3.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng
3.1.2. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng tại Khánh Hòa, Phú Yên
Chúng tôi tiến hành thu mẫu tại các địa điểm nuôi cá chim vây vàng ở Khánh Hòa, Phú Yên 3/3/2014 đến 21/10/2014. Đối tƣợng thu mẫu là những cá chim vây vàng có dấu hiệu nhiễm bệnh đốm trắng: gốc vây lở loét, có các nốt phồng rộp nhỏ ở da, khi vỡ tạo nên các vết loét nhỏ màu xám, có các khối u dọc cột sống làm cơ thể cá cong vẹo, dị dạng, bụng cá hơi phình và cứng. Cá có một số biểu hiện bất thường về tập tính sống như: bỏ ăn, bơi tách khỏi đàn, thường bơi lờ đờ, bơi không định hướng, bơi xoắn nhiều vòng trên mặt nước [6]. Sau đó các mẫu cá được tiến hành phân tích tại
phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học - Phân viện Thú y Miền trung, Nha Trang, Khánh Hòa.
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp mẫu cá bị bệnh thu đƣợc sau thu mẫu
Địa điểm Số lƣợng mẫu
Khánh Hòa 147
Phú Yên 86
Trong tổng số 233 con cá chim vây vàng thu đƣợc qua lấy mẫu (bảng 3.2) có 233 con cá bộc lộ dấu hiệu bệnh lý rõ ràng đó là:
Dấu hiệu bên ngoài của bệnh nhƣ: Da cá mất màu sáng bạc do mất nhớt, có nhiều nốt phồng rộp nhỏ từ phía dưới của da nhô lên, khi các nốt phồng này vỡ ra tạo nên các thương tổn nhỏ màu nâu (hình 3.1). Các vây bụng, vây ngực, vây lưng có hiện tƣợng xơ mòn (hình 3.2). Một số con cá bệnh xuất hiện các khối u nằm dọc cột sống (hình 3.3), khi khối u này lớn lên gây chèn ép làm cơ thể cá mất đi hình dạng bình thường, cơthểbị cong gập dị dạng. Mang cá tiết nhiều dịch nhày, tồn tại các vùng tổn thương do hoại tử và các đốm trắng nhỏ (kích thước đốm trắng 1 – 2 mm).
Giải phẫu bên trong ổ bụng của cá bệnh: Quan sát thấy nhiều đốm trắng nhỏ (đường kính 1 – 2 mm) xuất hiện nhiều ở gan, lách và thận. Ở một số con, các đốm trắng dạng u hạt còn tìm thấy bám trên bề mặt của bóng hơi, ở màng treo ruột hay ở xoang bụng. Đa phần những con cá bị bệnh có đầu thận bị sƣng to gấp 2 - 3 lần so với cá khỏe và gan có hiện tƣợng có hiện tƣợng xung huyết (hình 3.5).
Những kết quả trên cho thấy cá chim vây vàng nuôi tại Khánh Hòa và Phú Yên bị nhiễm Norcadiosis với dấu hiệu, triệu trứng bên ngoài cũng như bên trong tương đương với kết quả nghiên cứu trước đây [6].
Hình 3.2: Cá chim vây vàng bị xơ mòn gốc vây lưng Hình 3.1: Cá bị bệnh xuất hiện các nốt phồng rộp dưới da, sau một thời gian nốt phồng vỡ ra tạo ra các thương tổn
nhỏ mẫu nâu xám
Hình 3.3: Các dấu hiệu gặp ở nội tạng cá vây vàng bị bệnh
a. Xuất hiện đốm trắng ở lách của cá bệnh b. Xuất hiện đốm trắng ở gan cá bệnh c. Xuất hiện đốm trắng ở thận cá bệnh d. Xuất hiện ổ vi khuẩn màu trắng ở bụng cá bệnh
a b
d c
Bảng 3.3: Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng trong nội tạng ở cá chim vây vàng đã quan sát được bằng mắt thường (n = 233 con cá bệnh)
STT Các dấu hiệu chính của bệnh
Tần số
gặp (%)
1 Các dấu hiệu
quan sát từ bên ngoài
Xuất hiện các nốt phồng nhỏ trên da, các nốt phồng bị vỡ ra tạo vết thương tổn
nhỏ, gốc vây lở loét
186 80%
Mang bị hoại tử và tiết nhiều dịch nhầy Xuất hiện các đốm trắng
đục nhỏ trên mang
116 50%
Xuất hiện khối u dưới da, dọc theo cột sống, cơ thể có
khối u lớn nên bị uốn cong,
dị dạng.
