Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Tách và khảo sát hoạt tính giảm đau của một số Polypeptide từ nọc bò cạp Heterometrus Laoticus của Việt Nam

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học tác động lên hệ thống thần kinh, trong đó các polypeptide, độc tố thần kinh l

-

TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU CỦA MỘT SỐ

POLYPEPTIDE TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS

CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số : 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, Tháng 01 năm 2018

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TSKH Hoàng Ngọc Anh

Cán bộ chấm nhận xét 1: Hoàng Thị Kim Dung

I TÊN ĐỀ TÀI : Tách và khảo sát hoạt tính giảm đau của một số polypeptide từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus của Việt Nam

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tiến hàng nuôi và thu nọc bò cạp trong phòng thí nghiệm - Phân tách thành phần nọc bò cạp bằng sắc ký lọc gel và sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC)

- Khảo sát tác động giảm đau của các phân đoạn - Làm sạch và xác định khối lượng phân tử của phân đoạn có tác động giảm đau tốt nhất

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 04/09/2017 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 03/12/2017 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TSKH Hoàng Ngọc Anh

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên và chữ ký)

Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại phòng Vật liệu Y sinh thuộc Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn và hỗ trợ nhiệt tình từ Quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn cùng làm khóa luận

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành nhất đến TSKH Hoàng Ngọc Anh Cô đã luôn quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, truyền đạt cho em những kiến thức cũng như kinh nghiệm để giúp em hoàn thành tốt khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài ở Viện Sinh học Nhiệt đới

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Nguyễn Thị Thanh Thảo đã luôn quan tâm, giúp đỡ và cùng em thực hiện khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Thùy Trang, bộ môn Dược Lý, Khoa

thục hiện khóa luận này

Cuối cùng em xin gửi lời tri ân đến Quý Thầy Cô trong Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường ĐH Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM, những người đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức trong suốt thời gian em học Thạc sĩ tại trường

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2018

Học viên thực hiện

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của TSKH HOÀNG NGỌC ANH Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình Trường đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM không liên

quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện

(nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 01 năm 2018

Học viên Võ Phạm Hoàng Huy

I.1 Giới thiệu về bò cạp 3

I.1.1 Hình thái và cơ thể học 3

I.1.2 Phân bố và môi trường sống 5

I.1.3 Phân loại 6

I.2 Nọc bò cạp 9

I.2.1 Thành phần hóa học 9

I.2.2 Những nghiên cứu và ứng dụng của nọc bò cạp 9

I.2.2.1 Những nghiên cứu của nọc bò cạp trên thế giới 9

I.2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

I.2.2.3 Những ứng dụng của nọc bò cạp 12

I.3 Các phương pháp nghiên cứu 15

I.3.1 Phương pháp sắc ký lọc gel 15

I.3.1.1 Khái niệm 16

I.3.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) 19

I.3.2.1 Khái niệm 19

I.3.2.2 Các bộ phận chính của máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 19

I.3.2.2.1 Bình chứa dung môi giải ly cột 19

I.3.2.2.2 Máy bơm 19

I.3.2.2.3 Cột sắc ký 19

I.3.2.2.5 Detector 21

I.3.2.3 Dung môi dung trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 21

I.3.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 21

I.3.3.1 Khái niệm 21

I.3.3.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khô 21

I.3.3.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô 22

I.3.4 ĐAU VÀ TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU 22

I.3.4.1 Định nghĩa và phân loại 22

I.3.4.2 Nguyên nhân và cơ chế đau 23

I.3.4.3 Điều trị đau 25

I.3.4.4 Các mô hình thử nghiệm tác động giảm đau 25

I.3.4.4.1 Các mô hình thử nghiệm tác động giảm đau thần kinh ngoại biên 25 I.3.4.4.2 Các mô hình thử nghiệm tác động giảm đau thần kinh trung ương 26 I.3.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ MALDI-MS……… 28

I.3.6 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ DỮ LIỆU………29

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 30

II.1 NUÔI VÀ THU NỌC BÒ CẠP TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 30

II.3.2 Các bước tiến hành 36

2.3.2.1 Chuẩn bị dung môi 36

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu 36

2.3.2.3 Tiến hành chạy mẫu trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp đảo pha HPLC 36

2.3.2.4 Thu mẫu và đông khô: 37

II.4 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 4 37

II.4.1 Khảo sát tác động giảm đau ngoại biên trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 37

II.4.1.1 Dụng cụ và hóa chất: 37

II.4.1.2 Đối tượng thử nghiệm: 38

II.4.1.3 Thuốc thử nghiệm 38

II.4.1.4 Tiến hành thí nghiệm 39

II.4.2 Khảo sát tác động giảm đau trung ương trên mô hình thử nghiệm nhúng đuôi chuột trong nước nóng 40

II.4.2.1 Dụng cụ và hóa chất: 40

II.4.2.2 Đối tượng thử nghiệm: 41

II.4.2.3 Thuốc thử nghiệm 41

II.4.2.4 Tiến hành thí nghiệm 42

II.4.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ 42

QUÁ TRÌNH GIẢM ĐAU BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (RP-HPLC) 43

II.6 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU NGOẠI BIÊN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 4.7 TRÊN MÔ HÌNH GÂY ĐAU QUẶN BẮNG ACID ACETIC 43

II.7 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CÓ TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU TỐT NHẤT 43

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

III.1 KẾT QUẢ CỦA VIỆC THU NỌC BÒ CẠP 44

III.2 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỌC GEL VÀ ĐÔNG KHÔ 44

III.2.1 Kết quả chạy sắc ký lọc gel 44

III.2.2 Khảo sát độc tính của các phân đoạn nọc……… 45

III.3 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP ĐẢO PHA (RP-HPLC) CỦA PHÂN ĐOẠN 4 47

III.4 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 4 50

III.4.1 Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 50

III.4.2 Khảo sát tác động giảm đau trung ương trên mô hình thử nghiệm nhúng đuuoi chuột trong nước nóng 52

III.4 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP ĐẢO PHA (RP-HPLC) CỦA PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP 4.7 54

III.5 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU NGOẠI BIÊN CỦA PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP 4.7 TRÊN MÔ HÌNH GÂY ĐAU QUẶN BẰNG ACID ACETIC 56

III.6 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CÓ TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU TỐT NHẤT 57

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 58

IV.1Kết luận 58

IV.2Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

BmK Buthus martensi Karsch B.martensi karsh Buthus martensi Karsch H.laoticus Heterometrus laoticus L.mucronatrus Lychas mucronatrus

