Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu bệnh Nocardiosis ở cá chim vây vàng nuôi tại Khánh Hòa và Phú Yên

gây bệnh bao gồm: Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống, xác định loài vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử, xác định quan hệ di truyền của các chủng phân lập được.. Tro

-

PHAN NGUYỄN MINH THƢ

NGHIÊN CỨU BỆNH NOCARDIOSIS Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG

NUÔI TẠI KHÁNH HÕA VÀ PHÖ YÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2015

PHÂN VIỆN THÚ Y MIỀN TRUNG – NHA TRANG – KHÁNH HÒA Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS VŨ KHẮC HÙNG

Cán bộ đồng hướng dẫn : TS HUỲNH NGỌC OANH Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phan Nguyễn Minh Thư MSHV: 12310754 Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1989 Nơi sinh: Khánh Hòa Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 80

của vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh bao gồm: Phân lập vi khuẩn bằng phương

pháp truyền thống, xác định loài vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử, xác định quan hệ di truyền của các chủng phân lập được

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/12/2014 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/06/2015 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Vũ Khắc Hùng

CÁN BỘ ĐỒNG HƯỚNG DẪN: TS Huỳnh Ngọc Oanh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, các anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Ban lãnh đạo Khoa kỹ thuật hóa học, trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Phân Viện thú y Miền Trung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, như liên hệ nơi thực tập, hỗ trợ cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành công việc tốt nhất

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Khắc Hùng và TS Huỳnh Ngọc Oanh, người đã hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị tại Phân Viện thú y Miền Trung và tất cả các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tìm tòi, học hỏi để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị em và bạn bè tôi, đã luôn ở bên động

viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và cuộc sống

TÓM TẮT

Cá chim vây vàng là đối tượng mới và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, gần đây người nuôi trồng gặp khó khăn khi một số bệnh xuất hiện và có những diễn biến phức tạp, trong đó có bệnh đốm trắng nội tạng của cá (Nocadiosis) gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi

Trong bài luận này đã nêu rõ hai nội dung chính liên quan đến bệnh đốm trắng nội tạng bao gồm: xác định tình hình dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng được nuôi ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên và xác

định loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng Với nội

dung được tiến hành bằng các phương pháp thu mẫu, nhuộm mẫu, phân lập và đánh giá Dựa trên những phương pháp trên chúng tôi thu được 75 chủng được thu từ 233 mẫu bệnh phẩm được thu ở Khánh Hòa và Phú Yên, được nuôi trên môi trường đặc trưng Ogawa, chọn 56 chủng tiến hành các test sinh hóa

Đối với nội dung tiếp theo, chúng tôi tiến hành các phương pháp định danh, bằng PCR và giải trình tự gen 16S rDNA, xác định quan hệ di truyền bằng phương pháp điện di xung điện trường (PFGE) và thu được kết quả như sau: bằng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn phân lập được từ cá chim vây vàng ở Khánh Hòa và Phú Yên tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 1000 bp – 1100 bp kết quả này phù hợp với kết quả của tác giả Labrie và cs (2008) Theo nhóm tác giả này bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thì 100% các chủng vi

khuẩn Norcadia seriolae phân lập được đều nhân lên với đoạn gen có kích thước

1069 bp Chúng tôi giải trình tự gen 16S rDNA của 56 chủng và so sánh trình tự các chủng này với nhau bằng chương trình BLAST Kết quả cho thấy trình tự

được phân thành một pulsotype X1) và 19 băng với kích thước 40 -1100 kp (đối

với enzyme AseI, sau khi phân cắt 20 chủng được phân thành hai pulsotype

A1-A2) Tuy nhiên, xét về quan hệ di truyền có thể 20 chủng phân lập từ 2 tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên có thể chung nguồn gốc

Tiếp tục tiến hành cảm nhiễm ngược trên cá khỏe bằng cách tiêm 0,1 ml huyền dịch có mật độ 106

CFU/ ml vào ổ bụng của cá chim vây vàng với cỡ 20 – 22cm và kết quả thu được liều gây chết 50% tổng số cá là LD50= 1.26x104 CFU/ml

ABSTRACT

Snub – nose pampano are potential candidate that contribute high economic efficiency for aquaculture However, recently farmers are facing some difficulties of fish diseases especially Nocardiosis due to severe loss for cage-cultured farmers

In this thesis, we discussed two major issue involving Nocardiosis: determining the epidemiology of Nocardiosis on Snub-nuse pompanos cultured in

Khanh Hoa, Phu Yen provinces and identifying Nocardia sp causing Nocardiosis

on Snub-nuse pompanos The methods used in first experiment were sampling, dyeing, isolating and evaluating 75 Strains were isolated from 233 disease samples in two provinces These isolates were cultured on specific medium Ogawa and 56 trains were chosen for further biochemistry tests

Next experiment, we characterized bacteria, amplified by PCR method, sequenced 16s rDNA, identified genetic relation by pulsed electric field (PFGE) By

using PCR with specific primers, 100% of isolated Norcadia seriolae amplified

1069 bp gene segments (Labrie et al, 2008) Our PCR products were 1000 – 1100bp fragments and this was similar to the report of Labrie et al (2008) After that, the 16S rDNA of 56 strains were sequenced and compared with each other by BLAST program The results implied nucleotide sequence similarity of these strains.The 16S rDNAs from 6 corresponding strains were chosen randomly to be analysed and built phylogeny tree Comparing our sequences with the reference in NCBI, our 16S

rDNA sequences showed 100% of resemblance with that of Nocardia seriolae, this

meant that 16S rDNA sequences had high conservation and similarity PFGE was

applied to identify the genetic relation of 20 Nocardia seriolae strains There were 17 bands of 40 – 800 kb (for XbaI enzyme, after cleavaging of 20 stains were

