TÓM TẮT Chondroitin sulphate CS là một hợp chất thiết yếu trong quá trình điều trị các bệnh về xương khớp, có nguồn gốc từ thiên nhiên, trong cơ thể của động vật như vi cá, xương khớp cá
TỔNG QUAN
Tình hình chăn nuôi và chế biến gà
Tình hình chăn nuôi gà ở nước ta ngày càng phát triển mạnh Vùng chăn nuôi gà rộng khắp hầu hết trong cả nước Với số lượng đàn và tổng số lượng con ngày một gia tăng Mặc dù dịch bệnh diễn biến khá phức tạp nhưng ngành chăn nuôi gà có những biện pháp khác phục và duy trì đà phát triển khá tốt
Gà ở trong nước được nuôi dưới ba hình thức:
- Nuôi thả ở hộ gia đình với các giống gà trong nước như gà ri, gà mía, H‟mong, tre, ho, đông tảo, tam hoàng,… Chu kỳ nuôi từ 6†7 tháng, trọng lượng khoảng 1,2†1,5 kg/con, năng suất thấp, số lượng ít
- Nuôi bán công nghiệp từ 50 con đến 1 ngàn con, chu kỳ nuôi 70 - 90 ngày
- Nuôi công nghiệp từ 2†30 ngàn con trở lên (được nuôi từ năm 2001), chu kỳ nuôi 42†45 ngày, gà đạt 2,2÷2,4 kg
Sản lượng thịt gia cầm nước ta tăng nhanh trong những năm qua, năm 2005 chưa đến 360 ngàn tấn đến năm 2014 đạt 873,2 ngàn tấn Ước tính 6 tháng đầu năm 2015, đàn gia cầm nước ta có 311,1 triệu con, sản lượng thịt đạt 651,28 ngàn tấn (hình 2.1)(bảng 2.1)
Hình 2.1 Sản lƣợng thịt gia cầm ở Việt Nam
Bảng 2.1 Đàn gia cầm ở Việt Nam
Chỉ tiêu ĐVT Năm 2013 Năm 2014 Ước tính 6 tháng đầu năm 2015 Đàn gia cầm Triệu con 317.692 327.7 311.1 Đàn gà Triệu con 234.509 246.0 249.2
Tổng số đàn gia cầm bán Triệu con 473.1 476.7 339.3 Thịt gia cầm hơi Ngàn tấn 830.935 873.242 651.280
Nguồn: http://hoichannuoi.mard.gov.vn
2.1.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà
Lượng tiêu thụ thịt gia cầm cũng tăng mạnh, năm 2005 lượng tiêu thụ là 322 ngàn tấn, năm 2015 ước tính sẽ tiêu thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm lượng tiêu thụ tăng đến 267,7%
Tuy nhiên lượng tiêu thụ thịt gia cầm sẽ còn nhiều hơn nữa nếu tính theo số liệu tiêu thụ bình quân trên đầu người ở Việt Nam là 11,5 kg/người năm, thì với 90,5 triệu dân, năm 2015 lượng tiêu thụ sẽ trên 1 triệu tấn
2.1.3 Thịt gia cầm nhập khẩu vào Việt Nam
Hình 2.2 Tình hình thịt gia cầm nhập khẩu vào Việt Nam
Từ năm 2005 trở về trước, nguồn thịt gia cầm tiêu thụ ở Việt Nam hầu hết trong nước, lượng nhập khẩu tăng mạnh vào năm 2008, lên khoảng trên 80 ngàn tấn Từ đó đến nay dao động trong khoảng 35 – 50 ngàn tấn/năm
Trong 6 tháng đầu năm 2015, theo bài viết “Nhập khẩu gần 42 ngàn tấn thịt gà từ Mỹ” đăng trên baohaiquan.vn, tổng lượng thịt gà nhập khẩu là 69,8 ngàn tấn, chủ yếu từ Mỹ, Brazil và Hàn Quốc (gần 100% gà nguyên con được nhập từ Hàn Quốc, trong khi 98% đùi gà được nhập từ Mỹ; còn 70% cánh gà được nhập từ Brazil), ba quốc gia này chiếm trên 80% tổng lượng thịt gà nhập khẩu cả nước.