B.subtilis Bacillus subtilis

chromatography

Sắc ký lỏng cao áp đảo pha

LD50 : liều gây chết 50%

Hình 1.1 Bò cạp Heterometrus laoticus 3

Hình 1.2 Hình thái học của bò cạp Heterometrus laoticus 5

Hình 1.3 Sự phân bố các loài bò cạp ở Việt Nam 6

Hình 1.4 Cấu trúc toxin trong nọc bò cạp 11

Hình 1.5 Cơ chế phân tách trong sắc ký lọc gel 16

Hình 3.1: Sắc ký đồ của nọc bò cạp Heterometrus laoticus 44

Hình 3.2 Sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) trên cột C18 47

Hình 3.27 Săc ký lỏng cao áp phân đoạn thứ cấp 4.7 55

Bảng 1.1: Các loại cột sắc ký lỏng cao áp dùng trong kỹ thuật sắc ký……….20

Bảng 3.1: Khối lượng của các phân đoạn……….………45

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độc tính lên chuột của các phân đoạn nọc……… 46

Bảng 3.3: Khối lượng của các phân đoạn thứ cấp sau khi đông khô……… 48

Bảng 3.4: Số lần đau quặn trung bình của chuột vào các thời điểm khảo sát…………50

Bảng 3.5: Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi của chuột ( giây) ở các lô vào các thời điểm………53

Bảng 3.6: Khối lượng phân tử của các phân đoạn sau khi đông khô……… 55

Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm giảm đau của phân đoạn thứ cấp 4.7……… 58

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng được chú ý Ngày nay với sự hỗ trợ của trang thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại, các nhà nghiên cứu khoa học đã và đang tìm ra các giải pháp điều trị không những an toàn, ít tác dụng phụ mà còn đat hiệu quả cao từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao

Bên cạnh đó, việc điều chế thuốc giảm đau là một hướng đang được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới, trong đó nọc động vật là nguồn cung cấp các loại thuốc giảm đau kháng viêm thế hệ mới Nọc độc côn trùng và rắn được hình thành trong quá trình tiến hóa hàng trăm triệu năm để giết hoặc làm tê liệt con mồi vì vậy nó là nguồn dược liệu quý để chế ra các thuốc giảm đau đặc hiệu Nhiều loài nọc độc chứa hàng chục hoặc ngay cả hàng trăm neurotoxin có tác dụng mạnh và nhanh đối với cơ bắp và hệ thần kinh Những neurotoxin này đã và đang được nghiên cứu sử dụng trên thế giới để chế ra những loại thuốc mới có hiệu quả cao

Trải qua hơn 1000 năm, bò cạp đã được sử dụng rất rộng rãi trong ngành dược và là một vị thuộc quý của các bài thuốc cổ truyền đối với nhiều quốc gia trên thế giới Theo kinh nghiệm dân gian, bò cạp thường được dùng nguyên con (toàn yết), hoặc phần đuôi (yết vĩ) để trị động kinh ở trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị, méo miệng… dưới dạng thuốc bột hoặc làm viên uống Cùng với sự tiến bộ khoa học, đã có những nghiên cứu trên thế giới về nọc bò cạp và đã xác định có hoạt tính về thần kinh

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học tác động lên hệ thống thần kinh, trong đó các polypeptide, độc tố thần kinh là thành phần quan trọng, chúng tác động lên các thụ thể và các kênh ion của các màng tế bào bị kích thích, đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu và khảo sát để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh như: Parkinson, bệnh cao huyết áp, ung thư, Alzheimer…Ngoài ra, đã có rất nhiều

nghiên cứu trên thế giới về tác dụng điều trị các triệu chứng thần kinh, đặc biệt là

đau mãn tính từ nọc độc của loài bò cạp như Buthus martensi Karsch (BmK)

Nọc bò cạp cung cấp một kho các polypeptide với các chức năng sinh học đa dạng và tính đặc hiệu cao với các yếu tố nhất định của tế bào Những polypeptide này có trọng lượng phân tử thấp và được ổn định cấu trúc bởi các cầu disulfide Chính vì vậy các polypeptide từ nọc bò cạp sẽ tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng vào dược phẩm

Ngày nay, những vấn đề về hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng các loại thuốc giảm đau trong điều trị bệnh đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu, trong đó có Việt Nam Vì vậy, việc tìm ra các loại thuốc giảm đau từ nguồn hợp chất thiên nhiên đang là xu hướng nóng trên thế giới

Để có thể đóng góp một nguồn nguyên liệu mới cho ngành dược dùng làm thuốc chữa bệnh, và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo; nhóm nghiên cứu

chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu về nọc bò cạp Heterometrus laoticus Đề tài

“TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU CỦA MỘT SỐ

POLYPEPTID TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS CỦA VIỆT NAM” là một hướng nghiên cứu mới về nọc bò cạp Heterometrus laoticus Thực

hiện đề tài này chúng tôi sẽ mở ra hướng ứng dụng của nọc bò cạp trong y dược

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1 Giới thiệu về bò cạp

Bò cạp là một trong những nhóm động vật có lịch sử tiến hóa lâu đời, từ kỷ Silur với 430 triệu năm tiến hóa Chúng đã thích nghi với một loạt các điều kiện môi trường và bây giờ có thể tìm thấy trên tất cả các lục địa, ngoài trừ Nam Cực [1] Bò cạp thuộc động vật lớp nhện mà có thể dễ dàng nhận ra bởi cơ thể thon dài đặc trưng của chúng và phân đoạn đuôi kết thúc với một túi bao phồng ra và có vòi nhọn Có hơn 1500 loài bò cạp trên thế giới Trong quá trình tiến hóa, chúng đã phát triển nọc độc để làm vũ khí hiệu quả săn mồi và tự vệ [2] Nọc độc được tiết ra bởi các tế bào của tuyến nọc [3] và chúng chứa các thành phần hoạt tính sinh học phong phú, trong đó các polypeptide nhỏ có giá trị quan trọng nhất, chúng được sử dụng như một công cụ thử nghiệm cho những nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các kênh ion [4] và chúng được xem như bước đầu cho công nghiệp protein [5]

Hình 1.1 Bò cạp Heterometrus laoticus[6] I.1.1 Hình thái và cơ thể học

Thân bò cạp được chia làm ba phần: phần đầu ngực, phần bụng và đuôi [7][8] Phần đầu ngực hay còn gọi là đốt thân trước bao gồm bộ giáp, mắt, chân kìm (phần miệng), những chân kìm sờ (các chân kìm sờ của bò cạp có vuốt kìm, thường