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của học viên Phan Nguyễn Minh Thư với sự hướng dẫn của TS Vũ Khắc Hùng và TS Huỳnh Ngọc Oanh Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây

Người hướng dẫn khoa học Người đồng hướng dẫn khoa học

Tác giả luận văn

PHAN NGUYỄN MINH THƯ

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT DANH MỤC H NH DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi vi khuẩn Nocardia 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại học của Nocardia 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của chi Nocardia 3

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng 3

1.1.2.2 Cấu trúc 4

1.1.2.3 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Nocardia 5

1.1.3 Đặc điểm hóa sinh của các loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia 6

1.1.3.1 Nhuộm Acid-fast Ziehl-Neelsen 6

1.1.3.2 Nhuộm Gram 7

1.1.3.3 Phản ứng catalase 7

1.2 Tổng quan về cá chim vây vàng 8

1.2.1 Đặc điểm cá chim vây vàng 8

1.2.1.1 Vị trí phân loại 8

1.2.2 Đặc điểm hình thái 8

1.2.3 Sinh thái và phân bố của cá chim vây vàng 9

1.2.3.1 Phân bố địa lý 9

1.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới 12

1.4 Các phương pháp định danh loài thuộc chi Nocardia 13

1.4.1 Định danh bằng test hóa sinh 13

1.5 Phương pháp PCR 14

1.6 Giải trình tự các gene mã hóa cho tiểu phần 16S rDNA 14

1.7 Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE) 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Hóa chất và vật liệu 17

2.1.2 Môi trường 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Nghiên cứu dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng……… 19

2.3.2 Thu mẫu cá bệnh 20

2.3.3 Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh 21

2.3.4 Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn 21

2.3.5 Nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của các tổ chức cá bệnh theo phương pháp mô học của Tonguthai và cs 23

2.3.6 Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử 24

2.3.6.1 Phương pháp tách chiết 16S rDNA tổng số 24

2.3.6.2 Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của Nocardia sp 25

2.3.6.3 Kỹ thuật điện di gel Agarose 26

2.3.6.4 Tách chiết DNA từ gel agarose 26

2.3.7 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của Nocardia sp 27

2.4 Xác định quan hệ di truyền bằng phương pháp điện di xung điện trường (PFGE-pulsed-field gel electrophoresis) 27

2.5 Cảm nhiễm ngược các chủng vi khuẩn phân lập được vào cá chim vây vàng khỏe 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng 34

3.1.1 Tần suất gặp của bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng tại các vùng điều tra

31

3.1.2 Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng tại Khánh Hòa, Phú Yên……… ….……… 35

3.2 Kết quả nhuộm mô cá bệnh trên các tiêu bản phết 36

3.3 Nghiên cứu biến đổi mô, phân lập, định danh và xác định nguồn gốc của vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh 39

3.3.1 Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh 38

3.3.2 Định danh dựa trên sinh học phân tử 41

3.3.3 Xác định nguồn gốc di truyền của các chủng phân lập được bằng điện di xung điện trường 47

3.4.1 Kết quả thí nghiệm xác định tác nhân gây bệnh 49

3.4.2 Kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn 50

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia 7

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn phân loại các mức độ liên quan về gen giữa các chủng vi khuẩn bằng kỹ thuật PFGE 28

Bảng 2.2: Cảm nhiễm ngược các chủng vi khuẩn Nocardia phân lập được cho cá

chim vây vàng khỏe 29

Bảng 2.2: Cảm nhiễm ngược chủng vi khuẩn Nocardia sp vào cá chim vây vàng

khỏe ở các nồng độ khác nhau 30 Bảng 3.1: Tần suất gặp bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng nuôi tại Khánh Hòa, Phú Yên 31Bảng 3.2: Bảng tổng hợp mẫu cá bị bệnh thu được sau thu mẫu 33Bảng 3.3: Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng trong nội tạng 35

Bảng 3.4: Kết quả phân lập vi khuẩn Nocardia sp tự mẫu cá chim vây vàng bệnh 39

Bảng 3.5: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn đem đi phân tích trình tự 16S rDNA 43

Bảng 3.6: Mức tương đồng (%) nucleotid 16S rDNA của 6 chủng N seriolae 45 Bảng 3.7: Các chủng Nocardia có trình tự 16S rDNA gần nhất 46

DANH MỤC H NH

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Nocardia bắt màu nhuộm Gram 4

Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào của Nocardia 5

Hình 1.3: Khuẩn lạc N asteroides (bên trái) N brasiliensis (bên phải) trên môi trường thạch đường Sabouraud 6

Hình 1.4: Khuẩn lạc của Nocardia steroides phân lập trên cùng một môi trường TSB và nhiệt độ nhưng đa dạng về kích thước, màu sắc, hình dạng 6

Hình 2.2: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học ở cá xương 23

Hình 3.1: Cá bị bệnh xuất hiện các nốt phồng rộp dưới da, sau một thời gian nốt phồng vỡ ra tạo ra các thương tổn nhỏ mẫu nâu xám 33

