BÁO CÁO NGHIỆM THU ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của hội đồng nghiệm thu) ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ KEM CHỨA NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTI[.]
ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý hội đồng nghiệm thu) ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ KEM CHỨA NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TSKH HOÀNG NGỌC ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG / 2016 MỤC LỤC Trang Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) Bản nội dung thực theo hợp đồng Mục lục chi tiết Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình I v viii xiii xiv xvi TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Trong hai năm thực đề tài (12/2013 – 12/2015), 4000 bò cạp Heterometrus laoticus An Giang thu mua, nuôi lấy nọc phịng thí nghiệm Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Quy trình thu nọc hồn thiện với thời gian tốt để kích thích xung điện tần số 2,63 kHz bị cạp từ 10 giây đến 11 giây cho lần kích thích Từ 4000 bị cạp thu 24,0 g nọc khơ Phân tích cho thấy nọc bò cạp tách làm phân đoạn cột sắc ký với Sephadex G50 Khảo sát độc tính phân đoạn tách cho thấy phân đoạn độc chuột, phân đoạn có tác dụng kháng viêm giảm đau Kết điện di phân đoạn có độc tính cho thấy chúng có khối lượng phân tử tương đương với khối lượng phân tử neurotoxin enzyme, có phospholipase Từ nghiên cứu đề xuất tiêu chuẩn sở nọc bò cạp H.laoticus Đã khảo sát đề xuất công thức kem chứa nọc bị cạp Trên sở bào chế kem chứa nọc bị cạp Từ cơng thức trên, công thức kem với tỉ lệ nọc bò cạp 0,105%, 0,13%, 0,16%, 0,32% bào chế Trong số công thức chọn cơng thức với tỷ lệ nọc bị cạp 0,16 % để bào chế kem lượng nọc bị cạp cần kem bào chế có tác dụng kháng viêm giảm đau Chế phẩm kem ổn định mặt vật lý (không đổi màu, không tách lớp sau chu kỳ nhiệt) Chế phẩm không gây kích ứng da thỏ Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiê êm nguyên liê nọc bò cạp H laoticus, bao gồm tiêu: tính chất, ê tan, ê ẩm, pH, định tính protein tồn phần, định tính hetlaxin định lượng sơ bô ê hetlaxin Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiê êm kem xoa bóp giảm đau chứa nọc bò cạp H laoticus, bao gồm tiêu: tính chất, ê đồng nhất, ê đồng khối lượng, ê nhiễm khuẩn, pH, định tính protein toàn phần định lượng methyl salicylat Đã tiến hành kiểm nghiệm lơ ngun liệu nọc bị cạp H laoticus lơ kem xoa bóp giảm đau chứa nọc bò cạp H laoticus Đã bào chế kem cỡ lô 1000 g Kết cỡ lô 1000 g cho thấy tính chất sản phẩm từ lơ 1000 g không khác đạt yêu cầu đề Đã bào chế kem cỡ lô 3000 g Kết kiểm nghiệm lơ 3000 g cho thấy tính chất sản phẩm từ lô không khác nhau, đạt i yêu cầu đề không khác với cỡ lô 1000 g Điều cho thấy thành phần công thức quy trình bào chế có tính ổn định Chế phẩm kem bơi da nọc bị cạp H laoticus liều 4,75mg/kg (0,16%) kết hợp methyl salicylat 10% menthol 5% có tác đô êng kháng viêm tác đô êng khác biê êt khơng có ý nghĩa so với thuốc đối chứng ketoprofen 2,5% có thị trường Chế phẩm kem bơi da chứa nọc bị cạp H.laoticusliều 4,75mg/kg (0,16%) kết hợp methyl salicylat 10% menthol 5% có tác đô êng