Trước tiên, sự ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ trong quá trình xử lý enzyme đến hàm lượng betalains, phenolic tổng và hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích được khảo sát, tiếp theo,
TỔNG QUAN
Betalains
Thuật ngữ “Betalains” bắt nguồn từ tên Latin của củ dền (Beta vulgaris) So với các nhóm chất màu khác như carotenoids, chlorophylls và anthocyanins thì betalains ít được nghiên cứu hơn [Stintzing và cộng sự, 2006] Hiện nay, betalains có khoảng 55 cấu trúc bao gồm 2 nhóm betacyanins (đỏ tím) và betaxanthins (vàng cam) Betalains là chất màu tan trong nước có chứa nitơ, được sinh tổng hợp từ tyrosine
Hình 1.1: Cấu trúc của betalamic acid (a), betacyanins (b) and betaxanthins (c)
(Betanin R1=R2=H R3=nhóm amine hoặc amino acid)
Betalamic acid là cấu trúc mang màu phổ biến trong tất cả các chất màu betalains [Strack và cộng sự, 2003] (hình 1a), phần còn lại của betalamic acid quyết định nhóm chất màu là betacyanins hay betaxanthins (hình 1b và 1c) Sự khác biệt trong cấu trúc của betacyanins và betaxanthins làm cho chúng có độ hấp thu quang phổ khác nhau, betacyanins hấp thu tối đa ở bước sóng 540 nm và betaxanthins hấp thu tối đa ở 480 nm [Jackman và cộng sự, 1996; Strack và cộng sự, 2003] Betalains hình thành khi betalamic acid liên kết với cyclo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine (cyclo-dopa), amino acid hoặc amine
Betanidin là cấu trúc phi đường (rượu, acid, aldehyde, phenol, tannin…) có trong hầu hết betacyanins, kiểu thay thế khác nhau trong cấu trúc ở một hoặc hai nhóm hydroxyl của betanidin (ở vị trí 5 hoặc 6) làm xuất hiện các loại betacyanins khác nhau Cấu trúc thường thấy là 5-O-glucosides, nhưng 6-O-glucosides cũng thường được phát hiện Không có loại betacyanins nào có cả hai gốc đường trong thành phần cấu tạo [Delgado-Vargas và cộng sự, 2000] Betacyanins phổ biến nhất là betanidin-5-O-β-glycoside (betanin) – màu đỏ trong củ dền [Stintzing và cộng sự, 2004]
Betalains là chất màu trong không bào, tan nhiều và ổn định trong nước hơn trong cồn Betalains tan trong nước tốt hơn anthocyanins [Stintzing và cộng sự, 2006] và khả năng nhuộm màu tốt hơn gấp 3 lần so với anthocyanins [Stintzing và cộng sự, 2007] Ngoài ra, betalains bền ở khoảng pH từ 3 tới 7 thích hợp với các sản phẩm thực phẩm có pH từ acid tới trung tính
Các betalain hấp thụ phổ ánh sáng nhìn thấy được với hệ số hấp thụ phân tử lớn, làm chúng dễ dàng được phát hiện bằng phương pháp trích xuất dịch từ các loại thực vật khác nhau.
Betacyanins có khối lượng phân tử là 565 Da và betaxanthins có khối lượng phân tử là 309 Da
Betalains là chất màu tự nhiên được sử dụng rộng rãi trong các quá trình chế biến thực phẩm, các sản phẩm mỹ phẩm và dược phẩm Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định sự phân hủy và ổn định [Reynoso và cộng sự, 1997], sự đột biến [Schwartz và cộng sự, 1983] và độc tính cho thấy rằng nhóm màu này không gây hại đối với sức khỏe con người
Betalains là một nhóm các hợp chất có khả năng chống oxy hóa và quét gốc tự do [Pedreno và cộng sự, 2000; Kanner và cộng sự, 2001; Georgiev và cộng sự, 2010] Betacyanins như là betanin và betanidin, betaxanthins như là indicaxathin và vulgaxanthin đã được chứng minh rằng đều có khả năng làm giảm các ion tự do