Hình 3.2: Cá chim vây vàng bị xơ mòn gốc vây lưng 33

Hình 3.3: Các dấu hiệu gặp ở nội tạng cá vây vàng bị bệnh 34

Hình 3.4: Xuất hiện khối u nhiều đốm trắng ở mang và cột sống của cá bệnh 34

Hình 3.5: Các tiêu bản phết mô của cá bệnh nhuộm Gram (a,b,c,d) 38

Hình 3.6: Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch Ogawa 40

Hình 3.7: Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường BHI bổ sung huyết thanh bê 40

Hình 3.8: Các tế bào vi khuẩn dạng sợi, gram dương (+), kháng acid lấy từ khuẩn lạc mọc trên Ogawa 41Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA của

Hình 3.14: Mức tương đồng (%) về bộ gen của 20 chủng N seriolae phân cắt bằng AseI 49Hình 3.15: Kết quả cảm nhiễm các chủng vi khuẩn Nocardia phân lập được trên cá

chim vây vàng khỏe 50Hình 3.16: Kết quả kiểm tra độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được 50

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long PCR : Polymerase chain reation dNTP : deoxynucleotide Phosphate ddNTP : di deoxynucleotide Phosphate PFGE : Pulsed- Field Gel Electrophoresis NST : nhiễm sắc thể

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid PMSF : Phenyl Methane Sylfonyl Fluoride IDT : Intergrated DNA Technologies BHI : Brain Heart Infusion

O-F : Oxidation – Fermentation Medium DMSO : Dimethyl Sulfoside

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool NCBI : National Center for Biotechnology Information MEGA 6 : Molecular Evolutionary Gentics Analysis, version 6 HBA : Horse Blood agar

TSA : Tryptic Soy Agar TCBS : Thiosulphate Citrate Bile Salt EMB : Eosin Methylene Blue

GPS : Glutamate Starch Pseudomonas XLD : Xylose Lysine Deoxycholate

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Trong nhiều năm trở lại đây, ngành thủy sản đã phát triển và trở thành một

trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, đứng thứ ba sau dầu khí và dệt may Việc xuất khẩu thủy sản không ngừng tăng trong những năm như: năm 2007 đạt trên 3,65 tỷ USD, năm 2008 đạt 4,5 tỷ USD, năm 2009 đạt 4,4 tỷ USD, năm 2010 đạt 5,034 tỷ USD, năm 2011 đạt 6 tỷ USD và năm 2012 phấn đấu đạt 6,3 – 6,5 tỷ USD Để đạt được chỉ tiêu trên thì chiến lược của ngành được đưa ra là tăng cường chế biến các sản phẩm xuất khẩu do vậy đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu

chất lượng cao nhằm đạt được mục tiêu trên Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) là loài cá có giá trị dinh dưỡng cao, đã và đang được sự quan tâm của rất

nhiều cá nhân, đơn vị nuôi trồng thủy sản tại các tỉnh ven biển Nam Trung bộ như Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận Loài cá này là đối tượng nuôi mới và mang lại lợi ích kinh tế rất lớn cho người nuôi trồng thủy sản và đã được sản xuất giống và nuôi thương phẩm ở một số tỉnh nói trên Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, một số bệnh bắt đầu xuất hiện và có những diễn biến phức tạp trên đàn cá thương phẩm, trong đó đặc biệt là bệnh đốm trắng nội tạng như lách, gan, thận, và trong khoang bụng cá chim vây vàng gây chết hàng loạt gây thiệt hại rất lớn về kinh tế

Vì vậy nhu cầu cần đặt ra đó là xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh Norcadiosis và chính xác loài vi khuẩn gây bệnh, đồng thời xác định quan hệ di

truyền của các chủng vi khuẩn Norcadia sp phân lập được ở các vùng địa lý khác

nhau, từ đó đưa ra biện pháp phòng và trị bệnh do vi khuẩn này gây ra Để đáp ứng

những nhu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bệnh Nocardiosis ở cá chim vây vàng nuôi tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên”

2 Mục tiêu

- Xác định tình hình dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng được nuôi ở tỉnh Khánh Hòa và Phú yên

- Xác định loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng

Nội dung 2: Nghiên cứu biển đổi mô, phân lập, định danh và xác định quan

hệ di truyền của vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh

4 Ý nghĩa khoa học:

Xác định chính xác ở mức độ loài vi khuẩn gây ra bệnh đốm trắng ở nội tạng cá chim vây vàng, tìm hiểu chuyên sâu hơn về tác nhân gây bệnh đốm trắng nội trên cá chim vây vàng và từ đó đƣa ra biện pháp phòng chống bệnh

5 Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả là cơ sở cho việc phòng chống bệnh đốm trắng nội tạng của cá chim vây vàng nuôi ở Khánh Hòa và Phú Yên

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chivi khuẩn Nocardia 1.1.1 Đặc điểm phân loại học của Nocardia

Vi khuẩn Nocardia được nhà khoa học người Pháp Edmond Nocard (1850 – 1903) và

là bác sĩ thú y phát hiện và phân lập đầu tiên ở bò vào năm 1888 Sau đó năm 1890,

Eppinger phát hiện bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra ở người Theo phân loại học, Nocardia được xếp vào:

Giới: Bacteria Ngành : Actinobacteria

Lớp: Actinobacteria

Bộ: Actinomycetales

Họ: Nocardiaceae

Chi: Nocardia

Loài: Nocardia aerocolonigenes

Chi Nocardia có tổng cộng khoảng 85 loài được phát hiện bằng phương pháp

định danh truyền thống và sinh học phân tử, trong đó có một số loài gây bệnh ở động

vật như: chó, trâu, bò, ngựa, dê, cừu, và chưa có tài liệu nào cho thấy Nocardia gây bệnh ở lợn Bốn loài gây bệnh trên cá đã được phát hiện là: Nocardia seriola(trước đây là Nocardia kampachi), Nocardia asteroids, Nocardia salmonicida và Nocardia crassostreae [15,28] Và một số gây bệnh cho người trong đó có 13 loài: Nocardia abscessus, Nocardia africana, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia brevicatena, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia paucivarans, Nocardia pseudo brasiliensis, Nocardia transvalensis, Nocardia veteran [48,46,25]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của chi Nocardia