giảm đau ngoại biên Đồng thời, tác động giảm đau chế phẩm khác biê êt khơng có ý nghĩa so với tác động thuốc đối chứng aspirin 50 mg/kg Chế phẩm kem bôi da chứa nọc bò cạp H.laoticusliều 4,75mg/kg (0,16%) kết hợp methyl salicylat 10% menthol 5% chưa thể tác động giảm đau trung ương Sau 12 tháng khảo sát hai điều kiện bảo quản 30 ± oC; độ ẩm tương đối 75 ± 5% 40 ± 2oC; độ ẩm tương đối 75 ± 5%, tiêu tính chất, độ đồng nhất, độ đồng khối lượng, giới hạn nhiễm khuẩn, pH, định tính protein tồn phần lô không khác so với thời điểm ban đầu Như vậy, hai điều kiện bảo quản này, nhiệt độ độ ẩm không ảnh hưởng đến chất lương thuốc, đến thời điểm chế phẩm ổn định ii SUMMARY In the two years to implement the project (12/2013 - 12/2015), 4000 scorpions Heterometrus laoticus (An Giang) had been purchased, cultured and extracted venom in the laboratory of the Institute of Applied Materials Science Scorpion venom was collected by electro-stimulation at the frequency of 2.63 kHz, pierced at the tail of scorpion times in 10 seconds to 11 seconds, 24.0 g of dried venom were obtained The scorpion venom was separated into five fractions using column chromatography with Sephadex G50 Toxicity survey of five separated fractions shows that three fractions are toxic to mice These fractions also have anti-inflammatory and analgesic effects Electrophoresis results showed that the toxic fractions had molecular weight equivalent to that of the neurotoxins and enzymes including phospholipase Based on these results, the in-house specifications was proposed for scorpion venom H laoticus Analgesic cream was prepared based on four different formulae with the venom component percentage of 0.105 %, 0.13 %, 0.16 % and 0.32 % and the sample with 0.16 % venom was selected for cream preparation This sample showed antiinflammatory and analgesic effect with lowest concentration of venom Prepared cream containing 0.16 % scorpion venom exhibited physical stability (no discoloration, dilaminating after heat cycles) and no skin irration on rabbits The draft specification of Heterometrus laoticus scorpion venom was established It includes appearance, solubility, loss on drying, pH, identification of total protein and hetlaxin, and preliminary assay of hetlaxin Secondly, the draft specification of topical Heterometrus laoticus scorpion venom cream was established It includes appearance, homogeneity, uniformity of weight, microbial contamination, pH, identification of total protein and assay of methyl salicylate Results from quality control of three lots of the venom and corresponding cream were conformed to the draft specifications 1000 g batch preparation was conducted three times and the results showed that properties of product from batches was the same and meet the requirements 3000 g iii batch was also conducted and the product showed no differences from the previous batch product There fore, the ingredients and preparation process was stable and can be use for macroscale manufacturing The prepared cream containing scorpion venom H laoticus (4.75 mg/kg) combined methyl salicylate (10 %) and menthol (5 %) had anti-inflammatory effects