Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Loài Rùa Đầu To (Platysternon Megacephalum) Tại Việt Nam Dựa Trên Gen Nd4.Pdf

Trong đó, gen ND4 mã hóa NADH dehydrogenase subunit 4 là một chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong phân tích phát sinh chủng loại với các ưu điểm: có kích thước phù hợp đủ để đọ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Lê Huyền Mai

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI RÙA ĐẦU TO

(PLATYSTERNON MEGACEPHALUM) TẠI VIỆT NAM

DỰA TRÊN GEN ND4

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Lê Huyền Mai

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI RÙA ĐẦU TO

(PLATYSTERNON MEGACEPHALUM) TẠI VIỆT NAM

DỰA TRÊN GEN ND4

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ ĐỨC MINH

PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Hà Nội - 2023

trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ trước bất kỳ hội đồng nào trước đây

Tác giả

Lê Huyền Mai

thành nhất tới PGS.TS Lê Đức Minh (Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Và tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS Ngô Thị Hạnh, NCS Nguyễn Thị Thắm, ThS Dương Đức Thiện, CN Hồ Thị Ngọc Ánh cùng toàn thể anh chị học viên cao học và các sinh viên trong phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cũng như Chương trình bảo tồn Rùa châu Á (ATP) đã cung cấp các mẫu vật để tôi có thể hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi và tất cả các anh chị, bạn bè thân thiết, những người đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 11 năm 2023

Học viên cao học

Lê Huyền Mai

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về rùa 3

1.1.1 Phân loại học và vai trò trong tự nhiên 3

1.1.2 Đa dạng về rùa trên thế giới 3

1.1.3 Đa dạng các loài rùa tại Việt Nam 5

1.2 Rùa đầu to (Platysternon megacephalum) 6

1.2.1 Tổng quan về loài Rùa đầu to 6

1.2.2 Hiện trạng Rùa đầu to 12

1.3 Chỉ thị phân tử trong đa dạng di truyền loài 17

1.3.1 Các chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền loài 17

1.3.2 Gen ND4: ưu và nhược điểm 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

Bảng 2 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 3 Sự đa dạng haplotype của các mẫu Rùa đầu to tại Việt Nam được sử dụng

trong nghiên cứu dựa trên đoạn gen ND4 38 Bảng 4 Khoảng cách di truyền giữa các nhánh Rùa đầu to dựa trên đoạn gen ND4

41

Hình 2 Hình ảnh Rùa đầu to [9] 7

Hình 3 Khu vực phân bố của loài Rùa đầu to [58] 10

Hình 4 Ba phân loài của Rùa đầu to [58] 11

Hình 5 Tang vật 75 cá thể Rùa đầu to được thu giữ tại Nghệ An 15

Hình 6 Cấu trúc DNA ty thể [43] 19

Hình 7 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu máu 30

Hình 8 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu mô 31

Hình 9 Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu máu 32

Hình 10 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số mẫu mô 32

Hình 11 Kết quả giải trình tự hai chiều mẫu máu Pm522 33

Hình 12 Cây phát sinh chủng loại đầy đủ được xây dựng theo phương pháp Bayesian dựa trên đoạn gen ND4 của 469 mẫu 35

Hình 13 Cây phát sinh chủng loại tối giản dựa trên một đoạn gen ND4 36

Hình 14 Mạng lưới cây PSCL dựa trên đoạn gen ND4 xây dựng bằng phần mềm Split tree 37

Hình 15 Nhánh cây phát sinh loài bao gồm các cá thể Rùa đầu to thuộc phân loài P m shiui và khu vực phân bố/nơi bị tịch thu của chúng 42

Hình 16 Nhánh cây phát sinh loài bao gồm các cá thể Rùa đầu to thuộc phân loài P m peguense phân nhánh 1 và khu vực phân bố/nơi bị tịch thu của chúng 43

Hình 17 Nhánh cây phát sinh loài bao gồm các cá thể Rùa đầu to thuộc phân loài P m peguense phân nhánh 2 và khu vực phân bố/nơi bị tịch thu của chúng 44

Hình 18 Nguồn gốc các mẫu Platysternon megacephalum được sử dụng trong nghiên cứu 47

tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

CITES

Convention on International Trade in Endangered Species of Wild

Fauna and Flora

Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang

dã nguy cấp

MỞ ĐẦU

Rùa cạn và rùa nước ngọt hiện là một trong các nhóm loài có nguy cơ tuyệt chủng cao nhất Theo báo cáo của Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) năm 2018, trong số các loài rùa cạn và rùa nước ngọt đã được ghi nhận, có 51,9% số loài nằm trong nhóm sắp nguy cấp (VU), nguy cấp (EN) hoặc cực kỳ nguy cấp (CR) Từ những năm 1990, các loài rùa cạn và rùa nước ngọt ở châu Á đứng trước nguy cơ tuyệt chủng chủ yếu do hoạt động săn bắt, buôn bán trái phép để làm thức ăn, thú cưng và thuốc đông y

Rùa đầu to (Platysternon megacephalum) là đại diện duy nhất của họ

Platysternidae, thuộc bộ rùa Testudines, có phân bố ở các sinh cảnh khe suối nước trong, chảy chậm tại các địa hình đồi núi đá ở Campuchia, Trung Quốc, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam Ngoài nguyên nhân mất sinh cảnh sống, môi trường bị ô nhiễm, Rùa đầu to cũng là đối tượng thường xuyên bị săn bắt và buôn bán trái phép gây sụt giảm số lượng nghiêm trọng Vì vậy, năm 2018 IUCN đã nâng cấp tình trạng bảo tồn của Rùa đầu to từ nguy cấp (EN) thành cực kỳ nguy cấp (CR) Rùa đầu to được cho là khó có thể sinh trưởng và sinh sản tốt trong môi trường bị nuôi nhốt, vì thế các nỗ lực bảo tồn chủ yếu tập trung vào việc tái thả các cá thể bị bắt giữ trong buôn bán nhằm phục hồi các quần thể trong tự nhiên Để phục vụ công tác tái thả, thông tin về nguồn gốc di truyền và khu vực phân bố là vô cùng cần thiết

Trong những năm gần đây, các gen ty thể là chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi

trong việc đánh giá đa dạng di truyền của loài Trong đó, gen ND4 (mã hóa NADH

dehydrogenase subunit 4) là một chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong phân tích phát sinh chủng loại với các ưu điểm: có kích thước phù hợp đủ để đọc trình tự một cách dễ dàng, phân biệt được nhiều loài khác nhau, có vùng biên bảo thủ để dễ dàng thiết kế mồi, không có intron, di truyền theo dòng mẹ, ít xảy ra sự tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến thay thế cao

Cho đến hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về đa dạng di truyền của các quần thể

Rùa đầu to tại Việt Nam Do đó, nghiên cứu với tiêu đề “Đánh giá đa dạng di truyền

loài Rùa đầu to (Platysternon megacephalum) tại Việt Nam dựa trên gen ND4” được

thực hiện nhằm phân tích đa đạng di truyền loài Rùa đầu to Nghiên cứu này sử dụng

đoạn gen ND4 để đánh giá sự khác biệt di truyền của các phân loài Rùa đầu to và xác

nhận lại khu vực phân bố của các phân loài tại Việt Nam Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm bằng chứng khoa học về mặt phân loại học đồng thời cung cấp thông tin quan trọng phục vụ công tác bảo tồn Rùa đầu to tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rùa