được gọi là vuốt hay càng cua) và bốn cặp chân để di chuyển Bộ giáp ngoài của bò cạp dày và có độ bền cao, giúp chúng được bảo vệ tốt khỏi kẻ thù Bò cạp có hai mắt trên đỉnh đầu ngực, và thường có từ hai đến năm cặp mắt dọc nằm các góc phía trước của phần đầu ngực Vị trí của mắt trên phần đầu ngực phụ thuộc một phần vào độ cứng hay mềm của vùng đất mà chúng sinh sống [9]

mồi và tự vệ trước kẻ thù Các phân đoạn của chân kìm sờ là khớp háng, đốt chuyển, xương đùi ( xương cánh tay), xương bánh chè, xương chày (bao gồm 5 vuốt cùng với chân trước) và xương cổ chân( vuốt di động) [2] Bò cạp có lớp sạm hoặc hột nổi dọc theo chóp đỉnh, gọi là sóng lưng trên đốt chân xúc giác và một phần cơ thể, giúp nhiều trong việc phân loại chúng [7]

Phần bụng hay còn gọi là vùng thân sau bao gồm 7 phân đoạn (đốt), mỗi động mạch lưng được bao bọc bởi thể xương cứng (lưng) và cũng có ở phần bụng từ phân đoạn ba đến bảy Phân khúc bụng đầu tiên mang một cặp nắp mang sinh dục bao lấy cơ quan sinh sản Phần hai gồm các tấm nền với các pectines, đó là một cặp chi biến thành cơ quan cảm giác [10] Phân đoạn từ ba đến bảy có một cặp lỗ thở, đó là cơ quan hô hấp của bò cạp Các lỗ thở khi mở ra có thể là khe hở, hình tròn, hình elip hoặc bầu dục [7]

Phần cuối bụng, đuôi của bò cạp, bao gồm 5 phân đoạn đuôi và phân đoạn thứ 6 mang trâm cong (vòi) Trâm cong này lần lượt bao gồm các túi bọng giữ một đôi tuyến nọc độc và ngòi đốt dưới da, chích nọc độc

Trong một số trường hợp, bò cạp sinh ra có thể có hai đuôi Nó không phải là một loài mới mà chỉ là một sự bất thường trong di truyền học [11]

Hình 1.2 Hình thái học của bò cạp Heterometrus laoticus[12]

I.1.2 Phân bố và môi trường sống

Bò cạp được tìm thấy trên tất cả các vùng đất lớn, ngoại trừ Châu Nam Cực Bò cạp ban đầu không xuất hiện tự nhiên ở Anh, Nhật Bản, Hàn Quốc, New Zealand và một số hòn đảo của Châu Đại Dương nhưng do nhu cầu thương mại vô tình người ta đã đưa chúng đến đây Sự đa dạng lớn nhất của bò cạp ở Bắc Bán Cầu được tìm thấy trong các khu vực cận nhiệt đới nằm giữa vĩ độ 23oN và 38oN Trên những vĩ độ này, sự đa dạng sẽ giảm dần tới cực Bắc, cùng với đó là sự xuất hiện

loài bò cạp phía Bắc Paruroctonus boreus ở vùng Medicine Hat, Alberta, Canada

tại vĩ độ 50°N [7]

Hiện nay, bò cạp được tìm thấy ở hầu hết các môi trường sống trên cạn, trong đó núi có độ dốc cao, hang động và vùng triều, ngoại trừ hệ sinh thái phương Bắc như các vùng lãnh nguyên, ở độ cao rừng taiga và một số ngọn núi phủ tuyết vĩnh viễn [13] Bò cạp có thể sống dưới mặt đất, môi trường cát, vùng mưa nhiệt

đới…; một số loài như Vaejovis janssi rất linh hoạt và được tìm thấy trong tất cả các

loại môi trường sống ở Baja California, trong khi những loài khác chuyên sống

trong hang, hốc như Euscorpius carpathicus, chúng chỉ xuất hiện ở vùng ven biển

[14]

Ở Việt Nam, bò cạp phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bằng tới miền núi trong những khu vườn ẩm ướt và cả hải đảo khô Ở miền Bắc nước ta, bò cạp có thể gặp ở vùng rừng Vườn Quốc Gia Ba Vì hay ở vùng cao nguyên Mộc Châu (Sơn La) [4] Theo kết quả khảo sát năm 2004 của viện hóa học cho thấy ở tỉnh Đắc Nông có

nhiều bò cạp đen Heterometrus pertesii, còn ở vùng Đông nam Bộ có nhiều bò cạp nâu Lychas mucronatus Bên cạnh đó, Phạm Đình Sắc và cộng sự đã tóm tắt sơ bộ

để có cái nhìn rõ ràng hơn về sự đa dạng sinh học, tính đặc hữu của hệ động vật bò cạp ở Việt Nam [15]

Hình 1.3 Sự phân bố các loài bò cạp ở Việt Nam [15] I.1.3 Phân loại

Bò cạp có khoảng 1952 loài được ghi nhận thuộc 191 chi, phân bố trong 14 họ Trong đó, họ lớn nhất là họ Buthidae với 91 chi gồm 1032 loài, tiếp đến là họ Scorpionidae với 18 chi gồm 287 loài, họ Vaejovidae có 23 chi gồm 191 loài, họ Chacrtidae có 15 chi gồm 183 loài, họ Bothriuridae có 16 chi gồm 150 loài…[16]

Năm 2016, một loài bò cạp mới đáng chú ý thuộc chi Ananteris Thorell, 1891 (Buthidae) được tìm thấy tại vùng Massif Mitaraka ở Guiana thuộc Pháp, một địa điểm nằm gần biên giới của Guiana thuộc Pháp, Brazil và Suriname, có tên khoa

học là Spinochactas mitaraka gen n., sp n (Chactidae) Một loài khác cũng đã được phát hiện tại Honduras vào năm 2015 có tên khoa học là Diplocentrus Peters [17]

Ở Việt Nam đã phát hiện 4 họ là Buthidae [7], Scorpionidae [7], Chaerilidae [7] và Pseudochactidae [7], trong đó thường hay gặp nhất là hai họ : Buthidae và Scorpionidae Chúng phân bố như sau:

Họ Buthidae:

Lychas mucronatus Fabricius: phân bố ở các tỉnh miền Trung và miền Nam,

phát triển mạnh ở Đồng Phú (Bình Phước)

Isometrus bacilicus Karch: phân bố ở Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định,

Khánh Hòa (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú)

Isometrus sp: phân bố ở Nghệ An (Vinh)

Isometrus deharvengi sp: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên Giang [18]

Họ Scorpionidae:

Hetrometrus spinifer spinifer: phân bố ở Bình Phước (Bù Đốp, Bù Gia Mập,

Đồng Phú)

Hetrometrus petersii petersii: phân bố ở Tp Hồ Chí Minh, Bình Thuận,

Khánh Hòa, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh

Hetrometrus laoticus Couzijn: ở Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai (Biên Hòa),

Tây Ninh, An Giang

Hetrometrus cyaneus cyaneus : phân bố ở Thừa Thiên Huế, Quảng Trị

Hetrometrus sp: phân bố ở Sơn La (Mộc Châu), Hà Tây (Ba Vì)

Họ Chaerilidae

Chaerilus petrzelkai: ở miền Nam Việt Nam, đảo Côn Sơn [19]

Chaerilus Simon,1877: ở miền Nam Việt Nam [20]

Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhlu, 2008: phân bố ở miền Bắc

Chaerilus julietteae Lourenco, 2011: phân bố ở miền Nam

Chaerilus phami sp: tập trung ở đảo Côn Sơn

Họ Pseudochactidae

Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010 [21]

V thienduongensis Lourenco & Pham, 2012 [21]

Cả 2 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình

Năm 2014, một loài bò cạp mới đã được phát hiện trong hang động khu bảo tồn thiên nhiên Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị có tên khoa học là

Euscorpiops dakrong Lourenco & Pham Bò cạp mới này có màu nâu vàng với

nhiều đốm màu nâu đậm [22]

Năm 2015, một loài bò cạp mới đã được phát hiện ở rừng tự nhiên xã Nậm Vì, huyện Mường Nhé, tỉnh Điện Biên có tên khoa học là Scorpiops

(Vietscorpiops) dentidactylus Lourenco & Phạm Bò cạp mới này thuộc giống

Scorpiops, họ Euscorpiidae Chúng có mặt lưng màu nâu vàng, mặt bụng màu vàng nhạt [23]

Trong đề tài này chúng tôi đề cập đến bò cạp Heterometrus laoticus, thuộc

họ Scorpionidae Ở Việt Nam có nhiều bò cạp Heterometrus, đó là bò cạp đen hay

bò cạp rừng, trong đó bò cạp H.laoticus được tìm thấy nhiều ở vùng nam bộ [24]

I.2 Nọc bò cạp

Tất cả loài bò cạp đều có nọc độc và chúng sử dụng nọc để giết hoặc làm tê liệt con mồi làm thức ăn Nói chung, đó là một hành động nhanh chóng, cho phép chúng chụp con mồi hiệu quả Nọc độc còn được sử dụng để chống lại kẻ thù Nọc độc này là một hỗn hợp các hợp chất ( độc tố thần kinh, chất ức chế enzyme…) không chỉ gây ra các hiệu ứng khác nhau mà còn nhắm đến mục tiêu động vật cụ thể Mỗi hợp chất được tạo ra và lưu trữ trong một cặp túi tuyến nọc Trong số gần 2000 loài bò cạp, chỉ 25 loài có lượng độc gây chết người, hầu hết trong số chúng

thuộc họ Buthidae (bao gồm Leiurus quinquestriatus, Hottentotta, Centruroides and

Androctonus) [25][26]

I.2.1 Thành phần hóa học

Nọc độc của bò cạp là một hỗn hợp các thành phần như các enzyme, peptide, nucleotide, lipid, mucoproteins, amin hữu cơ và các phân tử khác chưa được biết đến [27], trong đó peptide và protein đóng vai trò cơ bản Hầu hết các peptide trong nọc bò cạp được tạo thành từ 20-75 gốc amino acid, trong khi những protein ít được biết đến (enzyme) có chứa 120-370 gốc acid amin [28][29][30] Nếu chúng ta xét đến vai trò của các kênh ion trong việc kiểm soát các hoạt động điện của hệ thống thần kinh và cơ bắp của sinh vật thì độc tố thần kinh là các thành phần độc tố nổi bật nhất [31][32][33]

I.2.2 Những nghiên cứu và ứng dụng của nọc bò cạp

I.2.2.1 Những nghiên cứu của nọc bò cạp trên thế giới

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học tác động lên hệ thống thần kinh, trong đó các polypeptide – độc tố thần kinh là thành phần được nghiên cứu nhiều nhất, chúng tác động lên các receptor và các kênh ion của các màng tế bào bị kích thích [34][35][36][37] Dựa vào tác động của các toxin với các kênh ion và được phân

Trong khi cấu trúc bậc một của các toxin trong nọc bò cạp khác nhau [37][45][53] thì cấu trúc không gian của chúng khá giống nhau Ngoại trừ cấu trúc không gian của các toxin nọc bò cạp tác động lên kênh Ca2+ là chưa được biết đến [43], tất cả các peptide nọc bò cạp bao gồm một alpha-spiral và hai hoặc ba nhánh của cấu trúc beta, được cố định bởi các cầu nối disulfide [37][38][45][54] Một trường hợp ngoại lệ này là một độc tố kích thích côn trùng có tên khoa học là

Buthotusjudaicus [55],có 2 phân đoạn alpha-spiral thay vì một như các đoạn peptide

bình thường khác

Hình 1.4 Cấu trúc toxin trong nọc bò cạp [56]

A Cấu trúc toxin dài B Cấu trúc toxin ngắn I.2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Từ xa xưa, trong y học phương Đông, bò cạp đã được sử dụng như một vị thuốc Bò cạp còn gọi là toàn trùng, yết tử, yết vĩ hay toàn yết Tên khoa học là

Buthus sp Nếu dùng cả con bò cạp để làm thuốc thì gọi là toàn yết, nếu chỉ dùng

đuôi không thôi thì gọi là yết vĩ Toàn yết là một vị thuốc trấn kinh, chữa trẻ em kinh phong, uốn ván Ngoài ra còn làm thuốc kích thích thần kinh, bán thân bất toại, bị cảm mồm miệng méo xệch [57][58]