Tổng quan về Chondroitin sulphate
Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của CS
Chondroitin sulphate (CS) là mucopolysaccharide acid và phân bổ khắp cơ thể người, động vật có vú, động vật không xương sống và trong một số loài vi khuẩn [1] CS thuộc nhóm glycosaminoglycan (GAG) là một chuỗi polyme của hydratcarbon gồm các monome là các đơn vị disaccharide Đơn vị cấu trúc cơ bản của CS là disaccharide chứa nhóm glucuronic acid (GlcA) và N-acetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA β(1→3) GalNAc) (hình 2.4) tạo thành chondroitin sulphate glycosaminoglycan (CS-GAG) không phân nhánh Một chuỗi CS-GAG có thể chứa từ 20 – 40 đơn vị disaccharide
Mỗi CS được gắn vào nhóm serin của lõi protein bởi liên kết Tetra- saccharide xylose-galactoe-galactose-glucuronic acid (Xyl-Gal-Gal-GlcA) (hình 2.3) [2], [3]
Mỗi nhóm OH của CS-GAG được thay thế bởi nhóm sulphate (S) tại vị trí carbon C4 và C6 của GalNAc và vị trí carbon C2 và C3 của GlcA sẽ tạo ra các đồng phân của CS (hình 2.5) [4], [5]
Hình 2.4 Cấu trúc chính của CS
Hình 2.5 Các đồng phân của CS
Số lượng đồng phân của CS được tìm thấy rất nhiều Điều này cho thấy rằng, cấu trúc chuỗi CS không mang tính ngẫu nhiên và những chuỗi CS có thể chứa những thông tin sinh học, cấu trúc phân tử đặc biệt ảnh hưởng đến chu trình sinh học của cơ thể theo Robert M Lauder và các cộng sự (2009) [7], [8], [9]
Nguồn gốc của CS trên thị trường hiện tại được chiết xuất từ các nguồn như phụ phẩm của heo (lỗ tai và mõm heo), vi cá mập, khí quản bò, Tuy nhiên, sản phẩm CS trong các loại thuốc điều trị bệnh khớp thường là hỗn hợp 2 đồng phân CS A (chondroitin 4-sulfate) và CS C (chondroitin 6-sulfate) [10], [11]
Một trong những yếu tố quyết định đến giá trị của CS đó là chất lượng và sự công nhận của các cơ quan có thẩm quyền Một số sản phẩm có thể chứa hàm lượng CS ít hơn so với quy định đã đăng ký nhưng không nhỏ hơn 10%, và có thể dùng CS từ sụn khí quản động vật để thay thế cho sụn cá mập, giảm giá thành nhưng vẫn đảm bảo chất lượng của sản phẩm [12]
Tùy nguồn gốc xuất xứ mà CS có cấu trúc hóa học khác nhau và mỗi cấu trúc hóa học của mạch polyme khác nhau có chức năng sinh học khác nhau, do đó cần phải tiến hành kiểm tra chất lượng và nguồn gốc của CS trong các sản phẩm thương mại
2.2.4 Chức năng sinh học của CS
Khớp trong cơ thể động vật là bộ phận liên kết bao bọc làm cầu nối giữa 2 đầu xương, bao gồm bở nhiều loại mô khác nhau như sụn khớp, bao khớp, dịch khớp, dây chằng (hình 2.6)
Hình 2.6 Cấu tạo của khớp xương
Sụn khớp là các cấu trúc che phủ bề mặt của khớp xương và dịch bôi trơn
(joint oil) hay gọi là dịch khớp có tác dụng bảo vệ, đóng vai trò như miếng đệm giữa các khớp xương và tái tạo đầu xương kéo dài ở lứa tuổi đang phát triển [13]
Khi cử động, sụn khớp giúp cho xương hoạt động được nhịp nhàng và dịch khớp được tiết ra giúp bôi trơn các sụn khớp giúp tăng cường hiệu quả của các quá trình vận động Proteolycan là một trong các thành phần chính cấu tạo nên sụn khớp, tạo cơ chất xung quanh nền ngoại bào của mô liên kết của sụn khớp [2], [13]
Hình 2.7 Cấu trúc của proteoglycan
Proteoglycan là những polyanionic có chứa các chuỗi heteropolysaccharide liên kết với chuỗi polypeptide qua cầu nối Xyl-Gal-Gal-GlcA Các polysaccharide này gồm CS và hyaluronic acid chiếm 90% cấu trúc của proteoglycan
Quá trình tổng hợp của proteoglycan trong cơ thể tại các sụn khớp cần phải có mặt của CS, aminoacid và hyaluronic acid Dưới sự xúc tác của các enzyme và đặc hiệu trong cơ thể từng loài N-acetyl glucosamine và glucuronate tham gia phản ứng tổng hợp CS, hyaluronic acid và tạo thành proteoglycan để bồi dưỡng khớp cho sự vận động hằng ngày [14]
Proteoglycan có khả hấp thụ nước vào các mô tạo ra áp suất thẩm thấu dẫn đến sự giãn nở của các mô sụn Khả năng chịu lực của sụn khớp và xương là do độ đàn hồi của các mô sụn kết hợp với các mô bao khớp và dây chằng có thành phần chính là colagen tạo nên một hệ thống xương khớp bền vững
Vì vậy, CS và hyaluronic acid đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của mô sụn Acid hyaluronic cũng được tìm thấy trong dịch khớp [13], [15], [16]
2.2.5 Vai trò 2.2.3.1 Khả năng kháng viêm nhiễm của CS