1.1.1 Phân loại học và vai trò trong tự nhiên

Về mặt phân loại, rùa thuộc giới Động vật (Animalia), ngành Dây sống (Chordata), lớp Bò sát (Reptilia), bộ Rùa (Testudines), xuất hiện vào khoảng 200 triệu năm trước, là loài bò sát có cơ thể được bọc trong một chiếc mai bằng xương [58] Mai rùa có đỉnh (mai) và đáy (yếm) Mai và yếm là những cấu trúc xương thường nối với nhau dọc theo mỗi bên của cơ thể, tạo ra một hộp xương cứng và được giữ lại trong suốt cuộc đời của rùa Trong số các loài động vật có xương sống, rùa là nhóm loài duy nhất có mai có tác dụng bảo vệ cũng như cung cấp nơi trú ẩn Loài rùa lớn nhất còn sống có thể dài tới hơn 2,7 m và nặng hơn 900 kg, trong khi loài rùa nhỏ nhất còn sống có chiều dài không quá 8 cm và nặng 140 gram Tuổi thọ của rùa có thể kéo dài từ 25 cho đến 200 năm Thói quen ăn uống của rùa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn thức ăn sẵn có, môi trường sống và hành vi của chúng, bao gồm thực vật, trái cây, các loài côn trùng nhỏ như sâu bướm, động vật không xương sống, cá và động vật giáp xác,… Tất cả rùa đều đẻ trứng trên cạn và không có loài nào thể hiện sự chăm sóc của bố mẹ đối với con cái Độ tuổi mà rùa sinh sản lần đầu thay đổi từ vài năm lên tới 50 năm, xảy ra theo mùa đối với hầu hết các loài Trong hệ sinh thái, rùa chiếm giữ vai trò cực kỳ quan trọng, từ việc tạo ra cũng như đóng góp sinh khối vào môi trường, tham gia vào mạng lưới thức ăn, chu trình khoáng hóa và tích lũy sinh học, tăng cường phát tán hạt giống, đến tham gia vào khôi phục hệ sinh thái bị suy thoái [44]

1.1.2 Đa dạng về rùa trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới, có khoảng hơn 350 loài rùa khác nhau [78], phân bố ở cả nước mặn cũng như nước ngọt, từ độ sâu 1200 m dưới đại dương cho đến độ cao trên 2000 m so với mực nước biển [13], trải rộng ở tất cả các châu lục ngoại trừ Nam Cực Mặc dù thích nghi với nhiều loại môi trường khác nhau nhưng số lượng loài lớn nhất

xuất hiện ở vùng đông nam của Bắc Mỹ và Nam Á (Hình 1) Ở cả hai khu vực, hầu hết các loài đều sống dưới nước, từ ao, đầm lầy nhỏ đến hồ, sông và biển Một số sống hoàn toàn trên cạn hoặc hoàn toàn dưới nước trong khi một số khác phân chia thời gian giữa đất và nước [67]

Đông Nam Á là khu vực có các loài rùa cạn và rùa nước ngọt đa dạng nhất thế giới, với hơn 90 loài, chiếm hơn 25% tổng số các loài rùa cạn và rùa nước ngọt được biết đến Mặc dù mức độ đa dạng cao cũng như có sự phù hợp về sinh thái của khu vực Đông Nam Á đối với các loài rùa cạn và rùa nước ngọt, nhiều loài trong số này vẫn nằm trong danh mục loài bị đe dọa lớn nhất trên thế giới [82] Báo cáo năm 2011 của IUCN về rùa cạn và rùa nước ngọt trên toàn cầu đã xếp 17 loài rùa của châu Á vào nhóm 25 loài bị đe dọa cao nhất thế giới [19]

Hình 1 Đa dạng phân bố rùa trên thế giới [67]

Mặc dù chiếm giữ vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, nhiều quần thể rùa hiện đang suy giảm nhanh chóng do mất và suy thoái môi trường sống, do con người tiêu thụ làm thực phẩm và các loại thuốc đông y, tác động từ các loài xâm lấn đồng thời khả năng sinh sản của rùa là thấp khi so sánh với các loài động vật khác Ngoài ra, tình trạng săn

bắt và buôn bán trái phép cũng như công tác bảo tồn chưa hiệu quả do gặp nhiều khó khăn khác nhau cũng là nguyên nhân dẫn đến sự sụt giảm số lượng này [73, 82]

1.1.3 Đa dạng các loài rùa tại Việt Nam

Việt Nam là nơi cư trú của 31 loài rùa chiếm khoảng 8,68% trong tổng số 357 loài rùa hiện còn được ghi nhận trên thế giới, và khoảng 34,83% trong tổng số 89 loài rùa bản địa châu Á, trong đó có 26 loài rùa cạn, rùa nước ngọt và 5 loài rùa biển: Rùa đầu to

(Platysternon megacephalum), Rùa hộp lưng đen (Cuora amboinensis), Rùa hộp trán vàng miền bắc (Cuora galbinifrons), Rùa hộp trán vàng miền trung (Cuora bourreti), Rùa hộp trán vàng miền nam (Cuora picturata), Rùa sa nhân (Cuora mouhotii), Rùa hộp ba vạch (Cuora cyclornata), Rùa đất sepon (Cyclemys oldhamii), Rùa đất pulkin (Cyclemys pulchristriata), Rùa đất atripon (Cyclemys atripons), Rùa đất spenglơ (Geoemyda spengleri), Rùa đất lớn (Heosemys grandis), Rùa răng (Heosemys

annandalii), Rùa ba gờ (Malayemys subtrijuga), Rùa trung bộ (Mauremys annamensis),

Rùa câm (Mauremys mutica), Rùa cổ sọc (Mauremys sinensis), Rùa bốn mắt (Sacalia

quadriocellata), Rùa cổ bự (Siebenrockiella crassicollis), Rùa núi vàng (Indotestudo elongata), Rùa núi viền (Manouria impressa), Ba ba nam bộ (Amyda ornata), Ba ba gai

(Palea steindachneri), Giải (Pelochelys cantorii), Ba ba bụng đốm (Pelodiscus

variegatus), Rùa hoàn kiếm (Rafetus swinhoe), Đồi mồi dứa (Chelonia mydas), Đồi mồi

(Eretmochelys Imbricata), Rùa da (Dermochelys Coriacea), Vích (Lepidochelys

olivacea), Quản đồng (Caretta caretta) Năm 2021, Sách đỏ của IUCN liệt kê 24 loài rùa

cạn và rùa nước ngọt cùng 5 loài rùa biển phân bố ở Việt Nam vào danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên Trong đó, hai loài đặc hữu là Rùa hộp trán vàng miền nam và Rùa trung bộ đều được xếp ở mức cực kỳ nguy cấp với số lượng đang trên đà suy giảm nhanh chóng Rùa trung bộ là loài vô cùng hiếm và chỉ được tìm thấy ở khu vực miền Trung của Việt Nam [48], trong khi rùa hộp trán vàng miền nam chỉ xuất hiện ở phía Nam xung quanh các tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa [46, 58]

Hiện nay, số lượng cá thể các quần thể rùa tại Việt Nam đang bị suy giảm nghiêm trọng Nạn săn bắt và buôn bán trái phép được coi là nguyên nhân chính dẫn tới sự nguy cấp của nhiều loài rùa tại Việt Nam Rất nhiều nỗ lực của các cơ quan pháp luật, cùng với sự chung tay của các tổ chức bảo tồn trong nước cũng như quốc tế đã được thực hiện, tuy nhiên, việc kiểm soát buôn bán động vật hoang dã nói chung và buôn bán rùa nói riêng vẫn còn rất nhiều khó khăn Theo Chương trình bảo tồn Rùa châu Á (ATP), tại Trung tâm Bảo tồn rùa Cúc Phương, từ năm 2015 trở lại đây, mỗi năm tiếp nhận từ 200 đến 400 cá thể của khoảng 15 đến 20 loài rùa khác nhau, chủ yếu tịch thu từ các vụ buôn bán trái phép, trong đó chỉ có 6 đến 7% số cá thể là từ các cá nhân tự nguyện chuyển giao Con số trên chỉ chiếm chưa đến 10% so với giai đoạn trước năm 2000

1.2 Rùa đầu to (Platysternon megacephalum)

1.2.1 Tổng quan về loài Rùa đầu to

Rùa đầu to (Platysternon megacephalum) là đại diện duy nhất của họ

Platysternidae, thuộc bộ Rùa Testudines Rùa đầu to là động vật biến nhiệt, có cơ thể đối xứng hai bên, với chiều dài cơ thể lên tới 40 cm Chúng mang những đặc điểm hình thái đặc biệt, có thể rõ ràng phân biệt với các loài rùa cạn và rùa nước ngọt khác như chiếc đầu to hình tam giác khiến chúng không thể rút được vào mai, hàm trên hình móc tạo thành chiếc mỏ sắc nhọn, đuôi dài bằng chiều dài thân, xương sọ đặc và dày, kích thước trung bình với chiều dài mai lên tới 25,5 cm [10] (Hình 2) Mai Rùa đầu to dẹt hơn rất nhiều so với các loài rùa nước ngọt khác, nó có màu từ vàng đến nâu, hình chữ nhật với mặt trước vuông vức và mặt sau tròn hơn, trong khi yếm thường có màu vàng Các ngón chân có màng mỏng với móng vuốt khỏe, mỗi ngón bao gồm 3 đốt Loài này được ghi nhận là có chân phủ vảy lớn, đuôi rất cơ bắp, có thể đỡ toàn bộ trọng lượng của rùa Không có sự khác biệt rõ rệt giữa con đực và con cái, ngoại trừ yếm của con đực có xu hướng lõm hơn con cái

