau ó, các axit béo t do có th b suy thoái b ng con ng oxy hóa , có liên quan n acyl-CoA oxidase (POX), multifunctional beta-oxidation protein (MFE1) và thiolase (THOI1) Trong Yarowia lipolytica, sáu gen (POX1 – POX6) mã hóa acyl-CoA oxidase có liên quan n b c th hai c a oxy hóa và ch có m t l ng nh SE c t ng h p (2 – 5%) [36].

Hình 2.8 S v các con ng t ng h p ch t béode novo [36]

(ii) Con ng tích l y ch t béo ex novo

Yarrowia lipolyticalà n m men duy nh t có kh n ng làm suy gi m ch t n n n c hi u qu thông qua c ch trao i ch t Ngh a là n m men trong môi tr ng k n c s ti t ra liposan, làm gi m kích th c các gi t ch t n n k n c. Các gi t ch t n n này s g n v i ph n nhô ra c a b m t t bào, sau ó chúng s i vào bên trong t bào Khi vào bên trong t bào, chúng s c s a i theo vài cách nh oxi hóa , oxi hóa , l u tr hình thành các triglyceride (ch t béo) Cu i cùng, nh TAG sau khi th y phân b ng lipase [35]. ây là tính ch t n i b t nh t c aYarrowia lipolytica, s ph c t p và a d ng gen giúp n m men này có th s d ng nhi u ch t n n k n c khác nhau và kh ng tích l y ch t béo Yarrowia lipolytica có nhi u h gen tham gia vào quá trình trao i ch t giúp n m men có kh n ng s d ng các ch t n n k n c khác nhau, trong ó có 6 gen mã hóa enzyme acetyl-CoA (l ng enzyme acetyl-CoA d th a là y u t quan tr ng s t ng h p ch t béo c a vi sinh v t cho d u) [17],[35].

Hình 2.9 S s h p thu các ch t n n k n c c aYarrowia lipolytica[35]

2.5.2 Hóa sinh và s u ch nh kh n ng tích l y ch t béo

Trong th i gian chuy n ti p gi a giai n t ng tr ng (t ng tr ng t o ra sinh kh i) và giai n tích l y ch t béo (t c t ng tr ng gi m do ch t dinh d ng b n ch và ngu n carbon d th a t ng h p ch t béo), m t s con ng b ng n ch n (t ng h p protein và axit nuleic) và nh ng con ng khác xu t hi n (t ng p TAG và axit béo) Trong giai n tích l y, t ng h p ch t béo c n có các ti n thân (acetyl-CoA, malonyl-CoA and glycerol) và n ng l ng (ATP, NADPH) [36] Vai trò c a các enzyme quan tr ng trong u ch nh kh n ng tích l y ch t béo c mô t nh sau:

Khi nit trong môi tr ng b c n ki t s kích ho t AMP deaminase trong giai n phát tri n c a vi sinh v t cho d u [35],[36] AMP deaminase xúc tác ph n ng sau:

→IMP NH 4 AMP kích ho t AMP deaminase làm gi m n ng AMP trong ty th và n ng amonium trong t bào t ng N ng AMP gi m s c ch isocitrate dehydrogenase, ng n ch n các chu trình axit citric c p isocitrate Aconitase u ch nh s tích l y citrate trong ty th , v i l i ra t ty th c u ch nh b i chu k citrate/malate [35],[36].

Thành ph n chính trong lignocellulose

Ngu n lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

Gi y 85 – 99 0 0 – 15 h t 25 – 30 25 – 30 30 – 40 tr u 35 25 12 tr u c a lúa mì 30 50 20

Cellulose là m t polyme m ch th ng có công th c hóa h c (C 6 H 10 O 5 ) n Cellulose th ng c xem nh là polyme c a D-Glucose, các phân t này liên k t i nhau b ng liên k t -1,4 glucoside gi a nguyên t carbon C1 và C4 c a hai phân t glucose li n k Các nhóm OH hai u m ch có tính ch t hoàn toàn khác nhau, c u trúc t i C1 có tính kh , trong khi ó OH t i C4 có tính ch t c a r u. Trong m ch cellulose có hai vùng c u trúc chính là vùng k t tinh và vùng vô nh hình (liên k t hydro và liên k t Van Der Waals) Trong vùng k t tinh, các phân t D-glucose c liên k t ch t ch v i nhau b ng liên k t hydro theo chi u ngang, vùng này khó b t n công b i enzyme và hóa ch t Ng c l i, trong vùng vô nh hình, cellulose liên k t không ch t v i nhau nên d b t n công Cellulose là v t li u ng i hút m, không tan trong n c ngay c dung d ch axit loãng nhi t th p hòa tan c a nó tùy thu c vào m c th y phân Cellulose khá b n v ng i tác ng c a vi sinh v t và hóa ch t, do nó c bao b c b i hemicellulose và lignin [45],[46],[47].

Hemicellulose là m t lo i polyme ph c t p và phân nhánh, th ng có công th c hóa h c (C5H8O4)n và trong s tr ng h p là (C6H10O5)n Hemicellulose là polyme không ng nh t, g m ng 6 (glucose, mannose, galactose) và ng 5(xylose và arabinose) Xylose là thành ph n ph bi n nh t trong hemicellulose, các phân t xylose liên k t v i nhau b ng liên k t -(1,4) Thành ph n ph bi n th hai trong hemicellulose là arabinose M t s thành ph n nh khác nh mannose, galactose và axit uronic c ng có m t Liên k t hình thành x ng s ng c a polyme, còn liên k t th ng hình thành các m ch nhánh C u trúc c a hemicellulose r t a ng tùy vào nguyên li u i v i g m m, D-Mannose chi m t l cao nh t, trong khi ó D-Xylose l i chi m u th trong g c ng Hemicellulose c a bã mía có m ch th ng là xylose, m ch nhánh là glucose và arabinose Mannose và xylose th ng hình thành liên k t este v i C c a lignin ch ng th m n c và s t n công c a ký sinh trùng Do hemicellulose có m ch nhánh nên t n t i d ng vô nh hình và d th y phân Hemicellulose không tan trong n c nhi t th p Nhi t b t u th y phân c a hemicellulose th p h n cellulose Khi có s hi n di n c a axit giúp i thi n kh n ng hòa tan c a hemicellulose trong n c [48],[49],[47].

Hình 2.14 M t s lo i ng trong hemicellulose [49]

Lignin là m t i phân t polyphenol phân nhánh c hình thành trong thành bào th c v t C u trúc c a lignin r t a d ng, ph c t p tùy thu c vào nguyên li u, tu i c a nguyên li u và liên k t ch y u là liên k t ete Lignin c hình thành i 3 monome khác nhau: p-hydroxyphenylpropane, guaiacylpropane và syringylpropane i v i g c ng, guaiacylpropane và syringylpropane là thành ph n ch y u c a lignin và m t l ng nh p-hydroxyphenylpropane Còn trong g m, lignin ch y u là guaiacylpropane Trong các lo i c , lignin bao g m guaiacylpropane và syringylpropane Trong t nhiên, lignin c xem là ch t liên t gi a các t bào th c v t, liên k t ch t ch v i cellulose và hemicellulose, b o v th c v t kh i s t n công c a vi khu n b n c a nh ng liên k t này ph thu c vào b n ch t liên k t và c u trúc c a lignin, các lo i ng n tham gia liên k t Vì y, thành ph n và s phân b c a lignin là các y u t quan tr ng nh t xác nh ph ng pháp th y phân phá v thành t bào kiên c này, r t khó có th tách lignin ra.

Nhóm ch c nh h ng n ho t tính c a lignin là nhóm phenolic hydroxyl t do, methoxy, benzylic hydroxyl, benzyl alcohol và nhóm carbonyl Lignin tan t t trong dung môi dioxane, acetone, pyridine và dimethyl sulfoxide C u trúc c a lignin r t d thay i nhi t cao và pH th p nhi t cao h n 200 o C, lignin b t kh i thành ph n riêng bi t và tách ra kh i cellulose [45],[47].

Hình 2.16 Các monome trong lignin [45]

Trong nguyên li u lignocellulose, có 4 liên k t chính c xác nh bao g m liên k t ete, liên k t este, liên k t carbon - carbon và liên k t hydro B n liên k t này hình thành các liên k t gi a các phân t ng t o thành các polyme (cellulose,hemicellulose và lignin) và liên k t gi a các polyme t o thành lignocellulose [45].Sau ây là b ng tóm t t m i liên h c a các lo i liên k t:

Các lo i liên k t trong các polyme

Cách liên k t Lo i liên k t Các polyme ch a liên k t

Liên k t carbon - carbon Lignin Liên k t hydro Cellulose Liên k t gi a các phân t ng t o thành polyme

Hemicellulose – lignin Liên k t este Hemicellulose – lignin Liên k t gi a các polyme

Mía là m t lo i c s ng d i, thân y u, thân r mang các thân cây m c trên m t t cao t 2 – 5 m, ng kính 2 – 5 cm Lá c ng, th ng, hình dài nh n, g c h p, u kéo dài, buông th ng, m t d i và mép lá u ráp, gân gi a n i rõ nh ng ng n, gân bên dày c n i rõ m t d i và có màu tr ng; b lá dài, giòn, bao b c g n h t thân, có lông, ráp, dày; l i b r t ng n, m m, có lông mi C m hoa hình chùy ng n thân, mang hoa dày c Thân có t, gi a các t ch a nhi u sacarosa Có nhi u lo i mía: mía thân nh g y và th p, mía b u thân to và cao, mía v tr ng hay tím Hàm l ng ng thay i tùy theo t ng lo i mía [50]. lâu, con ng i ch tr ng mía ép l y ng mà ch a t n d ng h t ph n ph ph m th i ra Mà nh ng n m g n ây, công ngh ngày càng phát tri n giúp t o ra các s n ph m s ch và có th tái t o t ph ph m Chính vì v y, ph m vi s d ng cây mía ngày càng a d ng v i các s n ph m có giá tr nh : ng, n sinh h c, nh a sinh h c, các h p ch t hydrocarbon sinh h c (x ng, diesel,…) [15],[48],[51].

Mía là cây d tr ng thích h p v i t phù sa, n ng su t cao Di n tích mía t p trung nhi u ng b ng sông C u Long, ông Nam B , duyên h i Nam Trung B và B c Trung B Vi t Nam c ánh giá là n c có ti m n ng phát tri n cây mía, do nó phù h p v i u ki n th i ti t, khí h u và t ai n c ta Thông th ng, ng i ta tr ng mía ép l y ng [52],[53]. ng B ng Sông C u Long 21%

Trung du và mi n núi phía B c 10% ng B ng Sông H ng 1%

Tây Nguyên 16% ông Nam B 14% c Trung B và duyên h i mi n Trung

Hình 2.17 Phân b các vùng tr ng mía n c ta.

