Đóng góp mới của đề tài Để tài đã lựa chọn được hai phương pháp tách chiết ADN của ký sinh trùng sốt rét KSTSR từ muỗi sốt rét đồng thời ứng dụng thành công các kỹ thu: al ELISA, PCR để
Trang 1BỘ Y TẾ
Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ưưng
BÁO CÁO KẾT QUÁ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP BỘ
ỨNG ĐỤNG MỘT SỐ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN
VÀ KỸ THUẬT ELISA, PCR ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ
'TRUYỂN BỆNH CỦA MUỖI AN.MINIMUS VÀ AN.DIRUS
Ở KHÁNH PHÚ, KHÁNH VĨNH, KHÁNH HOÀ
Chủ nhiệm đề t PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh Cơ quan chủ trì để tài: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng -
Côn trùng Trung ương,
Mã số để tài:
Hà nội - 2005
cnt
Trang 2BỘ Y TẾ
Vién Sot rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương
BẢO CÁO KẾT QUÁ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP BỘ
UNG DUNG MỘT SỐ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT AÐN
VÀ KỸ THUẬT ELISA, PCR ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ
TRUYỀN ENH COA MUỖI AN.MENIMUS VA AN.DIRUS
GO KHANH PHU, KHANH VINH, KHANH HOA
Chủ nhiệm để tài: PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh
Cơ quan chủ trì để tài: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng -
Côn trùng Trung ương
Cấp quản lý để tài: — Bộ Y tế
Mã số để tài:
Thời gian thực hiện: từ tháng 6 năm 2002 đến tháng 12 nám 2005 Tổng kinh phí thực hiện đẻ tài: 189.060.000 đồng
Trong đó kinh phí NSKH:
Trang 3
BẢO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CÚU CỦA ĐỂ
TÀI CẤP BỘ
TÊN ĐỂ TÀI: Ứng dụng một số quy trình tách chiết AIDN và kỹ thuật #1.ESA,
PCR đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi Av.minimus va An.dirus ử Khánh
Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
1 Chủ nhiệm để tài:
2 Cơ quan chủ trì đề tài:
3, Cơ quan quản lý dé tài: PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh Viện Sốt rét - Ký xinh trùng - Côn trùng Trung ương Bộ Y tế 4 Danh sách những người thực hiện chính: PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh Viện Sốt rết- KỸ The Nguyễn Thị Hương Bình — Viện Sốtrét- KS Ths Lê Đức Đào
€CN Nguyễn Văn Tuấn
TS Nguyễn Tuyên Quang CN Nguyễn Sơn Hải
TS Trần Đức Hinh TS Hồ Đình Trung
TS Lé Xuan Hợi
Trang 4ADN An B8 CPS cs dNTPs ELISA KST KSTSR Mab Mab- per E Bf Pw Pam PBS PCR Vien Sot rét- KST- CTTU WHO CÁC CHỮ VIẾT TẮT Axit đeoxyribonncleic Anopheles
Base pairs (d6i baze nite)
Blocking buffer (dem phong bế) Circumsporozoite protein
{Protein bề mặt thoa trùng) Cộng sự
TDeoxynncleotit trìphosphates
Enzyme finked immunosorbent assays
(Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết cnzym) Ký sinh trùng
Ký sinh trùng sốt rét
Monoclonal antibody (Khang thé don dong) Monoclonal antibody- peroxidase
Plasmodium
P falciparum
P vivax P.malariae
Phosphate buffered saline (mudi dém phdt phat)
Polymexase chain reaction (Phan ting chudi polymerasc) Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương
Trang 5MỤC LỤC
Phan A TOM TAT CAC KAT QUA NOI BAT CUA DE TAI
1 KET QUA NOI BAT CUA DE TÀI
2.AP DUNG VAO THUC TIEN SAN XUAT VA DOI SONG XA HOT 3 ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VGI DE CUONG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT
PHẦN B NỘI DƯNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CÚU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
2.1 Các phương pháp xác định ký sinh trùng sốt rét trong muỗi
2.1.1 Kỹ thuật mổ tự nhiên
3.1.2 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết enzym (ELISA) 3.1.3 Kỹ thuật phần tig chudi polymerase (PCR)
2.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước và ở nước ngoài 3.2.1 Tình hình nghiên cứu Ở trong nước
2.2.2 Tình hình nghiên cứu Ở nước ngoài
3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian nghiên cứu 3.2 Địa điểm nghiên cứu
3.3 Đối tượng nghiên cứu
3.4 Phương pháp nghiên cứu
34.1, M6 mudi tryc tiếp, soi bằng kính hiển vi quang học 3.4.2, Kỹ thuật ELISA
3.4.3 Kỹ thuật phẩn ting chudi polymerase (PCR) 3.4.4, Xử lộ số liệu
4 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU
4.1, Hoàn thiện kỹ thuật tách chiết ADN của KST ở tiêu bản thoa trùng,
trong mẫu khô để lâu ngày và ở dịch nghiên làm ELISA
Trang 64.12 Quy trình lách chiết AND từ tiêu bản thoa trùng khô bằng Phenol 4.1.3, Quy trình lách chiết AND từ tiêu bản thoa tràng tưới bằng
Chetex-100
4.1.4 Quy trink téch chiết AND từ tiêu bắn thoa trùng tưới bằng Phenol 4.1.5, Ony trình tách chiết AND từ miẫu vật đã làm BLISA bằng
Chetex-100
4.1.6, Quy trink tach chiét AND tit mau vat dd lam ELISA bang Phenot 4.1.7 Quy trink tach chiết ANDcủa KSHữ tiêu bản muỗi khô bằng
Chelex-100
4.1.8 Quy trinh tách chiết ANDcủa KSTtừ tiêu bản muôi khô bằng Phenol
4.2 Thử nghiêm ELISA xác định mức độ nhiễm KST sốt rét của muỗi AAn.dừus và An.mimimus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoa
4.3.Thử nghiệm PCR đánh giá mức độ nhiễm KST sốt rét ở muỗi An.dirus và Anminimus ờ Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
4.4 Điều tra bổ sung, mổ muỗi, kiểm tra bằng ELISA,, PCR xác định mức độ nhiễm KSTSR của muỗi An.dirus và An.minlmis
giai đoạn 2002- 2005
4.5 Đánh giá vai trò truyền bệnh của Azninimus và An dirus ti
Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khanh Hoa qua két qua ELISA va PCR
5 BAN LUAN
5.1 Hoàn thiện một số quy trình tách chiết ADN của KSTSR ở các mẫu dã thử nghiệm ELISA,, mâu muỗi khô, mẫu thoa trùng
Trang 7PHẦN A TÓM TÁT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỂ TÀI
1 KẾT QUÁ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
11 Đóng góp mới của đề tài
Để tài đã lựa chọn được hai phương pháp tách chiết ADN của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) từ muỗi sốt rét đồng thời ứng dụng thành công các kỹ
thu: al ELISA, PCR để nghiên cứu mức độ nhiễm KSTSR và đánh giá vai trò
truyền bệnh của muỗi Anminimws, An.dirs ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Kh 1.2 1.3 ánh Hoà Kết quả cụ thể của để
Hai phương pháp tách chiết ADN bằng Chelex-]00 và bằng phenol kết