and these effects were not significant different compared to the reference drug ketoprofen 2.5 % The prepared cream also had peripheral analgesic effect, with the same effect as aspirin 50 mg/kg Storage stability test was conducted in twelve months in two conditions of storage with different temperatures (30 ± ° C and 40 ± ° C) and same relative humidity (75 ± 5%) The properties, homogeneity and uniformity of volume, infection limit, pH, total protein quantitative of the batches did not differ from the original sample Thus, in this two storage conditions, temperature and humidity has no effect on the quality of the drug iv BẢN NỘI DUNG ĐÃ THƯC HIỆN SO VỚI HỢP ĐỒNG TT NỘI DUNG THEO HỢP ĐỒNG Xây dựng thuyết minh chi tiết duyệt Nuôi bị cạp Qui trình thu nọc, làm khơ bảo quản nọc NỘI DUNG ĐÃ THỰC HIỆN Đã xây dựng thuyết minh chi tiết thuyết minh duyệt Đã ni 4000 bị cạp để thu nọc KẾT QUẢ ĐẠT ĐẠT Đã hồn thiện quy trình thu nọc bị cạp Đã thu 24g nọc bị cạp, đơng khơ, bảo quản cung cấp cho ĐẠT nghiên cứu Khảo sát tính chất nọc bị cạp phương pháp điện di so màu Nghiên cứu khảo sát loại tỉ lệ tá dược để xác định cơng thức Thiết kế mơ hình thực nghiệm, xử lý tối ưu hóa (phần mềm + chuyên viên) Bào chế công thức để khảo sát tỉ lệ nọc bị cạp cơng thức; Bào chế lơ theo mơ hình thiết kế; Kiểm nghiệm 16 cơng thức theo mơ hình; Bào chế lơ cơng thức tối ưu, đánh giá thông số theo mô hình so sánh với kết dự đốn phần mềm Đã xác định tính chất nọc bị cạp phương pháp hóa lý so ĐẠT màu Đã đưa công thức kem Đã đưa mơ hình tối ưu hóa kem Đã đưa công thức tối ưu kem chứa nọc bò cạp v ĐẠT ĐẠT ĐẠT 10 11 Đánh giá tính kháng viêm (4 cơng thức thăm dò nồng độ nọc bò cạp, thuốc đối chiếu – lô x 20 chuột/lô – 160 chuột) Xây dựng qui trình định lượng nọc bị cạp nguyên liệu chế phẩm phương pháp HPLC (Do protein nọc bò cạp hỗn hợp phức tạp nên tiến hành định lượng nọc bò cạp nguyên liệu phương pháp so màu Biuret chế phẩm định lượng methyl salicylat) Khảo sát thành phần nọc bò cap (lọc gel, đơng khơ), thu phân đoạn có độc tính để định lượng nguyên liệu phương pháp so màu Lowry Biure Nâng cấp cỡ lơ hồn thiện qui trình bào chế Chế phẩm kem chứa nọc bị cạp có tác động kháng viêm tác đô êng khác biê êt khơng có ý nghĩa ĐẠT thống kê so với thuốc đối chứng ketoprofen 2,5% có thị trường -Đã xây dựng qui trình định lượng protein tồn phần nguyên liệu nọc bò cạp phương pháp Biuret Sơ định lượng helatxin (C148H238O47N44S9 – hoạt tính nọc bị cạp H.laoticus ĐẠT phương pháp LC-DAD-MS - Đã xây dựng quy trình định lượng methyl salicylat chế phẩm phương pháp sắc ký khí Đã khảo sát thành phần nọc bị cạp (lọc gel, điện di), thu phân đoạn có độc tính định lượng phân ĐẠT đoạn phương pháp so màu Biure - Đã bào chế kem cỡ lô 1000 g Kết cỡ lơ 1000 g cho thấy tính chất sản phẩm từ lô 1000 g không khác đạt yêu cầu đề - Đã bào chế kem cỡ lô 3000 g Kết kiểm nghiệm lơ 3000 g cho thấy tính chất sản phẩm từ lô không khác nhau, đạt yêu cầu đề vi ĐẠT không khác với cỡ lô 1000 g 12 Đánh giá tính giảm đau trung ương (4 cơng thức thăm dò nồng độ nọc bò cạp) 13 Đánh giá tính giảm đau ngoại biên (4 cơng thức thăm dò nồng độ nọc bò cạp 14 Thẩm định qui