Nghiên cứu thử nghiệm khả năng ức chế hoạt tính lipase của chủng helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân sử dụng một số hợp chất tách chiết từ cây dược liệu

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm khả ức chế hoạt tính lipase chủng Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân sử dụng số hợp chất tách chiết từ dược liệu H P U Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thị Vinh Hoa Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế cơng cộng Mã số đề tài: YTCC_CS45 H Năm 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm khả ức chế hoạt tính lipase chủng Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân sử dụng số hợp chất tách chiết từ dược liệu H P U Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thị Vinh Hoa Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế cơng cộng Cấp quản lý: Trường Đại học Y tế công cộng Mã số đề tài: YTCC_CS45 Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 Tổng kinh phí thực đề tài 130,8 triệu đồng Trong đó: kinh phí SNKH triệu đồng Nguồn khác: 130,8 triệu đồng H Năm 2015 Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp sở Tên đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm khả ức chế hoạt tính lipase chủng Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân sử dụng số hợp chất tách chiết từ dược liệu Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thị Vinh Hoa Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y tế công cộng Cơ quan quản lý đề tài: Trường Đại học Y tế công cộng Thư ký đề tài: CN Nguyễn Thị Huyền Trang Phó chủ nhiệm đề tài ban chủ nhiệm đề tài: khơng có Danh sách người thực chính: - ThS Phạm Thị Vinh Hoa - TS Đặng Thế Hưng - CN Nguyễn Phương Thoa - CN Nguyễn Thị Huyền Trang Các đề tài nhánh (đề mục) đề tài: khơng có Thời gian thực đề tài từ tháng 08 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 H P H U Những chữ viết tắt µl Micro-liter B Berberine BHI Brain heart infusion bp Base pair (cặp nucleotide) C Cytosine CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) FBS Fetal Bovine Serum g Gram G Acid glycyrrhizic ml Mili-liter mM Mili mole/liter PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Q Quercetin Rf Hệ số di chuyển TLC Thin layer chromatography (Sắc ký mỏng) H U H P Mục lục Phần A: Báo cáo tóm tắt nghiên cứu * Tóm tắt tiếng Việt * Tóm tắt tiếng Anh (Abstract) Phần B: Tóm tắt kết bật đề tài Phần C: Nội dung báo cáo chi tiết kết nghiên cứu đề tài cấp sở Đặt vấn đề 1.1 Tóm lược nghiên cứu nước liên quan đến đề tài Tính cấp thiết cần nghiên cứu đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan đề tài 2.1 Bệnh dày 2.2 Vi khuẩn Helicobacter pylori 2.3 Lipase với vi khuẩn Helicobacter pylori 2.4 Nguồn thảo dược để phát triển thuốc ức chế H pylori 2.4.1 Tiềm phát triển thuốc từ thảo dược 2.4.2 Một số thảo dược sử dụng thuốc trị bệnh dày 10 2.4.3 Khả ức chế vi khuẩn H pylori số dịch chiết thảo dược 10 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 13 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Thu nhận mẫu sinh thiết nuôi cấy phân lập H pylori 13 3.2.2 Thử nghiệm khả ức chế chủng H pylori ba dịch chiết tổng số 15 3.2.3 Thử nghiệm khả ức chế hoạt tính lipase ba dịch chiết từ thảo dược 15 3.2.4 Phân tích mẫu thảo dược sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) sắc ký cột 16 3.3 Y đức 16 Kết nghiên cứu 17 4.1 Nuôi cấy phân lập H pylori 17 4.2 Thử nghiệm khả ức chế chủng H pylori ba dịch chiết thảo dược 20 4.