tủa cồn đều có thể sử dụng để tách chiết ADN của KST sốt rét từ các mẫu
vat lm ELISA, muỗi khô để lâu ngày và mẫu vật thoa trùng mổ từ muỗi Anopheles Sin phdm ADN đảm bảo chất lượng cho việc thực hiện kỹ
thuật PCR
Thử nghiệm ELISA phát hiện tỷ lệ nhiễm KSTSR cao của muỗi Andirus
(7/76 giai đoạn 1993-1998; 4.25% giai đoạn 1999-2005) và muỗi
An.mimimus (7,25% trước 1998) tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà Thử nghiệm PCR khẳng định tất cả các kết quá thứ ELISA, xác định thoa
trùng ở hai loài muỗi An.minimus va An.dirus 1a KSTSR gây bệnh ở người
và P fatciparum chiém ty Ie cao
Cả hai loài mudi An.minimus va Andirus déu la ahting muỗi truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà Sau nam 1998,
mật độ muỗi An.minimax giảm đi rõ rệt và An.dirws vẫn còn là vectơ sốt rết quan trọng duy trì và lan truyền sốt rét ở điểm nghiên cứu
Hiệu quả đào tạo
-_ Nâng cao trình độ thực hành các kỹ thuật, đặc biệt là kỹ thuật sinh học
phân tử cho cán bộ nghiên cứu
Trang 81⁄4 Hiệu quả về kinh tế
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử có thể nghiên cứu hồi cứu nhiều số liệu dịch tế học bệnh sốt rét mà các nghiên cứu khác không thể làm dược Vì thế rất có hiệu quả về mặt kinh tế
1.5 Hiệu quả xã hội
Việc đánh giá đúng vai trò truyền bệnh hiện nay của muỗi Ánminimus và Andius ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà giúp ta có định hướng
đúng, tập trung nghiên cứu và tuyên truyền, giáo duc nhân dân thực hiện các
biện pháp phòng chống muỗi truyền sốt rét rừng: Án.4Zws, đồng thời cũng
quan tâm đến su phuc héi quan thé An.minimus
16 Các hiệu quả khác
Mỡ ra triển vọng trao đổi hợp tác nghiên cứu khoa học và ứng dụng thực
tiễn lĩnh vực sinh học phân tử bệnh sốt rét ở trong nước cũng như quốc k
2, AP DUNG VÀO THỰC TIỀN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
Kết quả nghiên cứu đã khẳng định vai trò truyền bệnh sốt rét hiện nay của An.dirus và đang triển khai những nghiên cứu sâu hơn về sinh học cũng như biện phấp phòng chống loài muỗi này, đồng thời cũng cần quan tâm theo đối sự phục hồi của quản thé An.minimus
3 ĐÁNH GIÁ THỰC BIEN DE TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
a Đề lài đã thực hiện đúng tiến độ (từ 6/2002 đến tháng 12/2005) b Đã thực hiện đầy đú 2 mục tiêu nghiên cứu là:
« Hồn thiện quy trình tách chiết ADN của KSTSR trên tiêu bản
thoa trùng, trong tiêu bản muỗi khô để lâu ngày, và dịch nghiền
dùng để thử ELISA
Trang 9«_ Đã lựa chọn và hoàn thiện được quy trình tách chiết AI3N của
KSTSR tại tiếu bản thoa trùng, muỗi khô để lâu ngày và dịch
nghiền thử nghiệm ELISA
«_ Đã kiểm tra kết quả ELISA bằng kỹ thuật PCR và đánh giá khả
năng áp dụng của phương pháp PCR
«_ Đã ứng dụng kỹ thuật ELISA và PCR để dánh giá mức dlộ nhiễm KSTSR và vai trò truyền bệnh của muỗi An.minimus vi An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hồ
«_ Đã có các báo cáo tiến độ và báo cáo tổng kết đúng kỳ hạn d, Đánh giá về việc sử dụng kinh phí
Đề tài đã sử dụng kinh phí đúng mục đích và đúng nguyên tắc tài chính Tổng số kinh phí được duyệt: 189.960.000 đồng
Tổng số kinh phí đã sử dụng: 189.960.000 đồng
4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT
Đề nghỉ có để (ai cấp bộ ứng dụng các kỹ thuật cao vào nghiên cứu dịch (ễ học phân tử bệnh sốt rết tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà cũng như
Trang 10' KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHAN B NOL DUNG BAO CAO CHT TIE 1 DAT VANDE
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh
nam, tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loài muỗi sống và phát triển trong đó có muỗi Anophefes Nhiều loài trong giống muỗi này dude xác định là vecu
truyền bênh sốt rét chủ yếu và thứ yếu ở nước ta Hiện nay việc nghiên cứu tìm ra phương pháp phát hiện nhanh, chính
(KSTSR) ở người để có biện pháp điểu trị
vecL, tìm cách phòng chống thích hợp là yên cầu cần thiết
“Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm ra nhiều kỹ thuật để ác loại Ký sinh trùng sốt rét
ở muỗi để đánh giá dúng các
xác dịnh KSTSR người, ở muỗi như kỹ thuật mổ tự nhiên, kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết enzym (ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) vi kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerasc (PCR: polymerasc cha¡n rcacUon)
Ở Việt Nam, kỹ thuật mổ muỗi tự nhiên để phát hiện KSTSR trên kính hiển vi quang bọc đã được áp dụng từ khá sớm, đến nay kỹ thuật vẫn có giá trị
thực tiễn và đáng tin cậy Tuy nhiên, kỹ thuật này có một số hạn chế như
không phát hiện được chính xác loài KSTSR, những trường hợp có mật độ KST nhiễm thấp, nhiễm phối hợp hai hay nhiều loại KST Trong những năm gần
đây, một số kỹ thuật tiên tiến đã và đang được ứng dựng vào nghiên cứu xác
định KSTSR trong muỗi nhụr kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR, với những ưu
điểm như độ nhạy cao, khả năng phát hiện được nhiều loại KST, phát hiện
được những trường hợp nhiễm phối hợp Các kỹ thuật trên đã khắc phục được những nhược điểm của kỹ thuật mổ tự nhiên
Xã Khánh Phú, huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà nằm trong vùng sốt
rét lưu hành nặng của nước ta Từ nãm 1993 đến nay, Uỷ ban [lợp tác Y tế
Việt Nam- Hà Lan (MCNV) đã kết hợp với Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn
trùng Trung ương, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng -
n trùng Qui Nhơn và Irung
tâm Phòng chống sốt rét và các tối loạn thiếu 1 ốt tỉnh Khánh Hoà tiến hành nghiên cứu sốt réi và vectơ sốt rết tại đây
Trang 11nghiên muỗi đương tính với protêin bể mật thoa tring (CSP) trong thử nghiệm
ELISA va hang nghin tiêu bản muỗi khô chưa xác định mức dộ nhiễm KSTSR
qua ác biện pháp phòng chống sốt rét (DCSR) khác nhau
Chính vì vậy, đễ tài nghiên cứu: "Ứng dụng một số quy trình tách chiết ADN
ác thời kỳ sử dụng
và kỹ thuật RLASA, P€WR đánh giá vai trò ruyền benh cha mudi An.nininus vài An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà” dược thực biện với hai mục
tiêu nghiên cứu là:
1 Lựa chọn và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN a ky sinh trùng sốt rét và dịch chiết sau khi đã trên Liêu bản thoa trùng, trong muối khô để lâu ngà thi ELISA
2 Sứ dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác dịnh vai trò truyền bệnh sốt rét của
Trang 122 TONG QUAN TAI LIEU LIEN QUAN DEN DE TAI
2.1 Các phương pháp xác định ký sinh trùng sốt rét trong mudi
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là sự phát triển trong lĩnh vực công nghệ sinh học, những tiến bộ trong nghiên cứu sinh học đã được ứng dụng trong nghiên cứu phát hiện KSTSR Từ những kỹ thuật cổ điển
như kỹ thuật mề tự nhiên, cho đến kỹ thuật tiên tiến hơn như kỹ thuật ELISA,
kỹ thuật lai phan tir (DNA probe) và kỹ thuật mới nhất hiện nay là kỹ thuật phắn ứng chuỗi polymerase (PCR) dã và đang được ứng dụng để xác định các loại KSTSR
6 nước ta đến nay, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Cöo trùng Trung ương đã áp dụng ba kỹ thuật chính vào mục đích nghiên cứu xác định KSTSR trong xuuổi là kỹ thuật mổ tự nhiên, kỹ thuật ELISA và kỹ thuật PCR
3.1.1 Kỹ thuật mổ tự nhiên
Kỹ thuật mổ muỗi tự nhiên để phát hiện thoa trùng (sprozoites) trong,
tuyến nước bọt muỗi và các nang trùng (oocysts) trong dạ đày muối Kỹ thuật
này được áp dụng ở nước ta từ khá sớm.J3l, 5, 6] Ngày nay, kỹ thuật mổ tự
nhiên vẫn là kỹ thuật chủ yếu được sử dụng trong việc phát hiện vai trò truyền
bệnh của muỗi [#, 35|
Kỹ thuật mổ tự nhiên có ưu điểm lä không đòi hỏi trang thiết bị, hoá
chất đắt tiền, có thể thực hiện ngay tại thực địa
Tuy nhiên kỹ thuật này cố nhiều hạn chế như: Phải tiến hành mổ khi
muỗi còn sống, không thể xác định chính xác các loài KSTSR trong muỗi,
không phát hiện dược những trường hợp nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài KSTSR 2.1.2 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết cnaym (ELISA: enzyme linked immunosorbert assays) Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết enzym được phát mình từ năm 1966, đã phát triển nhanh chóng và mở rộng lĩnh vực ứng dụng
Kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể kép được áp dụng nghiên cứu phát
hiện kháng nguyên KSTSR trong muỗi Kỹ thuật này được tiến hành dua tren
Trang 13ELISA dựa trên các kháng thể đơn dòng (Mabs- monoclonal antibodjes) được sử dụng Các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên và chống lại kháng nguyên KSTSR cần nghiên cứu Sau đó sử dụng kháng thế đơn đòng đặc hiệu liên kết enzym peroxidaza dánh dấu tạo nên phản ứng ruầu Sau khi loại bỏ những chất đánh dấu thừa không kết hợp thì đo lượng enzym còn lại sẽ biết có kháng nguyên bay không? Kết quả của phương pháp này dược nhàn biết bằng mắt thường hoặc được do trên máy ELISA ở bước sóng 405- 4i4nm Đo hoạt độ của cnzym để nhận biết được khả năng phân huỷ cơ chất từ không màu
thành có mầu (mầu xanh) [15, 16, 17
Ưu điểm của kỹ thuật ELISA có thể tiến hành trên mẫu sống, mắu để
lạnh và khô giữ một tho
có thể xác định được cả các loài KSTSR & ngudi IA Plasmodium falciparum,
gian nhất định trong điều kiện tự nhiên Cho đến nay
Plasmodium vivax, Plasmodium matariae, và Plasmodium ovale Tuy nhién
kỹ thuật này còn gặp phải một số nhược điểm về mặt kỹ thuật như: còn có những trường hợp dương tính giả [30], đòi hỏi hoá chất trang thiết bị tương dối đất tiển 2.13 Kỹ thuật phân ứng chuôi polymerase (PCR- Polymerase chain reaction)
Kỹ thuật PCR do Kary Mullis phat minh vao giifa nhiing om 80 cita thé kỷ trước Cho đến năm 1985 mới chỉ có 3 công trình được công bố vẻ PCR thì
chỉ 5 năm sau kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi tại hàng nghìn phòng thí
nghiệm trên thế giới, đưa lại cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Ở
nước ta, kỹ thuật PCR cũng đã và đang được sử dụng rong nhiều trường Đại học, các Viện nghiên cứu
Đây là kỹ thuật inviro để nhân bản nhanh một doạn ADN dặc thù mà chỉ cần một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, di truyễn quần thể,
pháp y
Trang 14sẵn và theơ quy trình của nhà sản xuất để tách chiết ADN Tuy nhiên, trên (hực tế, các nhà nghiên cứu thường dựa trên nguyên tắc khoa học và kinh nghiệm để lựa chọn những quy trình tách chiết cho phù hợp Hai phương pháp tách chiết ADN thông dụng nhất là tách chiết bằng Chelex 100 và tách chiết bằng
phenol tủa cồn
Nguyên lắc của kỹ thuật PCR: Dựa trên sự tham gia của enzym để nhân bản một đoạn ADN nhờ 2 đoạn mỗi oligenuclcotit (primer) tương hợp với hai đầu 3ˆ của hai mạch ADN đích Các oligonucleotit được dùng lầm cho môi
cho phép ADN mẫu được nhân bản nhờ sự tham gia của AJ2N - polymerase Kỹ thuật này được ứng dụng để xác định KSTSR trong máu của người
mắc bệnh sốt rét cũng như ở trong muối.[!4, 20, 24, 28, 29] Theo nhiều tài
liệu nghiên cứu ở nước ngoài cũng như ở trong nước cho thấy đây là kỹ thuật
có dộ chính xác và độ đặc hiệu cao {I„ 2, 13, 28]
Ưu điểm của kỹ thuật này 'ó thể phân tích chính xác tất
kể cá mẫu khô thu từ thực địa Kỹ thuật này dựa trên tính đặc hiệu của các đơi
mỗi cho từng lồi KST có khả năng phát hiện dược 4 loài KSTSR Nhược diểm
của kỹ thuật này là: Trang thiết bị, hoá chất
ä các mẫn,
sử dụng trong phương pháp này
đất tiên, hơn nữa để tiến hành phân tích mẫu tốt đòi hỏi người thực hiện phải có trình độ và có kinh nghiệm chuyên môn
2.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước và ở nước ngoài 3.3.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Kỹ thuật mổ muỗi tim KSTSR da duce thực hiện từ khá sớm ở nước ta
(311 Trong suốt quá trình nghiên cứu phòng chống bệnh sốt rét và cho đế nay kỹ thuật chủ yếu được áp dụng để nghiên cứu phát hiện KSTSR là kỹ thuật mở
muỗi tự nhiên trên kính hiển vị quang học Những công trình nghiên cứu vẻ
mổ muỗi tự nhiền đã được các tác giả thông báo trong Kỷ yếu các công trình
nghiên cứu của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Bằng kỹ
thuật này, các tác giả nghiên cứu đã xác định các loài muối truyền bệnh sốt rét chủ yếu và thứ yếu ở Việt Nam |4, 5, 6]
Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật đã dược áp dụng để phát hiện KSTSR trang vài thập kỷ gần đây Nhiẻ
Trang 15