Hi n nay, m i n m n c ta s n xu t kho ng 1,3 tri u t n ng (quy mô công nghi p và dân t ch bi n), t ng ng có kho ng 3 tri u t n bã mía c th i ra[15] Theo B Nông nghi p và Phát tri n nông thôn, v s n xu t mía ng 2011-

2012, c n c thu ho ch c 17,5 tri u t n mía ây là ngu n nguyên li u lignocellulose ph bi n và d i dào Vi t Nam, thích h p cho s n xu t nhiên li u sinh h c

Trong quá trình ch bi n ng, s n ph m ph l n nh t v kh i l ng là bã và n mía Bã mía chi m kho ng 25% kh i l ng cây mía em ép và hàm l ng carbonhydrate trong bã mía cao kho ng 60 – 80% Bã mía ép th công l ng ng còn l i trong bã mía khá cao Còn bã mía công nghi p có l ng ng th p, lignin cao (> 20%) [15].

M c dù bã mía là ngu n ph ph m nông nghi p phong phú nh ng ch a c d ng hi u qu n c ta Thông th ng, mía sau khi tr i qua quá trình xay xát s c dùng làm th c n cho trâu bò, cung c p nhi t, n cho nhà máy mía ng ho c k t h p v i các ph gia khác s n xu t ván sàn ép,… Nh ng bi n pháp x lý này ch a khai thác h t ti m n ng c a bã mía, ôi khi s gây cháy và làm ô nhi m môi tr ng [15],[16] N u có th t n d ng bã mía s n xu t ra biodiesel s giúp gi i quy t v n v môi tr ng, h giá thành s n ph m và nâng cao giá tr cây mía.

Thành ph n bã mía và kh n ng chuy n i cellulose, hemicellulose thành ng là các y u t giúp ngu n nguyên li u tái t o này c s d ng s n xu t nhiên li u sinh h c [51].

Thành ph n c a bã mía

2.10 Ph ng pháp th y phân lignocellulose

Th y phân là s phân c t các polyme c a cellulose và hemicellulose thành các monome Trong ph n ng, cellulose t o ra glucose và hemicellulose s phóng thích ra pentose và hexose Thành ph n ng ch y u trong hemicellulose c a g m m là mannose, trong khi ó ng xylose chi m u th nh t trong hemicellulose c a c ng và ph ph m nông nghi p Th y phân có th th c hi n b ng hóa h c và enzyme S l a ch n ph ng pháp th y phân ph thu c vào thành ph n, c u t o lignocellulose, s n ph m t o thành, chi phí th c hi n,…[54],[55].

Th y phân hóa h c là s ti p xúc c a nguyên li u lignocellulose v i hóa ch t trong kho ng th i gian và nhi t nh t nh, t o ra các phân t ng t cellulose và hemicellulose Axit c s d ng r ng rãi trong th y phân hóa h c Axit sunphuric là axit thông d ng nh t dùng trong quá trình th y phân lignocellulose, k n là axit hydrocloric, axit nitric, axit photphoric,… Th y phân b ng axit c chia thành hai nhóm: th y phân b ng axit m c và th y phân b ng axit loãng. t s thu n l i c a th y phân b ng axit là axit có th xâm nh p vào lignin mà không c n b t k ph ng pháp ti n x lý nào, t c ph n ng nhanh h n th y phân b ng enzyme [56],[57],[58].

Hình 2.18 Ph n ng th y phân hemicellulose [57]

Hình 2.19 Ph n ng th y phân cellulose [58]

Th y phân lignocellulose b ng H 2 SO 4 hay HCl m c là quá trình th y phân ng i c do ông Braconnot khám phá vào n m 1819 [56] Th y phân b ng axit m c cho hi u qu chuy n hóa ng cao h n th y phân b ng axit loãng Thêm vào ó, quá trình này c th c hi n nhi t th p (kho ng 40 o C) Tuy nhiên, ng axit trong quá trình này r t cao (30 – 70%) làm cho thi t b ph n ng d b n mòn Vì v y, yêu c u thi t b ph n ng ph i là nh ng h p kim t ti n ho c nh ng v t li u phi kim c bi t Ngoài ra, trung hòa axit c n m t l ng l n th ch cao và thu h i axit là m t quá trình yêu c u nhi u n ng l ng Chi phí u t và b o trì r t l n Vì nh ng lý do này làm cho ti m n ng và kh n ng ng d ng c a quá trình này trong l nh v c công nghi p r t th p M c dù có nh ng b t l i nêu trên nh ng th y phân b ng axit m c v n c quan tâm ó là quá trình biosulfurol c tìm ra b i m t nhóm nghiên c u Hà Lan Trong quá trình này, sinh kh i ti p xúc v i axit H 2 SO 4 70%, sau ó ti n hành th y phân b ng cách thêm n c vào Axit c thu h i m t ph n b ng màng anion, m t ph n b ng quá trình x lý n c th i khí d i d ng H 2 S [55],[56],[58].

2.10.1.2 Th y phân b ng axit loãng

T nh ng h n ch này, th y phân b ng axit loãng c nghiên c u r ng rãi và có kh n ng áp d ng quy mô l n Quá trình này có m t s thu n l i nh n gi n, nhanh chóng, không yêu c u thu h i dung môi Th y phân nguyên li u lignocellulose b ng axit loãng, cellulose và hemicellulose u c th y phân áng u ki n th c hi n t ng i nh nhàng nh n ng axit t 1 n 10%, nhi t ph n ng v a ph i (trong kho ng 100 – 150 o C) trong th i gian ng n Các polysaccharide liên k t v i lignin b ng liên k t este nên d b th y phân Th t v y, liên k t gi a hemicellulose và lignin d b th y phân nhi t nh khi có s hi n di n c a axit hay baz m t nhi t nh t nh, ph n ng phân h y liên t c x y ra, d n n s hình thành m t vài lo i furan (furfural, 5-hydroxymethylfurfural), axit formic và axit levulinic, Các ph n ng này làm gi m hi u su t chuy n hóa ng trong quá trình th y phân H n n a, các s n ph m không mong mu n này s c ch s lên men vi sinh v t T nh ng u nêu trên cho th y th i gian, nhi t ph n ng và n ng axit là nh ng y u t quan tr ng nh h ng m nh n quá trình th y phân Chính vì v y, c n ph i tìm ra các u ki n t i u cho quá trình th y nguyên li u lignocellulose M t s nghiên c u ng h c th y phân bã mía b ng axit loãng cho th y r ng thành ph n ng chính trong dung d ch sau th y phân là xylose, glucose, arabinose và các ch t c ch nh fufural, 5-hydroxymethylfurfural, axit axetic Quá trình th y phân c th c hi n các u ki n khác nhau nh thay i nhi t t 90 – 120 o C, n ng axit t 1 – 6% Th y phân v i các lo i bã mía và axit khác nhau (H 2 SO 4 , HCl, HNO 3 , H 3 PO 4 ) Hi u su t chuy n hóa ng c a hemicellulose khá cao h n 80% trong các u ki n nêu trên [44],[59],[60],[61].

Hình 2.20 Thành ph n sau th y phân ph ph m nông nghi p b ng axit loãng [59] 2.10.2 Th y phân b ng enzyme

Th y phân b ng enzyme là quá trình chuy n hóa cellulose và hemicellulose thành các lo i ng n b ng các enzyme c bi t Ph ng pháp này r t c quan tâm nghiên c u, có th thay th ph ng pháp th y phân b ng axit u m a th y phân b ng enzyme là hi u su t chuy n hóa ng cao, không t o ra ch t c ch , không n mòn thi t b , u ki n th c hi n nh (pH 4,5 – 5 và nhi t 40 –

50 o C), tiêu th n ng l ng th p, không c h i, ít nh h ng n môi tr ng Tuy nhiên, do th i gian ph n ng dài (kho ng vài ngày) và giá thành c a enzyme cao làm cho ph ng pháp này không th m r ng quy mô công nghi p Bên c nh ó, ng enzyme trong quá trình th y phân s gi m i áng k n u có s hi n di n c a lignin vì nó c xem là v t li u h p thu enzyme Và enzyme r t khó t n công vào u trúc cellulose do nó c bao b c b i hemicellulose và lignin Chính vì v y,nguyên li u ph i x lý s b tr c khi th y phân t ng t c ph n ng [44],[56].

Cellulase c dùng b gãy liên k t trong cellulose t o ra glucose. Cellulase là h n h p c a 3 lo i ezyme: endo-glucanase, exo-glucanase và - glucosidase; c t o thành t các vi khu n, n m (Trichoderma, Penicillium và

Aspergillus,…) Các enzyme này có tác d ng khác nhau trong quá trình th y phân.

Endo-glucanase t n công vào c u trúc bên trong c a cellulose Nó phân c t liên k t liên k t -1,4 glucoside c a c u trúc cellulose các v trí ng u nhiên t o ra các chu i t do Exo-glucanase t n công các v trí c th (các u không kh trong cellulose) t o cellobiose ho c glucose -glucosidase chuy n i cellobiose thành glucose [44].

Hình 2.21 S ph n ng th y phân cellulose b ng enzyme cellulase [44]

Hemicellulose là h n h p các polyme c a pentose (xylose và arabinose), hexoses (mannose) Xylan là thành ph n chính c a hemicellulose Thành ph n chính trong xylan bao g m xylose, L-arabinose, và axit D-glucoronic Th y phân hoàn toàn xylan c n có enzyme endo -1,4 xylanase, -xylosidase và m t s ho t ng enzyme ph ki n nh -L-arabinosidase và -glucoronidase Endo-xylanase n công c u trúc xylan m t cách ng u nhiên -xylosidase th y phân xylooligosacharide thành xylose Các enzyme -L-arabinosidase và -glucoronidase th y phân xylan thành arabinose và axit 4-O-methylglucuronic [44]. ng 2.10 So sánh các ph ng pháp th y phân [56],[62]

Ph ng pháp th y phân u m Khuy t m

– Nhi t ph n ng th p – Hi u su t chuy n hóa ng cao

– Tiêu hao nhi u axit – Thi t b ch ng n mòn – n nhi u n ng l ng cho quá trình thu h i axit

– Th i gian ph n ng dài (2 –

Th y phân b ng axit loãng

– Tiêu th ít axit – Th i gian ph n ng ng n

– Nhi t ph n ng cao – Hi u su t chuy n hóa ng th p h n – Thi t b ch ng n mòn – Hình thành các ch t c ch

– Nhi t ph n ng th p – Hi u su t chuy n hóa ng cao – Không có ch t c ch

– Th i gian ph n ng dài (vài ngày)

Trong quá trình th y phân b ng axit loãng có th t o ra m t m t s s n ph m gi m c p gây c ch quá trình lên men (Hình 2.22) S hình thành các ch t c ch trong th y phân axit ph thu c vào nhi u y u t nh b n ch t nguyên li u lignocellulose, nhi t và th i gian ph n ng c a quá trình th y phân Các ch t c ch gây c h i lên vi sinh v t, làm gi m n ng su t và hàm l ng d u thu c Khi có nhi u lo i ch t c ch cùng xu t hi n s gây ra tác d ng c ch càng cao Vì v y, ph ng pháp t i u là ng n ch n s hình thành các ch t c ch thông qua các u ki n th y phân ho c lo i b chúng b ng ph ng pháp kh c [54],[55] M t s ch t c ch th ng g p c trình bày trong hình 2.22.