Ở Việt Nam, một số loài bò cạp đã được nghiên cứu về tính chất và thành

phần, tiêu biểu là 2 loài bò cạp : Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus Từ loại bò cạp nâu L.mucronatrus, TSKH Hoàng Ngọc Anh và cộng sự đã phân lập được

bảy độc tố thần kinh, được tinh chế và xác định bằng RP-HPLC trên cột C18 và khối phổ Những độc tố được phân lập này có khối lượng phân tử là : 4948 Da, 4316 Da, 4054 Da, 3843 Da và 3812 Da có tác động lên myelin thần kinh [2]

Đối với nọc bò cạp đen H.laoticus,nhóm nghiên cứu của TSKH Hoàng

Ngọc Anh đã khảo sát thành phần protein và dược tính của nó Xác định nọc bò cạp này chứa các thành phần độc với động vật và côn trùng, nọc toàn phần có tác dụng kháng viêm, giảm đau Từ phân đoạn có độc tính với động vật đã tách được toxin có tác dụng với kênh Kali [41] Từ phân đoạn có độc tính đối với côn trùng đã xác

định được hai toxin là dipeptide Leu-Trp có khối lượng phân tử là 317,954 Da và toxin còn lại có khối lượng phân tử là 832,600 Da [24] Ngoài ra, từ nọc bò cạp

H.laoticus nhóm nghiên cứu này khảo sát tác động chống đông máu trên chuột Các

phân đoạn thứ cấp tách từ nọc bò cạp H.laoticus được tiêm vào tĩnh mạch đuôi

chuột và tiến hành khảo sát thời gian đông chảy máu sau khi cắt đuôi chuột Kết quả khảo sát đã xác định được khối lượng phân tử các toxin có hoạt tính chống đông máu là 1091 Da, 444 Da, 418 Da, 1506 Da, 165 Da và 831 Da [10][56]

Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát tác động kháng viêm,

giảm đau của các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và đã xác

định được các phân đoạn có hoạt tính Như vậy, nọc bò cạp có thể sử dụng để làm các chế phẩm có tác dụng kháng viêm, giảm đau như kem xoa bóp, keo dán [52] I.2.2.3 Những ứng dụng của nọc bò cạp

Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy nọc bò cạp có tác dụng trong việc giảm đau

Trong y học cổ truyền của Trung Quốc, loài bò cạp Châu Á Buthus martensi

Karsch (BmK) được sử dụng rộng rãi hang ngàn năm để điều trị các triệu chứng

thần kinh, đặc biệt là đau mãn tính BmK AS, một polypeptide từ nọc độc của bò

cạp B.martensi Karsh có thể tạo ra hiệu ứng giảm đau ngoại biên ở chuột.Đó chính

là hướng nghiên cứu về tác dụng giảm đau ngoại biên của BmK AS trên chuột [59]

Bên cạnh các độc tố thần kinh trên động vật có vú, từ loài bò cạp Buthus

martensi Karsch (BmK), các nhà nghiên cứu đã xác định được một độc tố mới có

tác động giảm đau trên chuột và được tinh chế từ nọc bò cạp Buthus martensi

Karsch (BmK) Peptide này được xác định là BmK IT-AP gồm 72 gốc amino acid

BmK IT-AP cho thấy tác dụng giảm đau rõ rệt khi sử dụng mô hình thử nghiệm đau quặn gây ra bởi acid acetic trên chuột thí nghiệm [60] Ngoài ra, nọc của loài bò cạp này còn được sử dụng để xác định tính hiệu quả và an toàn của việc tiêm nọc bò cạp trong điều trị đau thần kinh Nhóm 30 bệnh nhân được điều trị bằng nọc độc bò cạp

tiêm ở liều 20 µg và nhóm 30 bệnh nhân được điều trị bằng buprenorphine 0,15 mg Kết quả khảo sát cho thấy kết quả giảm đau của nhóm điều trị bằng nọc bò cạp là 53% và của nhóm buprenorphine là 47% Tuy nhiên có điểm bất lợi duy nhất là có biểu hiện đau tại chỗ khi tiêm đối với nhóm được điều trị bằng nọc bò cạp Như vậy: nọc bò cạp có thể được xem là phương pháp mới đáng tin cậy và an toàn như khi dùng buprenorphine [61]

Nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương của nọc bò cạp Buthus martensi

Karsch (BmK) và các phân đoạn của nó và so sánh với tác dụng giảm đau của

morphine bằng cách tiêm một lượng nhỏ mẫu thử nghiệm lên chuột và đánh giá theo phản xạ đau gây ra bởi nhiệt bức xạ Kết quả cho thấy ngưỡng chịu đau của chuột tăng hơn 150% trong 20 phút sau khi tiêm liều 0 5 µg / kg đến 2 µg / kg của nọc bò cạp và việc tiêm 10 µg / kg morphine lên chuột cũng có kết quả tương tự Từ đó ta thấy rằng khả năng giảm đau của nọc bò cạp lớn hơn so với morphine hơn 5 lần, như vậy nọc bò cạp là thuốc giảm đau trung ương mạnh [62]

Những tiến bộ gần đây trong công nghệ di truyền và protein đã thu hút nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu về nọc độc, chẳng hạn như dự án về hệ thống di truyền về nọc độc [61] và sự phát triển của các phương pháp phân tích phổ về thành phần độc tố [ 63][64]

Bò cạp cũng được biết đến nhiều do nọc độc của chúng có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng ở người, có thể dẫn đến tử vong [65][66] Trên thế giới, hằng nằm, trường hợp bò cạp chích người nếu ước tính trên một triệu người thì số người có nguy cơ tử vong chiếm 3% [67].Tuy nhiên, gần đây các hợp chất tự nhiên rất được quan tâm vì những đóng góp của chúng trong việc nghiên cứu ra các loại thuốc mới [68].Một vài thập niên trước đây, các poly-peptide từ bò cạp đã được phân lập và tinh chế Các poly-peptide này tạo được quan tâm nhiều vì sự tương tác của chúng với các kênh ion khác nhau và các thành phần của màng tế bào Như vậy, nọc bò cạp đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y học để tìm ra các loại thuốc mới [69][70]

Charybdotoxin là toxin được phân lập từ loài bò cạp Leiurus quinquestriatus

thuộc họ Buthidae chặn các kênh K+ trong tế bào lympho T ở người và chuột, gây ức chế sự tăng sinh của chúng [71] Hơn thế nữa, parabutoporin được phân lập