Các ion này hình thành do sự oxy hóa gián tiếp của enzyme horseradish peroxidase, hydrogen peroxide, hoặc là phản ứng với potassium persulfate (K2S2O8) Khi được biểu diễn dưới dạng đương lượng Trolox, betacyanins có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn betaxanthins [Escribano và cộng sự, 1997; Butera và cộng sự, 2002] Sự khác nhau này là do cấu tạo hóa học của betacyanins và betaxanthins Trong cấu tạo của betacyanins có chứa gốc glucose ở vị trí ortho dường như ngăn chặn nhóm phenolic phản ứng với gốc tự do và khi đó nhóm amine đóng vai trò là nhóm cho điện tử Giả thiết này dựa trên phản ứng của ethoxyquin và hoạt tính của vòng amine khi bị oxy hóa Ngược lại, betaxanthins chỉ chứa duy nhất vòng amine
Trong một vài nghiên cứu trước đây của Kanner và cộng sự [2001] đã chứng minh là betacyanins có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và có tác dụng sinh học ở người Nhóm tác giả cho rằng khi sắt trong cytochrome C phản ứng với lipid sẽ tạo thành ferryl và xúc tác quá trình oxy hóa lipid bằng các phản ứng sau:
Cyt C Fe 3+ + ROOH → Cyt C Fe 2+ + ROO • + H + (1) Cyt C Fe 2+ + ROOH → Cyt C Fe 3+ + RO • + HO - (2)
Betalains có thể ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid bằng cách phản ứng với gốc peroxyl và alkoxyl trong phương trình (1) và (2) Nhóm tác giả cũng cho rằng betalains có khả năng phản ứng tốt hơn catechin và α-tocopherol là do khả năng tan tốt hơn trong dung dịch
Trong quá trình chế biến, sự ổn định của chất màu là vô cùng quan trọng
Betalains bị biến đổi ngay sau khi trích ly ra từ không bào của tế bào thực vật
Betalains có thể bị phá hủy theo nhiều cơ chế khác nhau, nhưng có thể chia thành 2 nhóm chính như sau:
• Nhóm các yếu tố bên trong gồm có các enzyme oxy hóa có trong tế bào thực vật như là polyphenoloxidase, peroxidase và β-glucosidase; thành phần cấu tạo của chất màu; mức độ glycosyl hóa và acyl hóa
• Mức độ glycosyl hóa cao
• Mức độ acyl hóa cao
• Mức độ glycosyl hóa thấp
• Mức độ acyl hóa thấp
Sự ổn định của Betalains
Các điều kiện bên ngoài ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và bảo quản dầu thơm bao gồm: nhiệt độ, độ pH, oxy, ánh sáng, ion kim loại, nồng độ màu và hoạt độ nước Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của dầu thơm, giúp duy trì hương thơm và ngăn ngừa biến chất.
Hình 1.2: Các yếu tố ảnh hưởng tới sự ổn định của betalains a) Cấu trúc và thành phần
Betacyanins đã được chứng minh là ổn định hơn betaxanthins khi để ở nhiệt độ phòng [Sapers và cộng sự, 1979] và nhiệt độ cao [Herbach và cộng sự, 2004;
Singer và cộng sự, 1980] So sánh sự ổn định của các loại betacyanins khác nhau thì cấu trúc glycosylate ổn định hơn so với aglycons [Attoe và cộng sự, 1985] Sự ổn định không tăng theo mức độ glycosyl hóa [Huang và cộng sự, 1986] Nhiều nghiên cứu trước đây đã tiến hành gia tăng sự ổn định của betacyanis bằng cách este hóa với acid béo, các acid thơm, đặc biệt là tại vị trí 6-O [Reynoso và cộng sự, 1997;
Heuer và cộng sự, 1994; Schliemann và cộng sự, 1998] Tuy nhiên, Herbach và cộng sự [2006c] đã tiến hành quan sát sự phân hủy do nhiệt của betanin và các betacyanins acyl hóa (phyllocactin và hylocerenin) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC-DAD) Nhóm tác giả thấy rằng betanin ổn định hơn cấu trúc acyl hóa b) pH
Màu đỏ của betanin ổn định ở pH từ 3 tới 7 Khi pH dưới 3, màu đỏ của betanin chuyển sang màu tím và bắt đầu biến đổi sâu sắc Khi pH trên 7, betanin chuyển sang màu xanh và có sự thay đổi bước sóng hấp thu tối đa trong dải quang phổ hấp thụ Cường độ màu xanh cao nhất ở pH=9 và ở pH trên 10 thì sự phân hủy diễn ra mạnh mẽ kèm theo sự giải phóng betalamic acid có màu vàng Do đó, sự chuyển màu của betanin từ xanh sang vàng là kết quả của quá trình thủy betanin thành betalamic acid và cyclodopa-5-0-glycoside [Huang và cộng sự, 1985; Saguy và cộng sự, 1978] c) Nhiệt độ