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng

Chi Nocardia là vi khuẩn hiếu khí, Gram dương (+), sinh bào tử, các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (ở Actinosynnema, Actinomadura) thường có tỷ lệ GC trong ADN là 64% - 72%, hình que, dạng sợi, nhánh, không di chuyển và thuộc vi sinh vật hoại sinh Chi Nocardia được tìm thấy

khắp nơi trên thế giới, rộng rãi trong tự nhiên như: đất (nhất là đất đồi núi), cây, cỏ và

gỗ mục, vật liệu hữu cơ chết hoặc đang phân hủy Mô tế bào động vật và con người là môi trường lý tưởng để chúng phát triển và gây bệnh [5, 45]

Nocardia thường được phân lập và nuôi cấy trên các môi trường khác nhau

như: thạch Sabouraud có glucose, thạch máu, thạch Lowenstein - Jensen, BHI, Ogawa và phát triển khá chậm trong các môi trường nuôi cấy không chọn lọc [23]

Vi khuẩn Nocardia có thể sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 15 -

37ºC Tùy theo từng loài mà nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng khác

nhau, ví dụ như Nocardia asteroid; Nocardia brasiliensis; Nocardia farcinica; Nocardia caviae gây bệnh trên người sinh trưởng tốt ở 37ºC [44, 47]

1.1.2.2 Cấu trúc

Cấu trúc tế bào của vi khuẩn Nocardia gồm: màng, thành tế bào, màng

nguyên sinh, tế bào chất, thể nhân, các thể ẩn nhập trong nguyên sinh chất Đặc biệt

trong thành tế bào của Nocardia chứa acid mycolic với 3 liên kết đôi và chuỗi mạch thẳng 40 – 60 carbon, meso-acid diaminopimelic (meso-A2pm), arabinogalactan - là hợp chất được tổng hợp từ arabinose và galactose (hình 1.3)

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Nocardia bắt màu nhuộm Gram [7]

Thành phần phospholipid đặc trưng của vi khuẩn là

phosphatidylethanolamine Nocardia chứa menaquinone, không chứa ubiquinone Loại menaquinone chiếm ưu thế trong các loài Nocardia là MK-8(H2) (menaquinone chứa một trong số tám đơn vị isoprene bị hydroxyl hóa) [5, 20]

1.1.2.3 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Nocardia

Nocardia thường là khuẩn lạc khô, chắc, xù xì, nhăn nheo hoặc nhẵn bóng, đa số có dạng vôi, dạng da hoặc dạng màng dẻo.Khuẩn lạc của Nocardia có màu sắc rất

đa dạng như đỏ, vàng, trắng tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh

Khuẩn lạc Nocardia có kích thước không đều nhau, có thể thay đổi tùy từng

loài và điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm) Đường kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 – 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn [5, 20]

Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào của Nocardia [55]

1.1.3 Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia

1.1.3.1 Nhuộm Acid-fast Ziehl-Neelsen

Vi khuẩn thuộc chi Nocardia có cấu tạo vách tế bào không bình thường, và có

Hình 1.3: Khuẩn lạc N asteroides (bên trái) N brasiliensis (bên phải)

trên môi trường thạch đường Sabouraud [53]

Hình 1.4: Khuẩn lạc của Nocardia steroides phân lập trên cùng một môi trường TSB và nhiệt độ nhưng đa dạng về kích thước, màu sắc, hình dạng

[53]

1.1.3.2 Nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phản ứng dùng để phân biệt vi khuẩn Gram dương (+), hoặc

Gram âm (-) Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi khuẩn Gram dương (+) nên khi

quan sát dưới kính hiển vi chúng sẽ bắt màu tím của thuốc nhuộm Gram

1.1.3.3 Phản ứng catalase

Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi sinh vật hiếu khí, có chứa chuỗi truyền

điện tử cytochrome, đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2

Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có tính độc cao này trong tế bào Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí

Trên đây là một số phản ứng hóa sinh chung của vi khuẩn thuộc chi Nocardia Ngoài ra, tùy từng loài Nocardia mà còn có phản ứng thủy phân khác nhau để phân

loại và định danh chúng, ví dụ như: Các phản ứng Casein, L-tyrosine và Xanthine

thủy phân để phân biệt chủng Nocardia (Bảng1.1)

Bảng 1.1: Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia [54]

Casein thủy phân

1.2 Tổng quan về cá chim vây vàng 1.2.1 Đặc điểm cá chim vây vàng 1.2.1.1 Vị trí phân loại:

Ngành: Vertebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Carangidae Giống: Trachinotus

Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801

Tên tiếng anh: Snub – nose pampano Tên tiếng Việt: Cá chim vây vàng

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cơ thể cá chim vây vàng hơi tròn, cao, dẹp chính giữa, lưng hình vòng cung Trên đường bên vảy sắp xếp khoảng 135 - 136 cái, chiều dài so với chiều cao 1,6 - 1,7 lần, so với chiều cao đầu 3,5 - 4 lần, cuống đuôi ngắn và dẹp, đầu nhỏ, chiều cao đầu lớn hơn chiều dài, môi tù về phía trước Hai lỗ mũi nằm gần nhau và ở môi trên: lỗ mũi trước nhỏ hình tròn, lỗ mũi sau to hình bầu dục Mép phía trước xương nắp mang có dạng hình cung tương đối lớn, mép sau cong Xương nắp mang phía sau trơn, màng nắp mang tách rời, mỗi tia mang có 8 – 9 tơ mang ngắn Đầu và thân có màu trắng bạc, đỉnh đầu có màu xanh xám Ở những cá thể trưởng thành thỉnh thoảng có màu vàng cam đặc biệt trên cơ thể nhất là vùng miệng và nửa sau của thân Phần đầu không có vảy, cơ thể có nhiều vảy nhỏ dính vào dưới da Phía trước đường bên có hình cung khá lớn, trên đường bên vảy không có gờ Vây lưng thứ 1 hướng về phía trước, gai bằng và có 5 – 6 gai ngắn Ở cá giống giữa

Kích thước: Cá chim vây vàng có kích thước tương đối lớn, chiều dài có thể

đạt tới 45 – 60 cm, chiều dài gấp 1,6 - 1,7 lần chiều cao

Màu sắc: Đầu thân và bụng có màu trắng bạc, đỉnh đầu, lưng màu xanh xám Ở

những con trưởng thành thỉnh thoảng có màu vàng cam đặc biệt trên cơ thể nhất là vùng miệng và nửa sau của thân Vây lưng màu ánh bạc Vây hậu môn và vây lưng thứ hai màu cam sẫm Vây ngực tương đối ngắn, rộng, màu tối đen Vây đuôi màu tro [3, 22, 31]

Ở Việt Nam, loài cá chim vây vàng được tìm thấy ở vùng biển Vịnh Bắc Bộ, vùng biển miền Trung và Nam Trung Bộ [8]

1.2.3.2 Đặc điểm sinh thái:

Cá chim vây vàng là loài cá nước ấm, có tập tính di cư, sống ở tầng giữa và tầng trê Ở giai đoạn cá giống, hàng năm sau mùa đông thường sống ở vùng vịnh cửa sông, sống theo đàn Cá trưởng thành bơi ra vùng biển sâu Là loài cá rộng muối với ngưỡng chịu đựng độ mặn trong khoảng 3 – 35 0

/00, dưới 20 0

/00 cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện độ mặn cao cá sinh trưởng chậm Khả năng chịu

đựng nhiệt độ tương đối kém, nhiệt độ thích hợp từ 16 - 360C, sinh trưởng tốt nhất ở 22 – 280C Thông thường hàng năm cuối tháng 12 đến đầu tháng 3 năm sau là chu kỳ nhiệt độ thấp, cá không ăn thức ăn Nhiệt độ dưới 160C cá chim thường ngừng bắt mồi , nhiệt độ thấp nhất mà cá có thể chịu đựng được là 140C Nếu 2 ngày liên tục nhiệt độ xuống dưới 14 0C cá sẽ chết Ngưỡng oxy hòa tan thấp mà cá chịu đựng được là 2,5 mg/l [1]

1.2.3.3 Những tiềm năng của việc nuôi cá chim vây vàng tại Việt Nam

- Cá chim vây vàng là loài cá dễ nuôi, có thể nuôi bằng nhiều hình thứ như nuôi bằng lồng hoặc trong ao đất ở các thủy vực nước lợ và nước mặn

- Cá chim vây vàng sống ở biển có tốc độ tăng trưởng nhanh; khả năng chống chịu với môi trường tốt (sau 10-12 tháng sẽ đạt cỡ thương phẩm 800 - 1.000g), đem lại giá trị kinh tế và rất được thị trường trong và ngoài nước ưa chuộng

- Nguồn giống sản xuất trong nước chiếm từ 50-60%, còn lại phải nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, cá chim vây vàng giống (cỡ 3-3,5 cm) có giá nhập khẩu rất cao (từ 4.000-5.000 đồng/con)

- Thị trường Việt Nam có cá chim trắng vây vàng cỡ 600 - 1.000 g/con, giá 100.000 - 150.000 đồng/kg; xuất khẩu sang Nhật, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore với giá 8 - 10 USD/kg

- Theo kết quả phân tích của Phòng Công nghệ sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu hải sản, trong 100g thịt cá chim vây vàng, thành phần dinh dưỡng có Protein 43%, Lipid 10%, đặc biệt, trong thịt cá rất giàu hàm lượng Omega 3, giúp phát triển trí não con người

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

1.3.1.1 Những loại bệnh ở cá có xuất hiện các đốm trắng trên nội tạng đã được

cao, có 100% hộ nuôi thì 65% hộ chịu tác hại của bệnh này trong năm 2009 [7] và trong một vụ nuôi, bệnh này có thể xảy ra 1- 3 lần [7, 8]

- Một số tác giả nghiên cứu tìm hiểu tác nhân gây ra bệnh này ở cá tra nuôi tại Việt Nam: thông báo rằng, bệnh mủ ở thận và gan của cá tra nuôi tại ĐBSCL

(Việt Nam) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gram âm gây ra [10]

- Tác giả đã phân lập, định danh các chủng vi khuẩn từ cá tra nuôi ở ĐBSCL bị bệnh đốm trắng ở gan thận và cảm nhiễm thành công, gây bệnh cho cá

khỏe từ sự kết hợp 2 loại vi khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides [9]