được nghiên cứu và công bố như: “Nghiên cứu vai trò miễn dịch trong dịch lế,
ở người và muỗi”
điều trị sốt rết và phát hiện nhiễm ký sinh trùng sốt
tác giả đã nghiên cứu ở 14 điểm theo doi xét nghiệm trên 489 bệnh nhân và xét nghiệm 7868 mẫu muỗi phát hiện 337 mẫu muỗi nhiễm KSTSR |8]
Năm 1993, Đoàn [lạnh Nhân và cộng sự đã có thông báo “Kết quá bước đầu ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện thoa trùng trong muỗi” Kết quả cho thấy ở điểm nghiên cứu thí điểm Phong Phú, thành phố Hồ Chí Minh, có 4 loài muỗi nhiém c& 2 loal KSTSR P fulciparum va P vivax đó là An-teaselldtes,
An.testert, Ansundaicus vi An.sinensis © Cân Giuộc có 4 loài muỗi dương
tính với kháng thể #viwax đó là Anvagus Anasinemsis, Anileateri An.campestris.|7]
Trần Đức Hinh và cs trong công trình “Bổ sung dẫn liệu điều tra về muỗi Anophclzs và thực trạng phân hố vectơ sốt rót ở Việt Nam giai doan tir
1991 đến 199514] Các tác giả đã mổ 13747 muỗi thuộc 13 loài trong giống
Anophetes phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm thoa trùng của An.đừus là 3,98%, An,minimus là 3,58% Trong 19 loài được thử nghiệm ELISA thấy 7 loài có đương tính kháng nguyên prolein bề mặt thoa trùng CSP [4]
Tổng kết những công trình nghiên cứu vẻ ứng dụng kỹ thuật FI1SA để phát hiện thoa trùng sốt rết ở muỗi tại các tỉnh Thanh Hoá, Khánh Hoa,
phố Hồ Chí Minh và Long An, Đoàn Hạnh Nhân va cs (2004) đã cho thất
Khánh Phú Khánh Vinh, Khánh Hoà, trong 2 năm 1993 - 1994 dã thử nghiệm 4235 muỗi thuộc 13 loài của giống Anopbeles cho kết quả 4 loài An.dirus,
An.minimus, An.vagus va An.maculatus c6 thoa tring TY lé nhiễm trùng của 4
loài này theo thứ tự nêu trên là 8,5%; 8,4%; 3,29 và 0,7% [9]
Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerasc (PCR) dược giới thiệu tại Viện Sốt rét- KST- CTTU nam 1993, đến nay kỹ thuật này đã được Khoa Sinh học phân tử thực hiện thường qui để phâ tích KSTSR trong mẫu máu người, nghiên cứu các dặc tính di truyền của gen liên quan đến kí Ấu các nạ thuốc, xác định cơ
Trang 161ê Đức Đào và cs (1996), Bùi Quang Phúc và cs (2003); Nguyễn Văn Tuấn và cs (2003) đã áp dụng kỹ thuật PCR để nghiên cứu KSI5R ở người Kết quả thu được cho thấy trên tiêu bản máu người nhiễm KSTSR, kỹ thuật
này có khả năng phát hiện được 4 loài KSTSR 1a P falciparum , P.vivax ,
Pamalariae, P.ovale Với kỹ thuật này, lần đầu tiên ở Việt Nam các tác giá đã phát hiện được những trường hợp bệnh nhân nhiễm phối hợp nhiéu loai KSTSR trên người, Đặc biệt là phát hiện được những trường hợp nhiễm phối hợp 4 loài KSTSR mà với các kỹ thuật trước đây chưa phát hiện được Những phát hiển này góp phần giúp cho các nhà dịch tế hợc có thêm số liệu về cơ cấu KSTSR ở Việt Nam [2, 10, 13] Hiện nay kỹ thuật này đang được nghiên cứu áp dụng vào phát hiện KSTSR trong mui
2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Kỹ thuật ELISA đã được đưa vào nghiên cứu xác định KSTSR trong muỗi ở nhiều nước trên thế giới Có thể kế một vài công trình mới đây của
Kabiru E.W và cs (1997), nghiên cứu về mức độ nhiễm thoa trùng tự nhiên
của muỗi Anopheles tai huyén Kilifi, Kenia [23] Cùng trong năm 1997,
Fontcnilie D và cộng sự đã đùng kỹ thuật FI.ISA để nghiên cứu sự thay đổi lan truyền sốt rét theo mùa và theo năm của muỗi sốt rét ở Dielmo, một vùng
sốt rét nặng ở Senegal.[18]
6 Thai tan, bằng kỹ thuật ELISA, năm 1991 Green C.A và cs đã xác
định vai trò truyền bệnh sốt rết của Anpseudowillmori, mot loai trong phitc
hợp loài An.maculatus [20] Năm 1993, Somboon v:
Chiéng Mai, Thái Lan đã phát hiện có những dương tính giả, khi dùng kỹ thuật
EL.ISA để xác dịnh KSTSR P /eciparum và P.vivax trong muỗi |30]
“Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu KSTSR và muỗi sốt rét ở
s, với công Irình nghiên cứu của mình ở
mức độ sinh học phân tử đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Về
KSTSR ở bệnh nhân, người ta đi sâu nghiên cứu về mối liên quan mức độ đột
biến gen của KSTSR với tính kháng thuốc sốt rét Đồng thời cũng có những nghiên cứu so sánh kỹ thuật miễn địch chẩn đoán với kỹ thuật PCR
Trang 17Năm 1994, HH SM và Cramton JM, trong bài tổng kết về những phương pháp dựa trên cơ sở ADN để xác định các côn trùng truyền bệnh, trong phần xác định KSTSR trong muỗi, các tác giả đã tổng kết được 37 công trình nghiên cứu đã công bố Trong đó, chủ yếu là sử dụng kỹ thuật lai phân tử (ĐNA probe) Trong 37 công trình nghiên cứu chỉ có 4 công trình sử dụng kỹ thuật PCR [21]
Kỹ thuật PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn vào lình vực
nghiên cứu KSTSR và muối truyền sốt rét Nhiều khi trên một mẫu vật, người
ta có thể xác định được cả loài muỗi và loài KSTSR Có thể thấy rõ vấn đề này
trong nghiên cứu của Bouare M, và cs năm 1996 [14]
Phương pháp PCR có lợi thế là nó có thể xác định được cả KST trên tiêu bản muỗi khô để nhiều nam (Li J và cs, 1997) [24]
Năm 1998, Wilson M.D và cs đã làm nghiên cứu so sánh giữa phương pháp xác định thoa trùng bằng PCR và mổ sơi trực tiếp trên kính hiển vi Kết quả cho thấy: Mức độ dương tính của phương pháp PCR cao gấp 3 lần so với
phương pháp mổ trực tiếp [36]
Trang 183 PHƯƠNG PHÁP, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ THỜI GIAN
NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6/ 2002 đến tháng 12/2005 3.2 Địa điểm nghiên cứu:
~ Mẫu vật được thu thập tại xã Khánh Phú, huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà Đây là một vùng sốt rét lưu hành nặng của miễn Trung Việt Nam
- _ Các Kỹ thuật ELISA, PCR được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Viện
Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương
3.3 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là KSISR trong muối, và hai Jodi mudi
An.mimimus Và An.dirus
3.4 Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, phâu tích phòng thí nghiệm, chọn mẫu có chủ đích, những mẫu muỗi khô trước và sau năm 1998, dịch chiết ELJSA dương tính trước và sau năm 1998, các mẫu muỗi thu thập li nam 2001-2005
3.4.1 Mổ muỗi trực tiếp, soi bằng kính hiển vi quang học
Việc mổ muỗi được tiến hành theo thường quy kỹ thuật của Tổ chức V