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế lipase ba dịch chiết tổng số 21 4.3.1 Thiết lập quy trình thử lipase 21 4.3.2 Kết thử hoạt tính ức chế lipase ba dịch chiết tổng số 22 4.3.3 Ước lượng hàm lượng chất chuẩn có dịch chiết sắc ký mỏng 23 4.3.4 Phân tích ba mẫu dược liệu sắc ký mỏng sắc ký cột 24 Bàn luận 26 Kết luận kiến nghị 27 6.1 Kết luận 27 6.2 Kiến nghị 27 Tài liệu tham khảo 27 H P H U Phụ lục 32 Phụ lục 1: Đường kính vịng phân giải chất 32 Phụ lục 2: Quy trình phân lập nuôi cấy Helicobacter pylori từ mẫu mô sinh thiết 33 Phụ lục 3: Kết trình phân lập H pylori từ 30 mẫu mô sinh thiết 40 H P H U H P H U Phần A: Báo cáo tóm tắt nghiên cứu NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH LIPASE CỦA CHỦNG HELICOBACTER PYLORI PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN SỬ DỤNG MỘT SỐ HỢP CHẤT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU Ths Phạm Thị Vinh Hoa, TS Đặng Thế Hưng, CN Nguyễn Phương Thoa, CN Nguyễn Thị Huyền Trang (Phòng Xét nghiệm trung tâm Y tế công cộng, Trường Đại học Y tế công cộng) * Tóm tắt tiếng Việt Bệnh dày ngày phổ biến quan tâm nhiều giới Việt Nam mức độ phổ biến bệnh ảnh hưởng xấu đến sức khỏe Năm 1982, Warren Marshell xác định nguyên nhân gây phần lớn bệnh lý liên quan đến dày viêm loét dày, ung thư dày loại vi khuẩn đường ruột có tên Helicobacter pylori (H pylori) Trước đây, phần lớn phác đồ điều trị dày sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh có hiệu cao Tuy nhiên, gần số liệu điều tra cho thấy vi khuẩn có khả kháng ngày nhiều loại kháng sinh thông dụng Các chủng kháng thuốc xuất gây khó khăn kéo dài H P thời gian điều trị bệnh với tác dụng phụ không mong muốn Phịng Xét nghiệm trung tâm Y tế cơng cộng thuộc Trường Đại học Y tế công cộng đơn vị mới, đầu tư nhiều trang thiết bị đại nhiên nguồn nhân lực non yếu kỹ kinh nghiệm nghiên cứu lâm sàng Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm khả ức chế hoạt tính lipase U chủng Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân sử dụng số dịch chiết từ thảo dược” với mục tiêu nâng cao lực nghiên cứu cho cán phịng xét nghiệm, xây dựng quy trình thao tác chuẩn phân lập, nuôi cấy thử nghiệm hoạt H tính vi khuẩn; đồng thời nghiên cứu sàng lọc số loại dược liệu có hoạt tính tiềm để phát triển thuốc Nhóm nghiên cứu xây dựng thử nghiệm thành công quy trình ni cấy phân lập vi khuẩn H pylori từ mẫu mơ sinh thiết phịng xét nghiệm trường Mười tám mẫu mô sinh thiết nuôi cấy phân lập thành công tổng số ba mươi mẫu mô thu nhận (đạt tỷ lệ 60%) Nghiên cứu sử dụng ba dịch chiết tổng số hoàng liên, nghệ vàng trầu khơng có sẵn thu nhận từ đề tài Bộ Khoa học Công nghệ (106-NN.02-2013.55) để thử hoạt tính ức chế dịch chiết lên vi khuẩn H pylori phân lập Kết phân tích cho thấy dịch chiết tổng số có hoạt tính kháng khuẩn cao