AMP (adezonin monophosphat) từ loài bò cạp Parabuthus schlechteri có thể hoạt

hóa exocytosis và ức chế sản xuất ra superoxide trong bạch cầu đa nhân ở người

[72] Loài bò cạp Tityus serrulatus đã được ứng dụng để kích hoạt hệ thống bổ thể,

trong đó có một phần miễn dịch không đặc hiệu sentinel [73]

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều AMP, có nguồn gốc từ bò cạp, có khả năng ức chế mạnh hoạt động của virus để chống bệnh sởi, SARS-Cov, H5N1 [74], viêm gan B [75] và virus HIV [44][76][77] Chủ yếu các peptide này hoạt động thông qua một sự gián đoạn trực tiếp bao bọc lấy virus, do đó làm giảm sự lây nhiễm của các tác nhân gây bệnh

Bên cạnh đó, từ toxin nọc bò cạp, người ta đã điều chế ra nhiều loại thuốc

chữa bệnh ung thư Margatoxin được phân lập từ nọc bò cạp Centruroides

margaritatus đã được hãng Merck (Đức) đăng ký bản quyền như thuốc để điều trị

bệnh tự miễn dịch và chống loại bỏ trong quá trình cấy ghép các cơ quan [78]

Clorotoxin tách từ nọc bò cạp Leiurus quinquestritus được sử dụng để điều trị bệnh

ung thư não [79]

Dùng toxin antiosteoporotic từ loài bò cạp Heterometrus bengalensis tác

động lên buồng trứng của chuột bạch tạng cái được điều trị bằng methylprednisolone Tác dụng của nọc bò cạp được cho là nguyên nhân trực tiếp gây nên sự tái lập xương bằng việc hình thành xương và giảm quá trình tiêu xương Có vẻ như nó đã làm tăng thêm phần xương khoáng trong việc kết hợp với các tác nhân điều tiết như hormones, enzymes, và cytokines [80] Hướng nghiên cứu này có thể dẫn đến khả năng cải thiện điều trị tiêu xương [81]

Nọc bò cạp cung cấp một kho các polypeptide với các chức năng sinh học đa dạng và tính đặc hiệu cao với các yếu tố nhất định của tế bào Những polypeptide

này có trọng lượng phân tử thấp và được ổn định cấu trúc bởi các cầu disulfide Chính vì vậy các polypeptide từ nọc bò cạp sẽ tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng vào dược phẩm

Nghiên cứu về bò cạp H.laoticus

Những nghiên cứu về loài bò cạp H.laoticus không nhiều Đây là bò cạp ít

độc ở liều LD50= 190 mg/kg Từ nọc độc của loài này người ta đã phân lập được 3

loại toxin Toxin đầu tiên được phân lập là Heteroscorpine (HS-1) thuộc họ

scorpine từ nọc bò cạp H.laoticus ở Thái Lan với khối lượng phân tử lá 8293 Da Sau khi tinh chế, toxin này cho thấy khả năng hoạt động ức chế đối với B subtilis, K pneumoniae, và P aeruginosa cao hơn 300 lần so với nọc thô Ngoài ra, toxin này đã được xác định có độc tính với côn trùng [82] Toxin thứ hai được phân lập bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp và được xác định là HelaTx1 có khối lượng phân tử là 2763 Da HelaTx1 có tác động hiệu quả đối với kênh Kv1.1 và Kv1.6 với nồng độ (Kv1.1 EC50 = 9,9± 1,6 µM) Toxin này gây ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của các kênh K+ HelaTx1 là peptide đầu tiên tác động lên kênh κ-

KTx5 [83].Toxin thứ 3 được phân tách từ bò cạp H.laoticus là Hetlaxin Hetlaxin có

khối lượng phân tử là 3669,2 Da với 8 gốc cyteine hình thành nên 4 cầu nối disulfide Đây là toxin tác động lên kênh Kv1.3 với nồng độ nanomol ( EC50 = 0,48

± 0,01µM) đầu tiên được phân lập từ nọc bò cạp H.laoticus [84][85].Toxin gần nhất được phân lập từ bò cạp H.laoticus là Heteromtoxin (HmTx), toxin này là

phospholipase A2 nhóm III HmTx có khối lượng phân tử là 14018.4 Da Cấu trúc của HmTx tương tự như Pandinus imperator imperatoxin I (IpTxi) và Mesobuthus tamulus phospholipase A2 (MtPLA2) [86]

Đó là những nghiên cứu về độc tố của nọc bò cạp H.laoticus, hướng nghiên cứu có ứng dụng cao trong y học của loài bò cạp H.laoticus

I.3 Các phương pháp nghiên cứu I.3.1 Phương pháp sắc ký lọc gel

I.3.1.1 Khái niệm

Sắc ký lọc gel ( sắc ký rây phân tử ) là phương pháp tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất Một số vật liệu rắn xốp có khả năng tạo ra bộ khung gel hay rây phân tử khi gặp dung môi tách Pha tĩnh trong sắc ký lọc gel là dung môi trong các lỗ của hạt gel, còn pha động chính là dung môi chạy qua [20] Khi dung dịch cần phân tách đi qua bộ khung gel hay rây phân tử do có kích thước phân tử khác nhau nên sẽ có khả năng khác nhau khi qua gel

I.3.1.2 Nguyên tắc

Trong phương pháp sắc ký lọc gel, các cấu tử trong dung dịch phân tích sẽ được phân tách theo thứ tự giảm dần về kích thước phân tử [20] Các phân tử có kích thước phân tử lớn hơn kích thước lỗ gel sẽ không bị hấp phụ lên gel mà chỉ khuếch tán giữa các khe hở của các hạt gel Ngược lại, các phân tử có kích thước nhỏ hơn có thể thông qua các lỗ gel đi sâu vào bên trong hạt gel Khi pha động đi qua các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ bị rửa giải đầu tiên, các phân tử có kích thước bé hơn sẽ bị rửa giải sau Pha tĩnh trong sắc ký lọc gel là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng được phủ đầy các dung môi dung làm pha động [20] Các lỗ rỗng phải có kích thước đồng nhất vì chính nó giữ vai trò quan trọng trong quá trình phân tách chất [20]

Hình 1.5 Cơ chế phân tách trong sắc ký lọc gel [20]

1.3.1.3 Đặc tính hóa học của gel [13][87]