tế Thế giới (WHO) 1975 [35] 3.4.1.1 Hoá chất, dụng cụ:
~_ Nước muối sinh lý (0,9%), ête mẽ, côn tuyệt đối, giêm sa
-_ Kính lúp hai mắt VEt0, đèn cần
- Kính hiển vi quang boc thường
Trang 19Gây mê muỗi bang Ete mê, đặt muối vào phiến kính sạch, dùng kim mổ
để tách tuyến nước bọt muỗi cho sang một bên phiến kính, sau đó tách
da diy muỗi Dùng kim lấy phần đầu ngực cho vào ống Fpendofft 1,5 giữ lại để làm ELISA va PCR
Sau mỗi lần mổ muỗi, kim mổ pl
š được he trên ngọn lửa đèn cồn để
tránh lẫn mẫu Muỗi phải được để riêng trong từng ống Epcdofft và có cùng ký hiệu với phiến kính
Sau khi mồ xong, phiến kính có tuyến nước bọt và dạ dầy được sơi trên
kính hiển vi, điều chỉnh ánh sáng phù hợp để phát hiện KSTSR
Phiến kính để khô, cố định bằng cồn và nhuộm bằng giêm sa 10% trong 30 phút để xác định KST rõ hơn Tiêu bản được chụp trên kính hiển vi đối pha Nikon, sử dụng film Fugicolour 100 3.4.2 Kỹ thuật ELISA 3.4.2.1 Nguyên liệu, dụng cụ
Phần dầu ngực của muỗi Á»mintmus, Án dirus sau khi đã mổ hoặc phần đầu ngực của muỗi khô được giữ trong tủ lạnh sâu 75%
Bộ Kit ELISA phát hiện kháng nguyên đặc hiệu thoa tring P fateiparum VA P.vivax, khang thé don ddng 2A10 (Nardin va cs, 1982) va NSV3 (Naval Medical Research Istitute, Bethesda, Md) va hod chat can thict khác Máy đọc J.ISA, tử lạnh các loai: 4°C, - 20°C đến -?5°C, ống nhựa loại 1,5ml; 3ml, mieropipets và dụng cụ chuyên dụng khác 3.4.2.2 Hoá chất và cách pha
- Dung dich PBS (phosphate buffered saline) véi pH= 7,0 7.4 - Dung dich BB (Bloking buffer) Độ pH= 7.0 - 7,4
- Dung dich BB- Nonidet P-40 (BB- NP- 40) - Dung dich PBS- Tween:
- Mab va Peroxidaza- conjugated MAb - Dung dich rita (PBS- Tw)
Trang 204.4.2.3 Các bước tiến bành:
“Thực hiện theo qui trình kỹ thuật ELISA của Verhave cải tiến năm 1998
[331
Muii thử đã được xác định loài, từng con muỗi được bỏ chân, bụng lấy phẩn đầu ngực để trong tube nhựa loại 1,5ml Mỗi tube nhỏ 501 dung dịch nghiền muỗi (gồm BSAI% allbumin huyết thanh bê, 0,5% casein, 0,01% thimersol, và 0,002% đỏ phenol pha trong PBS, pH 7,4 có 0,5% Nonidet P-A0 Dùng que nhựa để nghiền muỗi tan trong dung dịch trên Cho 200 HÌ dung dịch phủ BSA 1% albumin huyết thanh bê vào mỗi tubc đựng dịch muối đã nghiền để ngay trong lạnh - 20% trong 30 phút và làm tan đông ở nhiệt độ phòng
- Phi khang thé don dòng đặc hiệu protcin thoa trùng vào các giếng ở phiến nhựa 96 giếng: nhỏ 30Hl dung dich khang thé Pfatciparurt 2A10 (2ul/mIPBS) hoặc P.vwax NSV3 (0,5ul/ml PBS) vào mỗi giếng, dậy
phiến nhựa bằng nilon đính để qua đêm ở nhiệt độ 4°C, sáng hôm sau
hút dung dịch ở các giếng và nhỏ 200 dung dịch phú BSA vào mỗi
giếng, để 60 phút ở nhiệt độ phòng
-_ Hút dung địch ở giếng rồi nhỏ 50HÌ dung dịch muỗi nghiền vào mỗi giếng, đậy phiến nhựa, ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng Rửa các giếng của
phiến nhựa 3 lần bằng dung dịch PBS có chứa 0,05% 'Twcen 20 (PBS
Tw)
~ Nhé S0! dung dịch Kháng thể gần pcroxydasc, để ¡ giờ ở nhiệt độ phòng, hút dune địch ở các giếng, rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- Tw, nhỏ 100] dung dịch cơ chal (enzyme substrate) vio mai giéng
Mẫu chứng âm, chứng đương và các mẫu thử nghiệm cùng làm trên một phiến nhựa 9ó giếng để kiểm tra
Trang 21chỉ số mật độ quang lớn hơn 3 lần trung bình chứng âm thì là kết quả dương
tính
3.4.3 Kỹ thuật phần ứng chuỗi polymerase (PCR) 3.4.3.1 Dụng cụ
Bo Miccopipetts: 20u1, LOOuL, 2001, 100001 Đầu côn các cỡ IOnl, 20041, 1000,
Tube Lippedofit: 1,5ml; 0,5m1
Máy luân nhiệt (Eppendofit Mastercycler [ersonal)
May lac (Rotolab) Máy khuấy (Rotolab)
Can phan tich (Denverinstrumentst- XL-40)
May do pH (TOA pH meter HM- 165) Microwase (Samsung) Mấy ly tâm (Eppendofft Centrifuge 54L7C) Bộ nguồn điện di (DCR- 400- 800) Bộ điện đi (F350) Đèn si tử ngoại
Máy chụp ảnh và phim polaroid
Hệ thống chụp ảnh kỹ thuật số Ïmaging Systems SDS - 8000 3.4.3.2 Hoá chất - Hoá chất tách chiết, tỉnh khiết ADN + PBS pH 7,4: + 8aponin 1%: l g hoà tan trong 10ml PBS dùng trong ngày +Chelex- 100 10% +SDSi0% + Protein K 20mg/ml
+ Phenol: Chloroform: isomytacochol ty lé 25: 24: |
+ Enzym xúc tác: Taq- polymcrase, bảo quản 20°C
+ Nước chất lượng cao: tình khiết, khử ion, bảo quản 20°C
Trang 22
+ Méi Nesti va Nest2: nông độ I,25HÀM bảo quản -201C, C¡
G.Snousnou, Viện Y học nhiệt đới [lồng Gia Anh tÍ trình tự như bang 1: cập mối do Bang 1: Trinh tự các mí ST [Min hiệu sit dung trong phan ting Nested PC Kiển phần ting sản phẩm
Plasmodium | PLUS Ï5'GTGTTGITGGCTTAAACTIC3” Ô 7 [123kb `
| Nest 1 i PLUG | STTAAAATTGTTGCAGTTA AA ACG?”
[Pjaksparum [FALL | STTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAAWRATTS' | 208hp
| Nest 2 | FAL2 Ì -ACACAATGAACICAATCATGACTACCCGCTS"
TP riven j VEVE AC
| Nest 2 VIV2
[Pmalamae MALI 144bp |
‘Nest 2 MAl2 | SAASATICC TACABAS
1 Poovale OVAL | 5° ATCTCVITIGCIATITISTAGTATIGGAGAS’ 1 §Ú0bp { Net _ OVA S'GGAAAAGGACACA’ Tơ TAT CCl AS 3 i i - Dem chay dién di- Gel + TBE 5X + TBE1X: pha loãng 5 lần tir TBESX + Gel aparose 2%
- Dung địch nhuộm ADN
+Ethidium bromide 1Ômg/mL
+ Loading buffer
3.4.3.3 Các bước tiến hành - Tách chiết và tinh khiết ADN
Hiện nay có nhiều phương pháp tá
h chiết, tình khiết AĐM Dưới dã:
hai phương pháp thường dùng cho phản ứng PCR trong nghiên cứu KSTSR + Phương pháp tách ADN bằng Chelex-100 10%; Theo phương pháp của Kains Lannar và cs nâm 1992, Đây là phương pháp tách AI3N từ mẫu máu thu lượm bang gidy tham Whatmam 3mm có thay đổi cho phà hợp với mẫu vật là KST ở trong muỗi Các mẫu vật sau khi xử lý sơ bộ ban đầu
là
Trang 23+ Thêm mỗi mẫu 0,5m] Saponin 0,5% Chú ý cho ngập mấu + Lắc kỹ, ũ 37C trong I giờ + Thém 0,5ml PBS lac kỹ + Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi + Rửa lại 3 lần bằng PBS + Thêm 8OHl Chelex100 10% + Bun soi 1Ú phút, + Ly tâm 12000 vòng/ phút trong I5 phút
+ Thu ADN hoa tan trong nước
+ Bảo quản — 2C đùng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR + Phương pháp tách AI3N bằng phenol, tủa bằng cồn
Theo phương pháp của Wooden 1993 phương pháp này sau khí tách ADN có độ tỉnh khiết cao, nồng độ ADN thay đổi theo ý muốn, áp dụng rộng tãi với các loại mẫu được thu thập bằng các hình thức khác nhau Tuy nhiên au khi xứ lý sơ bội