70 30%
2 Các dấu hiệu quan sát trong
ổ bụng
Đốm trắng xuất hiện ở thận, đầu thận rất to gấp 2-3 lần
so với cá khỏe 146 62,5%
Lách sƣng, viêm và xuất
hiện nhiều đốm trắng 128 55%
Đốm trắng xuất hiện ở gan Gan cá có hiện tƣợng xung
huyết
140 60%
Đốm trắng xuất hiện ở mạng treo ruột và bóng hơi 12 5%
Kết quả bảng 3.3 cho thấy tần suất gặp giữa các triệu chứng bên ngoài thì gốc vây lở loét, phồng dột trên da bắt gặp với tần suất cao ở cá bệnh, dấu hiệu u lớn dọc cột sống và làm cơ thể biến dạng thường ít gặp nhưng dấu hiệu này cùng với dấu hiệu xuất hiện đốm trắng ở gan, thận, lách cá bệnh lại là dấu hiệu điển hình và đặc trƣng
của bệnh. Kết quả này cho thấy cá chim vây vàng khi bị nhiễm Norcadiosis sẽ gây biểu hiện bệnh trên toàn cơ thể. Vi khuẩn xâm nhiễm và phá hủy hầu hết tất cả cơ quan bên ngoài, nội tạng của cá [7]. Đồng thời việc nghiên cứu về biểu hiện bệnh vi khuẩn
Nocardia trên cá chim vây vàng cũng cho thấy rằng bệnh này rất nguy hiểm, tỷ lệ chết
cao. Vì vậy các nghiên cứu về Norcadia gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng là hết sức cần thiết.
3.1.3. Phân bố bệnh theo mùa vụ và theo lứa tuổi
Theo điều tra bằng phiếu điều tra được phát cho người nuôi thì chúng tôi thấy bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng thường xuất hiện vào mùa mưa, từ tháng 9-12, vào mùa nắng khả năng mắc bệnh đốm trắng của cá chim vây vàng nuôi ở Khánh Hòa, Phú
Yên chỉ bằng 0,2 lần so với mùa mƣa [1].
Nguy cơ mắc bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng ở các kích cỡ khác nhau là khác nhau. Bệnh thường xuất hiện ở cỡ cá từ 50 – 350g. Ở cỡ cá nhỏ hơn 50g/con, nguy cơ mắc bệnh đốm trắng giảm thấp hơn 20 lần và còn giảm nhiều hơn nữa ở giai đoạn cá lớn hơn 350g/con [1].
3.1.4. Phân bố bệnh theo hình thức nuôi
Kết quả thu thập số liệu trực tiếp 300 hộ nuôi cá chim ở 3 tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên cho thấy có sự liên quan (P = 0,05) giữa hình thức nuôi với khả năng xuất hiện bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng [1].
Bảng 3.3: Phân bố nguy cơ mắc bệnh đốm trắng theo hình thức nuôi
Chỉ tiêu Hệ số
Sai số chuẩn F-test
Mức ý nghĩa Hình thức nuôi -0.001 0 3.9606 0.039234 Nguy cơ xuất hiện bệnh đốm trắng của cá chim vây vàng nuôi ở đìa chỉ bằng 0,2 lần (P = 0.039) so với những hộ nuôi cá ở lồng bè.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu: Chúng tôi quan sát được một loại vi khuẩn dạng sợi mảnh, phõn nhỏnh, cú đốt, dài từ 2 đến 20àm, Gram (+) trên hầu hết các tiêu bản phết làm từ mô nội tạng của cá bị bệnh.