Các loại gel phổ biến nhất hiện nay bao gồm các khung gel hữu cơ như dextran, polyacrylamide, polyvinylacetate, polystirol… hoặc các rây phân tử vô cơ như zeolite tổng hợp, thủy tinh xốp, silicagel v.v… Yêu cẩu các hạt gel phải có kích

thước giống nhau, trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học và các lỗ gel phải có hình dạng và kích thước tương đối đồng nhất Tùy theo kích thước lỗ gel mà mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại chất có kích thước phân tử hoặc khối lượng phân tử cụ thể Vì thế việc lựa chọn gel có kích thước lỗ gel phù hợp có khả năng tách chất có kích thước phân tử nằm trong vùng chúng ta cần

I.3.1.4 Chọn gel

Việc tách trong sắc ký lọc gel tùy thuộc vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất Các hạt gel có dạng hình cầu, hạt gel có kích thước càng nhỏ càng tốt vì như thế sẽ đảm bảo dòng chảy [13][20]

Cỡ hạt gel thường được sử dụng là 10-40 µm hay 20-80 µm Hạt nhỏ hơn cho kết quả tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện dài hơn [44] Việc lựa chọn gel, yêu cầu quan trọng nhất là phải chọn gel có khả năng tách được các chất có kích thước phân tử hoặc khối lượng phân tử trong vùng chúng ta cần, do đó phải hết sức cẩn thận chọn kích thước của gel ( nếu cần, phải tiến hành thí nghiệm thăm dò trước) [13][20]

I.3.1.5 Chọn cột Với từng loại mục đích phân lập loại hợp chất mà chọn cột phù hợp Để tách nhóm chất chỉ cần cột dài hơn 50 cm, tỉ lệ chiều dài cột so với đường kính ở khoảng 5-10 lần, và thể tích nền gấp 4-10 lần thể tích của mẫu [13][43]

Đối với quá trình tách các phân đoạn thì cần cột dài hơn 100 cm và tỉ lệ chiều dài lớp nền so với tỉ lệ đường kính là 25-100 lần hoặc lớn hơn và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu [13]

1.3.1.6 Dung môi và tốc độ dòng chảy

Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào tính tan của hỗn hợp tách, dung môi có thể là nước, toluene, chloroform,…

Tốc độ độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do Đối với gel có kích thước lỗ nhỏ thì tốc độ khoảng 8-12 mL/cm2 mặt cắt ngang (15-25 mL/h), đối với gel lỗ lớn thì 2-5 mL/cm2 (5-10mL/h) Dòng chảy có thể chảy theo cách chảy tự do hoặc dùng bơm nén tùy vào loại gel sử dụng [87]

1.3.1.7 Chuẩn bị mẫu [13]

Lượng mẫu cho vào cột quá nhiều sẽ làm giảm độ phân tách và nếu quá ít làm mẫu bị loãng Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột

Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/cm2 (5-10 ml/h) Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ Tuy nhiên, gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén Thông thường là nén theo chiều trọng lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên

Đưa mẫu vào cột bằng micoPipet hoặc bơm vi lượng trong lúc dung môi vẫn tiếp tục chạy qua cột Thu mẫu phía dưới cột, thường có thiết bị thu mẫu tự động theo thể tích đã quy định sẵn

I.3.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

I.3.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng cao áp gọi tắt là HPLC ( High Peformance Liquid Chromatography) là phương pháp tách chất hoạt động theo nguyên tắc của sắc ký nhưng được hoàn thiện ở mức độ cao [20] Khác với phương pháp sắc ký cổ điển, sắc ký lỏng cao áp đạt hiệu quả phân tách cao nhờ sử dụng các chất nhồi cột có kích thước rất nhỏ (5 đến 10 µm)

Phương pháp này còn nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác như: hoạt động ở áp suất cao, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy nhanh, dễ thu hồi mẫu [20]…

I.3.2.2 Các bộ phận chính của máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Máy HPLC là một hệ thống gồm nhiều thiết bị được lắp ráp với nhau thành một khối hay nhiều khối riêng biệt ghép lại [20] Bơm cao áp và detector là hai bộ phận quan trọng nhất của hệ thống máy HPLC

I.3.2.2.1 Bình chứa dung môi giải ly cột

Bình chứa dung môi được làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh, luôn có nắp đậy để bảo vệ dung môi tránh bị bụi bẩn Hệ dung môi dung để giải ly chứa trong những bình này Một hệ thống máy HPLC gồm có 4 bình dung môi [20] I.3.2.2.2 Máy bơm

Hệ thống dùng bơm đặc biệt tương ứng với áp suất cao lên đến 7000 psi (48,3 Mpa) để bơm dung môi ( còn gọi là pha động) đi qua lớp pha tĩnh trong cột với vận tốc không đổi ( khoảng 0,5-4,0 mL/phút)[20]

I.3.2.2.3 Cột sắc ký

Cột sắc ký dung trong máy HPLC được làm bằng thép không gỉ, có đường kính trong từ 2,1-4,6 mm, chiều dài từ 10-25 cm Bên trong cột được nhồi thật chặt bởi các hạt nhỏ thật mịn [88]

Bảng 1.1: Các loại cột sắc ký lỏng cao áp dung trong kỹ thuật sắc ký [5]

tích

đảo pha, pha tạo nối

(<2000Da) -Không mang điện tích -Có tính phân cực hoặc không có -Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hay nước

(<2000Da) -Phân tử có mang điện tích -Hòa tan được trong nước

-Không có mang điện tích -Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước

I.3.2.2.4 Bộ phận tiêm mẫu vào máy

Cho mẫu vào pha động là một vấn đề của máy HPLC, vì khi đó hệ thống đang ở áp suất cao [5] Bộ phận tiêm mẫu có cấu tạo đặc biệt giúp định hướng dòng chảy của pha động đưa mẫu vào cột sắc ký [20]

I.3.2.2.5 Detector

Trong hệ thống HPLC, loại đầu dò thường được sử dụng nhiều nhất là đầu dò hấp thu tia tử ngoại UV, vì loại detector này không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứng tuyến tính giữa hấp thu UV với lượng mẫu chất [20][66] Đầu dò UV hoạt động dựa trên sự hấp thụ tia tử ngoại của cấu tử trong mẫu phân tích mà dung môi phân tích không có sự xuất hiện của cấu tử này

I.3.2.3 Dung môi dung trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Hệ thống HPLC thường sử dụng hỗn hợp hai loại dung môi, đôi khi cũng có những quá trình phân tích sử dụng hệ bốn dung môi

Dung môi dung cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm, acetonitril,…có độ tinh khiết cao, không có lẫn bụi bẩn,… và phải loại khí trước khi đưa vào hệ thống Nếu detector là đầu dò UV, dung môi sử dụng phải trong suốt đối với bước song mà đầu dò UV đang hoạt động để phát hiện mẫu chất [20]