CS ức chế hoạt động của TNF-α làm giảm chứng mắc bệnh viêm ruột và bệnh vảy nến (M.T Osterman và G.R Lichtenstein, 2007) [17] TNF-α có thể liên kết với CS (E) với nồng độ cao làm giảm chứng viêm khớp Theo J.W Cho và các cộng sự, CS sụn khí quản làm giảm nồng độ serum TNF-α trong chuột [18]
CS cũng ức chế biểu hiện của những phân tử tiền viêm, làm giảm IL-1β tạo ra sự hoán vị của NF-κB và TNF-α tạo ra NF-κB kháng viêm cho cơ thể theo ghi nhận của C Jomphe và các cộng sự (2007) [19]
2.2.3.2 Hỗ trợ điều trị viêm võng mạc
Theo sách “Matindale, The complete drug reference” (34th, ed, 2005) [20],
CS được dùng rộng rãi trong nhãn khoa nhằm tác dụng bôi trơn và bồi bổ nội mô giác mạc
Cũng theo sách tham khảo về dược nổi tiếng này, CS được dùng hỗ trợ điều trị trong phẫu thuật mắt (điều trị mô cườm, đục thủy tinh thể), dùng làm dung dịch bảo quản giác mạc dùng trong phẫu thuật ghép giác mạc, đặc biệt, làm thuốc nhỏ mắt để trị chứng khô mắt [13], [21] Đó là thành phần của giác mạc, có tác dụng tái tạo lớp màng bảo vệ mắt, CS được ghi nhận giúp giảm thiểu sự khô mắt, mỏi mắt, hỗ trợ điều trị một số bệnh về mắt
Tổng quan về enzyme protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide (hình 2.8) Cơ chế thủy phân như sau:
Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzyme chuyển sang trạng thái hoạt động
Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease Dạng monome và dime của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetrame
Hình 2.8 Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng [37], [38]
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) hình 2.9 Protease được phân chia thành 2 loại: Endopeptidase và exopeptidase
- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành 2 loại:
+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide
+ Carboxypeptide: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide
Hình 2.9 Sơ đồ phân loại protease
.- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành
+ Serin proteinase: Những protein chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng
+ Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
- Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
+ Protease acid: pH 2,0÷4,0 + Protease trung tính: pH 7.0÷8,0 + Protease kiềm: pH 9,0÷11,0
2.3.3 Cơ chế xúc tác của protease
Xúc tác được thực hiện bằng một trong hai cơ chế:
- Aspartic, glutamic và metallo protease kích hoạt một phân tử nước, thực hiện tấn công một tác nhân ái lực trên mạch peptide để thuỷ phân nó [38]
- Serine, threonine và cysteine protease dùng một tác nhân ái lực (thường là trong một bộ ba xúc tác)
Bước 1 acyl hoá: Hình thành liên kết cộng hoá trị giữa nhóm –OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine
Bước 2 khử acyl hoá: Phức hệ acyl-enzyme bị thuỷ phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước 1 Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc –OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh enzyme [38]
2.3.4 Sử dụng enzyme alcalase 2.4L để thủy phân sụn ức gà Đặc điểm của enzyme alcalase 2.4L
Enzyme alcalase 2.4L (E.C.3.4.21.62) là một enzyme thương mại trong nhóm alcalase Có khối lượng phân tử là 27.300 Dalton, chứa 308 gốc acid amin
Cấu trúc không gian gần với một thiol proteinase, thuộc lớp cystein proteinase, peptidase họ D1 [39]
Phân tích cấu trúc bậc 1 của alcalase 2.4L cho biết cách sắp sếp của các acid amin ở phần gần trung tâm hoạt động như sau:
Enzyme alcalase 2.4L có trung tâm hoạt động chứa 2 nhánh: Một nhánh glysine nối với tryptophan và cystein với cầu di-sulfua (gọi là G67) và một nhánh nối alanin với glycine (gọi là S65G) Hai nhánh này gần như đối xứng nhau trong cấu trúc không gian (hình 2.10)
Hình 2.10 Cấu trúc không gian của alcalase 2.4L Đặc tính của enzyme alcalase: Điều kiện tối ưu: Nhiệt độ 55†70 0 C, tùy thuộc vào kiểu cơ chất, pH từ 6,5÷8,5 Hoạt tính enzyme alcalase 2.4L thường được xác định đơn vị Anson/g
(AU/g) Ở dạng thương mại, enzyme alcalase 2.4L là dạng dung dịch màu nâu và dễ dàng hòa tan với nước ở mọi nồng độ Màu sắc có thể thay đổi theo từng lô sản phẩm và nó không biểu hiện cho hoạt tính sinh học của sản phẩm
Enzyme alcalse 2.4L có thể bị mất hoạt tính ở 50 0 C, pH = 4,0; trong 30 phút hoặc 85 0 C; pH = 8,0 trong 10 phút
Emzyme alcalase 2.4L ứng dụng trong thủy phân sụn ức gà theo nghiên cứu của S.C Shin và các cộng sự (2005) [27], [39].