Hình 2.22 Các ch t c ch và c u trúc hóa h c [55]

2.11.1 Các s n ph m thoái hóa ng

M c trùng h p th p và tính ch t vô nh hình c a cellulose, hemicellulose ng trong quá trình th y phân d n n phóng thích ra hexose (glucose, galactose và mannose) và pentose (arabinose và xylose) vào ph n tan c trong n c Khi u ki n ph n ng khá kh c nghi t, pentose b kh n c hình thành furfural, t ng t 5- hydroxymethylfurfural (HMF) c t o thành t s kh n c c a hexose Furfural và HMF gây c ch tr c ti p n các enzyme nh alcohol dehydrogenase (ADH), pyruvate dehydrogenase (PDH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH) ây là các enzyme c n thi t cho s trao i ch t c a vi sinh v t HMF ít c h i h n furfural và n ng c a chúng th p trong th y phân cellulose và hemicellulose Nghiên c u ng h c ch ra r ng s hình thành các ch t c ch này t ng m nh khi ph n ng nhi t cao và th i gian dài [54],[55].

Hình 2.23 Các s n ph m thoái hóa ng có th hình thành trong quá trình th y phân b ng axit [54]

2.11.2 Các s n ph m thoái hóa lignin

Các h p ch t nh aromatic, polyaromatic, phenolic và aldehyde c hình thành t s suy thoái lignin Các h p ch t phenolic gây c ch áng k và c h i n furfural và HMF ngay c n ng th p Chúng gây ra s phân vùng và m t tính toàn v n c a màng t bào làm gi m s phát tri n t bào và ng hóa ng.

Th i gian và nhi t ph n ng là hai y u t chính nh h ng n s hình thành các ch t c ch này [54],[55].

2.11.3 Các h p ch t có ngu n g c t c u trúc lignocellulose

Ngoài các ch t c ch nêu trên, chính b n thân lignocellulose c ng có ch t c ch t nhiên (nh a có tính axit, taninic, các axit terpen, sáp, các h p ch t ch ng oxi hóa,…) Các h p ch t này có ngu n g c t s t v c a cây ch ng l i s t n công a vi sinh v t, sâu h i Thành ph n c a các ch t c ch t nhiên r t ph c t p và thay i tùy theo t ng lo i cây, gi a các cây cùng lo i và các b ph n khác nhau a cây Axit axetic có ngu n g c t các nhóm acetyl trong hemicellulose c phóng thích trong quá trình th y phân Nó khu ch tán vào trong t bào làm pH bên trong gi m gây c ch ho t ng t bào c tính này thay i tùy theo u ki n lên men Ch t chi t tách ít c h n các d n xu t t lignin và axit axetic.

S hình thành các ch t c ch t nhiên và axit axetic là u không th tránh kh i trong th y phân lignocellulose, có th lo i b hay làm gi m nh h ng c h i a chúng b ng cách nâng cao pH hay chuy n i chúng thành nh ng s n ph m không c h i [54],[55].

Các ion kim lo i n ng (s t, crom, niken, ng,…) có th xu t hi n do s n mòn thi t b th y phân Chúng c ch các enzyme trong quá trình trao i ch t c a vi sinh v t [54],[55].

Nh ã trình bày trên, sau khi th y phân b ng axit loãng, ngoài l ng ng thu c còn xu t hi n thêm m t s s n ph m ph không mong mu n Chúng nh ng n s phát tri n, trao i ch t và hình thành s n ph m c a t bào vi sinh v t trong quá trình lên men Do ó, ph i ti n hành kh c lo i b các ch t c ch này. Các ph ng pháp kh c s nh h ng khác nhau n thành ph n ng, ch t c ch và kh n ng lên men c a vi sinh v t [55],[54],[63],[64],[65] M t s ph ng pháp th ng s d ng:

Bay h i b ng chân không ch có th lo i b m t s h p ch t d bay h i nh axit axetic, furfural và vanilin Các ch t c h i không d bay h i (các ch t c ch nhiên và các d n xu t t lignin) v n không thay i [55],[54],[66].

So sánh k t qu th y phân v i các nghiên c u khác

Lo i nguyên li u u ki n t t nh t ng ng t ng (g/L) Tài li u tham kh o

Bã mía HCl 2,5%, 121 oC, 45 phút 21,38 [14]

Bã mía HNO 3 6%, 122 oC, 9,3 phút 21,96 [60]

Bã mía H2SO4 2%, 122 oC, 24 phút 25,10 [61]

4.2.6 Quá trình kh c dung d ch bã mía th y phân tr thành môi tr ng dinh d ng cho n m men phát tri n, c n ph i kh c lo i b các ch t c ch t n t i trong dung d ch bã mía th y phân Trong quá trình kh c, c m i 1000 mL dung d ch bã mía th y phân c n kho ng 29 g Ca(OH) 2

A: Dung d ch bã mía tr c khi kh c B: Dung d ch bã mía sau khi kh c

Hình 4.12 Dung d ch bã mía th y phân ch a và ã kh c

Sau khi kh c, x y ra th t thoát m t ít ng Tuy nhiên, s th t thoát này không áng k (B ng 4.8) S thay i n ng ng này c th hi n trong hình 4.13. ng 4.8 nh h ng c a kh c n n ng ng t ng

Bã mía th y phân N ng ng t ng (g/L)

Bã mía th y phân ng ng, g/L

Hình 4.13 th bi u di n nh h ng c a s kh c n n ng ng t ng

4.3 Quá trình nuôi c y tìm ra m t s u ki n t t nh t cho quá trình nuôi c y c ng nh kh n ng tích l y d u c a vi sinh v t, tài ti n hành thí nghi m kh o sát nh h ng c a th i gian, ngu n carbon, ngu n nit , nhi t và n ng ng t ng.

4.3.1 nh h ng c a th i gian nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Th i gian là y u t quan tr ng nh h ng n s phát tri n và kh n ng tích y ch t béo c a Y lipolytica Po1g trong quá trình nuôi c y N m men c nuôi y t 1 n 7 ngày trong môi tr ng g m bã mía th y phân ã kh c (20 g/L), cao n m men (5 g/L), pepton (5 g/L) u ki n nuôi c y c th c hi n nhi t

26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.14.

Hình 4.14 Sinh kh i thu c theo th i gian t ngày 1 n ngày 7 (t trái qua ph i)

K t qu nuôi c y c th hi n trong b ng 4.9 Ngày u tiên, l ng sinh kh i ít (1,97 g/L) (Hình 4.15) Trong giai n này, n m men ang m i b t u thích nghi trong môi tr ng m i, t bào chu n b phân chia Sau ó, n m men b t u sinh tr ng m nh t ngày th 2 vì ngu n carbon và nit b t u c s d ng Và vào ngày th 4 thì t giá tr c c i, n ng sinh kh i là 11,60 g/L Trong giai n này, n m men t tr ng thái cân b ng ng t c là t c sinh tr ng b ng v i c ch t i c a t bào K ó, ngày th 5 vi sinh v t b c vào giai n suy vong, sinh kh i b t u gi m Nguyên nhân do khi ngu n dinh d ng ang d n c n ki t làm gi m s trao i ch t c a n m men và x y ra s c nh tranh th c n d n n ch t hàng lo t c a t bào Ngày th 7, sinh kh i t ng l i Khi ngu n dinh d ng trong môi tr ng ã h t, t bào b t u s d ng ch t béo tích l y c nh là ngu n dinh d ng.

Cùng v i s phát tri n c a n m men theo th i gian, n ng ng t ng trong môi tr ng c ng c quan sát, ngày u l ng ng gi m nh Sau ó, b t u gi m m nh theo th i gian và n ngày th 5 thì n ng ng gi m còn kho ng 76,45%, ây là lúc ngu n dinh d ng trong môi tr ng tiêu th g n h t. n ngày th 7, l ng ng g n nh b ng không u này phù h p v i nh n xét trên v vi c s d ng ngu n dinh d ng c a n m men.

Song song ó, hàm l ng ch t béo thu c c ng c th c hi n Ngày u tiên c a nuôi c y, l ng d u tích l y th p kho ng 19,67% T ngày th 2 n ngày th 4, hàm l ng d u thu c t ng nhanh t 22,56 lên 34,33% Nguyên nhân do ngu n nit ã h t và b t u kích thích các enzyme tích l y d u ho t ng Vì v y, ng d u thu c t ng nhanh và t c c i vào ngày th 4 Nh ng ngày k ti p, ng d u gi m d n t 34,33% xu ng còn 25,14%. ng 4.9 nh h ng c a th i gian n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo a n m men

Sinh kh i (g/L) ng ng t ng (g/L)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 ng sinh kh i ng ng

Hàm l ng ch t béo ng si nh kh i, g/L ng ng t ng, g/L H àm l n g ch t béo, %

Hình 4.15 th bi u di n nh h ng c a th i gian n ng ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

V y th i gian t t nh t nuôi c y n m men là 4 ngày v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 11,60 g/L và 34,33%.

4.3.2 nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Kh o sát nh h ng c a các ngu n cung c p carbon khác nhau nh dung d ch bã mía th y phân ã kh c (A), D-Glucose tinh khi t (B) và dung d ch bã mía th y phân không kh c (C) n s phát tri n và hàm l ng ch t béo thu c c a m men Môi tr ng nuôi c y g m: ngu n carbon 20 g/L, cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L u ki n th c hi n: th i gian lên men là 4 ngày nhi t 26 o C v i c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.16.