Nguồn thu nhận Betalains
Trong số các thực vật bậc cao thì betalains được tìm thấy ở bộ cẩm chướng (Caryophyllales) và trong một vài loại nấm nhất định như là Amanita, Hygrocybe, và Hygrosporus Anthocyanins và betalains không có trong cùng một loại thực vật, dường như chúng triệt tiêu lẫn nhau [Stafford, 1994] Ở thực vật bậc cao, betalains nằm trong các cơ quan khác nhau Chúng tạo ra màu đỏ, vàng, hồng và cam trong hoa của họ phiên hạnh (Aizoaceae), họ rau sam (Portulacaceae), màu đỏ tím trong quả của họ xương rồng (Cactaceae) và trong củ dền đỏ Ngoài ra, betalains còn có trong chi hoa giấy (Bougainvillea) thuộc họ hoa giấy (Nyctagynaceae), trong hạt của chi dền (Amaranthus) [Delgado-Vargas-2000]
Nguồn thu nhận betalains chủ yếu hiện nay là củ dền đỏ (Beta Vulgaris) có chứa 2 thành phần chính là betanin (đỏ) và vulgaxanthine I (vàng) Hàm lượng betacyanins và betaxanthins trong củ dền phụ thuộc và giống và hiện nay có nhiều giống mới với hàm lượng betacyanins và betaxanthins cao hơn [Azeredo H.M.C, 2009] Nguồn Betalains từ củ dền đỏ có một bất lợi là có mùi đất do trong củ dền có geosmin và vài pyrazine, do đó không thể sử dụng cho một số sản phẩm được chế biến từ sữa [Stintzing và cộng sự, 2004; Lu và cộng sự, 2003] Do đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để tìm ra nguồn betalains thay thế, và một nguồn đầy hứa hẹn trong số các loài thực vật có chứa betalains là họ xương rồng (Cactaceae)
Trong số đó, xương rồng lê gai (chi Opuntia), thanh long (chi Cereus, Hylocereus và Selenicereus) được trồng phổ biến như cây ăn quả và phù hợp nhất để sử dụng như nguồn betalains cho ngành công nghiệp thực phẩm [Stintzing và cộng sự, 2003;
Stintzing và cộng sự, 2006] Trái ngược với củ dền, quả của thực vật thuộc chi xương rồng có thể được sử dụng trong thực phẩm mà không có bất cứ mùi vị gây bất lợi nào như dịch trích từ củ dền [Azeredo H.M.C, 2009] Hương vị của quả thuộc chi xương rồng rất nhạt nên không hấp dẫn người tiêu dùng, từ đó thị trường tiêu thụ loại quả này rất hạn chế; nhưng nếu sử dụng chúng trong việc sản xuất chất màu thì sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn
Trong số các loài thực vật xương rồng, Betalain là chất tạo nên màu sắc sống động của quả, từ cam vàng (Opuntia) đến đỏ tím (Hylocereus) nhạt hơn so với củ cải đường đỏ Đặc biệt, quả xương rồng màu cam vàng rất được chú trọng vì các hợp chất màu vàng hòa tan trong nước rất phổ biến trong tự nhiên [Moòhammer et al., 2005] Không những thế, cây xương rồng còn có ưu điểm là không đòi hỏi nhiều về điều kiện đất đai và kỹ thuật chăm sóc nên được xem là cây trồng tiềm năng trong nền kinh tế nông nghiệp ở những vùng đất khô hạn và bán khô hạn [Castellar et al., 2006].
Thanh long (Hylocereus spp) là loài thực vật bản địa tại Mexico, các nước Trung Mỹ và Nam Mỹ Hiện nay, loài cây này cũng được trồng ở các nước trong khu vực Đông Nam Á như Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Indonesia (đặc biệt là ở miền tây đảo Java); miền nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác Cả hai loài thanh long ruột trắng (Hylocereus Undatus) và ruột đỏ (Hylocereus Polyrhizus) có chứa khoảng 50% acid béo thiết yếu trong dầu hạt
[Ariƥ n và cộng sự, 2009], nhiều beta-carotene, lycopene và vitamin E [Charoensiri và cộng sự, 2009] Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu đều tập trung trên lá, hoa, hạt và thịt quả thanh long, các nghiên cứu trên vỏ rất giới hạn [Zhuang và cộng sự, 2012].