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Sụn ức gà được mua tại Công ty Phạm Tôn, quận Gò Vấp, TP HCM Sau khi xử lý sơ bộ đem bảo quản lạnh đông ở –18 0 C
Enzyme Alcalase 2.4L được mua bởi công ty BrennTag Việt Nam, thành phố Hồ Chí Minh, từ hãng (Novozymes, Đan Mạch) được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
Licheniformis Enzyme alcalase 2.4L là một endo-protease Hoạt tính ghi trên nhãn
2,4 đơn vị Ason/g; nhiệt độ tối ưu từ 40÷65 0 C; pH tối ưu từ 7,0÷9,0; tỷ trọng là 1,17
Các chế phẩm Enzyme được xác định lại hoạt độ theo phương pháp Ason cải tiến trước khi sử dụng
3.1.3 Hóa chất trong nghiên cứu
- Chondroitin sulphate (Sigma-Aldrich, Mỹ)
- 1,9 _ Dimethylmethylene blue (Sigma-Aldrich, Mỹ)
- Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 (Trung Quốc)
Dụng cụ và thiết bị
- Bình định mức 50ml, 100ml
- Thiết bị nấu áp suất
- Máy quang phổ UV-VIS
- Cân điện tử 2 và 4 số lẻ
Phương pháp nghiên cứu
Phân tích thành phần của sụn ức gà
Xác định hoạt tính của emzyme
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi CS thô
Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân sụn ức gà
Sấy thu nhận CS thô
- Độ ẩm - Protein - Lipid - Tro -Carbohydrat tổng
- pH - Nhiệt độ - Hàm lượng enzyme/cơ chất - Thời gian
- Tỷ lệ sụn:nước - pH
- Nhiệt độ- Hàm lượng enzyme/cơ chất- Thời gian
3.3.2 Quy trình thủy phân sụn ức gà bằng enzyme alcalase 2.4L
CS thô Sấy Kết tủa Enzyme
Thuyết minh quy trình Lựa chọn nguyên liệu sụn ức gà
Mục đích: Đảm bảo nguyên liệu mang tính đồng nhất để dùng trong nghiên cứu
Thực hiện: Sụn ức gà được mua cùng một công ty, cùng một giống gà của một trại chăn nuôi và cùng một lứa, sau đó đem bảo quản lạnh đông ở - 18 0 C cho đến khi sử dụng
Mục đích: Loại bỏ đi những mẫu thịt vụn còn sót dính trên sụn ức gà
Thực hiện: Dùng dao nhỏ cạo sạch, ngâm sụn ức gà trong dung dịch muối 3%
Mục đích: Chia sụn ức gà thành những mẫu nhỏ nhằm tăng diện tích tiếp xúc enzyme trong quá trình thủy phân
Thực hiện: Dùng máy xay nghiền sụn ức ra thành những mẫu nhỏ Kích thước khoảng 1x1x1 mm
Mục đích: Làm cho cấu trúc của sụn ức gà mềm để enzyme xúc tác tốt hơn
Thực hiện: Mẫu được cho nước vào với tỷ lệ nhất định sau đó cho vào nồi áp suất, chỉnh thời gian 15 phút Xong lấy ra làm nguội chuẩn bị cho bước tiếp theo
Mục đích: Khai thác CS có trong sụn ức gà
Thực hiện: Quá trình thủy phân được thực hiện trong bể điều nhiệt có lắc đảo 120 vòng/phút nhằm tăng khả năng tương tác giữa enzyme và cơ chất cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn Các điều kiện khảo sát: Tỷ lệ sụn:nước, pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme/cơ chất, thời gian quá trình thủy phân
Mục đích: Đình chỉ hoạt động của enzyme bổ sung trong quá trình thủy phân, nhằm tránh các biến đổi diễn ra sau thủy phân
Thực hiện: Đun cách thủy các mẫu thủy phân ở nhiệt độ 85 0 C trong 10 phút
Mục đích: Loại bỏ bã sót lại sau quá trình thủy phân
Thực hiện: Dùng thiết bị lọc chân không với máy hút chân không
Mục đích: Thu nhận CS trong dung dịch sau thủy phân
Thực hiện: Dùng ethanol cho vào mẫu để lạnh ở 5 0 C, gạn nước và ethanol thu được dịch keo
Mục đích: Thu nhận chế phẩm CS thô từ quá trình thủy phân Loại bỏ nước và cồn đã cho vào trong quá trình thủy phân
Thực hiện: Cho vào máy ly tâm 15 phút, tốc độ 3000 vòng/phút Sau đó loại bỏ nước và cồn, thu nhận paste dưới đáy côn ống ly tâm
Mục đích: Loại bỏ nước và ethanol đã bổ sung vào trong quá trình trước, thu nhận chế phẩm CS dạng bột thô
Thực hiện: Dịch keo được cho vào tủ sấy ở 50 0 C và thu bột CS thô
3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm thủy phân sụn ức gà Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ sụn:nước thích hợp cho quá trình thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi CS thô
Các yếu tố cố định:
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 4% ( v/w pro ) [27], [41], [42], [43]
- Thời gian thủy phân: 240 phút [29], [27], [47], [48]
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Các yếu tố cố định:
- Tỷ lệ sụn:nước: Theo kết quả thí nghiệm 1
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 4% (v/w pro )
- Thời gian thủy phân: 240 phút
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Các yếu tố cố định:
- Tỷ lệ sụn:nước: Theo kết quả thí nghiệm 1
- pH: Theo kết quả thí nghiệm 2
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 4% (v/w pro )
- Thời gian thủy phân: 240 phút
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme/cơ chất trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Các yếu tố cố định:
- Tỷ lệ sụn:nước: Theo kết quả thí nghiệm 1
- pH: Theo kết quả thí nghiệm 2
- Nhiệt độ thủy phân: Theo kết quả thí nghiệm 3
- Thởi gian thủy phân: 240 phút
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 0; 1; 2; 3; 4; 5% (v/wpro)
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Các yếu tố cố định:
- Tỷ lệ sụn:nước: Theo kết quả thí nghiệm 1
- pH: Theo kết quả thí nghiệm 2
- Nhiệt độ thủy phân: Theo kết quả thí nghiệm 3
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: Theo kết quả thí nghiệm 4
- Thởi gian thủy phân: 60; 120; 180; 240; 300 (phút)
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân sụn ức gà Để xác định được các kết quả tối ưu từ các thí nghiệm tương tác của các yếu tố đến hàm mục tiêu, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology – RSM) và phần mềm Modde 5.0 để xử lý kết quả
Phương pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp hữu hiệu trong việc tối ưu các quá trình chế biến thực phẩm Đây là tập hợp các mô hình toán học và thống kê, liên quan giữa việc xử lý số liệu và thành lập phương trình hồi quy để mô tả các thông số đầu vào tới tính chất của sản phẩm [49]
Kế hoạch hỗn hợp bậc hai tâm xoay được sử dụng khi xác định các hệ số của phương trình hồi quy Để kế hoạch hỗn hợp là xoay tâm, giá trị cánh tay đòn α chọn từ điều kiện: α = 2 k/4
Số điểm ở tâm theo kế hoạch n 0 được tăng lên 7 để ma trận không suy biến, do vậy nên kế hoạch này sẽ tránh được sai số khi xác định hàm mục tiêu Y ở các điểm thí nghiệm của bề mặt biểu diễn Mô hình thí nghiệm được thực hiện theo mô hình toán của phần mềm Modde 5.0
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm với 4 yếu tố khảo sát như bảng 3.1
Trong đó, các giá trị 0; –1 và +1 lần lượt là các giá trị ở tâm và biên của các biến được xét trong thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm Giá trị –α và +α được xác định dựa vào quy tắt đòn bẩy x 1 ; x 2 ; x 3 ; x 4 là các biến số cần tối ưu
Trong quá trình thực hiện cần chú ý Q 2 và R 2 , chúng sẽ cho biết mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm R 2 là độ biến thiên thật, Q 2 là độ biến thiên ảo Trong đó, R 2 > 0,8 và Q 2 > 0,5 và độ sai lệch của chúng là [0,2÷0,3] cho thấy giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy
Bảng 3.1 Bảng quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng
Theo phương pháp trực giao cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng thì phương trình hồi quy được biểu diễn như sau:
Các kết quả của phương trình hồi quy được tìm ra từ việc giải phương trình trong Modde 5.0 chỉ là các biến mã hóa (nhận khi giá trị p < 0,05), do đó cần chuyển sang biến số thực như sau:
Z j : giá trị thật của yếu tố gọi là biến thực x j : giá trị mã hóa của yếu tố gọi là biến mã hóa x 0 : giá trị mức cơ sở Các thí nghiệm được thực hiện với các yếu tố như bảng 3.2
Bảng 3.2 Giá trị tâm và các bước nhảy trong thí nghiệm tối ƣu quá trình thủy phân
STT Yếu tố Giá trị tâm Bước nhảy
2 Nhiệt độ (Z2) Từ thí nghiệm 3 5.0 0 C
3 Hàm lượng enzyme/cơ chất (Z3) Từ thí nghiệm 4 1%
4 Thời gian (Z 4 ) Từ thí nghiệm 5 60 phút
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thu hồi CS thô (%) Yếu tố tỷ lệ sụn:nước được chọn từ thí nghiệm 1 là 1:8 và cố định trong suốt quá trình thí nghiệm
Qua đó xây dựng được phương trình hồi quy thể hiện quy luật tương tác giữa các yếu tố tới hàm mục tiêu khảo sát Từ đó xác định được các thông số tối ưu
3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần
Tất cả dữ liệu được phân tích phương sai (ANOVA) nhằm kiểm định độ tin cậy với mức ý nghĩa 5% để đánh giá sự khác biệt, sử dụng phần mềm STATGRAPHICS XV
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thành phần cơ bản của sụn ức gà
Bảng 4.1 Thành phần cơ bản của sụn ức gà
Kết quả phân tích ở bảng 4.1 cho thấy nguyên liệu dùng cho nghiên cứu có hàm lượng các thành phần trong sụn ức gà tươi như sau: Ẩm chiếm 81,89±1,12%, protein chiếm 10,95±0,21%, lipid chiếm 0,25±0,34%, tro tổng chiếm 1,57±0,12%, tổng carbohydrat còn lại là 5,34±0,35%
Kết quả này cho thấy có điểm tương đồng theo công bố của S.C Shin và cộng sự (2005) Cụ thể là độ ẩm là 81,89±1,12%, protein là 10,95±0,21% và lipid là 0,25±0,34% gần tương đồng với các giá trị phân tích của S.C Shin và cộng sự sau 82,85%; 11,78%; 0,29% Bên cạnh đó hàm lượng tro tổng là 1,57±0,12% và carbohydrat tổng là 5,34±0,35% thì cao hơn so với các giá trị là 1,21% và 3,87%
Sự khác biệt về vùng chăn nuôi, chế độ dinh dưỡng, thời tiết, khí hậu,… có thể là nguyên nhân dẫn đến một số khác biệt về hàm lượng các thành phần như trên.
Khảo sát tỷ lệ sụn:nước ảnh hưởng tới quá trình thủy phân sụn ức gà
Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ sụn nước đến hiệu suất thu hồi CS thô
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình 3 lần lặp lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột, những giá trị nghiệm thức có cùng ký tự thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Cơ sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.1
Từ kết quả hình 4.2 cho ta thấy rằng tỷ lệ sụn:nước có ảnh hưởng đáng kể đến H CS (%) Khi tỷ lệ sụn:nước là 1:4 thì H CS (%) đạt giá trị thấp nhất là 17,15±0,50%, khi tăng tỷ lệ sụn:nước lên 1:6 thì H CS (%) đạt giá trị là 21,76±0,49% Trong khi tăng tỷ lệ sụn:nước lên 1:8 thì H CS (%) tăng đáng kể và đạt giá trị cao nhất là 26,45±1,00% Khi tiếp tục tăng thêm lượng nước với tỷ lệ sụn:nước là 1:10 và 1:12 thì HCS (%) có xu hướng ổn định không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thông kê p < 0,05, giá trị thu được lần lượt là 25,92±0,78% và 25,77±1,31%
Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
H CS (%) tăng lên khi tăng tỷ lệ sụn:nước từ 1:4; 1:6; 1:8 rồi tiến tới ổn định mặc dù tăng lượng nước ở các mức là 1:10 và 1:12 Điều này được giải thích là khi lượng nước thấp, nước ít nên khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất hạn chế, mức độ linh động của enzyme thấp dẫn tới HCS (%) thấp
Mặc khác, khi tăng lượng nước đến một mức độ nhất định thì khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất dần đạt mức tối đa, protein trong polyoglycan từ sụn bị thủy phân ở mức độ triệt để với cùng hàm lượng enzyme sử dụng do đó giải phóng hàm lượng là cao nhất Càng tăng lượng nước trong phản ứng thủy phân thì càng làm loãng nồng độ enzyme nên khả năng tiếp xúc với cơ chất hạn chế dẫn tới H CS (%) cũng không tăng lên và không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa (p < 0,05)
Theo nghiên cứu của W Garnjanagoonchorn và các cộng sự (2007) và của S.C Shin và các cộng sự (2006) có kết quả cũng tương ứng với kết quả của thí nghiệm là từ các tỷ lệ 1:8 đến 1:10 [27]
Thí nghiệm đã xác định tỷ được lệ sụn:nước thích hợp cho quá trình thủy phân sụn ức gà và nhằm mục tiêu đạt HCS (%) là cao nhất, đồng thời để giảm chi phí năng lượng, nước, thể tích thiết bị, do đó chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ sun:nước là 1:8 cho các thí nghiệm tiếp theo.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân sụn ức gà
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 4% (v/w pro )
- Thời gian thủy phân: 240 phút
Hình 4.3 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi CS thô
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình 3 lần lặp lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột, những giá trị nghiệm thức có cùng ký tự thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Cơ sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.2
Từ kết quả hình 4.3 cho ta thấy rằng pH có ảnh hưởng đáng kể đến hàm H CS
(%) Khi pH ở mức 5,5 và thì H CS (%) đạt giá trị thấp nhất là 20,99±0,52% giá trị này không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê p < 0,05 so với mức pH = 8,0 là 21,48±0,52% Khi pH ở các mức là 6,0; 6,5 và 7,5 thì H CS (%) là 22,97±1,03%;
24,13±0,76% và 23,63±0,76%, ba giá trị này không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê p < 0,05 Bên cạnh đó ở mức pH là 6,0 và 8,0 thì hiệu suất thu hồi CS thô
(%) cũng không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
Trong khi đó ở mức pH là 7,0 hiệu suất thu hồi CS thô (%) đạt giá trị cao nhất là 26,28±1,74% và có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê so với giá trị của các mức pH còn lại Khi mức pH càng cao thì mức độ thủy phân càng giảm, điều này chứng tỏ khoảng pH từ acid yếu đến trung tính là thích hợp cho enzyme alcalase 2.4L hoạt động để thủy phân sụn ức gà đạt kết quả cao nhất
Hiệu suất thu hồi CS thô (%) pH
Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn pH là 7,0 cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm thủy phân sụn ức gà đạt kết quả cao nhất
4.3.2 Nhiệt độ Điều kiện cố định:
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 4% (v/w pro )
- Thời gian thủy phân: 240 phút
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình 3 lần lặp lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột, những giá trị nghiệm thức có cùng ký tự thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Cơ sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.3
Hình 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi CS thô
Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Kết quả hình 4.4 cho ta thấy rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến HCS
(%) Dựa vào đồ thị (hình 4.4) cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 45 0 C đến 55 0 C thì H CS (%) tăng 1,12 lần (từ 23,88±0,76% lên 26,69±0,80%) Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục tăng trên 55 0 C thì mức độ thủy phân giảm dẫn tới giảm H CS (%), cụ thể ở các mức nhiệt độ 60 0 C, 65 0 C và 70 0 C các giá trị đạt được là 25,62±1,37%;
23,47±0,76%; 20,99±0,38% Điều này có thể gải thích là do khi nhiệt độ tăng cao enzyme sẽ bị biến tính làm giảm hoặc mất hoạt tính, sự biến tính là bất thuận nghịch nên khó phục hồi vì enzyme bản chất là protein
Kết luận: Ở mức nhiệt độ 55 0 C thì H CS (%) là 26,69±0,80% không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê p < 0,05 so với mức nhiệt độ 60 0 C là 25,62±1,37%
Tuy nhiên, để xác định mức nhiệt độ phù hợp cho quá trình thủy phân và giảm chi phí nhiệt lượng chúng tôi chọn mức nhiệt 55 0 C để làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo
4.3.3 Hàm lƣợng enzyme/cơ chất Điều kiện cố định:
- Thời gian thủy phân: 240 phút
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình 3 lần lặp lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột, những giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Cơ sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.4
Từ kết quả ở hình 4.5 cho ta thấy hàm lượng enzyme/cơ chất (%v/wpro) trong quá trình thủy phân có ảnh hưởng đáng kể đến H CS (%) H CS (%) ở hàm lượng enzyme/cơ chất tại giá trị 0% có giá trị thấp nhất là 12,88±1.14% so với các mức hàm lượng enzyme/cơ chất còn lại Ở các mức hàm lượng enzyme/cơ chất là 1% và
2% thì H CS (%) lần lượt là 20,24±0,76%và 24,38±0,76% Hai giá trị này có sự khác biệt về mặt ý nhĩa thống kê nhưng HCS (%) ở mức thấp Ở mức hàm lượng enzyme/cơ chất là 3%; 4% và 5% thì H CS (%) cao hơn, ở các mức này không có sự khác biệt về ý nhĩa thống kê p < 0,05 Điều này có thể giải thích là do lượng cơ chất có trong nguyên liệu là không đổi nên khi tăng hàm lượng enzyme/cơ chất (%v/w pro ) tới một giới hạn nhất định thì lượng [ES] không đổi do đó tốc độ phản ứng đạt đến giá trị cực đại và duy trì ổn định theo mô hình của Michaelis Menten, kết quả là HCS (%) đạt cực đại và ổn định
Hình 4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme/cơ chất đến hiệu suất thu hồi CS thô
H CS (%) đạt giá trị cực đại trong khoảng hàm lượng enzyme/cơ chất là 3% ÷
5% (v/w pro ) Do đó chúng tôi chọn hàm lượng enzyme/cơ chất là 3% (v/w pro ) làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo để giảm chi phí mà vẫn mà vẫn mang lại hiệu quả thủy phân cao
Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
Hàm lƣợng enzyme/cơ chất (%v/w pro )
4.3.4 Thời gian thủy phân Điều kiện cố định:
- Hàm lượng enzyme/cơ chất: 3% (v/wpro)
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình 3 lần lặp lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột, những giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05
Cơ sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.5
Hình 4.6 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi CS
Theo kết quả thu được từ hình 4.6 ta thấy thời gian có ảnh hưởng đến H CS (%) Nhìn chung, khi tăng thời gian thì H CS (%) tăng Cụ thể là từ mức nhiệt độ 60
(phút) lên 180 (phút) thì H CS (%) tăng lên 2,24 lần (11,89±0,74% lên 20,82±1,38%)
Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian thì H CS (%) có xu hướng ổn định như ở mức 180 (phút) và các tiếp theo là 240 (phút) và 300 (phút) thì các giá trị H CS (%) lần lượt là
Hiệu suất thu hồi CS thô (%)
20,82±1,38%; 27,11±1,41% và 26,86±1,12% Các giá trị này không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê p 0,8, giá trị biến thiên ảo là Q 2 = 0,748 > 0,5 và độ sai lệch của chúng là 0,203 thuộc [0,2 ; 0,3] Cho thấy các giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy Như vậy kết quả thí nghiệm là phù hợp khi tiến hành quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0 [51]
Sự ảnh hưởng của các biến thể hiện trong bảng 4.5 với mức ý nghĩa là 5%
Các giá trị b1, b 2 , b 3 , b 4 có ảnh hưởng dương, trong khi các biến b 1 2 , b 2 2 , b 3 2 , b 4 2 , b 12 , b 13 , b 23 có tác động âm đến hàm mục tiêu hiệu suất thu hồi CS thô (%), thể hiện ở giá trị p < 0,05 Các giá trị b 14 , b 24 , b 34 không có ảnh hưởng, thể hiện ở giá trị p >
0,005 và cá giá trị này được loại khỏi phương trình hồi quy
Phương trình hồi quy thực nghiệm có dạng sau:
(*) Trong đó: x 1 = (Z 1 - 7)/0,5 x 2 = (Z 2 - 55)/5 x 3 = (Z 3 - 3)/1 x 4 = (Z 4 - 180)/60 Thế các giá trị x 1 , x 2 , x 3 , x 4 vào phương trình (*) ta thu được phương trình biến thiên theo số thực như sau:
Trong đó: Z 1 : Biến thực của giá trị pH
Z 2 : Biến thực của giá trị nhiệt độ thủy phân ( 0 C) Z 3 : Biến thực của giá trị hàm lượng enzyme/cơ chất (%v/w pro ) Z 4 : Biến thực của giá trị thời gian thủy phân (phút)
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài toán tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi CS thô (%))
Lack of Fit 10 6.45 0.66 3.89 0.055 Không có ý nghĩa
Theo bảng 4.6 cho thấy các yếu tố thí nghiệm có ảnh hưởng mạnh lên hiệu suất thu hồi CS thô (%) (p < 0,05)
Tính tương thích của phương trình hồi quy được kiểm tra bằng phần mềm Modde 5.0 Phương trình hồi quy sẽ tương thích với thực nghiệm nếu kết quả phân tích “Lack of Fit” là không có ý nghĩa thống kê [52]
Kết quả bảng 4.6 cho thấy kiểm định “Lack of Fit” là không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) nên phương trình hồi quy có sự tương thích cao với thực nghiệm Như vậy, mô hình thống kê này có thể sử dụng để dự đoán điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân
Sự ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đến hiệu suất thu hồi CS thô (%) được thể hiện trên bề mặt đáp ứng như trong hình 4.7 và 4.8
Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Hình 4.8 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS thô
Kết quả kiểm chứng giá trị dự đoán H CS (%) tối ƣu hóa từ mô hình với giá trị thực nghiệm Điều kiện tối ưu hóa cho quá trình thủy phân được xác định bởi phần mềm Modde 5.0 cho thấy tại điều kiện pH = 7,03, nhiệt độ = 54,19 0 C, hàm lượng enzyme/cơ chất = 3,99% (v/w pro ) và thời gian = 211,59 (phút) thì H CS (%) cao nhất là 27,78% Để kiểm chứng chính xác các giá trị nhận được từ phương trình hồi quy, tiến hành thí nghiệm lập lại 3 lần với các thông số tương đương điều kiện ở trên cho quá trình thủy phân sụn ức gà Các điều kiện (đã được làm tròn số) như sau: pH = 7,0; nhiệt độ = 54 0 C; hàm lượng enzyme/cơ chất = 4% (v/w pro ) và thời gian = 212 (phút) Kết quả được thể hiện trong bảng 4.7
Bảng 4.7 Kết quả hiệu suất thu hồi CS thô (%) từ phương trình hồi quy và thực nghiệm
Hiệu suất thu hồi CS thô (%) từ phương trình hồi quy 27.78 a
Hiệu suất thu hồi CS thô (%) từ thực nghiệm 27.74 ± 0.46 a
Ghi chú: Giá trị biểu diễn là giá trị trung bình ba lần thí nghiệm lập lại lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Trong cùng một cột các giá trị không có sự khác biệt về ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05)
Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 4.7, hiệu suất thu hồi CS thô (%) từ phương trình hồi quy là 27,78 (%) và từ thực nghiệm là 27,74 ± 0,46 (%) không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê (p > 0,05), cho thấy rằng phương trình hồi quy xây dựng ở trên là phù hợp với thực tiễn thí nghiệm.
Phân tích chế phẩm CS thô thu được trong quá trình nghiên cứu
4.6.1 Phân tích chế phẩm CS thô bằng HPLC
Từ hình 4.9 và 4.10 cho thấy cấu trúc của CS trong chế phẩm nghiên cứu có đỉnh tương ứng với đỉnh của CS chuẩn (theo phụ lục B.8) Cụ thể đỉnh của CS chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 1,681 phút với chiều cao của đỉnh là 152801 (uV); CS trong chế phẩm ở thời gian lưu là 1,644 phút với chiều cao đỉnh là 142198 (uV) Điều đó chỉ ra rằng, CS trong chế phẩm thủy phân từ sụn ức gà bằng enzyme alcalase 2.4L có cấu tạo phân tử tương đồng với của CS chuẩn
(Kết quả được đo bằng máy HPLC Shimadzu 20A)
Hình 4.9 Đồ thị kết quả xác định chất chuẩn CS bằng HPLC
Hình 4.10 Đồ thị kết quả xác định CS của chế phẩm nghiên cứu bằng HPLC
Chất chuẩn CS được bơm vào máy có độ tinh khiết đạt 99,9% Thu được diện tích peack của chất chuẩn CS là 2108389 và diện tích peack của chế phẩm là 1130096 Ở cùng một nồng độ (CS chuẩn và mẫu chế phẩm thu được trong nghiên cứu) bơm vào máy từ đó tính được hàm lượng CS có trong chế phẩm là như sau:
( ) Kết quả này cho thấy chế phẩm CS thô thu từ sụn ức gà thủy phân bằng enzyme alcalase 2.4L có độ tinh sạch là 53,60%
4.6.2 Mẫu chế phẩm CS thô đƣợc phân tích thành phần Bảng 4.8 So sánh thành phần của chế phẩm với sản phẩm ngoại nhập
STT Chỉ tiêu Đơn vị Chế phẩm nghiên cứu
Từ bảng 4.8 ta thấy hàm lượng carbohydrat của chế phẩm CS thô thu được trong nghiên cứu là 54,98% gần tương đồng với mức độ tinh sạch của chế phẩm thủy phân từ sụn ức gà được xác định bằng HPLC là 53,60% Chế phẩm có độ tinh sạch thấp hơn so với sản phẩm ngoại nhập (theo phụ lục B.6) là 75,60% Hàm lượng protein và hàm lượng tro còn tồn tại trong chế phẩm thủy phân từ sụn ức gà lần lượt là 24,15% và 13,75% khá cao so với sản phẩm ngoại nhập lần lượt là 6.30% và 9.00% Ẩm của chế phẩm là 7,12% thấp hơn so với ẩm của sản phẩm ngoại nhập
Chế phẩm thô thu được trong quá trình thủy phân sụn ức gà độ tinh sạch đạt 53,60%, do đó cần có những nghiên cứu kế tiếp tiến hành tinh sạch để phù hợp với các tiêu chuẩn sản phẩm trên thị trường
4.6.3 Kiểm tra kích thước hạt của chế phẩm nghiên cứu
Từ kết quả đo kích thước hạt ở bảng 4.11 và đồ thị biểu diễn sự phân bố kích thước hạt ở hình 4.10 (theo phụ lục B.7) cho ta thấy rằng kích thước hạt của chế phẩm của quá trình nghiên cứu nằm trong khoảng từ 4,472μm đến 15,172μm, chiếm tỷ lệ trong chế phẩm là 67,791% Giá trị kích thước hạt trung bình là 7,589 (μm), kích thước hạt ý nghĩa là 11,48 (μm) và kích thước hạt có tần suất cao nhất là 8,217 (μm)
Bảng 4.9 Kết quả đo kích thước hạt của chế phẩm CS thô
STT Kích thước (μm) Tần suất q(%)
Hình 4.11 Đồ thị kích thước hạt
Kích thước hạt đã chỉ ra ở trên cho thấy khả năng hấp thu của cơ thể với chế phẩm là rất tốt, dễ dàng Ngoài ra, với kích thước hạt như trên có khả năng ứng dụng phối trộn trong sản xuất thực phẩm chức năng điều trị bệnh là rất lớn.
