CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của các tổ chức cá bệnh
Cố định mẫu dùng cho nghiên cứu mô bệnh học
Các tổ chức cơ quan nhƣ mang, não, gan, thận, lách, tổ chức cơ ở các vết lở loét và khối u xương của cá bệnh và cá khỏe được cắt ra các miếng nhỏ khoảng 1cm3 và cố định trong dung dịch Bouin (gồm: 750 ml acid picric bão hòa + 250ml Formalin đậm đặc + 50 ml acid acetic) hoặc cố định trong dung dịch Phosphate Buffer Formalin (gồm 100 ml formalin + 900ml nước cất + NaH2PO4.H2O + Na2HPO4) với tỷ lệ giữa mẫu và dung dịch cố định là 1/10, trong thời gian tối thiểu là 24 giờ. Sau đó có thể chuyển mẫu giữ trong cồn ethanol 70%, ở nhiệt độ phòng.
Xử lý và đúc mẫu
Các mẫu sau khi lấy ra khỏi dung dịch cố định được làm mất nước bằng ngâm mẫu lần lƣợt vào các dung dịch cồn ethanol với nồng độ tăng dần (50%, 70%, 95% và 100%), mỗi thang cồn giữ khoảng 30 – 60 phút. Sau đó mẫu đƣợc làm trong bằng cách ngâm trong xylen 2 – 4 giờ hoặc ngâm trong methyl salicilate với thời gian 12 – 24
paraphin bằng cách nhúng trong xylen 2 lần, 5 phút cho mỗi lần. Sau đó mẫu đƣợc làm no nước bằng cách nhúng trong cồn ethanol với các nồng độ giảm dần (100%, 90%, 70% và 50%), mỗi mức cồn giữa trong 2 – 3 phút. Sau khi đã no nước, các lam mẫu được nhúng với nước vòi 3 – 6 lần rồi nhuộm với Hematoxylin trong thời gian 4 – 6 phút, sau đó lấy mẫu ra rửa với nước vòi trong thời gian 4 – 6 phút trước khi nhuộm lần 2 với Eosine trong 2 phút. Tiếp tục làm mất nước của mẫu bằng cách nhúng 10 lần các lam mẫu trong dung dịch cồn với nồng độ tăng dần (50%, 70%, 90%, 95% và 100%). Cuối cùng làm trong bằng cách nhúng các lam mẫu trong xylen 2 lần, 2 – 3 phút cho 1 lần. Để lam mẫu khô tự nhiên trong không khí, đậy bằng lamel với keo dán Bomcanada. Các tiêu bản mô bệnh học được quan sát dưới kính hiển vi quang học và xác định những biến đổi trong tổ chức dựa vào sự so sánh với mẫu làm từ cá khỏe.
Phương pháp nhuộm của Ziehl - Neelsen:
Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen đã được sử dụng để nhận biết loại vi khuẩn kháng acid (acid fast) có mặt trong tổ chức mô của cá bệnh. Các bước tiến hành nhƣ sau:
Trước tiên tiến hành sát trùng bề mặt cá nghiên cứu bằng miếng bông thấm cồn etanol 70%, dùng kéo vô trùng giải phẫu cá để quan sát các nội tạng nhƣ gan, lách, và thận ở bên trong ổ bụng. Dùng kéo và panh vô trùng để cắt và kẹp một miếng nhỏ mô từ các tổ chức có bộc lộ bệnh lý, phết mô cắt này trên mặt của phiến kính sạch (đã được ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trước khi dùng), trong một giọt nước muối sinh lý vô trùng (0,85%) để tạo một vết bôi và để khô trong không khí.
Mẫu cá bệnh và cá khỏe đƣợc giải phẫu
Gắn tiêu bản bằng
bomcanada Đọc tiêu bản trên kính hiển
vi quang học. So sánh biến đổi mô học của cá bệnh và cá khỏe
Cố định mẫu trong dung dịch Bouin 24h và giữ mẫu trong cồn 70%
Xử lý mẫu và thấm paraphin
Đúc mẫu
Cắt mẫu bằng microton (5-6à) Nhuộm bằng
Hematoxyline và Eosin hoặc Ziehl-Neelsen
Hình 2.2: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học ở cá xương
Cố định tiêu bản này bằng cách đƣa phiến kính có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ Carbol fuchsine tràn trên mặt vết bôi và hơ nóng phiến kính này trên ngọn lửa nhỏ để bốc hơi trong 10 phút, tuy nhiên không nên để khô vết bôi, do vậy Carbor fuchsine đã đƣợc bổ sung. Tiếp theo đƣa phiến kính rửa nhẹ nhàng với nước sạch trước khi làm mất màu bằng acid acetic 0,5 % trong 20 - 30 giây. Tiếp theo nhuộm tiêu bản phết bằng Methylene blue trong 60 giây, sau đó rửa nhẹ bằng nước cất và để khô rồi quan sát ở kính hiển vi dưới vật kính dầu (100 x) để phát hiện phần cơ chất của các tổ chức vật chủ bắt màu xanh của methylene blue các khuẩn lạc hay các tế bào của vi khuẩn kháng acid bắt màu hồng tím của Fuchsine.
Phương pháp nhuộm Gram Phương pháp này nhằm nhận dạng ra các tế bào hay khuẩn lạc vi khuẩn trong mô của vật chủ và xếp vi khuẩn đó vào 1 trong 2 nhóm: Gram dương (+) hoặc Gram
âm (-).
Các thao tác đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Cắt một miếng mô nhỏ từ các tổ chức của cá bệnh có bộc lộ bệnh lý, dùng kẹp phết mô này lên mặt của tấm lam sạch (đã đƣợc ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trước khi dùng) trong một giọt nước muối sinh lý vô trùng (0,85%), để tạo một vết bôi và để khô trong không khí. Cố định tiêu bản này bằng cách đƣa lamel có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ tràn thuốc nhuộm tím crystal ( bao gồm: 2 g tím crystal hòa tan trong 20 ml cồn etylic, sau đó trộn lẫn với 80 ml dung dịch ammonium oxalate 1% trong nước cất) lên bề mặt của vết mô phết và để yên trong 30 - 60 giây. Sau đó rửa nhẹ bằng nước vòi, vẩy khô. Nhỏ tràn dung dịch lugol lên bề mặt của vết mô phết trong 1 phút sau đó rửa nhẹ và vẩy khô nước. Tiếp tục làm mất màu tím bằng cồn-aceton rồi rửa nhẹ và vẩy khô. Sau đó nhỏ tràn thuốc nhuộm Fuchsine trên vết mô phết trong 1 - 2 phút. Cuối cùng rửa nước chảy nhẹ, để khô tự
tốc độ 200 vòng / phút trong 14 ngày. Sau đó thu sinh khối và tách chiết DNA tổng số vi khuẩn bằng bộ kít PROMEGA. DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ kiểm tra bằng
cách điện di trong đệm TBE 0.5 X dưới nguồn điện 134 V để đọc kết quả, DNA được tách chiết thành công sẽ đƣợc bảo quản - 20ºC để sử dụng cho các phản ứng PCR sau đó.
2.3.6.2. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của Nocardia sp.
Vi khuẩn Nocardia sp. được nuôi cấy trên môi trường BHI (có bổ sung 2% huyết
thanh bê – FBS) sau đó đƣợc tách chiết DNA bằng bộ kit PROMEGA.
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR này là N5F1 và N5R1 dùng để khuếch đại đoạn gen đặc trƣng cho loài vi khuẩn Nocardia dài 1069 bp. Trình tự của 2 mồi
nhƣ sau:
Mồi xuôi N5F1: 5' -TGA GCC TGA ACT GCA TGG TTC-3'. (21nu) Mồi ngƣợc N5R1: 5'-ACG GTA TCG CAG CCC TCT GTA-3'. (21 nu)
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch (àl).
Master Mix 12,5
Mồi N5F1 1
Mồi N5R1 1
H2O 9,5
DNA 1
Tổng thể tích cho một mẫu phản ứng PCR: 25
Chu trình nhiệt:
Giai đoạn 1: 95ºC trong 2 phút
Giai đoạn 2: 95ºC trong 30 giây 58ºC trong 1 phút
72ºC trong 1 phút
Giai đoạn 3: 72ºC trong 5 phút
Giai đoạn 4: giữ ở 4ºC Sản phẩm PCR đƣợc tách chiết từ gel với bộ kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Đức).
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự tại Macrogen Inc., Hàn quốc. Kết quả trình tự 16S được sử dụng chương trình BLAST (Basic
Lặp lại 30 chu kỳ
Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự 16S rDNA của loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information). Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo chương trình MEGA 6 (Molecular Evolutionary Gentics Analysis, version 6.0)
2.3.6.3. Kỹ thuật điện di gel Agarose
Nguyên tắc chung:
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử tích điện âm khác nhau về kích thước, điện tích, mức cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di dưới tác dụng của điện trường. Các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn và ngƣợc lại vì vậy có thể phân tách đƣợc từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ.
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được phát hiện dưới tia tử ngoại UV nhờ ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của ti tử ngoại ( λ = 300 nm) sẽ phát huỳnh quang và quan sát thấy các vạch đỏ màu cam. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.
Các bước tiến hành:
- Cân 0,4 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X ( gel agarose 1 %) vào trong bình schottduran 250 ml, rồi cho vào lò vi sóng đun đến lúc gel tan hoàn toàn.
- Sau đú để nguội khoảng 500C – 600C, thờm 1,6 àl ethidium bromide vào gel, lắc đều, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lƣợc.
- Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lƣợc ra.
- Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5 X cho đến khi ngập bản gel.