Nhuộm tiêu bản phết bằng phương pháp của Ziehl - Neelsen:Các vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, mô của cá bắt màu xanh của thuốc nhuộm methylen blue. Do vậy, có thể nhận định rằng, loài vi khuẩn phát hiện trong mô nội tạng của cá bệnh là loại vi khuẩn kháng acid (acid fast bacteria). Các tiêu bản phết mô từ cá chim vây vàng khỏe mạnh đã không phát hiện đƣợc loại vi khuẩn nhƣ đã trình bày ở (hình 3.5). Các kết quả đọc trên các tiêu bản phết mô nội tạng cá bệnh cho phép ta nhận định rằng: cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng đã bị nhiễm hệ thống một loại vi khuẩn dạng sợi mảnh, phõn nhỏnh, kớch thước từ 2 đến vài chục àm, Gram dương (+) và là vi khuẩn kháng acid.
Mặt khác vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu và bước đầu khẳng định thuộc chi Norcadia [6]. Vi khuẩn Nocardia
cũng có kích thước và hình dạng giống với kết quả mà chúng tôi quan sát được. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác loài vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng đã thu mẫu chúng tôi đã tiến hành phân lập và định danh tác nhân gây bệnh.
Hình 3.5: Các tiêu bản phết mô của cá bệnh nhuộm Gram (a,b,c,d)
Nhuộm Ziehl-Neelsen (400X) (e, f, g, h)
chức mô, cơ quan (gan, mang, cơ, lách, thận, u xương) của cá bệnh. Vi khuẩn
Norcadia gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng không phân lập đƣợc trên các
môi trường TSA, NA, TCBS mà chỉ phân lập được trên môi trường Ogawa. Do đó, trong nghiên cứu này chỉ tiến hành phân lập vi khuẩn gây bệnh trên môi trường Ogawa (đã đƣợc mô tả trong phần 2.3.4). Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 26 - 28ºC, trên môi trường Ogawa xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng kem, khô và nhăn nheo, khuẩn lạc lớn nhất có đường kính khoảng 0,2 cm (Hình 3.6). Chúng tôi chọn ống phân lập được vi khuẩn mà không bị tạp nhiễm (theo quan sát bằng mắt thường) rồi đặt tên cho chủng theo nguồn gốc nơi lấy mẫu và cơ quan phân lập đƣợc chúng [6]. Kết quả phân lập đƣợc tổng kết trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả phân lập vi khuẩn Nocardia sp. tự mẫu cá chim vây vàng bệnh
Cơ quan phân lập
Số lƣợng cá phân tích
Số chủng vi khuẩn phân lập trên môi
trường Ogawa
Tỷ lệ (%)
Mang 233 41 17,60
Cơ 233 44 18,88
Lách 233 39 16,74
Gan 233 44 18,88
Thận 233 51 21,88
U xương 233 233 100,00
Từ bảng 3.4, mặc dù các cá bệnh khi thu mẫu để phân tích đã đƣợc chọn lọc kỹ khi thu mẫu để phân tích nhưng tỷ lệ phân lập được Nocardia sp. trên môi trường phân lập đặc trưng (môi trường Ogawa) vẫn rất thấp (dưới 30%) do tính chất đặc thù của vi khuẩn phân lập từ động vật máu lạnh. Kết quả của chúng tôi tương đương với kết quả của [2], nhóm tác giả này khi phân lập 47 mẫu các chim vây vàng có biểu hiện bệnh tính nhƣng chỉ phân lập đƣợc 25 chủng từ 12 mẫu cá bệnh.
Từ các khuẩn lạc đơn phân lập được trên môi trường Ogawa, khuẩn lạc được cấy tăng sinh trên môi trường lỏng BHI có bổ sung huyết thanh bê (2%). Sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 26ºC khuẩn lạc mọc và kết tủa trắng bông trong môi trường (hình 3.7). Chọn 69 chủng nuôi tăng sinh thì trong đó có 13 chủng bị tạp nhiễm đƣợc chúng tôi loại bỏ, còn lại 56 chủng.
Hình 3.6: Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch Ogawa
Dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 - 1000 lần, kết quả thu được 100%
chủng vi khuẩn phân lập được có dạng sợi, phân nhánh, gram dương (+) và kháng acid. Khi so sánh về đặc điểm hình thái và các đặc điểm khác, và nhận thấy loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng kem, khô và nhăn nheo trên chính là loại vi khuẩn đã tìm thấy trong các tiêu bản phết từ mô nội tạng của cá bệnh (hình 3.8) và tương đương với các kết quả khác [7].
Hình 3. 8: Các tế bào vi khuẩn dạng sợi, gram (+), kháng acid lấy từ khuẩn lạc mọc
trên Ogawa
3.3.2. Định danh dựa trên sinh học phân tử
Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA của loài vi khuẩn Nocardia sp.