Hình 4.16 Sinh kh i thu c c a các ngu n carbon khác nhau

K t qu c trình bày trong b ng 4.10 N m men phát tri n t t trên trong dung d ch bã mía th y phân ã kh c và D-Glucose v i l ng sinh kh i thu c ng ng là 11,86 g/L và 10,40 g/L (Hình 4.17) ng th i, hàm l ng ch t béo trong 2 môi tr ng này c ng c kh o sát và k t qu t c l n l t là 33,63% và 31,57% K t qu nuôi c y trong 2 môi tr ng này ít chênh l ch Vì v y, bã mía th y phân có th thay th D-Glucose nuôi c y n m men t o ra sinh kh i và d u vi sinh v t Thêm vào ó, khi xét v tính kinh t thì n m men sinh tr ng trong dung d ch bã mía th y phân ã kh c có l i h n, vì t n d ng c ngu n nguyên li u b i, trong khi D-Glucose tinh khi t r t m c ti n i v i dung d ch bã mía th y phân ch a kh c, n m men phát tri n r t kém u này cho th y kh c là c trung gian c n thi t cho quá trình nuôi c y n m men Nguyên nhân là do s có t c a ch t c ch HMF, furfural và pH trong môi tr ng nuôi c y quá th p. ng 4.10 nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men Ngu n carbon Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

A: Bã mía th y phân ã kh c B: D-Glucose

C: Bã mía th y phân ch a kh c

Ngu n cacbon ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng sin h kh i, g/L H àm l ng c h t b é o, %

A: Bã mía th y phân ã kh c B: D-Glucose

C: Bã mía th y phân ch a kh c

Hình 4.17 th bi u di n nh h ng c a ngu n carbon n s phát tri n và kh ng tích l y ch t béo c a n m men y, dung d ch bã mía kh c là ngu n carbon r ti n nuôi c y Y lipolytica

Po1g v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 11,86 g/L và 34,79%.

4.3.3 nh h ng c a ngu n nit n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Ngoài ngu n carbon, ngu n nit c ng nh h ng n quá trình nuôi c y Vì y, ti n hành kh o sát s nh h ng các ngu n nit khác nhau nh (NH 4 ) 2 SO 4 ,

NH4NO3, urê, pepton s phát tri n c a n m men c ng nh s tích l y ch t béo ây là nh ng ngu n nit ph bi n Môi tr ng nuôi c y g m: dung d ch bã mía th y phân ã kh c 20 g/L, cao n m men 5 g/L, ngu n nit 5 g/L u ki n ti n hành: th i gian lên men là 4 ngày nhi t 26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.18.

Hình 4.18 Sinh kh i thu c c a các ngu n nit khác nhau

K t qu c trình bày trong b ng 4.11 Khi pepton c s d ng nh ngu n nit , n m men phát tri n t t nh t v i l ng sinh kh i là 11,91 g/L và 34,68% ch t béo thu c Trong khi, dùng (NH 4 ) 2 SO 4 , urê, NH 4 NO 3 làm ngu n nit thì n ng sinh kh i thu c t ng ng là 9,57; 8,53 và 6,40 g/L và hàm l ng ch t béo thu c l n l t là 30,28; 26,88; 24,17% (Hình 4.19) Trong môi tr ng ch a NH 4 NO 3 ho c (NH4)2SO4, n m men t ng tr ng và tích l y ch t béo kém h n, có th gi i thích là trong quá trình phát tri n ã hình thành axit HNO3 ho c H2SO4 làm pH trong môi tr ng gi m xu ng gây c ch n m men sinh tr ng Hai môi tr ng này có pH o c là 4,03 và 4,73 u này ch ng minh gi i thích này phù h p Ngoài ra, k t qu c ng ch ra r ng s d ng ngu n nit h u c giúp n m men phát tri n và tích l y ch t béo t t h n khi s d ng ngu n nit vô c Mà k t qu này t ng t v i nghiên c u c a Zhu et al., (2008) Pepton là ngu n nit h u c t t nh t cho Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n và NH 4 NO 3 là ngu n nit vô c t nh t. ng 4.11 nh h ng c a ngu n nit n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men Ngu n nit Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

Ammonium sulphate Ngu n nit ng ô sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng sinh kh i, g/L H àm l ng ch t bé o, %

Hình 4.19 th bi u di n nh h ng c a ngu n nit n s sinh tr ng và kh ng tích l y ch t béo c a n m men

V y, pepton là ngu n nit thích h p nuôi c y Y lipolytica Po1g v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 11,91 g/L và 34,68%.

4.3.4 nh h ng c a nhi t nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Bên c nh ó, nhi t môi tr ng c ng là y u t quan tr ng nh h ng n quá trình nuôi c y Do ó, kh o sát nh h ng c a các nhi t khác nhau n n ng sinh kh i c ng nh s tích l y ch t béo Do nhi t sinh lý c aY lipolytica có th phát tri n trong kho ng 20 – 40 o C, m t s n c thì u ki n nuôi c y có th a vào u ki n t nhiên t ng hi u qu kinh t ó là lý do ch n nghi m th c dao ng t 20 – 37 o C Môi tr ng nuôi c y g m: dung d ch bã mía th y phân ã kh c 20 g/L, cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L Th i gian nuôi c y là 4 ngày v i c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.20.

Hình 4.20 Sinh kh i thu c các nhi t khác nhau

K t qu nuôi c y c trình bày trong b ng 4.12 Khi nhi t t ng t 20 n

37 o C thì n ng sinh kh i gi m d n t 13,55 xu ng 9,91 g/L Hàm l ng ch t béo ng t 27,90 n 34,25% khi nhi t t ng t 20 n 26 o C Nh ng khi nhi t ti p t c t ng n 37 o C, ph n tr m ch t béo thu c b t u gi m d n t 34,25 xu ng 21,27% (Hình 4.21) Kh n ng tích l y ch t béo t ng khi nhi t t ng, nh ng n u t ng n m t nhi t nh t nh (nhi t t i u) thì kh n ng này b t u gi m và n m c tri t tiêu Khi nhi t môi tr ng cao, các enzyme c a n m men s b bi n tính làm gi m kh n ng sinh tr ng và tích l y ch t béo N u nhi t môi tr ng th p h n nhi t t i u, n m men ho t ng t t h n nh ng do s sinh tr ng quá nhanh s x y ra hi n t ng c nh tranh th c n d n n n m men ch t hàng lo t, nên ch t béo thu c c ng th p u này cho th y, t c sinh tr ng và kh n ng tích l y ch t béo ch u nh h ng l n c a nhi t ng 4.12 nh h ng c a nhi t n s phát tri n kh n ng tích l y ch t béo a n m men Nhi t ( o C) Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

Nhi t , o C ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng s in h k h i, g/ L Hàm l ng c h t b éo , %

Hình 4.21 th bi u di n nh h ng c a nhi t n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

D a vào k t qu thí nghi m có th k t lu n nhi t t t nh t nuôi c y

Y.lipolytica Po1g là 26 o C v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 12,39 g/L và 34,25%.

4.3.5 nh h ng c a n ng ng t ng trong môi tr ng nuôi c y n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y lipolytica Po1g

Cu i cùng, kh o sát nh h ng c a n ng ng t ng n quá trình nuôi y D a vào m c tiêu th c ch t carbon nitrate c a vi sinh v t, tùy t ng ph ng pháp lên men khác nhau mà n ng ng có th dao ng t 20 – 100 g/L Môi tr ng nuôi c y g m cao n m men 5 g/L, pepton 5 g/L, dung d ch bã mía th y phân ã kh c v i n ng ng thay i t 20 n 40 g/L u ki n ti n hành: th i gian lên men là 4 ngày 26 o C v i t c l c 160 vòng/phút S n ph m nuôi c y c minh h a hình 4.22.

Hình 4.22 Sinh kh i thu c các n ng ng t ng khác nhau

K t qu c trình bày b ng 4.13 Nhìn vào hình 4.23 d dàng nh n th y ng khi n ng ng t ng t ng t 20 n 30 g/L thì sinh kh i và hàm l ng ch t béo t ng N ng ng t ng s d ng là 30 g/L thì sinh kh i thu c là cao nh t 13,67 g/L, ng v i hàm l ng ch t béo thu c 46,48% sinh kh i Tuy nhiên, khi ng ng t ng t ng lên 40 g/L thì n ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo t u gi m xu ng v i giá tr t ng ng thu c là 9,79 g/L và 38,86% Nguyên nhân a ra là ngoài ch t c ch (HMF và furfural) hi n di n trong môi tr ng bã mía th y phân, n ng ng cao gây c ch s sinh tr ng c a n m men c ng nh kh n ng tích l y ch t béo ng th i v t quá kh n ng ng hóa c a t bào. ng 4.13 nh h ng c a n ng ng t ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men ng ng (g/L) Sinh kh i (g/L) Hàm l ng ch t béo (%)

20 30 40 ng ng t ng, g/L ng sinh kh i Hàm l ng ch t béo ng si nh kh i, g/ L Hàm ng c h t b é o , %

Hình 4.23 th bi u di n nh h ng c a n ng ng t ng n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

V y n ng ng t ng t t nh t trong quá trình nuôi c y là 30 g/L v i n ng sinh kh i thu c và hàm l ng ch t béo thu c t ng ng là 13,67 g/L và 46,48%.

So sánh k t qu nuôi c y v i các nghiên c u khác

Ch ng n m men Ngu n carbon

Candida lipolytica n h p c a stearin, glucose và glycerol công nghi p

Yarrowia lipolytica Ch t béo công nghi p 8,7 44 [27]

ACA-YC 5033 Glucose th ng m i 5,5 14 [38]

Po1g Bã mía th y phân 13,67 46,48 Nghiên c u

Sau khi trích ly, kh sáp và gum, d u vi sinh v t c l u tr trong h bi y kín v i dung môi acetone, t trong t l nh.

Sau khi kh sáp và gum, thành ph n ch t béo c a d u vi sinh v t t t bào

Yarrowia lipolytica Po1g c phân tích b ng GC. t qu GC cho th y có kho ng 54,02 – 74,21% ch t béo trung tính là các axit béo t do (FFA), 3,20 – 29,32% MAG, 0,19 – 4,60% DAG, 2,84 – 27,11% TAG và nh ng ch t khác chi m 9,34 – 13,64% (B ng 4.15) Nh v y, ch t béo trung tính có hàm l ng cao nh t, k n là các glyceride.