có hoạt tính ức chế hoạt động enzyme lipase mạnh Ứng dụng quy trình này, nhóm nghiên cứu thử nghiệm thêm dịch chiết tổng số từ đậu rừng thu kết hoạt tính ức chế vi khuẩn mạnh Để tiến hành sâu thêm, nhóm nghiên cứu đề xuất tiếp tục phân tách dịch chiết tổng số thành phân đoạn nhỏ, thử nghiệm hoạt tính phân đoạn, tách chiết sàng lọc tới sản phẩm cuối để nghiên cứu hợp chất kháng khuẩn tách chiết từ thiên nhiên cho điều trị viêm loét dày * Tóm tắt tiếng Anh (Abstract) STUDY THE INHIBITION OF HELICOBACTER PYLORI LIPASE ACTIVITY BY USING THE MEDICINAL PLANT EXTRACTION Pham Thi Vinh Hoa, Dang The Hung, Nguyen Phuong Thoa, Nguyen Thi Huyen Trang (Public Health Center Laboratory, Hanoi School Of Public Health) Helicobacter pylori, previously named Campylobacter pyloridis, has been associated with many important gastro-duodenal diseases including peptic ulcers and gastric cancers since first isolated by Marshall and Warren in 1982 These bacteria usually persist in the gastric mucus for life once acquired, unless the patients are treated with appropriate antimicrobial chemotherapy According to recent reports, approximately half of the world population is infected with H pylori, and in developing countries including Vietnam, this ratio goes up to 70% H P Traditional medicinal plants are extremely abundant in Vietnam and many have been showed to have the inhibitory effect against bacteria including H pylori (Book on Vietnam medicinal plant) However, the molecular mechanism of this effect has not been completely understood To effectively develop a new therapeutic drug, it is necessary to identify the substances/compounds responsible for the inhibitory effect U The objectives of this study are to isolate the H pylori from biopsy samples, using those strains for testing the inhivition of lipase activities and H pylori Additionally, the study also strentheng and improve the research abilities for staffs of Public health Center Laboratory in Hanoi School of Public Health H We were successfully isolated 18 H pylori strains from 30 biopsy samles The extracts from Coptis teeta Wall, Curcuma xanthorrhiza Roxb, Piper betle , and even in “forest bean”, which was not identified yet, demonstrated strong anti-H pylori activities in both ethyl acetate and methanol Using several previously identified antiH pylori compounds as standards, we analyzed their presence in each medicinal plant by thin layer chromatography Herbal plants with abundant amounts of standard compounds could serve as starting material for large-scale production; except for Piper betle and “forest bean” that did not show trace of the standards while still being capable of inhibiting H pylori were subsequently analyzed using column chromatography for further identification of the active substances Phần B: Tóm tắt kết bật đề tài Kết bật đề tài (a) Đóng góp đề tài - Nghiên cứu thử nghiệm khẳng định hoạt tính kháng khuẩn in vitro dịch chiết tổng số đậu rừng, loại sử dụng thuốc dân gian người dân tộc Thái thuộc tỉnh Điện Biên (b) Kết cụ thể (các sản phẩm cụ thể) - Xây dựng quy trình phân lập nuôi cấy H pylori từ mẫu mô sinh thiết phòng xét nghiệm trường Đại học Y tế cơng cộng - Xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế tính kháng khuẩn sử dụng dịch chiết dược liệu - H P Kết thử nghiệm: khẳng định hoạt tính ức chế lipase hồng liên, nghệ vàng, trầu khơng đậu rừng Trong đậu rừng có hoạt tính ức chế mạnh, tiến hành nghiên cứu để xác định hợp chất có hoạt tính (c) Hiệu đào tạo - Đào tạo kỹ thuật cho cán phịng xét nghiệm: ni cấy phân lập H U pylori, kỹ thuật sinh học phân tử, tách chiết dịch chiết tổng số từ dược liệu, kỹ thuật thử nghiệm hoạt tính dịch chiết in vitro - Phối hợp Phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ Enzyme – Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đào tạo sinh viên cao học chuyên ngành Sinh học H (d) Hiệu xã hội - Nghiên cứu bước đầu thử nghiệm thành công khả ức chế H pylori số hợp chất từ dược liệu Nếu tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, nhóm nghiên cứu hi vọng tìm hợp chất ức chế mới, hỗ trợ điều trị viêm loét dày tách chiết từ thảo dược Áp dụng vào thực tiễn đời sống xã hội - Nghiên cứu bước đầu tạo tiền đề cho nghiên cứu hợp chất thảo dược có hoạt tính ức chế H pylori, hỗ trợ điều trị viêm loét dày, có khả sử dụng rộng rãi cộng đồng thử nghiệm lâm sàng Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu phê duyệt [ ] Nguyễn Ngọc Lanh (1999), Cơ chế bệnh sinh loét dày tá tràng, Bài giảng sau đại học, Bộ môn miễn dịch- Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội [8] Tạ Long (2003), Bệnh lý dày- tá tràng vi khuẩn Helicobacter pylori, Nhà xuất Y học [9] Tạ Long, Trần Ngọc Bảo, Phạm Thị Thu Hồ, (2012) Đồng thuận chẩn đoán điều trị nhiễm Helicobacter pylori Việt Nam Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt Nam, 7(29): p 1929-194 [10] Bùi Tất Lợi, (2004), Những thuốc quý vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học [11] Vũ Nam (2000), Bước đầu Nghiên cứu tác dụng diệt Helicobacter pylori hoạt chất toàn phần trầu không thực nghiệm viêm dày mạn tính, kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học, Viện Y học cổ truyền Việt Nam H P [12] Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, (2010) Khảo sát tính kháng thuốc chủng Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân viêm dày mạn tính, loét dày ung thư dày Tạp chí Y học thực hành 4( 12): p 20-22 [13] Nguyễn Đức Toàn, Nguyễn Văn Thịnh, Nguyễn Thị Nguyệt, Dương Thu Hương, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2012 Tình hình kháng kháng sinh Helicobacter pylori bệnh nhân viêm dày loét tá tràng Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt Nam, (2 ): p 1783-1788 U H [14] Lê Trung Thọ, Trần Văn Hợp, Phạm Bình Nguyên (2007) Nghiên cứu mô bệnh học tỷ lệ nhiễm H pylori bệnh nhân viêm dày mạn tính Y học TP Hồ Chí Minh, Vol.11, Supplement of No.3-2007, 68–74 Tài liệu tiếng Anh [15] Blundell, T.L (1994) Metalloproteinase superfamily and drug design Nat Struct Biol 1: 73-75 [16] Björkholm B.M., Oh J.D., Falk P.G., Engstrand L.G., Gordon J.I (2001) Genomics and proteomics converge on Helicobacter pylori Curr Opin Microbiol 4(3):237-45 [17] Castillo-Juarez I, Gonzalez V, Jaime-Aguilar H, Martinez G, Linares E, Bye R, Romero T (2009), “Anti-Helicobacter pylori activity of plants used in Mexican traditional medicine for gastrointestinal disorders”, Journal of Ethnopharmacology, Volume 122, Issue 2, pp 402-405 28 [18] Cave D.R (1999), Helicobacter pylori: Epidemilory and pathogenesis, clinical practice of gastroenterology Curr medicin, 36(1), 249-254 [19] Cheng-Dong Zheng, Ya-Qing Duan, Jin-Ming Gao1, Zhi-gang Ruan, (2010), Screening for anti-lipase proterties of 37 traditional Chinese medicinal herbs, Journal of Chinese medical asociation Volume 71, Issue 6, pp 319-324 [20] Cremonini F1, Di C S, Covino M., Armuzzi A., Gabrielli M., Santanrelli L., Nista E.C., Cammarota G., Gasbarrini G., Gasbarrini A (2002), “Efect of different probiotic preparation on anti-Helicobacter pylori therapy-related side effects: a parallel group, triple blind, placebo-controlled study”, The American Journal of Gastroenterology 97, pp 2744-2749 [21] Jeannet W Helicobacter species: Methods and Protocols, methods in Molecular Biology, vol 921, Chapter H P [22] Jung J., Choi J S and Jeong C S (2014), “Inhibitory activities of palmatine from Coptis chinensis against Helicobactor pylori and gastric damage”, Toxicological research, 30(1), 45-48 [23] Leen Jan van Doorn, Yvonne Henskenes, Nathalie Nouhan et al (2000) The efficacy of laboratory diagnosis of H pylori infections in gastric biopsy specimens is related to bacterial density and vacA, cagA and iceA genotypes Journal of clinical microbiology, Jan, p 13-17 Vol.38, N0.1 U [24] Livingston, D.M & Leder, P (1969) Deformylation and protein synthesis Biochemistry 8: 435–443 H [25] Ma F., Chen Y., Li J., Qing H P., Wang J D., Zhang Y L., Long B.G and Bai Y (2010), “Screening test for anti-Helicobacter pylori activity of traditional Chinese herbal medicines”, World Journal of astroenterology., 16(44), 5629-5634 [26] Manfred stolte, Alexander Meining (2001) The updated Sydney system: Classification and Grading of Gastritis as the basis of Diagnosis and Treatment Gastroenterology Vol 15 No [27] Michael F Dixon, Robert M Genta, John H Yardley et al (1996) Classification and grading of gastritis The updated Sydney system The American journal of surgical pathology, 20(10), 1161-1181 [28] Parsonnet J (1995) The incidence of Helicobacter pylori infection Aliment Pharmacol Ther, 9(2):45-51 29 [29] Piotrowski, J., A Slomiany, J Liu, Z Fekete, and B L Slomiany (1991) Effect of nitecapone on the proteolytic and lipolytic activities of Helicobacter pylori Biochem Life Sci Adv 10:79-83 [30] Ruiz C., Falcocchio S., Pastor F.I.J, Saso L., Diaz P (2007) Helicobacter pylori EstV: Identification, cloning and characterization of the first lipase from epsilon Proteobacterim, Applied ang Enviromental Microbiology, pp 2423-2431 [31] Slomiany, B L., C Kasinathan, and A Slomiany (1989) Lipolytic activity of Campylobacter pylori: effect of colloidal bismuth subcitrate (De-Nol) Am J Gastroenterol 84:1273-1277 [32] Slomiany, B L., H Nishikawa, J Piotrowski, K Okazaki, and A Slomiany (1989) Lipolytic activity of Campylobacter pylori: effect of sofalcone Digestion 43:33-40 -16 H P [33] Slomiany, B L., J Piotrowski, H Mojtahed, and A Slomiany (1992) Ebrotidine effect on the proteolyitc and lipolytic activities of Helicobacter pylori Gen Pharmacol 23:203-206 [34] Slomiany, B L., J Piotrowski, and A Slomiany (1992) Effect of sucralfate on the degradation of human gastric mucus by Helicobacter pylori proteases and lipases Am J Gastroenterol 87:595-599 U [35] Tokunaga Y, Shirahase H, Yamoto E et al (2000) Modified rapid urease test for H pylori detection in relation to an immunohistochemical stain PubMed 2000 Jun,15(6), 617-21 H [36] Toshio Fukai, Ai Marumoa, Kiyoshi Kaitoub, Toshihisa Kanda, Sumio Teradab, TaroNomuraa, (2002), Anti-Helicobacter pylori flanovoids from licorice extract, Life Sciences, Volume 71, Issue 12, pp 1449-1463 [37] Wenming W., Yunsheng Y., Gang S (2012) Recent Insight Into Antibiotic Resistance in Helicobacter pylori Eradication Gastroenterology Research and Practice [38] Yan-Chuen Wang and Tung-Liang Huang, (2005), Screeening of antiHelicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants, FEMS Immulogy & Medical Micrology, Volume 43, Issue 2, pp 295-300 [39] World Cancer Report 2014 World Health Organization Chapter 1.1 [40] Zaidi S F., Yamada K., Kadowaki K., Usmanghani K., Sugiyama T (2009), “Bactericidal activity of medicinal plants, employed for the treatment of 30 gastrointestinal ailments, against Helicobacter pylori”, Journal of Ethnopharmacology, 121(2), 286-291 H P U H 31 Phụ lục Phụ lục 1: Đường kính vịng phân giải chất TT Mẫu Đường kính vịng phân giải (cm) Đối chứng dương Nghệ vàng Hoàng liên uế 1,5 Quán chúng 1,3 Bồ công anh Cam thảo Bạch truật Dạ cẩm 10 Chè dây 11 Thổ phục linh 12 Kim ngân hoa 13 Tô mộc 3,3 14 Bắc mộc hương 2,7 H P 1,3 2,2 H U 3,2 2,8 Quy ước: Đường kính vịng phân giải chất tính đường kính lỗ đục Những lỗ khơng có vành phân giải không ghi cm mà ghi vành phân giải Hoạt tính ức chế hoạt động enzyme lipase đánh giá ( ) Đường kính lớn 1cm nhỏ 1.9 cm đánh giá ( ) Đường kính lớn 1.9 cm nhỏ 2.2 cm đánh giá ( ) Đường kính lớn 2.2 cm tính ức chế khơng ức chế 32 Phụ lục 2: Quy trình phân lập nuôi cấy Helicobacter pylori từ mẫu mô sinh thiết QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NI CẤY HELICOBACTER PYLORI TỪ MẪU MÔ SINH THIẾT Mã hiệu : XNVSLS.QT.11 Lần ban hành : 01 H P Ngày hiệu lực U Người soạn thảo Họ tên Chữ ký Ngày ký H : 12/2015 Người kiểm tra Người phê duyệt 33 BẢNG THEO DÕI NHỮNG THAY ĐỔI Stt Ngày Trang Mục sửa đổi sửa đổi sửa đổi Nội dung sửa đổi Ghi H P U 10 H 34 Mục đích uy trình hướng dẫn thực phân lập nuôi cấy H pylori từ mẫu mô sinh thiết nhằm đảm bảo tất nhân viên khoa xét nghiệm hiểu tuân thủ Phạm vi áp dụng uy trình áp dụng Trung tâm xét nghiệm – Trường Đại học Y tế công cộng Trách nhiệm - Trách nhiệm thực hiện: Kỹ thuật viên, iảng viên - Trách nhiệm giám sát: uản lý kỹ thuật, iảng viên Thuật ngữ sử dụng - Sinh thiết: kỹ thuật lấy mô tế bào quan bị bệnh để xét nghiệm H P - PCR (Polemerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi polymerase) kỹ thuật nhằm tạo lượng lớn DNA quan tâm ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Yêu cầu vật liệu 5.1 Thiết bị: U - Tủ an toàn sinh học cấp II - Tủ ấm 35- 37oC - Tủ ấm 35- 37oC, 5-7 %CO2 - Kính hiển vi - Máy vortex - Máy li tâm - Nồi hấp vô trùng - Tủ lạnh - Máy PCR - Nguồn bể điện di H 5.2 Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, pipet pasteur vô trùng - Đ n cồn, que cấy vịng, que cấy nhựa vơ trùng - ăng tay, trang, đồ bảo hộ 35 - Lam kính - Đĩa petri vơ trùng - BD GasPakTM EZ campy gas generating pouch system, catalog # 260685, BD - Bơ can chứa cloramin 5%, có nắp đậy 5.3 Thuốc thử hố chất: - Bactident® Oxidase, catalog # 113300, Merck - Columbia blood agar base, catalog # CM0331, Oxoid - Helicobacter pylori selective supplement - Dent, code SR0147, Oxoid - Fetal Bovine Serum, catalog # F6765-100ML, Sigma Aldrich - Hydrogen peroxide 3% Bactident®, catalog # 111351, Merck - Urease strips Cat #24639 - Gram-color, catalog # 111885, Merck H P 5.4 Vật liệu khác: - Mũ, trang - ăng tay - uần áo công tác U Mẫu bệnh phẩm H Mô sinh thiết bệnh nhân viêm loét dày – tá tràng Nguyên lý xét nghiệm Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, tính chất sinh vật – hóa học vi khuẩn để ni cấy phân lập Quy trình thực Bước 1: Thu nhận mẫu mô sinh thiết Mẫu mô sinh thiết bệnh nhân viêm loét dày – tá tràng thử khẳng định xét nghiệm test urease, nhuộm iemsa quan sát kính hiển vi để xác định có mặt vi khuẩn H pylori a Nhuộm Giemsa - Cố định mẫu sinh thiết lam kính - Nhỏ dung dịch iemsa phủ kín vết cố định để nhuộm phút 36 - Rửa trôi nhẹ nhàng dung dịch nhuộm - Hong khơ lam kính quan sát kính hiển vi với vật kính dầu 100X b Test nhanh rapid urease test - Một phần mẫu mô sinh thiết niêm mạc lấy từ hang vị dày phết lên test Urease strips có chứa urê chất thị phenol đỏ - Ủ môi trường vi hiếu khí 37°C vịng 4h - Quan sát đổi màu test Các mẫu có kết dương tính urease đổi màu chất thị từ vàng sang màu đỏ Bước 2: Nuôi cấy - Các mẫu có kết dương tính urease với H pylori quan sát tiêu nhộm iemsa phát thấy vi khuẩn chuyển sang môi trường nuôi cấy H P - Mẫu sinh thiết nghiền ống Eppendorf chứa 10 l dung dịch 0,9% NaCl vô trùng, sử dụng que nghiền nhựa - Lấy ăng que cấy dịch nghiền mẫu, cấy ria lên môi trường thạch máu có bổ sung: 5% máu cừu; kháng sinh chọn lọc cho H pylori gồm vancomycin (10 mg/l), trimethoprim (5 mg/l), cefsoludin (5 mg/l), amphotericin B (5 mg/l); 1% huyết U thai bị - Ni cấy mơi trường vi hiếu khí nhờ túi tạo mơi trường aspak từ 3-5 ngày H o C Bước 4: Kiểm tra khuẩn lạc đĩa thạch cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ - Khuẩn lạc có kích thước nhỏ cỡ 0,1 mm, khơng màu, trong, bóng cấy chuyển sang đĩa thạch máu - Ni cấy mơi trường vi hiếu khí Bước 5: Khẳng định o C từ 3-5 ngày - Khuẩn lạc kiểm tra nhanh tính chất oxidase (dương tính), catalase (âm tính), urease (dương tính) nhuộm ram ( ram âm) để quan sát bắt màu thuốc nhuộm hình dạng tế bào - Vi khuẩn tiếp tục khẳng định phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa lipase, kích thước đoạn nhân lên tính tốn 921 bp Lipase_FW_1407: 5’ – ACTAAGCTTGAATAAGTAAATGGCC – 3’ 37 5’ – TGAGAATTCAGCCAACTAAGAC – 3’ Lipase_RV_1407: Biện luận đọc kết Vi khuẩn H pylori vi khuẩn có khuẩn lạc kích thước nhỏ cỡ 0,1 mm, khơng màu, trong, bóng Các tính chất sinh vật – hóa học: oxidase (dương tính), catalase (âm tính), urease (dương tính) ram âm Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân lên đoạn gen có kích thước 921 bp 10 Tiêu chuẩn đánh giá kiểm tra chất lượng - Các thiết bị, dụng cụ kiểm tra định kì, đảm bảo chất lượng - Các sinh phẩm hạn sử dụng, bảo quản tiêu chuẩn loại kiểm tra định kì đảm bảo chất lượng - Khơng nhận mẫu sau: H P - Mẫu để 2h khơng có mơi trường bảo quản - Mẫu môi trường bảo quản 24h - Mẫu không đủ thông tin không phù hợp với phiếu định - Ống đựng bệnh phẩm không vô trùng, không Khoa vi sinh cung cấp có chất sát khuẩn U 11 Quy định an toàn - Phải mang găng tay cầm mẫu thuốc thử H - Không ăn, uống,hút thuốc khu vực làm xét nghiệm - Xem tất mẫu bệnh phẩm nguồn nhiễm - Bệnh phẩm tất kĩ thuật tiến hành với bệnh phẩm phải thực tủ an toàn sinh học 12 Tài liệu liên quan - Hồ sơ liên quan: STT Tên tài liệu M số Sổ ghi kết nội soi sinh thiết Sổ theo dõi giao nhận bệnh phẩm VS.HP.2 trả kết xét nghiệm VS.HP.1 38 uy trình xử lý bệnh phẩm VS.HP.3 uy trình trả kết VS.HP.4 uy trình xử lý phơi nhiễm VS.HP.5 13 Tài liệu tham khảo Jeannet W Helicobacter species: Methods and Protocols, methods in Molecular Biology, vol 921, Chapter Nguyễn Mai Khánh, Phạm Thị Vinh Hoa, Võ Thị Phương, Phạm Bảo Yên (2015) Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa Carboxylesterase ESTV số chủng Helicobacter pylori phân lập Việt Nam Tạp chí Sinh học; 37(1):117-122 H P U H 39 Phụ lục 3: Kết trình phân lập H pylori từ 30 mẫu mô sinh thiết Chủng Oxidase Catalase Urease PCR + Kết luận Dương tính + - + - - + + - + + + + + - + + Dương tính + - + + Dương tính - - + + - - + - + 10 + - + 11 - + 12 + 13 + 14 + 15 + 16 + + + + Dương tính Âm tính H P U H - Âm tính Âm tính Âm tính + Dương tính + Dương tính Âm tính + Dương tính + Âm tính - - Âm tính - + + Dương tính + - + + Dương tính 17 + - + Dương tính 18 + + + Âm tính 19 + - + + Dương tính 20 + - + + Dương tính 40 Chủng Oxidase Catalase Urease Kết luận PCR 21 - - + Âm tính 22 + - + + Dương tính 23 + - + + Dương tính 24 + - - 25 + - + + Dương tính 26 + - + + Dương tính 27 + - - 28 + - + 29 - - + 30 + - + Âm tính Âm tính H P + Dương tính Âm tính + Dương tính U H 41 Phần D: Giải trình chỉnh sửa: Phần áp dụng sau đề tài thông qua Hội đồng nghiệm thu kết TT Góp ý chỉnh sửa Giải trình chỉnh sửa - Chuyển nội dung kết thử nghiệm Đồng ý chỉnh sửa, bổ sung hoạt tính 30 dịch chiết lên phần tổng tổng quan tài liệu 30 loại thảo quan Nếu kết nghiên cứu được tìm hiểu, xác định cơng bố trích dẫn tài liệu tham khảo, loại thảo dược sử dụng cho chưa công bố ghi tham nghiên cứu khảo nghiên cứu chưa công bố - Đánh số trang, chỉnh sửa số lỗi Đồng ý chỉnh sửa: đánh số thuật ngữ góp ý trang, sửa lỗi thuật ngữ - Bổ sung bảng kết chi tiết phân lập 18 Đồng ý bổ sung bảng kết mẫu chi tiết Phụ lục H P - Chỉnh sửa: định tính khả ức chế Đồng ý chỉnh sửa phần (có/khơng) thay cho định lượng (ức chế kết quả, bàn luận xác định khả 0% ) ức chế hoạt tính dịch chiết H U Hà Nội, ngày03 tháng 02 năm 2016 TM Nhóm nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài Phạm Thị Vinh Hoa 42