phương pháp này tốn thời gian, độc và cần thiết bị báo vệ *
mẫu
Them SDS 10%: sao cho mẫu có nông độ cuối cùng là 0,5%
+ Thêm protein K 20mg/ml sao cho mẫn có nồng độ cuối cùng 500ug/mÌ
+_ Ủ nhiệt độ 37C trong 3 giờ
+ Thém phenol: chioroform: isoamyachohol (25: 24: 1) Ty lé 1:1 so với
mẫu
+ lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, thư phần nổi chuyển sang tube mới
+ Thém phenol: chloroform: isoamyachohol (25: 24: L) TY Ie 1:1 se voi mẫu
+ Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng/ phút trong ¡5 phút, thu phân nổi chuyển sang lube mdi
+_ Sau đó tiến hành tủa ADN bằng cồn:
+ Thêm acetate natri 3M tỷ lệ 1: 10 so với thể tích máu
+ Thém methanol 99% tỷ lệ i:1 sơ với thể tích mẫu Trộn đều để 20C qua dém
Trang 24» Rita lại 2 lần bằng cthanol 70% + Thu ADN tủa để khô hoàn toàn
+ Pha ADN tủa bằng dung dich TE theo nồng độ phù hợp cho phản ứng
PCR
Phản ứng PCR lầng (Nested PCR)
Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium gọi là Nested1 Hai méi duge str dung cho phan tng Nested 1 và Plus 5 và Plus 6 có
trình tự như ở bảng I
“Thành phần phản ứng trong tổng thể tích 2541 như sau:
PCR buffer LOX, 25ul
dNTPs 2mM: 2.501
Mỗi Plus 5 1/25wM — 1OgI
Mỗi Plus 6 1/251M 1.04
Taq DNA polymerase 10nl
Dich ADN miu 3.0) HO 14.0M Điều kiện cho phần ting Nested 1 là: + Bước 1: 95'C- 5 phút *ˆ Bước 2: 58°C- 2 phút *ˆ Bước 3: 72C- 2 phút Tước 4: 94C- 1 phút Bước 5: Lặp lại từ bước 2 đến bước 4: 25 lần # Bước 6: 58°C- 2 phút * Bước 7; 722C- § phút
Bước 8: Hạ nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng,
Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P,fieiparam Puyhax, Pamalariae P.ovale được gọi là Nest 2 Tinh tự các đôi môi đặc hiệu cho từng loài KSTSR, bước 5 lặp lại 30 lần
Trang 25Sau khí thực hiện phần ứng PCR xong trên máy luân nhiệt Kiểm tra sẵn phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 2%:
+ Loading buffer: It + Sản phẩm PCR: 10ml
Trộn đều nhồi vào giếng gel
Dung địch điện di: TBE 1X
+ Chạy điện di điện thế 110V, điện áp 75mA khoảng 30 phút +_ Đọc kết quả điện di dưới ánh đền tử ngoại:
+ Mẫu chứng âm không có vạch diện di
+ Mẫu chứng dương có các vạch điện di đặc hiệu tương ứng với kích thước thang đo sau: P falciparum: 205 by P.vivax: (205p; P.malariae: 144bp; P.ovale: 800bp,
Trang 264 KẾT QUÁ NGHIÊN C'
4.1, Hoàn thiện kỹ thuật tách chiết ADN của KST ở tiêu bản thoa trùng, trong mẫu muối khô để lâu ngày và ở địch nghiền làm ELISA
Đựa trên các phương pháp của Kains Lannar và cs 1992 và Wooden
1993 có thay đổi cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu là ký sinh trùng trong,
muỗi và được kiểm tra bằng cách so sánh kết quả với phương pháp tách chiết
bằng kil QiAgen va sự có mặt của ADN muỗi ở sản phẩm sau khi tách chiết ADN Cả hai phương pháp tách chiết ADN bằng Chelex- 100 và bằng Phenol, tủa côn đều có thể áp dụng nghiên cứu KSTSR ở muỗi
hi tách chiết ADN của ký sinh trùng sốt rét bằng hai phương pháp trên, ta cũng đồng thời thu được sản phẩm AIDN của muỗi sốt rét Sản phẩm
ADN của muối thường nhiều và dễ nhận biết hơn ADN của KST nén được
đùng để kiểm tra kết quả của việc tách chiết
“Trong các thử nghiệm mỗi loại vật mẫu dùng 30 mẫu, cả hai phương, pháp đều cho kết quả giống nhau về sự có mặt ADN muỗi và các kết quả phân
tích KST (hình 1,2, 3)
A 1
Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của muỗi tách
từ mẫu vật thử nghiệm ELISA
A Sản phẩm PCR của muỗi được tách bằng phương pháp Chelex- 100 B Sản phẩm PCR của muỗi được tách bằng phương pháp Phenol
Trang 27Có thể tóm tắt các bước tiến hành kỹ thuật lách chiết ADN bing trai phương pháp cho các loại vật mẫu khác nhan như sau:
4.1.1 Quy trình tách chiết ADN từ tiêu bản thoa trăng khô bằng Chelex-100 1 Tiên bản thoa trùng ngâm vào côn tuyệt đối 30 phút, cứ 5 phút lắc nhẹ
một lần
2 Lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng
3, Ding lưỡi dao cạo, cạo thoa trùng trên mặt tiên bản cho vào ống nhựa
1.5ml
Thêm vào Iml đung dịch PBS (pH 74) trộn đều
cal
3 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, đổ phần địch nối, thu cặn láng, 6 Thêm vào 80p] dung dịch 109 Chelex-100
7 Đun sôi 8 phút
8 Ly tam 12000v/phut, trong 15 phút
9 Thu phẩn dịch nổi có chứa ADN 10.Bao quản ADN ở nhiệt độ -20°C
4.1.2 Quy trình tách chiết ADN từ tiêu bắn thoa trùng khô bằng Phenol
Từ bước ¡ đến bước 5 làm giống như quy trình tách chiết ADN từ tiêu bản thoa trùng bằng Chelcx- L00
6 Trong bước 6 thêm 20! Proteinase K nồng độ 20mg/ml
7 Thêm SDS 10%
8 Ủ37°C trong 2 giờ
Phân lập 3 lần bằng Phenol Mỗi lần 0,5m]
10.Phân lập lần cuối bằng Chisam(Chloroform:Ïsoamylalcohol 24: 1)
11.Tủa ADN bằng 3 lấn thể tích cồn tuyết đối và 1/10 thể tích sodium acetat 3M
12 Rita lai 2 lin bang ethanol 70% 13 Để ở nhiệt độ -20°C qua đêm
14 Ly tâm 12000v/15phút Để phần nổi, thu căn lắng
13 Ly tâm hút chân không hoặc để ở nhiệt độ 45“C trong thời gian 30 phút đến 60 phút
Trang 2817 Bảo quán ADN ở nhiệt d6 -20°C
4.1.3 Quy trình tách chiết AIIN từ tiêu bản thoa trùng tuoi bang Chelex- 100
Rửa mẫu vật bằng 3 lần dung dich PBS (pH 7.4), mỗi lần 0.5m†
Hút sạch địch nổi
Thêm vào tube Imt dung dich PBS (pH 7,4), trộn đều
Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 15 phút, đổ dịch nổi, thu cặn lắng Thêm 8041 dụng dịch 10% Chelex- 100
Dun soi 8 phot
Ly tam 12000 vòng /phút trong 15 phút
Thu hồi phần dịch nổi có chứa ADN 9 Bảo quản ADN ở nhiệt độ - 20°C,
4.1.4 Quy trình tách chiết ADN từ tiêu bản thoa trùng tươi bằng Phenol 1 Rửa mẫu vật 3 lần bằng dung dich PBS pH7.4, mỗi lần 0,5 ml
Húi sạch dịch nổi
Thêm 2001 Proteinasc K nồng d6 20me/ml va SDS 10%
U 37°C trong 2 giờ
Phân lập 3 lần bằng Phenol Mỗi lần 0,5ml
Phân lập lần cuối bằng Chisam(Chloroform:]soarmylalcohol 24:1)
Tủa ADN bằng 3 lần thể tích cồn tuyệt đối và 1/10 thể tích sodium acetat 3M
8 Để ở nhiệt độ -20°C qua đêm,
9 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút Đổ phần nổi, thu cần lắng,
10 Ly tâm hút chân Không hoặc để ở nhiệt độ 45°C trong thời gian 30 phút đến 60 phút