trình định lượng protein nọc bị cạp phương pháp Biuret Chế phẩm kem chưa thể tác động giảm đau trung ương ĐẠT Chế phẩm kem có tác động giảm đau ngoại biên tác động không khác biệt so với thuốc đối chứng ĐẠT aspirin liều 50 mg/kg Đã thẩm định qui trình định lượng protein nọc bò cạp ĐẠT phương pháp Biuret -Đã đánh giá chế phẩm ổn định 15 Đánh giá tiêu chất lượng thành phẩm kem nọc bị cạp 16 Theo dõi độ ổn định, ước tính tuổi thọ 17 Viết báo cáo tổng kết mặt vật lý -Đã đánh giá chế phẩm khơng gây kích ứng da thỏ Đã khảo sát độ ổn định kem chứa nọc bò cạp sau 12 tháng khảo sát điều kiện bảo quản 30 ± 2oC; độ ẩm tương đối 75 ± 5% tháng điều kiện bảo quản 40 ± 2oC; độ ẩm tương đối 75 ± 5% Đã viết báo cáo tổng kết ĐẠT ĐẠT ĐẠT MỤC LỤC CHI TIẾT CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THU MUA VÀ NI BỊ CẠP THU NỌC VÀ HỒN THIỆN TIÊU vii Trang CHUẨN CƠ SỞ NGUYÊN LIỆU NỌC BÒ CẠP 2.1.1 Thu mua ni bị cạp 2.1.2 Quy trình thu nọc, làm khơ bảo quản nọc 2.1.3 Hồn thiện tiêu chuẩn sở nọc bị cạp 2.1.3.1 Tính chất 2.1.3.2 Đơ ê tan 2.1.3.3 Đơ ê ẩm 2.1.3.4 pH 2.1.3.5 Định tính protein 2.1.3.6 Định lượng protein nọc bò cạp phương pháp Biuret 2.1.3.7 Sơ bơ ê định lượng hetlaxin nọc bị cạp phương pháp LC-DAD-MS 2.1.3.8 Khảo sát thành phần protein nọc bị cạp 2.2 NGHIÊN CỨU CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ KEM CHỨA NỌC BỊ CẠP ĐÁNH GIÁ TÍNH ỔN ĐỊNH VẬT LÝ CỦA THÀNH PHẨM QUA CHU KỲ THAY ĐỔI NHIỆT ĐỘ (0 0C VÀ 400C) ĐÁNH GIÁ TÍNH KÍCH ỨNG DA CỦA THÀNH PHẨM 2.2.1 Nghiên cứu cơng thức quy trình bào chế kem chứa nọc bò cạp 2.2.1.1 Các bước tiến hành bào chế 2.2.1.2 Đánh giá thơng số q trình nghiên cứu 2.2.2 Bào chế công thức để khảo sát tỉ lệ nọc bị cạp cơng thức 2.2.3 Thiết kế tối ưu hố cơng thức 2.2.3.1.Thiết kế mơ hình thực nghiệm 2.2.3.2 Bào chế đánh giá tính chất sản phẩm theo mơ hình thiết kế 2.2.3.3 Tối ưu hóa cơng thức 2.2.3.4 Kiểm chứng cơng thức tối ưu 2.2.4 Đánh giá tính ổn định vật lý thành phẩm qua chu kỳ thay đổi nhiệt 2.2.5 Đánh giá tính kích ứng da thành phẩm kem chứa nọc bò cạp 2.3 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẨM 2.3.1 Nguyên vật liệu đối tượng nghiên cứu 2.3.1.1.Đối tượng nghiên cứu 2.3.1.2 Chất chuẩn, hóa chất dung mơi viii 8 9 10 10 12 13 14 15 16 16 18 18 18 18 19 19 19 19 19 22 22 22 22 trị p < 0,05 vào ngày 2, ngày 6; với giá trị p < 0,01 vào ngày ngày trình thử nghiê êm Vì vâ yê , methyl salicylat methol làm tăng tác đô nê g kháng viêm nọc bò cạp vào ngày 1, ngày 2, ngày ngày trình thử nghiê êm so với lơ thử kem chứa nọc bị cạp 3.5.1.5 Tác động kháng viêm chế phẩm kem bôi da chứa nọc bò cạp so sánh với thuốc đối chiếu có thị trường Chế phẩm kem bơi da nọc bò cạp kết hợp liều 4,75 mg/kg làm giảm độ sưng phù chân chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng từ ngày đến ngày 4, so với lô tá dược kết hợp ngày trình thử nghiê m ê Chế phẩm kem bơi da nọc bị cạp kết hợp liều 4,75 mg/kg có tác êng kháng viêm khơng khác thuốc đối chứng ketoprofen 2,5% khác biê êt khơng có ý nghĩa thống kê Hình 3.33 Tác đô êng kháng viêm chế phẩm kem bơi da nọc bị cạp kết hợp methyl salicylat menthol liều 4,75 mg/kg so với lô đối chứng ketoprofen 2,5% (*)p