Các phương pháp trích ly Betalains
Betalains có thể được trích ly bằng nước, mặc dù trong nhiều trường hợp phải sử dụng methanol hoặc ethanol (20-50%) để trích ly hoàn toàn [Delgado-Vargas và cộng sự, 2000] Tuy nhiên, sử dụng nước trích ly chất màu từ quả của loài Opuntia tốt hơn hệ dung môi ethanol/nước [Castellar và cộng sự, 2006] Garcıa Barrera và cộng sự [1998] đã chứng minh hệ dung môi ethanol/HCl (tỉ lệ v/v/1) có khả năng trích ly betalains tốt hơn nước Tuy nhiên nếu trích ly betalains trong nước thì chất màu ổn định hơn Acid hóa nhẹ môi trường sau khi trích ly làm gia tăng tính ổn định của betacyanins và tránh bị oxy hóa bởi polyphenoloxidases [Strack, 2003]
Ngoài ra, người ta có thể sử dụng enzyme để thủy phân các hydrocolloids (các polymer tan trong nước như là carbohydrat và protein) để hỗ trợ cho quá trình trớch ly [Moòhammer và cộng sự, 2005] Nếu đem dịch trớch đi lờn men thỡ cú thể làm giảm lượng đường khử, gia tăng hàm lượng betacyanins [Pourrat và cộng sự, 1988] Độ thấm của màng tế bào là một yếu tố chính để xác định hiệu quả trích ly Sử dụng trường xung điện để làm gia tăng tính thấm của màng tế bào sẽ làm tăng hiệu quả trích ly betalains [Rastogi và cộng sự, 1999; Ade-Omowaye và cộng sự, 2001;
Chalermchat và cộng sự, 2004; Fincan và cộng sự, 2004] Lợi ích của việc sử dụng phương pháp này là mức độ tổn thương tế bào cao và sử dụng ít năng lượng [Fincan và cộng sự, 2004]
Nayak và cộng sự [2006] đã sử dụng tia gamma như là một tác nhân tiền xử lý trong quá trình trích ly rắn-lỏng của betanin từ củ dền Sử dụng phương pháp này làm hiệu quả trích ly gia tăng cùng với liều chiếu xạ (0-10kGy) Sự gia tăng này có thể là do sự thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhưng sử dụng phương pháp chiếu xạ cũng làm gia tăng tỉ lệ phân hủy betanin Ở quy mô phòng thí nghiệm, betalains có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau như là trích ly bằng cách khuếch tán nồng độ [Wiley và cộng sự, 1978], trích ly lỏng-rắn [Lee và cộng sự, 1981], thẩm thấu ngược [Lee và cộng sự, 1982] và sử dụng siêu âm [Bayindirli và cộng sự, 1988; Zafra-Rojas và cộng sự, 2013] Các phương pháp này đều hiệu quả hơn so với phương pháp trích ly lỏng thông thường.
Điểm mới của đề tài
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về quá trình trích ly betalains từ các nguồn khác nhau như củ dền, thanh long ruột đỏ, vỏ thanh long ruột đỏ bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào sử dụng vỏ thanh long ruột trắng để trích ly betalains và tối ưu hóa quá trình trích ly betalains có sử dụng chế phẩm enzyme thủy phân như một tác nhân hỗ trợ cho quá trình trích ly Đề tài nghiên cứu này sẽ đưa ra một quy trình thu nhận chất màu tự nhiên sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đồng thời góp phần làm giảm giá thành sản phẩm do nguồn nguyên liệu từ nguồn phụ phế phẩm là vỏ thanh long.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu của đề tài
Tối ưu hóa điều kiện xử lý enzyme trên đối tượng nguyên liệu vỏ thanh long để trích ly chất màu betalains và khảo sát độ bền màu của chế phẩm thô trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Vỏ thanh long sử dụng trong nghiên cứu này thuộc loài Hylocereus undatus được thu nhận từ công ty Rồng Xanh (Phan Thiết)
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của vỏ thanh long
Chế phẩm Pectinex Ultra SP-L ứng dụng trong đề tài này được mua từ công ty Nam Giang (Việt Nam) Đây là hỗn hợp enzyme chứa chủ yếu thành phần polygalacturonase (PG), pectin methyl esterase (PME), cùng lượng nhỏ cellulase, hemicellulase và arabinase Đặc điểm của enzyme này là hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50 độ C, độ pH lý tưởng trong khoảng 4,5-5.
Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Khảo sát tính chất của chế phẩm betalains
- Tính ổn định của dịch màu trong các điều kiện bảo quản khác nhau Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình xử lý enzyme để trích ly chất màu
- Tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu
- Nồng độ chế phẩm enzyme
- Nhiệt độ - pH - thời gian xử lý
Tối ưu hóa quá trình xử lý enzyme để trích ly chất màu bằng quy hoạch thực nghiệm
• Hàm mục tiêu - Hàm lượng betalains - Hàm lượng phenolic tổng - Hoạt tính chống oxy hóa - Độ nhớt
- Hàm lượng betalains • Hàm mục tiêu
Mức hàm lượng betalains và phenolic tổng trong rau củ quả có tác động đáng kể đến tác dụng chống oxy hóa Để tối ưu hóa quá trình chiết xuất, việc xác định hai yếu tố công nghệ có ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu suất chiết xuất betalains là rất quan trọng Thông qua việc lựa chọn hai yếu tố này, các nhà nghiên cứu có thể thiết kế thí nghiệm một cách hiệu quả, kiểm tra tương tác giữa các yếu tố và xác định các điều kiện tối ưu để đạt được năng suất chiết xuất betalains mong muốn.
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình xử lý enzyme để trích ly chất màu
Hình 2.2: Quy trình thu nhận dịch trích betalians thô ở quy mô phòng thí nghiệm
Vỏ thanh long sau khi đem về đuợc rửa sạch, sau đó gia nhiệt sơ bộ từ 90- 95 o C trong 3 phút để vô hoạt các enzyme oxy hóa có trong vỏ thanh long Sau khi gia nhiệt sơ bộ, vỏ thanh long được xay nhỏ rồi trộn đều Vỏ thanh long sau khi xay được bảo quản ở nhiệt độ là -18 o C và được sử dụng cho tất cả các nghiệm thức của
Dịch trích betalains thô một đợt thí nghiệm Khi tiến hành thí nghiệm, nguyên liệu được rã đông ở nhiệt độ phòng, cân mẫu vào các bình tam giác với khối lượng đều nhau là 30g và xử lý enzyme Sau đó, mẫu được vô hoạt enzyme (90-95 o C, 5 phút) rồi lọc qua vải Dịch sau lọc được dùng để xác định các hàm mục tiêu ngay trong ngày a) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly
Thí nghiệm 1: tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu
Thông số khảo sát: tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu vỏ thanh long được thay đổi lần lượt là 15:1; 20:1; 25:1; 30:1 và 35:1 mL dung môi/g chất khô (Dung môi là nước được chỉnh pH về 5)
- Nồng độ chế phẩm enzyme: 0,3% (Thể tích chế phẩm so với khối lượng vỏ thanh long)
- Nhiệt độ: 50 o C - Thời gian: 60 phút - pH dung môi: 5
Hoạt tính chống oxy hóa Độ nhớt
Thí nghiệm 2: nồng độ chế phẩm enzyme
Các thông số khảo sát trong nghiên cứu gồm nồng độ chế phẩm enzyme pectinase với các mức lần lượt là 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5% Nồng độ chế phẩm này được tính theo tỷ lệ phần trăm thể tích so với khối lượng chất khô của vỏ thanh long.
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 1 - Nhiệt độ: 50 o C
- Thời gian: 60 phút - pH dung môi: 5
Hoạt tính chống oxy hóa Độ nhớt
Thông số khảo sát: nhiệt độ xử lý enzyme được thay đổi lần lượt là 30, 40, 50,
Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi được lựa chọn dựa trên kết quả thí nghiệm 1 Nồng độ chế phẩm enzyme được xác định từ kết quả thí nghiệm 2 Quá trình thủy phân diễn ra trong thời gian 60 phút.
Hoạt tính chống oxy hóa Độ nhớt
Thí nghiệm 3: pH dung môi Thông số khảo sát: pH của dung môi được thay đổi lần lượt là 3, 4, 5, 6, 7 Thông số cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 1 - Nồng độ chế phẩm enzyme: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 2 - Nhiệt độ: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 3
Thời gian Thông số khảo sát: thời gian được thay đổi lần lượt là 0, 30, 60, 90, 120 phút Thông số cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 1 - Nồng độ chế phẩm enzyme: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 2 - Nhiệt độ: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 3
- pH: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 4
Hoạt tính chống oxy hóa Độ nhớt b) Tối ưu hóa quá trình trích ly bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Để đạt hiệu quả trích ly cao nhất Đầu tiên chúng tôi sử dụng mô hình Plackett-Burnn [1946] để chọn ra hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu suất trích ly betalains Chúng tôi thiết kế thí nghiệm theo mô hình Plackett-Burnn cho năm yếu tố khảo sát ban đầu ở mức độ thấp (-) và cao (+) Giá trị thấp (-) và cao (+) là hai giá trị lân cận của giá trị tốt nhất sau tiến hành các thí nghiệm tối ưu cổ điển
Sau đó, chúng tôi chọn ra hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu suất trích ly bealains bằng cách dựa trên hệ số ảnh hưởng E và giá trị Pvalue của từng yếu tố để tiến hành tối ưu hóa quá trình xử lý enzyme để trích ly betalains bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm c) Khảo sát độ bền của dịch màu Để khảo sát độ bền màu của dịch trích, trước tiên dịch trích được tinh sạch sơ bộ để loại bỏ một số tạp chất Chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để tinh sạch dịch trích Dịch màu trước khi lọc gel được đem ly tâm 5000 vòng trong 40 phút để loại bỏ cặn mịn, sau đó dịch sau khi ly tâm được lọc qua gel Sephadex G-25
Dịch màu sau khi lọc gel được khảo sát độ bền trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau là nhiệt độ phòng, 4 o C và -18 o C trong 7 ngày.
Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần, lấy kết quả trung bình và độ lệch chuẩn
Sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics và modde 5.0 để xử lý kết quả thực nghiệm.
Các phương pháp phân tích
Nguyên tắc: Betalains có độ hấp thu khác cao nhất ở 540nm Dựa vào độ hấp thu của mẫu ở bước song nói trên, chúng tôi sẽ suy ra được hàm lượng betalains có trong nguyên liệu ban đầu [Cai và cộng sự, 1998]
3.4.2 Xác định hàm lượng phenolic tổng
Nguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu
(hỗn hợp của oxyde tungsten và molybdenum) để tạo thành hợp chất có màu xanh
Cường độ màu sắc của mẫu chiết suất tỉ lệ thuận với nồng độ polyphenol trong mẫu Bằng phương pháp so màu đo độ hấp thụ bước sóng 760nm so với đường chuẩn axit gallic, có thể xác định được hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong mẫu phân tích.
3.4.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Nguyên tắc: Gốc tự do DPPH• (màu tím) bị khử thành hydrazine (màu vàng) khi nó phản ứng với những chất cho hydro (chất chống oxy hóa)
DPPH• (màu tím) + H-A → DPPH-H (màu vàng) + A•
DPPH là gốc tự do bền ở nhiệt độ phòng, có thể nhận một điện tử hay gốc hydro để trở thành phân tử bền và nghịch từ Vì DPPH có một điện tử lẻ nên có màu tím đậm trong MeOH và hấp thu mạnh ở bước sóng cực đại 515 nm, khi điện tử lẻ đó được ghép cặp thì độ hấp thu giảm và kéo theo sự giảm màu tỷ lệ với số điện tử được ghép cặp [Fernández-López và cộng sự, 2010]
3.4.4 Phương pháp đo độ nhớt Nguyên tắc: Độ nhớt dung dịch càng lớn thì thời gian chảy của một thể tích dung dịch xác định qua ống mao quản càng lâu [Andrade, 1934].
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình xử lý enzyme để trích ly chất màu từ vỏ thanh long
3.1.1 Tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu
Quá trình trích ly chất màu từ vỏ thanh long phụ thuộc vào tỷ lệ dung môi và nguyên liệu Tỷ lệ này ảnh hưởng tới hàm lượng betalains, phenol tổng, khả năng chống oxy hóa và độ nhớt của dịch trích Nghiên cứu này sẽ khảo sát tác động của tỷ lệ dung môi lên các thành phần quan trọng này.
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỉ lệ lượng dung môi so với lượng nguyên liệu đến hàm lượng betalains
Kết quả trên hình 3.1 cho thấy khi tăng tỉ lệ lượng dung môi so với nguyên liệu từ 15:1 lên 25:1 thì hàm lượng betalains tăng từ 5,20 mg/100g nguyên liệu tươi lên 9,39 mg/100g nguyên liệu tươi Nếu tiếp tục tăng tỉ lệ lượng dung môi so với
15:1 20:1 25:1 30:1 35:1 nguyên liệu thì kết quả xử lý thống kê cho thấy hàm lượng betalains tăng, không có ý nghĩa về mặt thống kê
Trong nghiên cứu trích ly polysaccharides từ Poria cocos của Wang và cộng sự [2009] và trích ly lycopen từ quả cà chua của Lianfu và cộng sự [2008] các tác giả cũng thu được quy luật tương tự Khi tăng dần tỉ lệ dung môi sử dụng thì hàm lượng chất chiết ban đầu tăng lên và sau đó không thay đổi
Trong quá trình trích ly betalains từ vỏ thanh long, pectin từ vỏ quả cũng hòa tan một phần vào dịch trích và làm tăng độ nhớt của dịch trích Do đó khi tăng tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu thì độ nhớt của hỗn hợp sẽ giảm, giúp enzyme hoạt động dễ dàng hơn phá hủy cấu trúc mô vỏ quả nhiều hơn, dẫn tới hàm lượng betalains càng tăng Ngoài ra, khi tăng lượng dung môi thì nồng độ các chất hòa tan trong dung môi giảm xuống nên độ hòa tan cũng như khả năng khuếch tán của các chất chiết từ bên trong tế bào ra ngoài dung môi sẽ tăng lên Tuy nhiên, hàm lượng betalains trong cùng một khối lượng nguyên liệu là không đổi nên dù tăng lượng dung môi lên rất cao thì hàm lượng chất trích ly chỉ tăng đến một ngưỡng giới hạn nhất định [Wang và cộng sự, 2009] b) Hàm lượng phenolic tổng
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ lượng dung môi so với nguyên liệu đến hàm lượng phenolic tổng
Tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng hợp chất phenolic tương tự như betalains Tăng tỉ lệ từ 15:1 lên 25:1 đã làm tăng hàm lượng phenolic tổng từ 32,35 mg axit gallic/100 g nguyên liệu tươi lên 37,34 mg axit gallic/100 g nguyên liệu tươi, tương ứng với mức tăng 13,4%.
Nếu tiếp tục tăng lượng dung môi thì hàm lượng phenolic tổng cũng thay đổi không đáng kể về mặt thống kê c) Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa trong dịch trích chủ yếu là do sự có mặt của betalains và các hợp chất polyphenol khác trong vỏ Do đó quy luật biến đổi hoạt tính chống oxy hóa trích ly từ vỏ thanh long cũng tương tự như quy luật biến đổi betlains và các hợp chất phenolic khi tăng lượng dung môi sử dụng Hoạt tính chống oxy hóa tăng mạnh nhất ứng với 20,75 mM Trolox/g chất khô, khi tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu là 25:1, giá trị này tăng 57% khi so sánh với tỉ lệ dung môi và nguyên liệu là 15:1 Như vậy, hoạt tính chống oxy hóa tăng cao nhiều hơn so với hàm lượng phenolic tổng khi tăng lượng dung môi sử dụng Đó là do sự hiện diện của các hợp chất chống oxy hóa khác trong vỏ thanh long ngoài nhóm phenolic như betalains
Trước đây, một số tác giả cũng ghi nhận hiện tượng tương tự khi khảo sát nước ép từ quả xương rồng lê [Butera và cộng sự, 2002; Stintzing và cộng sự, 2005;
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ lượng dung môi so với nguyên liệu đến hoạt tính chống oxy hóa 15:1 20:1 25:1 30:1 35:1 d) Độ nhớt tương đối
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ lượng dung môi so với nguyên liệu đến độ nhớt dịch trích Trái ngược với hàm lượng betalains, hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính chống oxy hóa, khi tăng luợng dung môi sử dụng thì độ nhớt của dịch trích ly càng giảm Độ nhớt tcủa các nghiệm thức khảo sát đều khác nhau có nghĩa về mặt thống kê
Dựa theo 3 hàm mục tiêu trước là hàm lượng betalains, hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính chống oxy hóa, tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu được chọn để thực hiện các thí nghiệm là 25:1
3.1.2 Nồng độ chế phẩm enzyme
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme pectinase trên một đơn vị khối lượng vỏ thanh long đến hàm lượng betalains, hàm lượng phenolic tổng, hoạt tính chống oxy hóa và độ nhớt của dịch trích Kết quả được trình bày trong hình 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến hàm lượng betalains
Khi tăng nồng độ chế phẩm enzyme từ 0 lên 0,1% thì hàm lượng betalains trong dịch trích tăng từ 5,96 lên 10,35 mg/100g nguyên liệu tươi, tức tăng 42%
Như vậy, enzyme đã cắt đứt các phân tử pectin trong lớp liên kết của mô thịt quả giúp giải phóng các chất từ bên trong tế bào ra bên ngoài, đồng thời giảm độ nhớt dịch trích giúp quá trình trích ly dễ dàng hơn [Ortega-Regules và cộng sự, 2006]
Khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên nữa thì hàm lượng betalains có xu hướng giảm xuống
Nghiên cứu của Khandare và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng sử dụng chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger để chiết xuất anthocyanin từ cà rốt đen có thể làm giảm hàm lượng sắc tố màu Nguyên nhân được cho là do chế phẩm enzyme pectinase chứa các enzyme oxy hóa như polyphenol oxidase và β-glucosidase Các enzyme này có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc của các sắc tố màu trong quá trình chiết xuất.
Hàm lượng phenolic tổng cũng tăng theo nồng độ chế phẩm enzyme nhưng ở mức độ thấp hơn, cụ thể khi nồng độ chế phẩm enzyme tăng từ 0% lên 0,1% (v/w), hàm lượng phenolic tổng tăng 47% Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ chế phẩm enzyme thì hàm lượng phenolic tổng lại có xu hướng giảm.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng phenolic tổng
Các hợp chất phenolic hiện diện trong không bào ở dạng hòa tan hoặc liên kết với thành tế bào như là pectin, cellulose, hemicellulose và lignin [Zafra-Rojas và cộng sự, 2013] Do đó, khi xử lý vỏ thanh long bằng enzyme pectinase thì sẽ giải phóng phenolic nằm trong không bào đồng thời giải phóng cả các hợp chất phenolic liên kết trên thành tế bào từ đó làm tăng nồng độ phenolic trong dịch trích c) Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích từ vỏ thanh long là do sự có mặt của các hợp chất phenolic và betalains tạo nên Do đó, sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích tương tự như sự thay đổi hàm lượng betalains và phenolic tổng trong dịch trích Khi tăng nồng độ chế phẩm enzyme lên 0,1% thì hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích tăng cao đạt 23,03 mM Trolox/g chất khô
Tối ưu hóa quá trình xử lý enzyme để trích ly chất màu bằng phương pháp
Để quá trình trích ly chất màu từ vỏ thanh long (Hylocerus Undatus) đạt hiệu quả cao hơn, trong phần này chúng tôi tiến hành thêm 2 thí nghiệm Thứ nhất là thí nghiệm sàng lọc nhằm chọn ra các yếu tố nào ảnh hưởng nhiều nhất đến hàm mục tiêu và từ thí nghiệm thứ nhất chúng tôi chọn ra 2 yếu tố nào ảnh hưởng nhiều nhất tới hàm mục tiêu để tiến hành thí nghiệm thứ hai là thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng của 5 yếu tố ảnh hưởng trong phần 3.1 được xem là 5 biến độc lập đến hàm mục tiêu, chúng tôi bố trí thí nghiệm bằng mô hình Plackett-Burman [Plackett và cộng sự, 1946] Hàm mục tiêu chúng tôi chọn trong thí nghiệm này là hàm lượng betalains thu được trong dịch trích Giá trị thấp (-) và cao (+) của mỗi biến sẽ được chọn dựa trên kết quả thí nghiệm phần 3.1
Bảng 3.1: Giá trị của các biến trong thí nghiệm Plackett-Burman
Thấp (-1) Cao (+1) Tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu (mL dung môi/g chất khô) Z 1 20:1 30:1
Nồng độ chế phẩm enzyme
Nhiệt độ xử lý ( o C) Z 3 25 35 pH dung môi Z 4 4 6
Thời gian xử lý (phút) Z 5 30 90
(Giá trị thấp (-) và cao (+) của mỗi biến là các giá trị lân cận của giá trị tốt nhất trong các thí nghiệm phần 3.1)
Kết quả của thí nghiệm sàng lọc bằng mô hình Plackett-Burman được trình bày trong bảng 3.2 với số lần lặp là 1
Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng mô hình Plackett-Burman
Hàm lượng Betalains (mg/100g nguyên liệu tươi)
Mức độ ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu được thể hiện qua hệ số ảnh hưởng E và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê thể hiện qua trị số P Bảng 3.3 thể hiện kết quả phân tích thống kê và ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu
Bảng 3.3: Kết quả phân tích thống kê (theo mô hình Plackett-Burman) ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu là hàm lượng Betalains
Khi một hệ số ảnh hưởng của biến mang giá trị dương, giá trị của hàm mục tiêu sẽ tăng theo giá trị biến Ngược lại, nếu hệ số ảnh hưởng mang giá trị âm, giá trị hàm mục tiêu sẽ giảm khi giá trị biến tăng.
Theo kết quả trong bảng 3.3, tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu (Z1), nồng độ chế phẩm enzyme (Z2), pH dung môi (Z4) và thời gian xử lý enzyme (Z5) là những yếu tố có ảnh hưởng đến hàm lượng betalains với độ tin cậy trên 95% (P