Khi s d ng ngu n nit là pepton cho hàm l ng FFA cao nh t, k n là (NH4)2SO4, NH4NO3, urê Ti p n là các glyceride chi m kho ng 16,45 – 33,59%. Hàm l ng FFA, các glyceride g n b ng nhau trong môi tr ng nuôi c y s d ng ngu n carbon là D-Glucose và bã mía th y phân ã kh c u này cho th y, bã mía th y phân là ngu n carbon r ti n có th thay th D-Glucose, làm gi m chi phí n xu t biodiesel. ng 4.15 Thành ph n ch t béo c a SCO khi nuôi c y Yarrowia lipolytica

Po1g v i ngu n nit và carbon khác nhau.

Ph n tr m th tích (%) Thành ph n

FFA 56,23 68,90 54,02 70,16 74,21 MAG 4,08 10,56 29,32 11,82 3,20 DAG 2,40 1,95 0,38 0,19 4,61 TAG 27,11 4,95 2,84 6,84 8,64 Khác 10,18 13,64 13,44 10,99 9,34

A: NH 4 NO 3 , B: (NH 4 ) 2 SO 4 ,C: Urê, D: Glucose, E: Pepton ho c bã mía th y phân ã kh c.

Thành ph n axit béo ch y u c a t bào Yarrowia lipolytica Po1g là axit oleic

(C18:1), axit palmitic (C16:0), axit palmitoleic (C16:1), axit stearic (C18:0), axit arachidonic (C20:0), axit eicosenoic (C20:1) và nh ng axit béo không xác nh khác (B ng 4.16). t qu cho th y hàm l ng và thành ph n axit béo trong ch t béo khác nhau tùy thu c vào môi tr ng nuôi c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g Nuôi c y m men trong cùng m t ngu n carbon, khác ngu n nit cho k t qu khác nhau. Axit palmitic 36,14%, axit oleic 23,43%, axit stearic 7,64% chi m t l cao trong ch t béo trung tính khi s d ng (NH4)2SO4 là ngu n nit Trong khi dùng NH4NO3 là ngu n nit , axit oleic chi m t l cao nh t 51,02%, k n là axit palmitic 17,22%, axit palmitoleic 11,04% Trong 4 ngu n nit kh o sát, urê cho k t qu t nh t vì có nhi u thành ph n không xác nh c (66,58%) và các FFA ch chi m kho ng 33,42% Hàm l ng FFA trong môi tr ng s d ng pepton là ngu n nit ch y u là axit oleic 24,09%, axit palmitic 20,84%, axit arachidonic 20,28%, axit stearic 16,28% Hàm l ng axit oleic (51,21%), axit palmitic (13,89%), axit palmitoleic (10,33%) cao trong môi tr ng có D-Glucose là ngu n carbon. ng 4.16 Thành ph n axit béo t do v i ngu n nit và carbon khác nhau

Ph n tr m th tích (%) Thành ph n

A: NH 4 NO 3 , B: (NH 4 ) 2 SO 4 ,C: Urê, D: Glucose, E: Pepton ho c bã mía th y phân ã kh c

Hàm l ng axit béo bão hòa và không bão hòa n chi m h n 80%, làm cho ch t béo trung tính thu c t nuôi c y Yarrowia lipolytica Po1g là m t nguyên li u lý t ng s n xu t biodiesel Trong ó, ch t béo trung tính c trích ly trong môi tr ng bã mía th y phân ã kh c v i pepton là ngu n nit là thích h p nh t do hàm l ng FFA cao kho ng 92,22% và axit béo bão hòa trong ch t béo trung tính chi m kho ng 57,40% cao h n các ngu n carbon, nit khác.

Sau khi kh o sát quá trình th y phân bã mía và quá trình nuôi c y n m men

Yarrowia lipolyticaPo1g Chúng tôi ã thu c m t s k t qu nh sau:

– Các k t qu trong quá trình th y phân cho th y hàm l ng ng thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, n ng axit, t l bã mía/dung d ch axit và nhi t N ng ng t ng theo th i gian, n ng axit và nhi t Khi t giá tr c c i thì b t u gi m xu ng Các thông s t t nh t c a quá trình th y phân bã mía là: ặ Th i gian: 6 gi ặ ng axit: 3% ặ l bó mớa/dung d ch axit: 1/25 ặ Nhi t : 90 o C

– V i u ki n th y phân này, n ng ng t ng thu c là 22,45 g/L và thành ph n chính trong dung d ch th y phân là các lo i ng n nh xylose, glucose và arabinose u này ch ng t bã mía là nguyên li u lignocellulose ti m ng có th ng d ng trong hóa h c xanh.

– K t qu trong quá trình nuôi c y ch ra r ng kh i l ng sinh kh i và kh ng tích l y ch t béo c a n m men thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, ngu n carbon, ngu n nit , nhi t và n ng ng N ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo t ng theo th i gian và n ng ng t ng Khi t giá tr c i thì b t u gi m xu ng i v i nhi t , hàm l ng ch t béo thu c bi n i theo xu th nêu trên nh ng n ng sinh kh i l i gi m khi t ng nhi t Các thông s t t nh t c a quá trình nuôi c y là: ặ Th i gian nuụi: c y 4 ngày ặ Ngu n carbon: dung d ch bó mớa th y phõn ó kh c ặ Ngu n nit : pepton ặ Nhi t : 26 o C ặ ng ng: 30 g/L

– V i u ki n nuôi c y này, n ng sinh kh i thu c 13,67 g/L và hàm ng ch t béo tích l y là 46,48% t ng i cao, g n b ng v i k t qu c a các nghiên c u khác Thành ph n d u vi sinh v t bao g m các axit béo m ch dài C16, C18 và C20 no và không no, t ng t nh d u th c v t u này cho th y ch t béo n m men phù h p yêu c u nguyên li u t ng h p biodiesel Vì v y, có th s ng Y.lipolytica Po1g s n xu t d u vi sinh v t r ti n t bã mía th y phân ây là n m men cho d u ti m n ng có th ng d ng trong công ngh sinh h c tr ng.

– Qua ó cho th y bã mía th y phân là ngu n carbon r ti n s n xu t ch t béo t n m men, giúp gi m giá thành s n xu t d u vi sinh v t, nâng cao tính c nh tranh v i các ngu n nguyên li u truy n th ng T n d ng c ngu n ph ph m nông nghi p n c ta, giúp b o v môi tr ng, nâng cao giá tr c a cây mía.

5.2 Ki n ngh ỉ Quỏ trỡnh th c hi n thu c k t qu kh quan nh ng tài cũn m t s h n ch sau:

– Ch a kh o sát c t ng b ph n c a cây mía nh m ánh giá, so sánh ch t ng và hi u qu kinh t

– Ch a th y phân bã mía b ng enzyme so sánh hàm l ng ng và tính kinh t

– Ch a phân tích c thành ph n các ch t c ch trong dung d ch bã mía th y phân tr c và sau khi kh c.

– Ch a phân tích các ch s hóa lý c a ch t béo. ỉ h n ch v m t th i gian và kinh phớ th c hi n nờn tài d ng l i cỏc t qu kh o sát trên, c n c vào k t qu thu c t quá trình thí nghi m và m t s t còn h n ch c a tài, chúng tôi xin a ra m t s ki n ngh nh sau:

– Phân tích thành ph n các ch t c ch trong môi tr ng nuôi c y hi u rõ nh h ng c a chúng n phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp kh c khác (than ho t tính, nh a trao i ion, enzyme,….) so sánh hi u qu kh c và tính kinh t c a t ng ph ng pháp.

– Ti n hành nuôi c y n m men trên các ngu n carbon khác (xylose, arabinose) giúp hi u rõ h n kh n ng tiêu th và tích l y ch t béo c a n m men trên ng lo i ng này.

– Kh o sát thêm các y u t nh h ng n quá trình nuôi c y (t l C/N, t c l c, pH) và các ph ng pháp nuôi c y (nuôi c y b , liên t c, bán liên t c) nh m thu c hàm l ng ch t béo nhi u nh t, nâng cao tính kh thi và hi u qu c a tài.

– Phân tích thành ph n trong môi tr ng sau khi nuôi c y và kh n ng t n ng c a chúng.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp ly trích hi n i khác (chi t soxhlet có h tr c a sóng siêu âm, chi t soxhlet có h tr c a vi sóng ho c CO2 ng siêu t i h n) k t qu kh o sát c phong phú h n.

– Nghiên c u t n d ng xác sinh kh i c a n m men (s n xu t bioethanol) và ph n k t t a trong kh c (làm th ch cao bó x ng, n n t ng) ti t ki m chi phí s n xu t.

– u tiên hàng u là nghiên c u t ng h p biodiesel t ngu n d u này.

[1] A Dufey, Biofuels Production, Trade and Sustainable Development: Emerging Issues: International Institute for Environment & Development,

[2] M Balat, "Global Bio-fuel Processing and Production Trends," Energy, Exploration & Exploitation,vol 25, pp 195-218, 2007.

[3] A Demirbas, "Progress and recent trends in biofuels," Progress in Energy and Combustion Science, vol 33, pp 1-18, 2007.

[4] P Fontanille, et al., "Bioconversion of volatile fatty acids into lipids by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica,"Bioresource Technology, vol 114, pp. 443-449, 2012.

[5] P Felizardo, et al., "Production of biodiesel from waste frying oils," Waste Management, vol 26, pp 487-494, 2006.

[6] L H H Yeshitila Asteraye Tsigie, Ibrahim Nasser Ahmed, Yi-Hsu Ju,

"Maximizing biodiesel production from Yarrowia lipolytica Po1g biomass using subcritical water pretreatment," Bioresource Technology, vol 111, pp. 201-207, 2012.

[7] A N Phan and T M Phan, "Biodiesel production from waste cooking oils,"

[8] Y Mulugetta, "Evaluating the economics of biodiesel in Africa," Renewable and Sustainable Energy Reviews, vol 13, pp 1592-1598, 2009.

[9] C Ratlege, et al., Biotechnology for the Oils & Fats Industry: Amer Oil

[10] J.-M Nicaud, "Yarrowia lipolytica,"Yeast,vol 29, pp 409-418, 2012.

[11] F Shahidi, "Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Volumes 5," 6 th ed:John Wiley & Sons, 2005.

[12] P Fickers, et al., "Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications," FEMS Yeast Research, vol 5, pp. 527-543, 2005.

[13] M E Guerzoni, et al., "Variability of the lipolytic activity in Yarrowia lipolytica and its dependence on environmental conditions," International Journal of Food Microbiology, vol 69, pp 79-89, 2001.

[14] C.-Y W Yeshitila Asteraye Tsigie, Chi Thanh Truong, Yi-Hsu Ju "Lipid production from Yarrowia lipolytica Po1g grown in sugarcane bagasse hydrolysate,"Bioresource Technology,vol 102, pp 9216-9222, 2011.

[15] T N X B PGS.TS.Lê c Ngoan, TS.Nguy n H u V n, Th c n cho gia súc nhai l i trong nông h mi n Trung Hà N i: Nhà xu t b n nông nghi p,

[16] B P Lavarack, et al., "The acid hydrolysis of sugarcane bagasse hemicellulose to produce xylose, arabinose, glucose and other products,"

Biomass and Bioenergy,vol 23, pp 367-380, 2002.

[17] T D r A Beopoulos, J Sabirova, J.-M Nicaud, Yarrowia lipolytica as a Cell Factory for Oleochemical Biotechnology: Springer-Verlag Berlin

[18] J Leman, "Oleaginous Microorganisms: An Assessment of the Potential," in

Advances in Applied Microbiology vol Volume 43, L N Saul and I L.

Allen, Eds., ed: Academic Press, 1997, pp 195-243.

[19] X Meng, et al., "Biodiesel production from oleaginous microorganisms,"

[20] C Ratledge and S G Wilkinson,Microbial lipids: Academic Press, 1989.

[21] M Mazza, et al., "Omega-3 fatty acids and antioxidants in neurological and psychiatric diseases: An overview," Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry,vol 31, pp 12-26, 2007.

[22] N K P Ph ng, Ph ng pháp cô l p h p ch t h u c : Nhà xu t b n i h c

Qu c gia TP H Chí Minh, 2007.

[23] C C Akoh and D B Min, Food lipids: chemistry, nutrition, and biotechnology: CRC Press/Taylor & Francis Group, 2008.

[24] W W Christie, Lipid Analysis: Isolation, Separation, Identification, and Structural Analysis of Lipids: Amer Oil Chemists Society, 2003.

[25] A A Maddalena Rossi, Stefano Raimondi and Alan Leonardi Getting Lipids for Biodiesel Production from Oleaginous Fungi: InTech, 2010.

[26] C Ratledge and Z Cohen, "Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils?,"Lipid Technology,vol 20, pp 155-160, 2008.

[27] S Papanikolaou, et al., "Kinetic profile of the cellular lipid composition in an oleaginous Yarrowia lipolytica capable of producing a cocoa-butter substitute from industrial fats," Antonie van Leeuwenhoek, vol 80, pp 215-

[28] K Gunkel, et al., "Selective peroxisome degradation in Yarrowia lipolytica after a shift of cells from acetate/oleate/ethylamine into glucose/ammonium sulfate-containing media,"FEBS Letters,vol 451, pp 1-4, 1999.

[29] G Barth and C Gaillardin, "Yarrowia lipolytica," inNonconventional Yeasts in Biotechnology, ed: Springer Berlin Heidelberg, 1996, pp 313-388.

[30] F M Kawasse, et al., "Morphological analysis of Yarrowia lipolytica under stress conditions through image processing," Bioprocess and Biosystems Engineering,vol 25, pp 371-375, 2003/07/01 2003.

[31] J A Cervantes-Chávez, et al., "Regulatory role of the PKA pathway in dimorphism and mating in Yarrowia lipolytica," Fungal Genetics and Biology, vol 46, pp 390-399, 2009.

[32] G M Walker,Yeast Physiology and Biotechnology: Wiley, 1998.

[33] S Papanikolaou, et al., "Accumulation of a Cocoa-Butter-Like Lipid byYarrowia lipolytica Cultivated on Agro-Industrial Residues," CurrentMicrobiology,vol 46, pp 0124-0130, 2003/02/01 2003.

[34] L Y Zhu, et al., "Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation," Bioresource Technology, vol 99, pp. 7881-7885, 2008.

[35] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica: A model and a tool to understand the mechanisms implicated in lipid accumulation," Biochimie, vol 91, pp. 692-696, 2009.

[36] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production,"

Progress in Lipid Research,vol 48, pp 375-387, 2009.

[37] S Papanikolaou, et al., "Citric acid production by Yarrowia lipolytica cultivated on olive-mill wastewater-based media," Bioresource Technology, vol 99, pp 2419-2428, 2008.

[38] S Papanikolaou, et al., "Biosynthesis of lipids and organic acids by Yarrowia lipolytica strains cultivated on glucose," European Journal of Lipid Science and Technology,vol 111, pp 1221-1232, 2009.

[39] G Aggelis and M Komaitis, "Enhancement of single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing in the presence of Teucrium polium L aqueous extract,"Biotechnology Letters,vol 21, pp 747-749, 1999/09/01 1999. [40] S E Karatay and G Dửnmez, "Improving the lipid accumulation properties of the yeast cells for biodiesel production using molasses," Bioresource Technology,vol 101, pp 7988-7990, 2010.

[41] J Rup , et al., "Cell lipids of the Candida lipolytica yeast grown on methanol,"Journal of Chromatography A, vol 755, pp 75-80, 1996.

[42] C Madzak, et al., "Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica," J Mol Microbiol Biotechnol,vol 2, pp 207-16, 2000.

[43] T Deak, "Environmental Factors Influencing Yeasts," in Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, G Péter and C Rosa, Eds., ed: Springer Berlin

[44] C.-H C a D F D Yong-Jae Lee, "Sugarcane bagasse oxidation using a combination of hypochlorite and peroxide," Bioresource Technology, vol.

[45] P F H Harmsen (2010, Literature review of physical and chemical pretreatment processes for lignocellulosic biomass.

[46] S I Mussatto and J A Teixeira, Lignocellulose as raw material in fermentation processes: Formatex, 2010.

[47] H Palonen and V t tutkimuskeskus, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose: VTT, 2004.

[48] S Walford, "Sugarcane bagasse: How easy is it to measure its constituents?,"

Proc S Afr Sug Technol Ass,pp 266 - 273, 2008.

[49] C E Wyman, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization: Production & Utilization: Taylor & Francis Group, 1996.

[50] T L i, Nh ng cây thu c và v thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Khoa h c & thu t, 1995.

[51] S M Azizin, Isolation of hemicellulose from sugarcane bagasse by alkaline extraction: Universiti Teknologi MARA, 2010.

[52] T t t L y L T c, Cây thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Nông nghi p

[53] Atlat a lý Vi t Nam: Nhà xu t b n Giáo d c Vi t Nam, 2011.

[54] J R Almeida, Modig, T., Petersson, A., Họhn-Họgerdal, B., Lidộn, G and Gorwa-Grauslund, M F , "Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae," J Chem. Technol Biotechnol,vol 82, pp 340–349, 2007.

[55] E Palmqvist and B Hahn-Họgerdal, "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates II: inhibitors and mechanisms of inhibition," Bioresource Technology,vol 74, pp 25-33, 2000.

[56] M J Taherzadeh and K Karimi, "Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review [Elektronisk resurs]." vol.2:3, s 472-499, ed: BioResources North Carolina State University, 2007.

[57] P L Dhepe and R Sahu, "A solid-acid-based process for the conversion of hemicellulose,"Green Chemistry, vol 12, pp 2153-2156, 2010.

[58] J.-P Lange, "Lignocellulose Conversion: An Introduction to Chemistry, Process and Economics," in Catalysis for Renewables, ed: Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co KGaA, 2007, pp 21-51.

[59] A Chandel, et al., "Dilute Acid Hydrolysis of Agro-Residues for the Depolymerization of Hemicellulose: State-of-the-Art," in D-Xylitol, S S da

Silva and A K Chandel, Eds., ed: Springer Berlin Heidelberg, 2012, pp 39- 61.

[60] A Rodr guez-Chong, et al., "Hydrolysis of sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessment," Journal of Food Engineering, vol 61, pp 143-

[61] R Aguilar, et al., "Kinetic study of the acid hydrolysis of sugar cane bagasse,"Journal of Food Engineering,vol 55, pp 309-318, 2002.

[62] M J Taherzadeh and K Karimi, "Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review.," BioResources, vol 2, pp. 707-738, 2007.

[63] K Y Foo and B H Hameed, "Detoxification of pesticide waste via activated carbon adsorption process," Journal of Hazardous Materials, vol.

[64] C Namasivayam, et al., "Removal of dyes from aqueous solutions by cellulosic waste orange peel," Bioresource Technology, vol 57, pp 37-43, 1996.

[65] A Martinez, et al., "Detoxification of Dilute Acid Hydrolysates of Lignocellulose with Lime," Biotechnology Progress, vol 17, pp 287-293, 2001.

[66] S S r d S a O V S Anuj K Chandel, "Detoxification of LignocellulosicHydrolysates for Improved Bioethanol Production, Biofuel Production-Recent Developments and Prospects," in Biofuel Production-Recent

Developments and Prospects, D M A D S Bernardes, Ed., ed: InTech,

[67] T N M N Tr n Bích Lam, inh Tr n Nh t Thu, Thí nghi m hóa th c ph m: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP H Chí Minh, 2011.

[68] M D Luque de Castro and F Priego-Capote, "Soxhlet extraction: Past and present panacea," Journal of Chromatography A, vol 1217, pp 2383-2389, 2010.

[69] W L Marsden, et al., "Evaluation of the DNS method for analysing lignocellulosic hydrolysates," Journal of Chemical Technology and Biotechnology,vol 32, pp 1016-1022, 1982.

[70] N V Mùi,Th c hành sinh hóa vol 5: NXB KH&KT Hà N i, 2002.

[71] T Foyle, et al., "Compositional analysis of lignocellulosic materials: Evaluation of methods used for sugar analysis of waste paper and straw,"

[72] N T T Vân, Phân tích nh l ng: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP.H Chí MINH, 2010.

[73] N X D ào H u Vinh, Tr n Th M Linh, Ph m Hùng Vi t, Các ph ng pháp s c kí: Nhà xu t b n Khoa h c k thu t, 1985.

[74] J Milanesio, Hegel, P., Medina-González, Y., Camy, S and Condoret, J.-S,

"Extraction of lipids from Yarrowia Lipolytica," Chemical Technology andBiotechnology,2012.

NG CHU N C A N NG NG KH

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng ng và m t quang o b c sóng 540nm y = 0,91732x + 0,07737 R 2 = 0,99927 Trong ó y: giá tr m t quang 540 nm (OD540) x: n ng ng (g/L)

NG CHU N C A N NG SINH KH I

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng sinh kh i và m t quang o b c sóng 600 nm y = 0,2601x + 0,0025 R 2 = 0,9906 Trong ó y: n ng sinh kh i (g/L) x: giá tr m t quang 600 nm (OD600)

OD600 ng sinh khi, g/L ng chu n c a n ng sinh kh i

PH L C 3 KÍCH C H T BÃ MÍA á Mía ép th công á Mía nhà máy

U VI SINH V T SAU KHI KH SÁP VÀ

GUM u vi sinh v t thu c theo th i gian u vi sinh v t thu c c a các ngu n carbon khác nhau u vi sinh v t thu c c a các ngu n nit khác nhau u vi sinh v t thu c các nhi t khác nhau u vi sinh v t thu c các n ng ng t ng khác nhau

PH GC PHÂN TÍCH THÀNH PH N CH T BÉO c ký c a ch t béo ã kh sáp và gum c a Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i pepton là ngu n nit

Peak Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i NH 3 NO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i (NH 4 ) 2 SO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i urê là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng D-Glucose i pepton là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Thành ph n axit béo t do v i ngu n nit và carbon khác nhau

Ph n tr m th tích (%) Thành ph n

A: NH 4 NO 3 , B: (NH 4 ) 2 SO 4 ,C: Urê, D: Glucose, E: Pepton ho c bã mía th y phân ã kh c

Hàm l ng axit béo bão hòa và không bão hòa n chi m h n 80%, làm cho ch t béo trung tính thu c t nuôi c y Yarrowia lipolytica Po1g là m t nguyên li u lý t ng s n xu t biodiesel Trong ó, ch t béo trung tính c trích ly trong môi tr ng bã mía th y phân ã kh c v i pepton là ngu n nit là thích h p nh t do hàm l ng FFA cao kho ng 92,22% và axit béo bão hòa trong ch t béo trung tính chi m kho ng 57,40% cao h n các ngu n carbon, nit khác.

Sau khi kh o sát quá trình th y phân bã mía và quá trình nuôi c y n m men

Yarrowia lipolyticaPo1g Chúng tôi ã thu c m t s k t qu nh sau:

– Các k t qu trong quá trình th y phân cho th y hàm l ng ng thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, n ng axit, t l bã mía/dung d ch axit và nhi t N ng ng t ng theo th i gian, n ng axit và nhi t Khi t giá tr c c i thì b t u gi m xu ng Các thông s t t nh t c a quá trình th y phân bã mía là: ặ Th i gian: 6 gi ặ ng axit: 3% ặ l bó mớa/dung d ch axit: 1/25 ặ Nhi t : 90 o C

– V i u ki n th y phân này, n ng ng t ng thu c là 22,45 g/L và thành ph n chính trong dung d ch th y phân là các lo i ng n nh xylose, glucose và arabinose u này ch ng t bã mía là nguyên li u lignocellulose ti m ng có th ng d ng trong hóa h c xanh.

– K t qu trong quá trình nuôi c y ch ra r ng kh i l ng sinh kh i và kh ng tích l y ch t béo c a n m men thu c ph thu c nhi u vào các y u t nh th i gian, ngu n carbon, ngu n nit , nhi t và n ng ng N ng sinh kh i và hàm l ng ch t béo t ng theo th i gian và n ng ng t ng Khi t giá tr c i thì b t u gi m xu ng i v i nhi t , hàm l ng ch t béo thu c bi n i theo xu th nêu trên nh ng n ng sinh kh i l i gi m khi t ng nhi t Các thông s t t nh t c a quá trình nuôi c y là: ặ Th i gian nuụi: c y 4 ngày ặ Ngu n carbon: dung d ch bó mớa th y phõn ó kh c ặ Ngu n nit : pepton ặ Nhi t : 26 o C ặ ng ng: 30 g/L

– V i u ki n nuôi c y này, n ng sinh kh i thu c 13,67 g/L và hàm ng ch t béo tích l y là 46,48% t ng i cao, g n b ng v i k t qu c a các nghiên c u khác Thành ph n d u vi sinh v t bao g m các axit béo m ch dài C16, C18 và C20 no và không no, t ng t nh d u th c v t u này cho th y ch t béo n m men phù h p yêu c u nguyên li u t ng h p biodiesel Vì v y, có th s ng Y.lipolytica Po1g s n xu t d u vi sinh v t r ti n t bã mía th y phân ây là n m men cho d u ti m n ng có th ng d ng trong công ngh sinh h c tr ng.

– Qua ó cho th y bã mía th y phân là ngu n carbon r ti n s n xu t ch t béo t n m men, giúp gi m giá thành s n xu t d u vi sinh v t, nâng cao tính c nh tranh v i các ngu n nguyên li u truy n th ng T n d ng c ngu n ph ph m nông nghi p n c ta, giúp b o v môi tr ng, nâng cao giá tr c a cây mía.

5.2 Ki n ngh ỉ Quỏ trỡnh th c hi n thu c k t qu kh quan nh ng tài cũn m t s h n ch sau:

– Ch a kh o sát c t ng b ph n c a cây mía nh m ánh giá, so sánh ch t ng và hi u qu kinh t

– Ch a th y phân bã mía b ng enzyme so sánh hàm l ng ng và tính kinh t

– Ch a phân tích c thành ph n các ch t c ch trong dung d ch bã mía th y phân tr c và sau khi kh c.

– Ch a phân tích các ch s hóa lý c a ch t béo. ỉ h n ch v m t th i gian và kinh phớ th c hi n nờn tài d ng l i cỏc t qu kh o sát trên, c n c vào k t qu thu c t quá trình thí nghi m và m t s t còn h n ch c a tài, chúng tôi xin a ra m t s ki n ngh nh sau:

– Phân tích thành ph n các ch t c ch trong môi tr ng nuôi c y hi u rõ nh h ng c a chúng n phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp kh c khác (than ho t tính, nh a trao i ion, enzyme,….) so sánh hi u qu kh c và tính kinh t c a t ng ph ng pháp.

– Ti n hành nuôi c y n m men trên các ngu n carbon khác (xylose, arabinose) giúp hi u rõ h n kh n ng tiêu th và tích l y ch t béo c a n m men trên ng lo i ng này.

– Kh o sát thêm các y u t nh h ng n quá trình nuôi c y (t l C/N, t c l c, pH) và các ph ng pháp nuôi c y (nuôi c y b , liên t c, bán liên t c) nh m thu c hàm l ng ch t béo nhi u nh t, nâng cao tính kh thi và hi u qu c a tài.

– Phân tích thành ph n trong môi tr ng sau khi nuôi c y và kh n ng t n ng c a chúng.

– C n kh o sát thêm m t s ph ng pháp ly trích hi n i khác (chi t soxhlet có h tr c a sóng siêu âm, chi t soxhlet có h tr c a vi sóng ho c CO2 ng siêu t i h n) k t qu kh o sát c phong phú h n.

– Nghiên c u t n d ng xác sinh kh i c a n m men (s n xu t bioethanol) và ph n k t t a trong kh c (làm th ch cao bó x ng, n n t ng) ti t ki m chi phí s n xu t.

– u tiên hàng u là nghiên c u t ng h p biodiesel t ngu n d u này.

[1] A Dufey, Biofuels Production, Trade and Sustainable Development: Emerging Issues: International Institute for Environment & Development,

[2] M Balat, "Global Bio-fuel Processing and Production Trends," Energy, Exploration & Exploitation,vol 25, pp 195-218, 2007.

[3] A Demirbas, "Progress and recent trends in biofuels," Progress in Energy and Combustion Science, vol 33, pp 1-18, 2007.

[4] P Fontanille, et al., "Bioconversion of volatile fatty acids into lipids by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica,"Bioresource Technology, vol 114, pp. 443-449, 2012.

[5] P Felizardo, et al., "Production of biodiesel from waste frying oils," Waste Management, vol 26, pp 487-494, 2006.

[6] L H H Yeshitila Asteraye Tsigie, Ibrahim Nasser Ahmed, Yi-Hsu Ju,

"Maximizing biodiesel production from Yarrowia lipolytica Po1g biomass using subcritical water pretreatment," Bioresource Technology, vol 111, pp. 201-207, 2012.

[7] A N Phan and T M Phan, "Biodiesel production from waste cooking oils,"

[8] Y Mulugetta, "Evaluating the economics of biodiesel in Africa," Renewable and Sustainable Energy Reviews, vol 13, pp 1592-1598, 2009.

[9] C Ratlege, et al., Biotechnology for the Oils & Fats Industry: Amer Oil

[10] J.-M Nicaud, "Yarrowia lipolytica,"Yeast,vol 29, pp 409-418, 2012.

[11] F Shahidi, "Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Volumes 5," 6 th ed:John Wiley & Sons, 2005.

[12] P Fickers, et al., "Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications," FEMS Yeast Research, vol 5, pp. 527-543, 2005.

[13] M E Guerzoni, et al., "Variability of the lipolytic activity in Yarrowia lipolytica and its dependence on environmental conditions," International Journal of Food Microbiology, vol 69, pp 79-89, 2001.

[14] C.-Y W Yeshitila Asteraye Tsigie, Chi Thanh Truong, Yi-Hsu Ju "Lipid production from Yarrowia lipolytica Po1g grown in sugarcane bagasse hydrolysate,"Bioresource Technology,vol 102, pp 9216-9222, 2011.

[15] T N X B PGS.TS.Lê c Ngoan, TS.Nguy n H u V n, Th c n cho gia súc nhai l i trong nông h mi n Trung Hà N i: Nhà xu t b n nông nghi p,

[16] B P Lavarack, et al., "The acid hydrolysis of sugarcane bagasse hemicellulose to produce xylose, arabinose, glucose and other products,"

Biomass and Bioenergy,vol 23, pp 367-380, 2002.

[17] T D r A Beopoulos, J Sabirova, J.-M Nicaud, Yarrowia lipolytica as a Cell Factory for Oleochemical Biotechnology: Springer-Verlag Berlin

[18] J Leman, "Oleaginous Microorganisms: An Assessment of the Potential," in

Advances in Applied Microbiology vol Volume 43, L N Saul and I L.

Allen, Eds., ed: Academic Press, 1997, pp 195-243.

[19] X Meng, et al., "Biodiesel production from oleaginous microorganisms,"

[20] C Ratledge and S G Wilkinson,Microbial lipids: Academic Press, 1989.

[21] M Mazza, et al., "Omega-3 fatty acids and antioxidants in neurological and psychiatric diseases: An overview," Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry,vol 31, pp 12-26, 2007.