Hình 2 Hình ảnh Rùa đầu to [9]

Rùa đầu to được xem là loài bán thủy sinh nhưng chủ yếu phần lớn thời gian chúng sống ở trong các dòng suối dốc đứng có nước trong vắt, không bị ô nhiễm, chảy chậm, có độ sâu 12 – 92 cm ở các khu vực đồi rừng ở độ cao từ 100 đến 800 m, nhiệt độ nước dao động trong khoảng 12 – 28oC [72] Ngoài ra, Rùa đầu to sống ở những dòng suối có nhiều đá và dốc, có thể ở trong các vũng có tốc độ dòng chảy thấp để giảm nguy cơ bị dòng chảy có tốc độ cao cuốn trôi xuống hạ lưu khi mưa lớn Rùa đầu to sống về đêm, chúng thường dành cả ngày nằm dưới một tảng đá hoặc dưới nước [69, 72] Vào ban đêm, chúng nổi lên để tìm kiếm thức ăn dọc theo đáy suối hoặc ra khỏi nước dọc theo mép suối Chúng không phải là loài bơi giỏi nhưng thích nghi tốt với việc đi lại và leo trèo trên đá Rùa đầu to không có phạm vi di chuyển rộng trong tự nhiên, trung bình dao động trong khoảng 97 m, không có sự khác biệt quá nhiều giữa hai giới và khoảng cách di chuyển của rùa xa hơn trong mùa mưa so với mùa khô cũng như di chuyển xa hơn vào ban đêm so với ban ngày [65, 72] Nghiên cứu cho thấy các cá thể đực thay đổi vị trí hàng tuần và có xu hướng di chuyển quãng đường dài hơn so với các cá thể cái

Nghiên cứu trước đây cho rằng rùa đực phải di chuyển quãng đường xa hơn để tìm kiếm con cái trong mùa sinh sản cũng như tìm kiếm địa điểm làm tổ thích hợp [72]

Rùa đầu to là loài ăn tạp, chúng có thể ăn nhiều loại thức ăn khác nhau từ trái cây, côn trùng, thực vật, cua và động vật thân mềm Ở Hồng Kông, các cá thể hoang dã chủ yếu ăn trái cây của thực vật thuộc chi Machilus [70] Trong điều kiện nuôi nhốt tại vườn thú, Rùa đầu to được cho ăn giun đỏ, chuột con, ấu trùng sâu bướm, tôm càng nước ngọt, cá hoặc tôm cắt nhỏ, một số rau củ và bổ sung thêm canxi [2] Tuy nhiên, chế độ ăn chính của chúng được ghi nhận là cá, động vật thân mềm và sâu bọ Các đặc điểm độc đáo của đầu và mỏ của Rùa đầu to giúp chúng không chỉ bù đắp cho khả năng phòng thủ mà còn nâng cao khả năng săn mồi của chúng thông qua việc cắn, xé cơ hoặc các mô khác của con mồi một cách hiệu quả vì chiếc đầu lớn có thể góp phần tạo lực cắn mạnh [9] Ngoài ra, chiếc đuôi dài có tác dụng giữ thăng bằng cho cơ thể trong quá trình đi săn hoặc leo trèo trên đá dốc Nó thường tìm kiếm thức ăn vào ban đêm dọc theo đáy suối và giữa các bụi cây thấp [9]

Tuổi thọ của Rùa đầu to có thể lên tới 27 năm [66] Độ tuổi trưởng thành trung bình của cá thể cái và cá thể đực lần lượt là 8 tuổi và 13 tuổi Khi trưởng thành, chiều dài mai trung bình của rùa cái và rùa đực lần lượt là khoảng 100 mm và 130 mm [71] Rùa non sinh ra thường có hai loại màu mai là màu nâu vàng và xanh ô liu, yếm có hoa văn màu cam hoặc màu đen Khi rùa lớn lên màu mai sẽ có sự thay đổi từ màu nâu vàng thành màu nâu hạt dẻ, hoặc từ màu xanh ô liu sang màu nâu sẫm, màu sắc hoa văn yếm không có nhiều thay đổi theo thời gian [8] Trong tự nhiên, giai đoạn giao phối thường trong khoảng tháng 5 và tháng 6, Rùa đầu to chỉ đẻ một lứa một năm và kích thước lứa có mối tương quan thuận với chiều dài mai của con cái, thời kỳ phát triển của trứng có thể nằm trong khoảng từ 103 đến 110 ngày [38] Mỗi ổ trứng có khoảng 1 – 8 trứng Trứng của Rùa đầu to giống trứng chim, màu trắng và có kích thước khoảng 37 mm x 22 mm [38]

Trong điều kiện nuôi nhốt, việc ghép đôi sinh sản Rùa đầu to cũng có bước đầu thành công Con cái có thời gian mang thai dao động trong thời gian 78 – 97 ngày với tỷ lệ nở là 74,3% [38] Ngoài ra tình trạng một ổ trứng được thụ tinh từ nhiều cá thể rùa đực cũng cũng xuất hiện ở loài này Mặc dù không có mối tương quan đáng kể giữa kích thước của con cái và số lượng trứng nhưng có mối tương quan đáng kể giữa kích thước con đực với số lượng trứng quan sát được Tuy có sự thành công trong việc nhân nuôi sinh sản Rùa đầu to trong điều kiện nuôi nhốt nhưng khả năng thành công thường khá thấp, do Rùa đầu to có đặc tính hung dữ và có khả năng gây tổn thương đến các cá thể nhốt cùng

Hoạt động giao phối ở Rùa đầu to diễn ra ở dưới nước Đầu tiên, rùa đực sẽ tiếp cận rùa cái, thể hiện hành vi tán tỉnh, sau đó, rùa đực vươn cổ ra và ngửi, tiếp xúc với vùng lỗ huyệt của con cái, yếm ở rìa, hoặc cổ Tiếp theo, con đực sẽ cưỡi lên người con cái, tuy nhiên, thông thường, con cái bỏ trốn trong giai đoạn con đực tiếp cận hoặc khi con đực đang cưỡi lên con cái Khi đó, con đực sẽ bắt đầu đuổi theo, trong lúc rượt đuổi, con đực thường nghỉ ngơi khoảng 30 giây Nếu rượt đuổi thành công thì con đực sẽ cưỡi lên người con cái để bắt đầu quá trình giao phối Trong quá trình giao phối, con cái tiếp tục thể hiện hành vi chấp nhận hoặc kháng cự lại việc giao phối Khi đó, rùa đực sẽ phải khuất phục rùa cái bằng cách nằm song song và ôm chặt lấy mép yếm của rùa cái, sau đó, chúng xoay vòng 90 độ hoặc 180 độ trong nước Nếu khuất phục không thành công, con cái sẽ bỏ trốn Nếu thành công, giao phối sẽ diễn ra Trong suốt quá trình này, con đực thường mở rộng và co cổ từ từ (2 – 3 lần mỗi phút) Khi giao phối xong, con đực thả con cái ra và con cái sẽ tìm cách trốn thoát [86]

Dựa trên đặc điểm hình thái, Rùa đầu to trước đây được phân thành 5 phân loài:

Platysternon megacephalum megacephalum Grey, 1831, phân bố ở miền Nam Trung

Quốc; P m peguense Grey, 1870 được ghi nhận từ phía Tây Việt Nam, Campuchia, Lào tới miền Nam Thái Lan; P m vogeli Wermuth, 1969, ở Tây Bắc Thái Lan; P m

tristernalis, Schleich & Gruber, 1984, ở Vân Nam, Trung Quốc; và P m shiui Ernst &