I.3.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

I.3.3.1 Khái niệm

Đông khô là phương pháp sấy thăng hoa đệm ở nhiệt độ và áp suất thấp Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm để làm khô các sản phẩm sinh học như: enzyme, protein, tế bào…mà không ảnh hưởng đến những tính chất và hoạt tính của sản phẩm [13][20]

Cách đông khô mẫu: đông lạnh nhanh mẫu nhờ dung dịch nitơ lỏng hoặc CO2 tinh thể; làm khô ở điều kiện lạnh trong chân không [13]

I.3.3.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khô

Nguyên tắc của phương pháp đông khô là loại đệm ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển mẫu đông khô từ trạng thái rắn sang trạng thái khí, mà không qua giai đoạn lỏng trong điều kiện hút chân không ở nhiệt độ thấp Quá trình được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất thấp nên nguyên liệu không bị hỏng hay biến tính [13][20]

I.3.3.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô

Sau khi mẫu đem đi sấy thăng hoa thì tính chất lý, hóa, sinh của nguyên liệu không thay đổi [76]:

 Duy trì tạo hương, vị và các chất dễ bị phân hủy như vitamin, protein  Màu sắc và hình dạng của mẫu được giữ nguyên

 Kéo dài thời gian sử dụng nhờ vào nguyên liệu có độ ẩm thấp

Hình 1.6 Máy đông khô hãng Thermo [56] I.3.4 ĐAU VÀ TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU

I.3.4.1 Định nghĩa và phân loại

Đau là một cảm giác khó chịu thường được gây ra bởi các kích thích hoặc gây tổn hại dữ dội [89] Hiệp hội nghiên cứu đau quốc tế đã định nghĩa như sau: “Đau là một trải nghiệm cảm giác và cảm xúc khó chịu liên quan với tổn thương mô thực sự hay tiềm tàng, hoặc được mô tả trong thuật ngữ về sự tổn thương tương tự” [90]

Đau thường là tạm thời, chỉ kéo dài cho đến khi kích thích độc hại được loại bỏ, tổn thương tiềm ẩn hoặc bệnh đã lành, nhưng một số điều kiện đau đớn như

I.3.4.2 Nguyên nhân và cơ chế đau

Đau là kết quả của một quá trình sinh lý phức tạp gồm nhiều sự kiện và có sự tham gia của nhiều yếu tố Đau thụ cảm được gây ra bởi sự kích thích của các sợi thần kinh ngoại biên mà chỉ phản ứng với các kích thích gần hoặc vượt cường độ hại và có thể được phân loại theo các chế độ của kích thích nguy hại Các loại phổ biến nhất là nhiệt (ví dụ: nóng hoặc lạnh), cơ học (ví dụ như nghiền,xé,cắt…) và hóa học (ví dụ như bột ớt trong mắt…) [89]

Đau thần kinh là do tổn thương hoặc bệnh tật ảnh hưởng đến bất kỳ một phần của hệ thống thần kinh liên quan đến cảm xúc của cơ thể (hệ thống bộ phận cảm nhận) [93] Đau thần kinh ngoại biên thường được mô tả như là đốt cháy, ngứa, hoặc ghim và kim tiêm [60]

Mặc dù tất cả các thụ cảm đau đều là những đầu tận cùng tự do của sợi thần kinh, mỗi mút tận cùng này đều có hai con đường riêng biệt để dẫn truyền tín hiệu

đau đến hệ thống thần kinh trung ương Hai con đường ấy tương ứng với hai dạng đau: Con đường đau nhanh cấp tính (fast -sharp pain pathway) và con đường đau chậm mạn tính (slow-chronic pain pathway) [94]

Tín hiệu đau nhanh cấp tính vừa là kết quả của sự kích thích thụ thể nhận cảm cơ học, vừa của thụ thể nhiệt; Trái lại, cảm giác đau chậm mạn tính lại xảy ra sau kích thích tại thụ thể hóa học, nhưng đôi khi cũng có sự tham gia của hai loại thụ thể còn lại Tín hiệu đau này truyền tới tủy sống trong sợi thần kinh C có tốc độ từ 0.5 đến 2 m/giây [94] Chính vì sự hiện diện của một hệ thống kép như trên mà khi có một kích thích đau đột ngột, sẽ tạo ra động thời hai tín hiệu: cảm giác đau nhanh cấp tính dẫn đến não trong sợi thần kinh A∆ và cảm giác đau chậm mạn tính sẽ truyền theo sợi C chậm sau vài giây Cảm giác đau nhanh cấp tính nhanh chóng báo động cá thể nhận thức về sự tổn thương; do đó, nó có vai trò quan trọng trong thúc đẩy cá thể đó phản ứng ngay lập tức để giải thoát bản thân khỏi các tác nhân kích thích Trong khi đó, cảm giác đau chậm mạn tính lại có khuynh hướng tăng dần theo thời gian, cho đến khi người bệnh không thể chịu đựng thêm nên phải tìm cách loại bỏ nguyên nhân tận cùng của sự đau đớn này Khi đến tủy sống qua các rễ sau, sợi thần kinh ngoại biên sẽ tận cùng tại các neuron tiếp hợp ở sừng sau Một lần nữa, hai hệ thống dẫn truyền tín hiệu đau sẽ cùng song hành đến não bộ [94]

Sau khi vào đến tủy sống, tín hiệu đau sẽ theo hai con đường đi đến não, qua bó gai đồi thị mới (neospinothalamic tract) và bó gai đồi thị cũ (paleospinothalamic tract) Trong đó bó gai đồi thị mới với đau nhanh, còn bó gai đồi thị cũ dẫn truyền cảm giác đau chậm mãn tính Nhiều nghiên cứu đã cho thấy đầu của sợi thần kinh C tận cùng trong tủy sống có khả năng bài tiết ra cả glutamate và chất P Glutamate là chất dẫn truyền hoạt động tức thì và chi kéo dài trong vài phần ngàn giây Trong khi đó, chất P lại được giải phóng chậm hơn nhiều nhưng lại có thể duy trì nồng độ trong khoảng thời gian vài giây hay đến vài phút Thực tế cũng đã cho thấy điều này: cảm giác đau hai lần mà một cá thể cảm nhận được sau một lần châm kim; theo đó, cảm giác đau đầu tiên là hệ quả của sự hoạt hóa nhanh chóng glutamate, lần sau