[22] N K P Ph ng, Ph ng pháp cô l p h p ch t h u c : Nhà xu t b n i h c

Qu c gia TP H Chí Minh, 2007.

[23] C C Akoh and D B Min, Food lipids: chemistry, nutrition, and biotechnology: CRC Press/Taylor & Francis Group, 2008.

[24] W W Christie, Lipid Analysis: Isolation, Separation, Identification, and Structural Analysis of Lipids: Amer Oil Chemists Society, 2003.

[25] A A Maddalena Rossi, Stefano Raimondi and Alan Leonardi Getting Lipids for Biodiesel Production from Oleaginous Fungi: InTech, 2010.

[26] C Ratledge and Z Cohen, "Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils?,"Lipid Technology,vol 20, pp 155-160, 2008.

[27] S Papanikolaou, et al., "Kinetic profile of the cellular lipid composition in an oleaginous Yarrowia lipolytica capable of producing a cocoa-butter substitute from industrial fats," Antonie van Leeuwenhoek, vol 80, pp 215-

[28] K Gunkel, et al., "Selective peroxisome degradation in Yarrowia lipolytica after a shift of cells from acetate/oleate/ethylamine into glucose/ammonium sulfate-containing media,"FEBS Letters,vol 451, pp 1-4, 1999.

[29] G Barth and C Gaillardin, "Yarrowia lipolytica," inNonconventional Yeasts in Biotechnology, ed: Springer Berlin Heidelberg, 1996, pp 313-388.

[30] F M Kawasse, et al., "Morphological analysis of Yarrowia lipolytica under stress conditions through image processing," Bioprocess and Biosystems Engineering,vol 25, pp 371-375, 2003/07/01 2003.

[31] J A Cervantes-Chávez, et al., "Regulatory role of the PKA pathway in dimorphism and mating in Yarrowia lipolytica," Fungal Genetics and Biology, vol 46, pp 390-399, 2009.

[32] G M Walker,Yeast Physiology and Biotechnology: Wiley, 1998.

[33] S Papanikolaou, et al., "Accumulation of a Cocoa-Butter-Like Lipid byYarrowia lipolytica Cultivated on Agro-Industrial Residues," CurrentMicrobiology,vol 46, pp 0124-0130, 2003/02/01 2003.

[34] L Y Zhu, et al., "Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation," Bioresource Technology, vol 99, pp. 7881-7885, 2008.

[35] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica: A model and a tool to understand the mechanisms implicated in lipid accumulation," Biochimie, vol 91, pp. 692-696, 2009.

[36] A Beopoulos, et al., "Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production,"

Progress in Lipid Research,vol 48, pp 375-387, 2009.

[37] S Papanikolaou, et al., "Citric acid production by Yarrowia lipolytica cultivated on olive-mill wastewater-based media," Bioresource Technology, vol 99, pp 2419-2428, 2008.

[38] S Papanikolaou, et al., "Biosynthesis of lipids and organic acids by Yarrowia lipolytica strains cultivated on glucose," European Journal of Lipid Science and Technology,vol 111, pp 1221-1232, 2009.

[39] G Aggelis and M Komaitis, "Enhancement of single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing in the presence of Teucrium polium L aqueous extract,"Biotechnology Letters,vol 21, pp 747-749, 1999/09/01 1999. [40] S E Karatay and G Dửnmez, "Improving the lipid accumulation properties of the yeast cells for biodiesel production using molasses," Bioresource Technology,vol 101, pp 7988-7990, 2010.

[41] J Rup , et al., "Cell lipids of the Candida lipolytica yeast grown on methanol,"Journal of Chromatography A, vol 755, pp 75-80, 1996.

[42] C Madzak, et al., "Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica," J Mol Microbiol Biotechnol,vol 2, pp 207-16, 2000.

[43] T Deak, "Environmental Factors Influencing Yeasts," in Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, G Péter and C Rosa, Eds., ed: Springer Berlin

[44] C.-H C a D F D Yong-Jae Lee, "Sugarcane bagasse oxidation using a combination of hypochlorite and peroxide," Bioresource Technology, vol.

[45] P F H Harmsen (2010, Literature review of physical and chemical pretreatment processes for lignocellulosic biomass.

[46] S I Mussatto and J A Teixeira, Lignocellulose as raw material in fermentation processes: Formatex, 2010.

[47] H Palonen and V t tutkimuskeskus, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose: VTT, 2004.

[48] S Walford, "Sugarcane bagasse: How easy is it to measure its constituents?,"

Proc S Afr Sug Technol Ass,pp 266 - 273, 2008.

[49] C E Wyman, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization: Production & Utilization: Taylor & Francis Group, 1996.

[50] T L i, Nh ng cây thu c và v thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Khoa h c & thu t, 1995.

[51] S M Azizin, Isolation of hemicellulose from sugarcane bagasse by alkaline extraction: Universiti Teknologi MARA, 2010.

[52] T t t L y L T c, Cây thu c Vi t Nam: Nhà xu t b n Nông nghi p

[53] Atlat a lý Vi t Nam: Nhà xu t b n Giáo d c Vi t Nam, 2011.

[54] J R Almeida, Modig, T., Petersson, A., Họhn-Họgerdal, B., Lidộn, G and Gorwa-Grauslund, M F , "Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae," J Chem. Technol Biotechnol,vol 82, pp 340–349, 2007.

[55] E Palmqvist and B Hahn-Họgerdal, "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates II: inhibitors and mechanisms of inhibition," Bioresource Technology,vol 74, pp 25-33, 2000.

[56] M J Taherzadeh and K Karimi, "Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review [Elektronisk resurs]." vol.2:3, s 472-499, ed: BioResources North Carolina State University, 2007.

[57] P L Dhepe and R Sahu, "A solid-acid-based process for the conversion of hemicellulose,"Green Chemistry, vol 12, pp 2153-2156, 2010.

[58] J.-P Lange, "Lignocellulose Conversion: An Introduction to Chemistry, Process and Economics," in Catalysis for Renewables, ed: Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co KGaA, 2007, pp 21-51.

[59] A Chandel, et al., "Dilute Acid Hydrolysis of Agro-Residues for the Depolymerization of Hemicellulose: State-of-the-Art," in D-Xylitol, S S da

Silva and A K Chandel, Eds., ed: Springer Berlin Heidelberg, 2012, pp 39- 61.

[60] A Rodr guez-Chong, et al., "Hydrolysis of sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessment," Journal of Food Engineering, vol 61, pp 143-

[61] R Aguilar, et al., "Kinetic study of the acid hydrolysis of sugar cane bagasse,"Journal of Food Engineering,vol 55, pp 309-318, 2002.

[62] M J Taherzadeh and K Karimi, "Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review.," BioResources, vol 2, pp. 707-738, 2007.

[63] K Y Foo and B H Hameed, "Detoxification of pesticide waste via activated carbon adsorption process," Journal of Hazardous Materials, vol.

[64] C Namasivayam, et al., "Removal of dyes from aqueous solutions by cellulosic waste orange peel," Bioresource Technology, vol 57, pp 37-43, 1996.

[65] A Martinez, et al., "Detoxification of Dilute Acid Hydrolysates of Lignocellulose with Lime," Biotechnology Progress, vol 17, pp 287-293, 2001.

[66] S S r d S a O V S Anuj K Chandel, "Detoxification of LignocellulosicHydrolysates for Improved Bioethanol Production, Biofuel Production-Recent Developments and Prospects," in Biofuel Production-Recent

Developments and Prospects, D M A D S Bernardes, Ed., ed: InTech,

[67] T N M N Tr n Bích Lam, inh Tr n Nh t Thu, Thí nghi m hóa th c ph m: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP H Chí Minh, 2011.

[68] M D Luque de Castro and F Priego-Capote, "Soxhlet extraction: Past and present panacea," Journal of Chromatography A, vol 1217, pp 2383-2389, 2010.

[69] W L Marsden, et al., "Evaluation of the DNS method for analysing lignocellulosic hydrolysates," Journal of Chemical Technology and Biotechnology,vol 32, pp 1016-1022, 1982.

[70] N V Mùi,Th c hành sinh hóa vol 5: NXB KH&KT Hà N i, 2002.

[71] T Foyle, et al., "Compositional analysis of lignocellulosic materials: Evaluation of methods used for sugar analysis of waste paper and straw,"

[72] N T T Vân, Phân tích nh l ng: Nhà xu t b n i h c qu c gia TP.H Chí MINH, 2010.

[73] N X D ào H u Vinh, Tr n Th M Linh, Ph m Hùng Vi t, Các ph ng pháp s c kí: Nhà xu t b n Khoa h c k thu t, 1985.

[74] J Milanesio, Hegel, P., Medina-González, Y., Camy, S and Condoret, J.-S,

"Extraction of lipids from Yarrowia Lipolytica," Chemical Technology andBiotechnology,2012.

NG CHU N C A N NG NG KH

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng ng và m t quang o b c sóng 540nm y = 0,91732x + 0,07737 R 2 = 0,99927 Trong ó y: giá tr m t quang 540 nm (OD540) x: n ng ng (g/L)

NG CHU N C A N NG SINH KH I

Bi u th c th hi n m i quan h gi a n ng sinh kh i và m t quang o b c sóng 600 nm y = 0,2601x + 0,0025 R 2 = 0,9906 Trong ó y: n ng sinh kh i (g/L) x: giá tr m t quang 600 nm (OD600)

OD600 ng sinh khi, g/L ng chu n c a n ng sinh kh i

PH L C 3 KÍCH C H T BÃ MÍA á Mía ép th công á Mía nhà máy

U VI SINH V T SAU KHI KH SÁP VÀ

GUM u vi sinh v t thu c theo th i gian u vi sinh v t thu c c a các ngu n carbon khác nhau u vi sinh v t thu c c a các ngu n nit khác nhau u vi sinh v t thu c các nhi t khác nhau u vi sinh v t thu c các n ng ng t ng khác nhau

PH GC PHÂN TÍCH THÀNH PH N CH T BÉO c ký c a ch t béo ã kh sáp và gum c a Yarrowia lipolytica Po1g phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i pepton là ngu n nit

Peak Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i NH 3 NO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i (NH 4 ) 2 SO 4 là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng bã mía th y phân v i urê là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.

Ph GC c a m u d u c trích ly t sinh kh iYarrowia lipolytica Po1g khi n m men phát tri n trong môi tr ng D-Glucose i pepton là ngu n nit

Peak# Ret.Time Area Height Initial Time Final Time Area% Separation F.