McCord, 1987, ở miền Bắc Việt Nam và Vân Nam ở Trung Quốc [15] Tuy nhiên, phân tích lại sau đó dựa trên các đặc điểm hình thái và phân bố địa lý tổng thể hơn cho thấy

P m vogeli và P m tristernalis là những phân loài đồng danh tương ứng với P m peguense và P m megacephalum [15] Vì thế, cho đến nay, Rùa đầu to được phân thành

ba phân loài dựa trên hình thái bao gồm: P m megacephalum Grey, 1831 phân bố ở miền Nam Trung Quốc và một khu vực nhỏ ở phía Bắc Việt Nam; P m shiui Ernst & McCord, 1987 phân bố ở miền Bắc Việt Nam và P m peguense Grey, 1870 phân bố dọc

miền Tây Việt Nam mở rộng qua Campuchia, Lào đến phía Tây và miền Nam Thái Lan và cũng có ghi nhận phân bố ở Vân Nam, Trung Quốc [58] (Hình 3)

Hình 3 Khu vực phân bố của loài Rùa đầu to [58]

(phân loài: megacephalum: màu đỏ, peguense: màu tím, shiui: xanh; chấm da cam: các cá thể buôn bán hoặc tái thả)

Cả ba phân loài P.m megacephalum, P.m peguense và P.m shiui hiện đều được

ghi nhận có sự phân bố tại Việt Nam

A

B

C

Hình 4 Ba phân loài của Rùa đầu to [58]

A Platysternon megacephalum peguense Gray 1870c B Platysternon megacephalum megacephalum Gray 1831c C Platysternon megacephalum shiui Ernst and McCord 1987

Về mặt hình thái, P m megacephalum có đặc điểm chủ yếu là có yếm màu vàng, không có hoa văn, trong khi hầu hết bề mặt lưng của P m shiui có những đốm màu, và

P m peguense có vệt tối màu dọc theo yếm [14] (Hình 4) Tuy nhiên, việc phân loại này

vẫn còn tranh cãi, phần lớn là do sự khác biệt về mặt hình thái giữa hoặc trong các quần thể địa lý và thiếu dữ liệu toàn bộ hệ gen Ngoài ra, một số cá thể được bắt gặp trong tự nhiên không có hình thái đặc trưng mà mang những đặc điểm của cả ba phân loài Điều này gây nhiều khó khăn trong công tác định loại và phân biệt các phân loài Rùa đầu to [14, 15] Do đó, việc sử dụng các công cụ sinh học phân tử trong công tác định danh, phân loại là vô cùng cần thiết

1.2.2 Hiện trạng Rùa đầu to

Rùa đầu to là loài có nguy cơ tuyệt chủng và là một trong những loài rùa bị đe dọa nhiều nhất trên thế giới [58] Nó được đánh giá là loài cực kỳ nguy cấp trong Sách

đỏ IUCN [18] Từ năm 2013, P megacephalum được đưa vào Phụ lục I trong Công ước

về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) Nó được bảo vệ theo luật pháp tại Trung Quốc (Luật bảo vệ động vật hoang dã: Được bảo vệ vì giá trị lợi ích, kinh tế hoặc khoa học), Đặc khu hành chính Hồng Kông (Pháp lệnh bảo vệ động vật hoang dã); Myanmar (Luật Bảo vệ động vật hoang dã, thực vật hoang dã và bảo tồn các khu vực tự nhiên, 1994: Được bảo vệ hoàn toàn); Thái Lan (Luật WARPA, 1992: Luật được bảo vệ số 1, Mục 3); và Việt Nam (Nhóm IIB, Nghị định 06/2019/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm (được sửa đổi, bổ sung bởi Nghị định 84/2021/NĐ-CP) và Nghị định 160/2013/NĐ-CP về tiêu chí xác định loài và chế độ quản lý loài thuộc Danh mục loài nguy cấp, quý, hiếm được ưu tiên bảo vệ (được

sửa đổi, bổ sung bởi Nghị định 64/2019/NĐ-CP)) P megacephalum hiện không được

bảo vệ bởi pháp luật ở Campuchia hoặc Cộng hòa dân chủ nhân dân Lào

Ngoài tự nhiên, P megacephalum có phạm vi phân bố tương đối rộng bao gồm

Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Myanmar Rùa đầu to từng khá

phổ biến ở một số khu vực phân bố, nhưng hiện nay có rất ít cá thể rùa ngoài tự nhiên trong vùng phân bố của nó Do bị khai thác quá mức (làm thực phẩm, vật nuôi và y học

cổ truyền) và môi trường sống bị phá hủy nên hiện nay chỉ còn lại một số quần thể P

megacephalum hoang dã [22, 73] Tuy nhiên, số lượng cá thể của quần thể đang suy

giảm với tốc độ chưa từng thấy trên khắp vùng phân bố của nó [73, 75, 82, 84] Ví dụ: chỉ có 0 – 0,36 cá thể/km suối được phát hiện ở Quảng Đông và Hải Nam, trong khi tỷ lệ săn trộm là >120 cá thể/km suối ở Hồng Kông [22] Ngoài ra, trong một nghiên cứu khác được thực hiện ở Nam Trung Quốc chỉ có 16 cá thể được tìm thấy trong hơn 4000 ngày đặt bẫy Trên hầu hết các khu vực phân bố của loài, các quần thể đều bị suy giảm nghiêm trọng, thể hiện qua mức độ hiếm trong tự nhiên và số lượng lớn các cá thể xuất hiện trong buôn bán

Quần thể Rùa đầu to ở Thái Lan và Hồng Kông được coi là ổn định, nhưng suy giảm nhanh chóng ở các khu vực phân bố khác Một số nghiên cứu cho rằng số lượng cá

thể của loài này đã giảm hơn 90% trong ba thế hệ qua (90 năm) Platysternon

megacephalum đã được xác nhận là có xuất hiện ở một số khu bảo tồn, tuy nhiên, không

phải tất cả các quần thể như vậy đều được bảo đảm khỏi bị săn bắt bất hợp pháp nhằm mục đích buôn bán Tập tính sống dưới nước của loài này có thể giải thích tại sao nó rất dễ bị bẫy bất hợp pháp Ở Nam Trung Quốc, những kẻ đánh bẫy bất hợp pháp chủ yếu sử dụng lưỡi câu có mồi đặt trong các hồ hoặc dọc theo suối để bắt chúng [72] Ngoài ra, sự suy thoái môi trường sống do du lịch và nông nghiệp, tác động từ các động vật xâm lấn cùng với việc khả năng sinh sản của rùa thấp cũng góp phần ảnh hưởng tới nhiều quần thể Rùa đầu to

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về Rùa đầu to mới chỉ tập trung tìm hiểu về khu phân bố và tình hình săn bắt, buôn bán của loài Theo các nghiên cứu thực địa, Rùa đầu to được ghi nhận tại các tỉnh Điện Biên, Lào Cai, Hà Giang, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Bắc Giang, Thái Nguyên, Phú Thọ, Sơn La, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình,

Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai Nghiên cứu của Hoang và cộng sự năm 2021 về tình trạng săn bắt Rùa đầu to ở khu vực Vườn Quốc Gia Pù Mát và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hu cho thấy số lượng Rùa đầu to bị săn bắt tăng rất nhanh từ năm 1993 – 2000, nhưng bắt đầu từ năm 2002 cho đến nay, số lượng săn bắt được ghi nhận giảm dần Năm 1999, các thương lái được phỏng vấn cho biết họ có thể mua từ 15