đã đƣợc thực hiện nhờ cặp mồi và chu trình nhiệt đã trình bày ở phần 2.3.6.2. Cặp mồi đƣợc thiết kế theo tác giả Labrie và cs ( 2008). Kết quả PCR sau đó đƣợc điện di.
Kết quả điện di (hình 3.8) cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn gen của loài vi khuẩn phân lập được từ cá chim vây vàng tại Khánh Hòa có kích thước trong khoảng 1000 bp – 1100 bp là 1069bp [29].
DNA tổng số của 56 chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng phân lập đƣợc dùng để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi N5F1 và N5R1. 4 mẫu vi khuẩn này đƣợc phân lập từ 2 tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên.
Kết quả 100% các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc đều nhân lên đoạn gen có kích thước 1069bp (hình 3.9) [29].
Kết quả trình tự 16S được sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự 16S rDNA của loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Từ 56 chủng vi khuẩn này chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên ra 6 trình tự chủng vi khuẩn đại diện cho vi khuẩn phân lập đƣợc từ 2 tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, để phân
Hình 3. 9: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen 16S
rDNA của Nocardiasp
(Giếng1: thang DNA chuẩn; giếng 2: Sản phẩm PCR chủng NHU1;
giếng 3: sản Phẩm PCR của chủng CRU1, giếng 4: sản phẩm của chủng NTU1, giếng 5: sản phẩm của chủng NTM1, giếng 6: đối chứng âm).
Bảng 3.5: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn đem đi phân tích trình tự 16S rDNA
TT Ký hiệu
chủng
Ký hiệu
cá
Cơ quan phân lập
Kích thước cá
(cm)
Năm Địa phương
phân lập
1 KH03 1 Thận 28 2014
Khánh Hòa
2 KH08 5 Mang 27 2014
3 KH12 8 Cơ 27 2014
4 PY15 10 U xương 20 2014
Phú Yên
5 PY21 13 Gan 21 2014
6 PY32 15 Cơ 22 2014
Kết quả giải trình tự gen của 6 chủng vi khuẩn đƣợc trình bày ở hình 3.10. Kết quả này được sử dụng chương trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự 16S rDNA của loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information). Và cả 6 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có trình tự 16S rDNA tương đồng 100% với trình tự 16S rDNA của Nocardia seriola (bảng 3.5)
KH03 KH08 KH12 PY15 PY21 PY32 NT40 NT47 NT53
Kết quả so sánh mức tương đồng nucleotide của 6 chủng N.seriolae phân lập đƣợc
6 chủng N.seriolae được so sánh mức tương đồng nucleotide bằng phương pháp Pairwise aligment/Calculate identity/Similarity for two sequences (BioEdit). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Mức tương đồng (%) nucleotid 16S rDNA của 6 chủng N. seriolae
KH03 KH08 KH12 PY15 PY21 PY32
KH03 99,8 100 100 100 100
KH08 99,8 99,8 99,8 99,8
KH12 100 100 100
PY15 100 100
PY21 100
PY32
Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S rDNA của 6 chủng N. seriolae ở hình 3.10 và tỷ lệ tương đồng nucleotide ở bảng 3.6 cho thấy:
- Trình tự nucleotide 16S rRNA giữa các chủng N. seriolae phân lập tại Việt Nam có mức tương đồng cao chỉ sai khác từ 0 đến 5 nucleotide trong đoạn gen 947 bp đƣợc phân tích (hình 3.10).
- Tỷ lệ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn cao từ 99,5% đến 100% chứng tỏ gen này có độ bảo tồn và tương đồng rất cao giữa các chủng N. seriolae ở các vùng địa lý khác nhau trong khu vực Nam Trung bộ, Việt Nam.
So sánh mức tương đồng nucleotide với các chủng trên thế giới và xác định vị trí phân loại của các chủng phân lập đƣợc
Để xác định quan hệ họ hàng của các chủng phân lập tại Việt Nam với các chủng N. seriolae trên thế giới, chúng tôi sử dụng chương trình BLAST để tìm trong Ngân hàng gen quốc tế các trình tự có mức tương đồng nucleotide cao nhất với trình tự đã giải mã. Kết quả BLAST cho hàng chục gen có trình tự tương đồng 100%
với mỗi chủng phân lập. Trong bài báo này, chúng tôi chỉ trích dẫn một trong số những chủng có trình tự tương đồng cao nhất với đọan 16S rDNA của 6 chủng đại diện.