- Công bố về tác nhân gây bệnh đốm trắng ở gan thận của cá tra nuôi tại ĐBSCL là một trực khuẩn gram (+), kỵ khí, có sinh bào tử, bào tử thường nằm ở vị trí chính giữa, cuối hoặc gần cuối tế bào bị biến dạng Kết luận ban đầu cho rằng

đây là vi khuẩn này thuộc giống Clostridium sp [39]

- Xác định tác nhân gây bệnh cho cá chim vây vàng tại Vũng Ngán, Nha Trang là một vi khuẩn Gram dương dạng sợi mảnh, phân nhánh, phân đốt và kháng

acid, chúng thuộc loài Nocardia sp và tương tự loài Nocardia seriolae [1]

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng

Năm 2006, Trại Nuôi trồng thủy sản thực nghiệm của Trường Cao Đẳng Thủy sản Bắc Ninh tại Hưng Yên – Quảng Ninh đã nhập công nghệ sản xuất giống cá chim vây vàng từ Trung Quốc.Việc di nhập đàn cá bố mẹ và cho đẻ tại Hưng yên đã khá thành công: tỷ lệ cá đẻ trung bình giữa các đợt là 87,5%, tỷ lệ thụ tinh trung bình 60%, tỷ lệ nở trung bình 80%, tỷ lệ sống từ bột lên cá hương trung bình đạt 30% và đã sản xuất được 65 nghìn con giống cỡ 4 – 6 cm

Năm 2009, Khoa nuôi trồng Thủy sản thuộc Trường Đại Học Nha Trang bắt đầu thử nghiệm sản xuất giống nhân tạo loài cá chim vây vàng tại Nha Trang, Khánh Hòa Cá bố mẹ được nuôi vỗ tại các lồng đặt tại cơ sở thực nghiệm ở Vũng Ngán, trên vịnh Nha Trang Tại đây, cá bố mẹ thành thục và đẻ trứng, sau đó trứng được thu về ấp và ương cá giống trong các bể xi măng tại trại Sản xuất giống cá Biển, tại phường Vĩnh Hòa, Nha Trang

Đề tài sản xuất giống cá chim vây vàng của khoa nuôi trồng thủy sản đến nay vẫn chưa kết thúc nhưng đã có một số lượng con giống là sản phẩm của đề tài này được nuôi trong lồng tại trại thực nghiệm Vũng Ngán và cung cấp cho một số hộ nuôi ở vùng ven biển từ Phú Yên đến Ninh Thuận Loài cá này được các hộ dân

nuôi ở hai hình thức khác nhau: nuôi lồng ngoài biển và nuôi trong ao đất Và kết quả thu được từ các hộ nuôi thì cá có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, tỷ lệ sống tương đối cao Nhưng bên cạnh đó cũng gặp một số khó khăn trong việc nuôi loài cá này đó là vào tháng giao thời giữa mùa khô và mùa mưa (khoảng tháng 7 – 8 dương lịch) cá nuôi tại một số huyện trong tỉnh Khánh Hòa bị chết rải rác với tỷ lệ chết tích lũy lên đến 80% Những dấu hiệu cá bệnh như xuất hiện các nốt phồng nhỏ dưới da, sau đó các nốt phồng vỡ ra, trên cột sống cũng xuất hiện các khối u, đôi khi làm cơ thể cá công dị dạng Đây là một vấn đề quan trọng trong việc nuôi loài cá này và ở Việt Nam nghiên cứu về lĩnh vực này còn đang bỏ ngỏ

1.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới:

Nocardiosis ở cá

- Bệnh Nocardiosis ở cá do vi khuẩn Nocardia sp gây ra được Rucker mô tả lần đầu tiên năm 1949 và khi đó gọi là bệnh nhiễm trùng Streptomyces salmonicida ở cá hồi đỏ Sau này vi khuẩn này được xếp vào chi Nocardia và loài Nocardia salmonicida dựa trên sự có mặt của meso – diaminopimelic acid,

arabinore và galactose khi thủy phân vi khuẩn và sau này dựa trên kết quả phân tích

giải trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn Cho đến nay có 4 loài của Nocardia được mô tả N asteriodes; N seriolae (trước đây gọi là N kampachi; N Salmonicida và N crassostreae) đã được phân lập từ các loài cá bị bệnh [26, 11, 14, 50]

- Bệnh Nocardiosis là bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi khuẩn Nocardia

spp (vi khuẩn dạng sợi, phân nhánh, Gram dương (+) và kháng acid) gây với các triệu chứng điển hình như: các nốt tổn thương xuất hiện ở da, mang và một số cơ quan nội tạng (gan, lách, thận) xuất hiện các mụn áp xe màu trắng, cá bị bệnh chướng bụng to Một số nghiên cứu ở các nước lân cận Việt Nam cho thấy bệnh

Nocardiosis thường xuyên xuất hiện và gây thiệt hại cho một số loài cá nuôi ở khu

được công bố lần đầu tiên năm 1968 tại Nhật, sau đó bệnh nhanh chống lan truyền khắp vùng phía Tây của Nhật làm tỷ lệ chết ở các trang trại nuôi cá thu Nhật

(yellowtail) (Seriola quinqueradiata) và cá thu lớn (amberjack) (S dumerelli) tăng lên nhanh chóng và gây thiệt hại kinh tế lớn Tại Đài Loan và Trung Quốc N seriolae được thông báo là gây bệnh trên cả cá nước mặn cá đuôi vàng (yellowtail),

cá hổ phách (amberjack), cá đù vàng (large yellow croaker) và cá nước ngọt như cá lóc (snakehead), cá đuối (striped mullet) [11, 50, 51]