– 80 kg cá thể P megacephalum (khoảng 8 – 40 cá thể rùa với trọng lượng trung bình là 0,5 kg) từ các thợ săn địa phương Khối lượng P megacephalum được thương lái mua

giảm mạnh vào năm 2002 và kể từ đó, vẫn ở mức thấp [35] Điều này không chứng minh rằng nạn săn bắt và khai thác trái phép Rùa đầu to được kiểm soát mà chỉ cho thấy số lượng cá thể Rùa đầu to đã suy giảm mạnh, thể hiện qua các cá thể Rùa đầu to đã khó bắt gặp hơn rất nhiều trong môi trường tự nhiên những năm gần đây Các thông tin này cho thấy dấu hiệu rõ ràng của sự suy thoái và tình trạng nguy cấp của loài Tuy vậy, các vụ vi phạm vẫn tiếp tục diễn ra và nhiều cá thể Rùa đầu to vẫn bị bắt giữ từ hoạt động buôn bán trái phép (Hình 5) Vì vậy, IUCN đã nâng cấp Rùa đầu to từ mức độ nguy cấp (EN – 2017) lên mức độ rất nguy cấp (CR – 2019) Tại Việt Nam, Rùa đầu to được xếp vào nhóm IIB theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP (2017) và được nâng cấp lên nhóm IB theo Nghị định 06/2019/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm (được sửa đổi, bổ sung bởi Nghị định 84/2021/NĐ-CP) và Nghị định 160/2013/NĐ-CP về tiêu chí xác định loài và chế độ quản lý loài thuộc Danh mục loài nguy cấp, quý, hiếm được ưu tiên bảo vệ (được sửa đổi, bổ sung bởi Nghị định 64/2019/NĐ-CP), theo đó Rùa đầu to bị cấm săn, bắt, giết, vận chuyển buôn bán cũng như nuôi nhốt trái phép, mọi hành vi vi phạm sẽ bị truy cứu trách nhiệm hình sự

Hình 5 Tang vật 75 cá thể Rùa đầu to được thu giữ tại Nghệ An

(https://truyenhinhnghean.vn/phap-luat/202212/bat-qua-tang-doi-tuong-van-chuyen-75-ca-the-rua-quy-hiem-1954695/) Trước bối cảnh các quần thể Rùa đầu to đang bị đe dọa nghiêm trọng, nhiều nỗ lực bảo tồn loài đã được triển khai Từ năm 2015 đến năm 2021, Trung tâm Bảo tồn Rùa Cúc Phương, thuộc Vườn Quốc gia Cúc Phương (Việt Nam) đã tiếp nhận gần 600 cá thể

P megacephalum bị tịch thu, một số cá thể có nguồn gốc từ các khu bảo tồn của Việt

Nam [50] Bên cạnh đó, trong những thập kỷ gần đây, Rùa đầu to thường được tìm thấy ở các chợ bất hợp pháp [21, 22] Khi những cá thể này bị tịch thu, chúng sẽ cung cấp

nguồn cá thể cho việc bảo tồn chuyển vị (ex situ) Sinh sản thành công trong điều kiện

nuôi nhốt là bước cần thiết đầu tiên trong quá trình phục hồi loài Rùa đầu to ở Việt Nam

Trong quá khứ, việc nhân giống Rùa đầu to trong điều kiện nuôi nhốt đã được nhiều vườn thú thử nghiệm, tuy nhiên rất ít trường hợp loài này sinh sản thành công trong điều kiện nuôi nhốt [64, 69, 86], có thể do kiến thức về tập tính tự nhiên của chúng hiện còn hạn chế [69] Trong tự nhiên, rùa thường trốn trong các khe đá, và có nhiều khe có kích thước phù hợp hơn, trong các vũng có tỷ lệ đá cuội cao Đồng thời, loài này cũng được tìm thấy tại các địa điểm có lớp phủ lá cao hơn mà môi trường nuôi nhốt không đủ điều kiện để đáp ứng Đáng chú ý, rùa ưa thích môi trường sống với tỷ lệ đá cuội và lá

rụng thấp hơn trong mùa khô [69] Nghiên cứu trong tương lai về mối quan hệ giữa chế độ ăn uống, môi trường vật lý và việc sử dụng môi trường sống của loài rùa này sẽ cung

cấp thông tin cần thiết cho cả bảo tồn nguyên vị (in situ) và bảo tồn chuyển vị (ex situ)

Nhân giống trong môi trường nuôi nhốt và tái thả là những phương pháp quan

trọng để cải thiện khả năng phục hồi của P megacephalum trên phạm vi phân bố của loài

(Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Myanmar, Lào và Campuchia [58]), nơi một số quần thể tự nhiên có thể đã bị tuyệt chủng nhưng môi trường sống tự nhiên vẫn được duy trì [22, 65] Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, việc nhân giống Rùa đầu to trong môi trường nuôi nhốt đã thành công ở một số trang trại rùa [24] Tuy nhiên, Rùa đầu to được cho là loài khó có thể sinh trưởng và sinh sản tốt trong môi trường bị nuôi nhốt do có đặc tính hung dữ và có khả năng gây tổn thương đến các cá thể nhốt cùng, vì thế các nỗ lực bảo tồn chủ yếu tập trung vào việc tái thả các cá thể bị bắt giữ trong buôn bán nhằm phục hồi các quần thể trong tự nhiên Ngoài ra, Rùa đầu to tại các trang trại thường được thu thập từ các nguồn khác nhau không có thông tin về vùng phân bố địa lý rõ ràng Do đó, việc thả các cá thể không phải bản địa hoặc lai vào tự nhiên có thể sẽ làm tăng nguy cơ tuyệt chủng của quần thể địa phương [81]

Việc định danh các loài bị đe dọa là điều kiện tiên quyết cho việc xây dựng chính sách bảo tồn hiệu quả Hiện nay, việc định danh nhiều loài bị đe dọa chủ yếu dựa trên số lượng mẫu hạn chế và sự khác biệt về hình thái và hầu như chưa xem xét đến sự khác biệt di truyền bằng cách sử dụng các chỉ thị sinh học phân tử, dẫn đến phân loại không phù hợp [26, 29] Bên cạnh đó, thông tin về nguồn gốc di truyền và khu vực phân bố là vô cùng cần thiết Việc đánh giá sự đa dạng và biến đổi di truyền ở các quần thể hiện có trở nên rất quan trọng đối với việc phân loại và bảo tồn loài [41, 51]

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học hiện đại, các chỉ thị sinh hóa như protein và isozyme đã được sử dụng Vào những năm 1980, nhiều loại chỉ thị phân tử DNA khác nhau đã được khám phá [87] và kể từ đó trở đi, các chỉ thị phân tử đã

nhanh chóng trở thành một công cụ hữu ích để phân tích đa dạng di truyền Tất cả các chỉ thị phân tử này đều có những ưu điểm cụ thể và đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền ở động vật, xác định nguồn gen cũng như phân tích cấu trúc di truyền

1.3 Chỉ thị phân tử trong đa dạng di truyền loài 1.3.1 Các chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền loài

Trong những năm gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong các nghiên cứu phát sinh chủng loại đã trở nên ngày càng phổ biến Các chỉ thị phân tử có thể được sử dụng để nghiên cứu các biến thể di truyền ở cấp độ DNA giữa các quần thể và cá thể khác nhau, ưu điểm của nó là có thể tìm ra các biến thể di truyền một cách nhanh chóng và trực tiếp [87] Cho đến nay, nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau đã được sử dụng để đánh giá tính đa hình của DNA, có thể kể đến DNA vi vệ tinh (microsatellite DNA) hay trình tự lặp lại đơn giản (Simple sequence repeats – SSR), đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphisms – SNP), các gen DNA ty thể (mitochondrial DNA – mtDNA),…

DNA vi vệ tinh, còn được gọi là trình tự lặp lại đơn giản (SSR), là các trình tự từ 1 – 6 cặp bazơ (bp) được lặp lại nhiều lần [42, 76] Các DNA vi vệ tinh là một hệ thống đánh dấu được sử dụng rộng rãi để ước tính đa dạng di truyền trong các nghiên cứu di truyền quần thể [63] Kể từ khi được phát hiện vào những năm 1980, việc sử dụng microsatellites đã tăng một cách tuyến tính [77] và cho đến nay chúng được áp dụng rộng rãi, đặc biệt trong di truyền học bảo tồn [20] Ưu điểm của chỉ thị SSR là có độ tin cậy và độ chính xác cao, có thể phân biệt giữa dị hợp tử với đồng hợp tử, yêu cầu số lượng DNA mẫu thấp (10 – 100 ng), tính đa hình cao Mặc dù cho đến gần đây, microsatellites là các chỉ thị được sử dụng rộng rãi nhất để đánh giá đa dạng di truyền [6, 16, 34], tuy nhiên, chúng cũng tồn tại một số nhược điểm: tốn thời gian và cần nhiều

kinh phí để phát triển, các dị hợp tử có thể bị phân loại sai thành đồng hợp tử, mô hình đột biến phần lớn chưa được biết đến [87]

Đa hình đơn nucleotide – SNP là những đột biến đơn nucleotide tại một locus cụ thể trong trình tự DNA Các đa hình đơn nucleotide (SNP) trên cơ sở giải trình tự DNA truyền thống [61] đã được biết đến từ lâu, nhưng chúng hiếm khi được sử dụng trong di truyền quần thể [32], tuy nhiên trong những năm trở lại đây, việc sử dụng SNP đã tăng theo cấp số nhân [28], do sự phát triển của các kỹ thuật giải trình tự thông lượng cao cho phép xác định hàng nghìn đến hàng triệu SNP và ước tính đồng thời tần số SNP trên bộ gen của các cá thể, quần thể và loài [11, 49, 62] So với các chỉ thị khác, SNP có nhiều ưu điểm: chúng rất nhiều và phân bố rộng khắp toàn bộ bộ gen [57], độ ổn định di truyền, độ lặp lại cao và độ chính xác cao, cho phép tạo kiểu gen nhanh, thông lượng cao [80], thuận tiện cho việc phân biệt hiệu quả dị hợp tử với các alen đồng hợp tử [87] Tuy nhiên, SNP có một nhược điểm là thông tin thu được thấp hơn so với DNA vi vệ tinh

DNA ty thể có phương thức sao chép và di truyền khác biệt so với hệ gen nhân Do đó, tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những sai khác nhất định so với tốc độ đột biến và thay thế của hệ gen nhân So với DNA nhân, hầu hết DNA ty thể của sinh vật nhân chuẩn (mtDNA), đặc biệt là ở vùng D_loop, có tốc độ tiến hóa nhanh hơn (tần số đột biến khoảng 5,7 x 10-8 – gấp 10 lần so với hệ gen nhân), do đó tạo ra mức độ đột biến cao hơn Vì vậy, mtDNA có thể được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền và phát sinh loài [7] Nếu như DNA nhân phù hợp để giải quyết các mức phân loại cao hơn cho sinh vật thì DNA ty thể là nguồn chỉ thị di truyền hữu ích để giải quyết các mức phân loại thấp hơn DNA ty thể mã hoá cho 37 gen, 13 gen trong đó mã hoá cho chuỗi polypeptit trong chuỗi truyền điện tử, 22 tRNAs và hai rRNAs Một số trình tự

mtDNA đã được sử dụng trong phân tích phát sinh gen, bao gồm các gen 12S rRNA, 16S

rRNA, Cytb (Cytochrome b) và COI (cytochrome c oxidase subunit 1),… [40, 85] Một

đặc điểm khác của DNA ty thể là không có các vùng intron, di truyền theo dòng mẹ nên

không có sự tái tổ hợp do trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể, và có hàng nghìn bản sao trong tế bào Những ưu điểm này biến gen ty thể trở thành công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền giữa các loài và các quần thể

1.3.2 Gen ND4: ưu và nhược điểm

ND4 là gen của bộ gen ty thể mã hóa cho protein NADH dehydrogenase tiểu đơn

vị 4 và là một trong bảy gen ty thể mã hóa các tiểu đơn vị của enzyme NADH

dehydrogenase, cùng với ND1, ND2, ND3, ND4L, ND5 và ND6 Gen ND4 ở Rùa đầu to

có chiều dài 1377 bp, nằm trên sợi dương của DNA ty thể, từ vị trí 14057 đến vị trí 15433, mã hóa cho protein có chiều dài 459 amino acid [43]

Hình 6 Cấu trúc DNA ty thể [43]

A Trình tự DNA ty thể ở các loài khác B Trình tự DNA ty thể ở Rùa đầu to

Trong số các gen ty thể, ND4 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu di truyền quần thể và tiến hóa phân tử [5, 31] Gen ND4 cũng mang những ưu điểm của

gen ty thể khi như tốc độ tiến hóa nhanh, di truyền theo dòng mẹ, không có intron hay không có sự trao đổi chéo Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc sử

dụng gen ND4 như là một chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền Nghiên cứu công bố năm 2005 của J F Wallman và cộng sự sử dụng gen ND4 đã chỉ ra nguồn gốc

phát sinh của loài đom đóm đặc hữu ở nước Úc [83] Năm 2018, Maria Claudia Atencia

và cộng sự đã đánh giá cấu trúc và sự biến đổi của quần thể muỗi Aedes aegypti tại

Colombia thông qua phân tích trình tự gen ND4 [1] Năm 2020, H S D Fernando và cộng sự cũng đã sử dụng gen ND4 nhằm đánh giá quan hệ phát sinh chủng loại của muỗi

Aedes trên toàn cầu [17]

Các gen dài nhất (COX1, ND4, Cytb và ND5) tạo ra các kiểu phát sinh chủng loại

gần với kiểu gen của bộ gen ty thể hơn là các gen ngắn hơn [33] Điều này phù hợp với các nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm cho thấy rằng các trình tự dài hơn giải quyết

các phát sinh loài tốt hơn so với việc dựa trên các trình tự ngắn hơn [12, 60] Gen ND4

là một trong những gen dài nhất của DNA ty thể ở Rùa đầu to [43] Ngoài ra, trong một nghiên cứu khác kiểm tra các chỉ thị của chọn lọc tự nhiên trên ba gen ty thể (cytochrome

oxidase 1 (COX1)), cytochrome b (Cytb) và NADH dehydrogenase 4 (ND4), cho thấy gen ND4 có số lượng vị trí được chọn lọc tích cực cao nhất [3], chứng tỏ gen này có thể

là một chỉ thị phân tử tiềm năng trong việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể

Cho đến nay, những hiểu biết về loài Rùa đầu to vẫn chưa thật sự đầy đủ Những nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể của Rùa đầu to đã phát hiện có sự sắp xếp lại trật tự các gen và có thêm một bản sao của vùng điều hòa (control region – CR) vì thế kích thước hệ gen ty thể của Rùa đầu to là khoảng 19kb, lớn hơn so với các loài rùa khác [9, 45, 53, 54] Dựa trên trình tự vùng CR, Zheing và cộng sự năm 2013 đã xây dựng cây

phát sinh chủng loại cho thấy hai phân loài P m megacephalum và P m shiui có sự gần gũi về mặt di truyền hơn so với P m peguense [88] Các nghiên cứu về đa dạng di truyền

của loài có sử dụng chỉ thị phân tử microsatellite, ISSR,… cũng đã được thực hiện, tuy nhiên số lượng mẫu còn ít và mới chỉ xem xét giữa các cá thể có khu vực phân bố ở Trung Quốc [47, 89] Hơn nữa, không có mẫu Rùa đầu to nào được thu thập từ Campuchia, Hải Nam – Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam trong các nghiên cứu phát sinh chủng loại phân tử trước đây với các chỉ thị di truyền còn hạn chế [45, 88] cho thấy cần có những nghiên cứu chi tiết hơn về đa dạng di truyền của loài này

Xuất phát từ thực trạng nguy cấp của loài Rùa đầu to trong tự nhiên, cùng với việc chưa có nghiên cứu nào về đa dạng di truyền của quần thể Rùa đầu to tại Việt Nam được chính thức tiến hành, gây nhiều khó khăn trong công tác bảo tồn và tái thả Rùa đầu to, kết hợp với những tiến bộ của công nghệ sinh học phân tử, bên cạnh những ưu điểm

của gen ND4, nghiên cứu “Đánh giá đa dạng di truyền loài Rùa đầu to (Platysternon

megacephalum) tại Việt Nam dựa trên gen ND4” được thực hiện với mục tiêu:

- Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của loài Rùa đầu to (Platysternon

megacephalum) và xác nhận khu vực phân bố tại Việt Nam

- Xây dựng được hệ dữ liệu di truyền của loài nhằm hỗ trợ công tác quản lý và thực thi pháp luật, xác định nguồn gốc rùa trong buôn bán và phục vụ công tác tái thả các cá thể rùa về tự nhiên

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng 465 mẫu vật bao gồm 15 mẫu mô thu từ các cá thể trong tự nhiên và 450 mẫu máu thu từ các cá thể là tang vật trong các vụ buôn bán động vật hoang dã

Các mẫu mô được thu từ các cá thể trong tự nhiên ở các khu vực đã ghi nhận có sự phân bố của Rùa đầu to thông qua quá trình khảo sát thực địa từ năm 2007 – 2015, công tác thu mẫu được thực hiện bởi các nhà nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, và Chương trình bảo tồn rùa châu Á (ATP) Trong 15 mẫu mô thu từ

các cá thể bắt gặp trong tự nhiên, 11 cá thể nằm trong khu vực phân bố của phân loài P

m peguense được thu từ tỉnh Lào Cai, Quảng Bình, Điện Biên, Sơn La, Hà Tĩnh, Thừa

Thiên Huế, Quảng Trị, Gia Lai và bốn cá thể nằm trong khu vực phân bố của phân loài

P m shiui được thu từ hai tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn Các mẫu mô được cắt một mẩu nhỏ

ở đuôi Rùa đầu to để tránh tổn thương đến sức khỏe của các cá thể

Các mẫu máu được thu từ các cá thể là tang vật của các vụ việc buôn bán động vật hoang dã hiện đang được cứu hộ tại Trạm cứu hộ động vật hoang dã Hà Nội, Trạm cứu hộ Mê Linh và Trung tâm Bảo tồn Rùa Cúc Phương (TCC) thuộc Vườn Quốc gia Cúc Phương tại tỉnh Ninh Bình Công tác thu mẫu được thực hiện bởi các chuyên gia chăm sóc rùa của Trung tâm Bảo tồn Rùa Cúc Phương Thời gian thu mẫu diễn ra từ năm 2017 – 2021

Các mẫu vật được bảo quản trong dung dịch cồn 70% (Merck, CHLB Đức) và được vận chuyển về Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Đại học Khoa học Tự nhiên, bảo quản ở 4oC trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Thông tin chi tiết về các mẫu được thể hiện trong Bảng 1 và Phụ lục 1

Bảng 1: Thông tin mẫu vật được sử dụng trong nghiên cứu

lượng

Loại mẫu

Tự nhiên/ tang vật Địa điểm thu mẫu

Năm thu

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Sa Pa, Lào Cai 2014

P m shiui 1 Mô Tự nhiên Hạ Lang, Cao Bằng 2012

P m peguense 3 Mô Tự nhiên Quảng Bình 2015

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Mường Nhé, Điện Biên 2015

P m shiui 1 Mô Tự nhiên Nà Rì, Bắc Kạn 2013

P m shiui 1 Mô Tự nhiên Chợ Đồn, Bắc Kạn 2013

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Mộc Châu, tỉnh Sơn La 2011

P m shiui 1 Mô Tự nhiên Nguyên Bình, Cao Bằng 2012

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Nam Đông, Thừa Thiên

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Mang Yang, Gia Lai 2007

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Vũ Quang, Hà Tĩnh 2015

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Can Lộc, Hà Tĩnh 2015

P m peguense 1 Mô Tự nhiên Hướng Hóa, Quảng Trị 2015

P megacephalum 2 Máu Tang vật

Công an tỉnh Thái Bình, từ đối tượng ở Quảng Bình

2017

P megacephalum 2 Máu Tang vật Công an thành phố Bắc

P megacephalum 2 Máu Tang vật Tỉnh Ninh Bình 2017

P megacephalum 4 Máu Tang vật Thành phố Hà Nội 2017 –

2019

Tên loài Số

lượng

Loại mẫu

Tự nhiên/ tang vật Địa điểm thu mẫu

Năm thu

P megacephalum 2 Máu Tang vật Công an Kỳ Sơn, tỉnh

P megacephalum 174 Máu Tang vật

Cứu hộ tại Trung tâm cứu hộ rùa, VQG Cúc

Phương (TCC)

2019

P megacephalum 165 Máu Tang vật Tỉnh Quảng Ninh 2017 –

2019

P megacephalum 7 Máu Tang vật Chuyển cho VQG Pù Mát 2019

P megacephalum 1 Máu Tang vật Tỉnh Ninh Bình 2020

P megacephalum 2 Máu Tang vật Tỉnh Thanh Hóa 2020 –

2022

P megacephalum 2 Máu Tang vật Tỉnh Nghệ An 2020

P megacephalum 20 Máu Tang vật Tỉnh Sơn La 2021

P megacephalum 7 Máu Tang vật Tỉnh Hòa Bình 2021

P megacephalum 50 Máu Tang vật Tỉnh Kon Tum 2021

P megacephalum 2 Máu Tang vật Tỉnh Quảng Nam 2021

sử dụng hỗn hợp HotStarTaq Mastermix (Qiagen, CHLB Đức) và hỗn hợp DreamTaq

Mastermix (ThermoFisher Scientific, Lithuania)

Sản phẩm phản ứng PCR được phân tích bằng phương pháp điện di, sử dụng các hóa chất: agarose (1st_Base, Malaysia), ethidium bromide, tris base (Merck, CHLB Đức), EDTA (Merck, CHLB Đức), Boric Acid (Merck, CHLB Đức), marker 1 kb (ThermoFisher Scientific, Lithuania) và TriTrack 6X (ThermoFisher Scientific,

Lithuania)

Sản phẩm PCR thành công được tinh sạch sử dụng bộ kit GeneJET PCR

Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania)

2.1.3 Phần mềm tin sinh

Các phần mềm tin sinh được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Công cụ BLAST, công cụ PRIMER BLAST trên Ngân hàng Gen (GenBank), Sequencher v5.4, Bioedit v7.1, ClustalW v2.1, DnaSP v6.12.03, jModeltest v2.1.4, MrBayes v3.2.7, IQ-TREE v1.6.7, SplitTree v4.14.2, Figtree v1.4.4, PAUP 4.0

2.1.4 Thiết bị

Các thiết bị, máy móc để phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

Các mẫu mô và mẫu máu lần lượt được bảo quản trong dung dịch cồn 70% hoặc EDTA 0.5M pH8 và được lưu trữ ở 4oC trước khi tiến hành tách chiết DNA Quá trình tách chiết DNA tổng số sử dụng hai bộ kit Đối với các mẫu máu thu từ các cá thể được cứu hộ tại Trung tâm bảo tồn rùa Cúc Phương có lượng mẫu nhiều và bảo quản trong điều kiện đảm bảo (cồn Merck 70%, CHLB Đức), bộ kit GeneJet Genomic DNA

Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania) được sử dụng, quy trình tách chiết DNA được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các mẫu mô là những mẫu thu từ các cá thể bắt gặp trong quá trình nghiên cứu thực địa có lượng mẫu ít, thu từ lâu và bảo quản trong điều kiện không đảm bảo sẽ được tách chiết sử dụng bộ kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, CHLB Đức), quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất có chỉnh lý một số thể tích hóa chất khi sử dụng

Quy trình tách chiết sử dụng kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, CHLB Đức) và GeneJet Genomic DNA Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania) có các bước lần lượt như sau: Đầu tiên, 60 – 80 µl mẫu máu hoặc 10 – 25 mg mẫu mô đã cắt nhỏ được cho vào ống eppendoft 1.5 ml (trước khi thực hiện cần lưu ý ủ dung dịch đệm nếu bị kết tủa) Sau đó tiến hành phá màng tế bào và loại bỏ protein bằng cách bổ sung thêm 180 µl dung dịch ATL, và 20 µl proteinase K (Qiagen, CHLB Đức) hoặc 180 µl Digestion solution và 20 µl proteinase K (ThermoFisher Scientific, Lithuania), ủ mẫu ở 56oC trong 4 – 6 giờ Tiếp theo, tiến hành phá màng các bào quan trong tế bào và loại bỏ RNA, sử dụng 200 µl dung dịch AL (Qiagen, CHLB Đức) hoặc 20 µl Rnase A cùng với 200 µl Lysis Solution (ThermoFisher Scientific, Lithuania) DNA được kết tủa sử dụng 200 µl cồn 100% hoặc 400 µl cồn 50% (Merk, CHLB Đức) Cột lọc có chứa màng silica được sử dụng để tách DNA ra khỏi các thành phần khác của tế bào thông qua quá trình ly tâm Sau đó, DNA được tiến hành rửa lần lượt với dung dịch đệm AW1, AW2 (Qiagen, CHLB Đức) hoặc Wash 1, Wash 2 (ThermoFisher Scientific, Lithuania) Cuối cùng, DNA được giữ lại ở màng silica được hòa tan bởi dung dịch đệm AE (Qiagen, CHLB Đức) hoặc Elution Buffer (ThermoFisher Scientific, Lithuania) và bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho thí nghiệm tiếp theo Đối chứng âm luôn được sử dụng song song trong quá trình tách chiết DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%, đệm TBE 1X (Tris base, Boric acid, EDTA pH8) ở 100V trong vòng 25 phút, sử dụng marker 1 kb