Bảng 3.7: Các chủng Nocardia có trình tự 16S rDNA gần nhất
TT Chủng Chủng tương đồng Tỷ lệ tương đồng Mã số trên
genebank
1 KH03 Nocardia seriolae strain NH-1 100% JF834066.1
2 KH08 Nocardia seriolae strain ATCC 43993 100% NR_117346.1
3 KH12 Nocardia seriolae strain NH-1 100% JF834066.1
4 PY15 Nocardia seriolae strain NH-1 100% JF834066.1
5 PY21 Nocardia seriolae strain NH-1 100% JF834066.1
6 PY32 Nocardia seriolae strain NH-1 100% JF834066.1
Từ kết quả xây dựng cây phả hệ của chủng Nocardia phân lập đƣợc ở các tỉnh Nam Trung Bộ, Việt Nam (hình 3.11), chúng tôi thấy rằng chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng tại Việt Nam thuộc giống Nocardia, loài Nocardia
seriolae [29]. Theo nhƣ kết quả xây dựng cây phân loài, các chủng Nocardia phân lập
tại Việt Nam này có quan hệ gần với các chủng cũng gây bệnh trên cá nhƣ N.
salmonicida [17], N. asteroides [25], Nocardia crassostreae [14].
3.3.3. Xác định nguồn gốc di truyền của các chủng phân lập đƣợc bằng điện di xung điện trường
Trong nghiên cứu này, chúng tôi so sánh quan hệ di truyền của 20 chủng vi khuẩn Nocardia seriolae phân lập từ cá chim vây vàng bị bệnh Nocadiosis nuôi tại
Khánh Hòa, Phú Yên. Thí nghiêm được tiến hành tại trường Đại học khoa học và công nghệ Bình Đông, Đài Loan và kết quả phân cắt DNA bằng enzyme giới hạn XbaI và AseI tạo thành 17 băng với kích thước 40 – 800 kb (đối với enzyme XbaI) và 19 băng
với kích thước 40 – 1100 (với AseI) Hình 3.12 và bảng 3.14 và 3.15. Đối với enzyme
XbaI sau khi phân cắt 20 chủng đƣợc phân loại thành 1 pulsotype X1. Nhƣ vậy theo
tiêu chuẩn của Tenover thì 20 chủng không có sự khác biệt và có thể là từ một chủng.
Tuy nhiên, khi phân cắt bằng enzyme giới hạn AseI 20 chủng đƣợc phân thành hai
pulsotype (khác nhau một băng) A1-A2. Nhƣ vậy, xét về quan hệ di truyền có thể 20 chủng phân lập từ hai tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên có chung một nguồn gốc. Theo chúng tôi, có thể các chủng vi khuẩn này nhiễm từ nơi sản xuất cá giống, và khi cá giống mang khuẩn được bán cho các lồng nuôi ở các địa phương khác nhau thì đây là nguồn lây nhiễm cho các địa phương đó. Kết quả của chúng tôi khác so với kết quả của Shimaha và cs. (2009). Nhóm tác giả này cũng sử dụng enzyme Xbal và AseI để phân cắt 92 chủng N. seriolae phân lập từ nhiều loài cá khác nhau tại Đài Loan, kết quả
phân cắt tạo ra 12 pulsotype (đối với XbaI) và 9 pulsotype (đối với AseI) trong đó
nhóm X1 và A1 chiếm tỷ lệ trên 79% và hai nhóm này từ các chủng phân lập đƣợc từ hầu hết các loại cá. Trong khi đó 10 chủng phân lập từ Nhật tạo ta 10 pulsotype (đối với XbaI) và 9 pulsotype (đối với AseI). Sự khác nhau giữa kết quả của chúng tôi với
nhóm tác giả Shimaha có thể là do các chủng vi khuẩn N. seriolae phân lập từ nhiều
loài cá khác nhau, từ nhiều nơi khác nhau, và thời gian phân lập khác nhau nên các chủng này có thể xuất hiện một số biến cố độc lập của gen.