- Năm 1964 tại Nhật Bản, sau khi gây nhiễm thực nghiệm 1 – 3 tháng vi

khuẩn N asteroides vào cá hồi con thì thấy các tổn thương trên cá phát triển rõ rệt Tại Đài Loan, N asteroides gây bệnh cho cá lóc (snakehead) được mô tả lần đầu

tiên năm 1989 bởi Chen và cs., ở cá vược (largemouth bass) tên khoa học là

Micropterus salmoides được mô tả đầu tiên năm 1991 bởi Chen và Tung và ở cá vược biển (see bass) tên khoa học là Lateolabrax japonicus năm 2000 [51]

Hình 1.6: Cá hồng đỏ (Lutianus erythopterus) bị bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi

khuẩn Nocardia spp [29] 1.4 Các phương pháp định danh loài thuộc chi Nocardia

1.4.1 Định danh bằng test hóa sinh

Yêu cầu đầu tiên và quan trọng đối với test hóa sinh là thu được khuẩn lạc đơn, thuần khiết để việc định danh được chính xác hơn Việc định danh này được thực hiện dựa vào các đặc điểm kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật Các cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống [4]

1.4.2 Định danh bằng sinh học phân tử

Phân tử 16S rDNA ở prokaryote và 18S ở eukaryote là một công cụ hữu ích

trong phân loại và định danh vi sinh vật

Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử 16S rDNA còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp vì mục tiêu phân lọai nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 nucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết hợp cả quan sát hình thái,

nhuộm Gram, test hóa sinh và sinh học phân tử để định danh loài vi khuẩn Nocardia sp

1.5 Phương pháp PCR:

PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp có thể tăng lượng đoạn DNA đặc hiệu từ mẫu DNA vi lượng khoảng 200 - 500 nghìn lần sau 2 - 3 giờ xử lý Do đó, đây là phương pháp làm thuận lợi những kỹ thuật DNA tái tổ hợp cũng như được vận dụng trong giải trình DNA, chẩn đoán bệnh cảm nhiễm Phương pháp này thành công trên cơ sở phát kiến enzyme chịu nhiệt và sáng tạo máy luân nhiệt tự động hóa (programmed thermocycler) Lượng phản ứng có thể từ 5 - 100 µl Tùy loại máy luân nhiệt mà cần (thế hệ cũ) hoặc không cần sử dụng dầu khoáng chống bốc hơi của dịch phản ứng, các máy thế hệ mới có hệ thống cung cấp nhiệt ở nắp máy đậy trên các ống phản ứng nên không cần đến lớp dầu này

1.6 Giải trình tự các gene mã hóa cho tiểu phần 16S rDNA

Khi muốn nghiên cứu trình tự các nucleotide của một gene, một đoạn DNA, hoặc cả phân đoạn DNA cần phải tiến hành giải trình tự Một số phương pháp giải trình tự thường dùng hiện nay đó là:

Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977)

Các đoạn DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở đầu 5’, và được xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí base khác nhau Từ các đoạn DNA sau một loạt lần giải trình tự người ta có thể ghép nối để có trình tự

DNA một các ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích thước 20 nucleotide

Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung khoảng 1% các loại ddNTP (dideoxynucleotide) Cho mỗi phản ứng khác nhau Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở cacbor thứ 3 và carbon thứ 4 Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3’OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được kéo dài, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại

Chính do lượng ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA dừng lại Kết quả sẽ tổng hợp được đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau Dể xác định trình tự, người ta điện di kết quả thu được trên gel polyacylamide Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen

1.7 Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE)

Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt Kết quả phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis ) Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn

đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm Sự di động khác nhau của DNA chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường

Tiếp theo các mô tả của Schwartz va Cantor, Smith và Codemine (1990) đã đề cập đến sự di chuyển của các mảnh DNA khác nhau là hàm số tuyến tính với kích thước của chúng Trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trường Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khả năng di động của ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng như nồng độ ion trong đệm

Một số điểm cần lưu ý khi sử dụng kỹ thuật PFGE

+ Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật

+ Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn Điều đó có nghĩa là kỹ thuật này nên dùng để xác định sự khác nhau còn việc xác định sự giống nhau thì không đủ tin cậy Tuy nhiên ngay cả khi xác định sự khác nhau đôi khi các mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cũng cần xét đến vì chính nguồn DNA này cũng tạo ra những sai khác giả + Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện được khi dùng các enzym cắt hạn chế khác nhau

Từ các thành tựu nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục đích xác định chính xác loài vi khuẩn gây bệnh cho cá chim vây vàng với những nội dung dưới đây

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

- Đối tượng nghiên cứu: loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Trachinotusblochii (Lacepéde, 1801) được nuôi tại Khánh

Hòa và Phú Yên

- Thời gian nghiên cứu: 01/10/ 2014 – 15/06/2015 - Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn công nghệ sinh học - Phân viện thú y miền Trung – Nha Trang – Khánh Hòa

2.1.1 Hóa chất và vật liệu:

Hóa chất:  Các loại đường sử dụng để kiểm tra đặc tính hóa sinh của loài vi khuẩn

Nocardiasp : mannitol, glucose, galactose, arabinose, sucrose, maltose, mannose

 Các loại hóa chất dùng cho test hóa sinh: H2O2, paraffin, NaCl  Bộ kít tách chiết DNA: PROMEGA, QIAGEN

 Hóa chất điện di

- Dung dịch đệm Tris – borat/ EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0,5M

- Ethidium bromide 10mg/ml - Thang DNA

- Agarose tinh khiết  Hóa chất cho PCR

- Nước không chứa RNase, DNase do công ty Promega cung cấp - Cặp mồi N5F1 và N5R1 do công ty IDT (Integrated DNA Technologies tổng hợp) có trình tự như sau:

- Mồi xuôi N5F1: 5'-TGA GCC TGA ACT GCA TGG TTC-3' (21nu) - Mồi ngược N5R1: 5'-ACG GTA TCG CAG CCC TCT GTA-3' ( 21 nu) - Master Mix (1,5mM MgCl2, 0,16 mM dNTP, 1U Taq DNA polymerase, 2,5 µl RCR buffer minus 1X) được cung cấp bởi công ty Promega

2.1.2 Môi trường

 Môi trường Ogawa

- Dịch muối khoáng bao gồm: Kali đihydro sulphate (KH2PO4) 3%, Sodium glutamate 3%, NaCl 6%

- Dung dịch malachite green, 2% - Dịch trứng gà

- Dung dịch glycerol Pha môi trường:

Dung dịch muối khoáng bao gồm có: 3 g Kali đi hydro sulfate ( KH2PO4); 3 g Sodium glutamate, 6 g NaCl hòa tan trong 300 ml nước cất Dung dịch này được hấp tiệt trùng bằng autoclave, ở nhiệt độ 121oC, trong thời gian 30 phút

Dung dịch malachite green, 2%: Hòa tan 2g bột Malachite greeen với 100 ml nước cất đã tuyết trùng trong dụng cụ thủy tinh đã vô trùng và đặt vào trong tủ ấm 1- 2 giờ

Trứng: Dùng trứng gà không quá 7 ngày từ khi đẻ được làm sạch bên ngoài bằng xà phòng, Sau đó ngâm tiếp trong dung dịch xà phòng 30 phút, tiếp theo rửa nước và ngâm cồn ethanol 70% trong 15 phút Cầm quả trứng đã làm sạch trên tay và làm vỡ nó bằng một con dao vô trùng, rồi cho dịch trứng vào dụng cụ vô trùng sau đó trộn đều trứng bằng một dụng cụ khuấy trứng đã vô trùng

Trộn đều kỹ 300 ml dung dịch muối khoáng, 18 ml dung dịch malachite green 2%, 600 ml trứng gà và 18 ml glycerol Điều chỉnh pH của hỗn hợp này là 6,8 Sau đó phân phối môi trường từ 6 - 8 ml vào mỗi ống nghiệm đã tiệt trùng Để ống nghiệm nghiêng một góc 45º

và làm đông các ống môi trường này bằng cách đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 80 – 85ºC trong thời gian 45 phút Khi môi trường đã rắn lại sẽ có màu xanh lá chuối non

 Môi trường BHI (cho 1L môi trường)

- Nutrient substrate: 27,5 g - D (+) Glucose: 2,0 g - Sodium chlorire: 5,0 g

3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ khối mô tả các bước thực hiện khi nghiên cứu định danh vi khuẩn

sinh vi khuẩn Làm các tiêu bản phết từ: cơ, gan, thận, lách, mang

Nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen

Chọn khuẩn lạc đơn riêng lẻ, đặc trưng

Giải trình tự, phân tích trình tự

Điện di kiểm tra kết quả PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA

Tách chiết DNA

Định danh loài

2.3.1 Nghiên cứu dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng

2.3.1.1 Dịch tễ học mô tả

Chúng tôi sử dụng phương pháp điều tra cắt ngang kết hợp với nghiên cứu hồi cứu dựa trên bộ câu hỏi có sẵn để thu thập thông tin về kỹ thuật nuôi, tình hình dịch bênh và hiệu quả sử dụng thuốc để điều trị bệnh Nocardiosis trên cá chim vây vàng Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Epi Info phiên bản 3.4.3 Đối với các biến cố liên tục, sử dụng phân tích linear regresstion để phân tích nguy cơ xuất hiện bệnh Nocardiosis trên cá chim vây vàng Sau đó dùng hàm frequencies để tách các biến này thành các nhóm và vùng Phân tích logistic regression để phân tích nguy cơ gây bệnh Nocardiosis ở các nhóm này

2.3.1.2 Dịch tễ học phân tích

Để có dữ liệu cho phân tích các yếu tố nguy cơ của bệnh, phương pháp điều tra hồi cứu cũng đã được thực hiện để tìm hiểu tình trạng bệnh xảy ra trong những năm đã qua kèm theo các yếu tố có liên quan để phân tích, đo lường sự tiếp xúc với tình trạng bệnh tật

Các yếu tố nguy cơ của bệnh được phân tích dựa vào 2 chỉ số: chỉ số nguy cơ tương đối (Relative Rick - RR) và chỉ số chênh (Odd Ratio - OR):

Nguy cơ bệnh ở nhóm tiếp xúc a/(a + b) RR = =

Nguy cơ bệnh ở nhóm không tiếp xúc c/(c + d)

Số cá tiếp xúc ở nhóm bệnh

Bảng 2.1: Trình bày số liệu trong nghiên cứu hồi cứu

BỆNH

TIẾP XÚC NGUY CƠ

2.3.4 Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn

Với loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia thường được sử dụng phương pháp bảo

quản lạnh sâu ở -80ºC Với phương pháp này tế bào vi khuẩn có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước đá trong tế bào, vì thế để khắc phục nhược điểm này người ta thường bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoside), trong đề tài này chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào dịch trước khi đem đi bảo quản