11.ADN khơ được hồ tan trong 20-3001 dụng dịch TE 12.Báo quần ADN ở nhiệt độ -20"
Trang 29Dun soi 8 phút,
Ly tam 12000 vòng/phút trong 13phút Thu phần địch nổi có chứa ADN
Bảo quản ADN ở nhiệt độ -20°C
oye
4.1.6 Quy trình tách chiết ADN từ mẫu vat dd lam ELISA bang Phenol
Rửa mẫu vật 3 lần bằng dung dịch PBS pH7,4, mỗi lần 0,5 ml Hút sạch dịch nổi
“Thêm 20HI Proteinase K nông độ 20mg/ml và SDS 10% U 37°C trong 2 giờ
Phân lập 3 tần bằng Phenol Mỗi tần 0,5ml
Phân lập lần cuối bằng Chisam(Chioroform:Isoamylalcohol 24: I)
Tủa ADN bằng 3 lần thể tích cồn tuyệt đối và 1/10 thể tích sodium
acetaL 3M
8 Để ở nhiệt độ -20°C qua đêm
9 Ly tâm: 12000 vòng/phút trong 15 phút Để phẩn nổi, thu cận lắng
10.Ly tâm hút chân không hoặc để ở nhiệt độ 45°C trong thời gian 30 phút đến 60 phút
11.ADN khô được hoà tan trong 20-301 dụng địch TE 12.Báo quản ADN ở nhiệt độ -20°C NO eR NS M4—-A———-—* 4—- B————*
Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của KST SR P./afciparum
tách từ mẫu vải thit nghiém ELISA
A Sản phẩm PCR của KST được tách bằng phương pháp Chelex-100 B Sản phẩm PCR của KST được tách bằng phương pháp Phenol
M: thang chuẩn pBR322/HaeTIT
Trang 30
4.1.7 Quy trình tách chiết ADN của K: từ mẫu vật muôi khú bằng Chelex 100 1 Cho đầu ngực muỗi vào trong ống 1,5 mi, dùng chày nghiền nghiền mau trong 1,5 ml PBS pH = 7,4 2 Rita mau vat 3 lần bằng dung địch PBS pH7,4, mdi lin 0,5 ml 3 Hút sạch địch nổi 4 Thêm vào phần cặn lắng 80 dung dịch 10% Chelex-100 5 Đun sôi 8 phút
6 Ly tâm 12000 vòng/phút trong I5phút
7 Thu phần dịch nổi có chứa ADN
8 Bao quản ADN ở nhiệt độ -20°C
4.1.8 Quy trình tách chiết ADN của KST từ tiêu bẵn muỗi khó bằng Phenol 1 Cho đầu ngực muỗi vào trong ống I,5 ml, dùng chây nghiền, nghiền mẫu trong 1,5 ml PBS pH = 744 Rửa mẫu vật 3 lần bằng đung dịch PBS pH7,4, mỗi lần 0,5 ml Hút sạch dịch nồi Thêm 2001 Proteinase K nồng độ 20mg/ml U 37°C trong 2 gid
Phân lặp 3 lan bang Phenol Mdi lan 0.5ml
Phan lap lan cudi bang Chisam(Chloroform:Isvamylalcohol 24:1)
Tủa ADN bằng 3 lần thể tích cồn tuyệt đối và 1/10 thể tích sodium
acetat 3M
9 Để ở nhiệt độ -20"C qua đêm
10.T.y tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phúi Dổ phần nối, thu cặn lắng
11.Ly tâm hút chân không hoặc để ở nhiệt độ 45°C trong thời gian 30 phút đến 60 phút
Trang 31
M4———À———> ®———————->
Hình 3: Hình ảnh điện đi sản phẩm PCR của KST SR ?*/4feqparum và F.vax
tách từ tiêu bản muỗi khó,
A San phẩm PCR của KST được tách bằng phương pháp Cbelcx-100 B San phẩm PCR của KST được tách bằng phường pháp Phcnol
M: thang chuẩn pBIR322/1TaeTIT
4.2 Thử nghiệm ELISA xác định mức độ nhiễm KST sốt rét của muối Andiruy va An.minimus ủ Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
Bảng 2 trình bày kết quả thử nghiệm ELISA để xác định mức độ nhiềm KSTSR cia 2 loai mudi Andirus va An.minimus & Khánh Phú, Khánh Vĩnh,
Khánh Hoa 6 day mu vat thử nghiệm được lấy ở hai giai doan: 1993- 1998
và 1999- 2005
Musi Andirus va An minimus & giai doan 1993- 1998 nhiém KSTSR rat cao (7,76% va 6,53%) Mức độ nhiễm KST sốt rét của Án.đi+v cũng thấp hơn sơ với giai đoạn trước (4,25 so với 7/76) Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm KSISR của loài muối này vẫn còn rất cao (4,259),
Một điều đáng lưu ý là tỷ lệ thành phần loài P/zlcipariơn bao giờ cũng
cao hon P.vivax Mức độ nhiễm KST phối hợp thay đối từ 2.2255 đến 4,58%
Trang 33Hình 5: Thử nghiệm KLISA cho kết quá dương tính với P.virax A3: chứng dương B2 đến H2: chứng âm D6 và G10; mẫu đương tính
443 Thứ nghiệm PCR đánh giá mức độ nhiễm KST sốt rét ở muỗi An.dirus và An.minimas ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
4.3.1 Thứ nghiệm PCR với những mẫu vat dd lam ELISA va mau muối khơ
Tồn bộ dịch nghiền của các mẫu vật thử nghiệm EJLISA cho kết quả
đương tính (mật độ quang lớn hơn 3 lần trung bình chứng âm) và 36 mẫu có biện mầu nhưng với mật độ quang nhỏ hơn 3 lần trung bình chứng âm đã được phân tích bằng PCR Kết quả so sánh lương quan đương tính RLISA vi PCR được thể hiện ở bảng 3
Có thể thấy rằng, kết quả thử nghiệm PCR và ELISA rất phù hợp nhau
(p > 0,05) Trong số 291 mấu dương tính bằng thử nghiệm EL.ISA tỷ lệ KST
P faiciparum chiém uu thé 261= 74 23%) sau dé la P vivax (64 1,99%), tỷ
lệ nhiễm phối hợp 2 loại KST P fateiparum và P.ivax là 3,78% (11 trường
hợp)
Thử nghiệm PCR cho két quả tương tự: tất cả các trường hợp dương tính
trong thử nghiệm ELISA đều dương tính khi thử nghiệm PCR Tỷ lệ KST
Trang 34Pjfideiparum, P.vivax và nhiễm phối hợp trong thử nghiệm PCR lần lượt là: 73,20%; 20,27% và 6,53%,
Bảng 3 So sánh kết quả dương tink giita thir nghiém ELISA va PCR trong đánh giá nhiễm KST của An.dirus và An.minimus ở Khánh Phú Andirus An.mininus is h [PCR |ELISA [PCR Số mẫu phân tích | Í 93 |291 |29L [P#Meiparwm | Z1 6 |213 | P vivax 13 64 a P.ft Pv 9 Pvt Pam s P.i+P.m `
Ghi ch: * không thử ELISA vì không có kháng thể đơn dòng của P.malariae
Tỷ lệ nhiễm phối hợp phát hiện bằng PCR cao hơn hẳn với HILISA là do trong FLISA không sử dụng kháng thể đơn dòng của P.malariae Thử nghiệm PCR đã phát hiện một trường hợp muỗi Az.điws và một trường hợp muỗi Anuminimus nhiễm phéi hop ba loai kf sink tring: P falciparum, P.vivax, và
P malariae, Chita phat hiện teudng hyp mudi ahiém KST P.ovate oho
“Trong 36 trường hợp thử nghiệm IiLISA có hiện mau nhưng chỉ số mật
độ quang nhỏ hơn ba lần trung bình mẫu chứng âm, thử nghiệm PCR đều cho kết quả âm tính Trong số 120 mẫu muỗi khô thu thập từ 1993 (gồm 60 mudi
An.dirus vi 60 mudi An.minimus) thử nghiệm bằng PCR thay 6 muỗi có
PjJalciparem (2 An.difus và 4 An.mintma); 3 nhiễm P.vivax (2 Andirus, t Anrminimus) và một trường hợp (An.dirus) nhiềm phối hợp P./aleiparim và
P.vivax, Đa số các trường hợp thử nghiệm EI.ISA trước năm [998 là mẫu thu
thập trong các năm 1993, 1994, 1995 được giữ ở nhiệt dộ 75”
Trang 35Hình 6 cho thấy một trường hợp nhiểm 3 loại KST Pfafciparem
P vivax và Pamalariae ở muỗi Án dừng
Hình 6: Hình ảnh muỗi Az.đữøs nhiễm 3 loại KSTSR Cột 1: thang chuẩn pBR322/l lacTII : Pfalciparum Cot 3: P.vivax Cột 4: P.malariae Cột m tính của P.ovale