2.2.2 Thiết kề mồi đặc hiệu

Các nghiên cứu trước đây chưa từng khuếch đại đoạn gen ND4 cho loài Rùa đầu

to Do đó nghiên cứu này đã dựa vào trình tự hệ gen ty thể của loài Rùa đầu to đã công bố trên Ngân hàng Gen (Genbank) để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại một đoạn có

kích thước 689 bp nằm ở đầu đoạn gen ND4 riêng cho loài này Mồi được thiết kế sử

dụng phần mềm Primer – BLAST của NCBI Mồi xuôi và mồi ngược có kích thước lần lượt 24 nucleotide và 27 nucleotide (Bảng 2)

Bảng 2 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

DNA khuếch đại

689 bp

2.2.3 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR đã được thực hiện nhằm khuếch đại đoạn gen ND4 có kích thước

689 bp, sử dụng cặp mồi như đã trình bày trong Bảng 2 Trong nghiên cứu này, hai hỗn hợp Mastermix được sử dụng bao gồm DreamTaq PCR Mastermix (ThermoFisher Scientific) dùng cho các mẫu có nồng độ DNA cao và HotStarTaq Mastermix (Qiagen) để khuếch đại các mẫu có nồng độ DNA thấp với mục đích hạn chế thời gian tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR cũng như tiết kiệm nguồn mẫu để sử dụng cho các nghiên cứu trong tương lai

Thành phần của mỗi phản ứng PCR bao gồm 1 – 2 µl DNA khuôn tùy thuộc vào nồng độ DNA tổng số, 2 µl mỗi mồi (10 µM/L), 5 µl nước và 10 µl DreamTaq PCR Mastermix hoặc HotStarTaq Mastermix, tổng thể tích sử dụng trong mỗi phản ứng PCR là 21 µl Chu trình nhiệt của phản ứng PCR là: 95oC trong 15 phút với HotStar Taq

Mastermix và 5 phút với DreamTaq Mastermix, 35 – 40 chu kỳ ở 95oC trong 30 giây, 48oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút và bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 10 phút Đối chứng âm được tiến hành song song trong mỗi phản ứng PCR

Kết quả sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% trong đệm TBE 1X ở 100V trong 25 phút Sản phẩm điện di được quan sát dưới ánh sáng UV sử dụng máy Alphamager MINI (Protein Simple, Mỹ) và kích thước tương đối của sản phẩm được so sánh với Marker 100bp hoặc 1kb (ThermoFisher Scientific)

Các sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch sử dụng kit GeneJet PCR Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đầu tiên, gắn DNA lên màng (sử dụng 15 µl Binding Buffer, trộn đều hỗn hợp và chuyển toàn bộ dịch sang cột lọc có màng silica, ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng), làm sạch DNA (sử dụng 400µl dung dịch đệm rửa Wash Buffer, ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút 30 giây ở nhiệt độ phòng và loại bỏ dịch lọc), cuối cùng hòa tan DNA sử dụng 25µl dung dịch đệm Elution Buffer Sản phẩm sau khi tinh sạch được bảo quản ở 4oC và sau đó gửi đi giải trình tự hai chiều theo phương pháp Sanger tại công ty FirstBase (Malaysia)

2.2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Kết quả giải trình tự được nối hai chiều, kiểm tra và hiệu chỉnh sử dụng phần mềm Sequencher v5.4.6 (GeneCodes Corp, AnnArbor, MI, USA) Trình tự sau khi thu nhận được so sánh trên Ngân hàng Gen (Genbank) sử dụng công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Sau đó, các trình tự này cùng với các trình tự từ Ngân hàng Gen (Genbank) được gióng cột bằng phần mềm Bioedit v7.1.3 với các thông số cài đặt mặc định [30] Dữ liệu sau đó được đánh giá bởi phần mềm DnaSP v6.12.03 để xác định sự đa dạng haplotype và nucleotide Trong nghiên cứu này, hai phương pháp phân tích được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại (PSCL) là: hợp lý tối đa (Maximum Likelihood – ML) và Bayesian (BI) Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên

phương pháp Bayesian sử dụng sử dụng phần mềm MrBayes v3.2.7, chuỗi Markov Monte Carlo (MCMC) kết hợp giữa mô hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào, từ đó tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây [59] Các phân tích được thực hiện dựa trên cây lựa chọn ngẫu nhiên và chạy trong 1 x 107 thế hệ, tần số lấy mẫu được thực hiện sau 1000 thế hệ Những cây được tạo trước khi chương trình chạy ổn định sẽ bị loại bỏ khỏi phân tích cuối cùng bằng chức năng burn-in Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phương pháp Maximum Likelihood sử dụng phần mềm IQ-TREE v1.6.7 [52] Mô hình tiến hóa tối ưu với bộ dữ liệu cho cả hai phương pháp đều được xác định bằng phần mềm JModeltest v2.1.4 [56] Mối quan hệ cùng loài giữa

các quần thể P megacephalum cũng được suy ra từ thuật toán NeighborNet trong

SplitTree v4.14.2 [27], cây chủng loại sau khi được xây dựng sẽ được chỉnh sửa sử dụng phần mềm Figtree v1.4.4 Giá trị độ tin cậy (bootstrap) sẽ được hiển thị cùng cây phát sinh chủng loại ngay sau khi phần mềm phân tích dữ liệu Một nhánh được coi là đạt độ tin cậy khi giá trị này đạt trên 95% Khoảng cách di truyền giữa các cặp được tính toán trong phần mềm PAUP 4.0 [74]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA tổng số

Trong 465 mẫu vật Rùa đầu to được tiến hành tách chiết DNA, 450 mẫu máu là những mẫu mới thu (2017 – 2021), nồng độ máu nhiều và được bảo quản trong điều kiện đảm bảo (cồn Merck 70%) Sau khi tách chiết DNA ghi nhận 450/450 mẫu máu có kết quả điện di với băng sáng tương ứng với nồng độ DNA tương đối cao (Hình 7), đáp ứng điều kiện để tiếp tục tiến hành các bước phân tích tiếp theo

Hình 7 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu máu

Mk1kb Pm460 Pm461 Pm462 Pm463 Pm464 Pm465 Pm466 Pm467 Pm46810000bp

Đối với 15 mẫu mô được thu từ 2011 đến 2015, lượng mẫu ít và bảo quản trong điều kiện không đảm bảo (cồn công nghiệp), kết quả điện di DNA tổng số ghi nhận 8/15 mẫu có xuất hiện băng điện di, tuy nhiên chất lượng không được tốt và có vệt smear, 7/15 mẫu không ghi nhận được băng DNA tổng số thông qua điện di (Hình 8)

Hình 8 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu mô

3.2 Phản ứng PCR và giải trình tự

Tất cả các mẫu sau khi tách chiết được tiến hành PCR với cặp mồi PlaND4F1 và

PlaND4R1 nhằm khuếch đại đoạn gen ND4 Đối với các mẫu máu và các mẫu mô có

xuất hiện băng DNA tổng số sáng trên kết quả điện di, tất cả các mẫu đều ghi nhận sản phẩm PCR trong lần PCR đầu tiên sử dụng DreamTaq PCR Mastermix (ThermoFisher Scientific) Sản phẩm PCR thu nhận đều có băng điện di sáng, có kích thước đúng với kích thước đoạn gen mục tiêu cần khuếch đại ~690 bp (Hình 9)