4.3.2 Thử nghiệm PCR xác định loài KST của thoa trùng trong muối
Số liệu mình bày ở bảng 4 dưới đây cho thấy kết quả của việc sử dụng kỹ
thuật CR để xác định thành phần loài thoa trùng nhiễm ở muỗi trên tiêu bản
khô, nhuộm giêm sa để lâu ngày (tất cả các tiêu bản được phân tích
mổ và lầm tiêu bán trước năm 1998)
được
Như vậy tất cả các thoa trùng mổ được tiv mudi Andirus và Án mininuts
ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà đều là KSTSR ở người Cũng giống với
kết quả thử ELISA, thành phần KSTSR thấy trong tuyến nước bọt muỗi gồm
có 3 loài: P falciparum, P.vivax, và Pmalarrae, Trong dé P falciparum chiém uu thé (Andirus: 69,44%; Anwminimus: 72,41% và chung cho cả 2 loài là
Trang 3670,77%) Tỷ lẻ nhiễm phối hợp 2 đến 3 loại ký sinh trùng là 8,33% đối với An.diris, 6,90% đối với An minimus và 7/70% cho cả 2 loài
Bang 4 Kết quả phân tích thành phân loài KSTSR từ các tiêu bản thoa trùng,
nhuộm giêm sa tại Khánh Phú thu thập trong giai đoạn 1993- 1998 TAndirus | An.mininas | Tổng cộng tiêu Tht 36 738 7 7 J7 Ì nghiệm Số cổ KSTSE người cence 1g.)))H | 29 65 iz falciparum 46 (70,77%) | Pvivax 8 (22,22%) 69%) (154m) 10.28%) ]1(3455) 3.08%) PT (028%) | T4) | [1 (028%) | 2,08%) \
4.4 Diéu tra bé sung, mé mudi, kiém tra bằng ELISA, PCR xác định mức
do nhiém KSTSR cia mudi An.dirus và An.minimus giai doan 2002- 2005, Đã tiến hanh 7 dot diéu tra bé sung s6 liéu vé mudi Andiruy va Anamiiumus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà, trong đó chủ yếu bắt
được muỗi An.dirux bằng phương pháp mồi người Một phần rất ít được xử lý
tại thực địa còn đa số được đem vẻ phòng thí nghiệm tại Là Nội Muối s
8
được mổ, soi bang kính hiển ví quang học, những trường hợp dương lính đều
được kiểm tra lai bang ELISA va PCR
Kết quá nghiên cứu về An 4irws được trình bày tại bảng 5, hình 7, 8
Trang 37
Bảng 5: Kết quả điều tra bổ
của An.dinss tại thí điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà trang các năm từ 2002 đến 2005 Ing và xác định vai trò truyền bệnh 2004 | 2005 TTầng công | \ I i [I7 |230 1937 10/88 ]145 T139 lượng có thoa trùng |6 I Ọ ï 7 TT Tiás li tạp] 33a 7 5 lee by ng 1 1 | —E= [2 7 | 10 Pfatciparum (5 0 TT ụ vod TT “NT ey Oo” U 27 —a
[Bieleiparon Revive NTO J8 |G Te
Trong giai đoạn từ 2002- 2005, mật độ muỗi bắt được bằng phương, pháp môi người thấp nhất là 0,98, cao nhất 4,35, trung bình 1.99 con/ người/
đêm Tỷ lệ muỗi có thoa trùng từ 1,69 dến 4,72%, trung bình 3,32% Kết quả
kiểm tra bằng ELISA và PCR đều giống nhau và khẳng định đây là thoa trùng
KSTSR ở người Trong 10 trường hợp nhiễm ký sinh trùng có 7 trường hợp là
Pfalcipanun, 2 trường hợp P.vivax và một trường hợp nhiễm phối hợp 2 loài KST: P/ulciparum + P.vivax
Hầu bết các trường hợp nhiễm thoa trùng đều có mật độ rất cao Hình 7
là hình ảnh của một trường hợp nhiém P falciparum cia Andirus di dược
kiểm tra khẳng dịnh bằng EI.ISA và PCR
Trang 38
Hinh 7: Thoa tring P,falciparum ở tuyến nước bọt muỗi Án.dirws Hình 8 cho thấy một trường hợp nhiễm #,risax rất cao ở đa đầy của một muỗi An.dirus khác, KST đã được khẳng định bảng PCR
Tình
Đối với muỗi Azminimaus, trạng 4 năm chỉ bắt dược 1 Anminimus bằng
Nang trùng P.vivax ở dạ dày muỗi An.diruy
phương pháp mỗi người, còn lại chỉ bắt được bọ gây Kết quả kiểm tra Bằng PCR cho thay uit ed déu 1a Ansminimus C
Trang 394.5 Xác định vai trò truyện bệnh của An.minimus và An.dirus tai Khanb Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà qua kết quả ELISA va PCR
4.5.1 Val rd truyén bénh cla An.minimus
Kết quả phân tích bằng ELISA va PCR (bang 2, 3, 4) cho thay ti nam 1998 trở vẻ trước, mức độ nhiễm KST sối
qua phân tích ELISA và 6,61% qua phân tích PCR) trong đó chủ yếu là KST P falciparum (80,64%) Từ năm 1999, do bat được ít muỗi nên số lượng muỗi
\ của An.minimus khá cao (6,53%
thử nghiệm chỉ cớ 10 con, chưa thấy có muỗi nhiễm KẾT sốt rét Như vậy mudi Anvminimes ti mot vectơ sốt rét chủ yếu ở Khánh Phú giai đoạn 1998 trở về trước Trong giai đoạn hiện nay, tuy mật độ muỗi đã giảm thấp nhưng cần chứ ý theo đõi sự phục hồi quản thể của loài muỗi này
4.5.2 Vai trò truyền bệnh của An.dirus
Qua phân tích các vật mẫu cũ và mẫu vật mới bổ sung (bảng 2, 3, 4)
Trang 405 BẢN LUẬN
5.1L Hoàn thiện một số quy trình tách chiết ADN của KSTSR ở các mẫu đã thử nghiệm ELISA, mẫu muỗi khô, mẫu thoa trùng
Thường thì khi bắt dầu việc nghiên cứu ADN một đối tượng nào đó, việc tách chiết ADN được tiến hành bằng cách sử dụng các bộ KiL có sẵn Khó khản lớn cho những người làm nghiên cứu là vấn đẻ kinh phí vì giá cả của các
bộ KiL này không nhỏ
Việc tách chiết cứu ADN của KSTSR trong máu người ở
nghiê
nước ta đã được tiến hành từ những năm 90 của thế kỷ trước và các nhà nghiên
ADN nghiên cứa KSTSR
cứu đã ứng dụng thành công các quy trình tách chỉ
ở máu người có hiệu quả [1,2,3,10,13]
Hai phương pháp tách chiết ADN bằng Chelex- 100
tủa bằng cồn là những phương pháp đã được sử dụng để nghiên cửu trên nhiều à bằng Phenol,
đối tượng sinh vật khác nhau, trong dé có KSTS§R và muỗi sốt rét [19,22,28,29,32]
Dựa vào những quy trình tách chiết AI3N của RSTSR ở mẫu máu
người, chúng tôi đã áp dụng và rút ra quy trình tách chiết ADN cúa KSTSR ở những tiêu bản muỗi gâm có mẫu đã sử dụng để tách chiết ADN, mẫu mudi
khô dễ lâu ngày, mẫu các thoa trùng mổ tự nhiên
Cả hai phương pháp tách chiết AI2N bằng Chelex-L00 và tách chiết ADN bằng Phenol, rửa cồn đền có thể sử dựng trong nghiên cứu KSTSR ở
muỗi Vì có cùng một phương pháp tách chiết ADN, mà ADN tổng số cửa
muỗi nhiều, đễ phát hiện hơn nên đã được dùng làm dấu hiệu nhận biết kết quá của phương pháp tách chiết Sau đó, bằng phản ứng PCR lỏng sẽ kiểm tra sự có
mặt của KSTSR trong muỗi
Kết quả tách chiết ADN KSTSR của chúng tôi cũng cho ra sản phẩm cung cấp nguồn vật Hiệu tốt cho phản ứng PCR giống với các nghiên cứu của
các tác giả trước[24.27,36]
5.2 Ứng dụng kỹ thuật ELISA, PCR đánh giá mức độ nhiễm KSTSR và
xác dịnh vai trò truyển bệnh của muỗi An.minimus, Andirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà