Đánh giá Độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn lam trên dòng tế bào cho

Đánh giá Độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn lam trên dòng tế bào cho Đánh giá Độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn lam trên dòng tế bào cho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Huyền Trang

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH GENE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT

VI KHUẨN LAM TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Huyền Trang

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH GENE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT

VI KHUẨN LAM TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Nguyễn Lai Thành

Hà Nội - Năm 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Đánh giá độc tính gene của một số dịch chiết vi

khuẩn trên dòng tế bào CHO” do PGS TS Nguyễn Lai Thành và TS Phạm Thị

Lương Hằng hướng dẫn là công trình nghiên cứu của bản thân tôi

Các kết quả công bố trong luận văn là trung thực, chính xác và tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận văn

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2023

Học viên

Nguyễn Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Lai

Thành - người thầy đáng kính của chúng em Thầy đã luôn tạo điều kiện để em có

thể học tập và làm việc tốt trong suốt quá trình hoàn thành luận văn Thầy luôn là tấm gương sáng về lòng nhiệt huyết và đam mê dành cho khoa học

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phạm Thị Lương Hằng và NCS Ngô

Thị Trang Các cô đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp em có thể hoàn

thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình Các cô đã dành cho em những kinh nghiệm, những bài học quý giá để em có thêm nhiều kiến thức bổ ích

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích, những kiến thức khoa học mới và cả các kinh nghiệm quý báu mà em không thể tìm thấy trong sách vở

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới anh Kiều Trung Kiên và chị Ngô Thị Hải

Yến Anh chị đã luôn chỉ bảo cho em những kiến thức khoa học bổ ích, hỗ trợ em

trong suốt quá trình làm việc trong phòng Công nghệ Tế bào Động vật, những bài học cuộc sống mà em sẽ luôn ghi nhớ

Em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị và các em đang học tập nghiên cứu tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật đã giúp đỡ và bên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài QG.22.04, công ty PanBiotech, bộ môn Hóa

sinh và Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho em có thể hoàn thành tốt đề tài này

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình Mọi người đã luôn tin tưởng, đứng đằng sau để bảo vệ, động viên con cố gắng học tập và làm việc Gia đình là động lực cho con thêm vững tin trên con đường đã chọn

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2023

Nguyễn Thị Huyền Trang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu về độc tính gene 3

1.1.1 Lịch sử phát triển của các phương pháp đánh giá độc tính gene 3

1.1.2 Xu hướng ứng dụng thử nghiệm đánh giá độc tính gene hiện nay 4

1.1.3 Thử nghiệm đánh giá đột biến gene tế bào động vật có vú dựa vào gene HPRT/XPRT theo hướng dẫn của OECD 476 9

1.2.Tổng quan về vi khuẩn lam 15

1.2.1 Nguồn gốc vi khuẩn lam 15

1.2.2 Sự đa dạng các chủng vi khuẩn lam ở Việt Nam 16

1.2.3 Ứng dụng của vi khuẩn lam trong sinh dược 16

1.2.4 Khả năng gây độc tính gene của các hợp chất thứ sinh được tổng hợp từ vi khuẩn lam 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1.Vật liệu 23

2.2.Đối tượng nghiên cứu 24

2.3.Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Hoàn thiện quy trình đánh giá độc tính gene trên tế bào CHO 26

2.3.2 Quy trình đánh giá độc tính tế bào 29

2.3.3 Quy trình đánh giá độc tính gene một số dịch chiết vi khuẩn lam 31

2.4 Phương pháp phân tích thống kê……… 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1.Hoàn thiện quy trình đánh giá độc tính gene trên dòng tế bào CHO 35

3.1.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp với tế bào CHO 35

3.1.2 Xác định thời gian nhân đôi của quần thể tế bào CHO 37

3.1.3 Khả năng tạo cụm của dòng tế bào CHO 39

3.1.4 Ảnh hưởng sức sống của CHO khi phơi nhiễm trong môi trường chọn lọc có bổ sung 6-TG 39

3.1.5 Khả năng gây đột biến của chứng dương EMS trên tế bào CHO 40

3.2.Khả năng gây độc của một số dịch chiết vi khuẩn lam lên dòng tế bào CHO 42

3.2.1 Độc tính tế bào của dịch chiết NK13_TS 42

3.2.2 Độc tính tế bào của dịch chiết QT1321_EtOAc 43

3.2.3 Độc tính tế bào của dịch chiết QT1321_MeOH 45

3.3.Độc tính gene thông qua khả năng gây đột biến gene HPRT của ba dịch chiết vi khuẩn lam 47

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

Tài liệu tham khảo 53

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Các vật tư sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng 23

Bảng 2.3: Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.4: Nồng độ các dịch chiết vi khuẩn lam trong dung môi DMSO 100% 25

Bảng 3.1: Bảng giá trị độc tính của ba dịch chiết vi khuẩn lam 46

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Kết quả thử nghiệm Ames 5

Hình 1.2: Kết quả thử nghiệm bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể 6

Hình 1.3: Kết quả thử nghiệm Comet assay 7

Hình 1.4: Kết quả thử nghiệm vi nhân 8

Hình 1.5: Cụm tế bào được nhuộm Giemsa 9

Hình 1.6: Hình thái tế bào CHO, độ phóng đại 5X 12

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm 26

Hình 2.2: Số lượng tế bào tăng sinh theo thời gian 27

Hình 2.3: Sơ đồ đánh giá độc tính gene trên dòng tế bào CHO 34

Hình 3.1: Tế bào CHO được nuôi trong môi trường Ham's F12, độ phóng đại 5X 35 Hình 3.2: Tế bào CHO nuôi trong môi trường DMEM/F12, độ phóng đại 5X 36

Hình 3.3: Tế bào CHO trong môi trường DMEM high glucose, độ phóng đại 5X 36

Hình 3.4: Tế bào CHO nuôi trong môi trường RPMI 1640, độ phóng đại 5X 37

Hình 3.5: Tỷ lệ tế bào CHO tăng sinh theo thời gian 38

Hình 3.6: Tế bào CHO sau rã đông, độ phóng đại 5X 38

Hình 3.7: Tế bào CHO nuôi duy trì với mật độ 2500 tế bào một đĩa 60mm, độ phóng đại 5X 39

Hình 3.8: Tế bào CHO sau 10 ngày nuôi trong môi trường có bổ sung 6-TG 40

Hình 3.9: Tỷ lệ tần số đột biến của EMS lên dòng tế bào CHO 40

Hình 3.10: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phơi nhiễm với NK13_TS 42

Hình 3.11: Hình thái tế bào CHO sau phơi nhiễm NK13_TS 43

Hình 3.12: Tỷ lệ tế bào sống sau phơi nhiễm QT1321E 44

Hình 3.13: Hình thái tế bào CHO sau phơi nhiễm QT1321E 44

Hình 3.14: Tỷ lệ tế bào CHO sau phơi nhiễm QT1321_MeOH 45

Hình 3.15: Hình thái tế bào CHO sau phơi nhiễm QT1321_MeOH 46

Hình 3.16: Hiệu suất cấy tế bào CHO (PE) 48

Hình 3.17: Tỷ lệ tần số tế bào đột biến của ba dịch chiết vi khuẩn lam 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 6 - TG 6 - Thioguanine 2 CHO Chinese Hamster Ovary

4 DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium 5 DMSO Dimethyl Sulfoxide

6 EMS Ethyl methanesulfonate 7 EtOAc Ethyl Acetate

8 EtOH Ethanol 9 FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh thai bò

Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals

Hệ thống hài hoà toàn cầu về phân loại và ghi nhãn hoá chất 11 HPRT Hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase 12 IC Inhibitory concentration Nồng độ ức chế 13 MeOH Methanol

15 NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ 16 OECD Organisation for Economic

Co-operation and Development

Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế 17 PBS Phosphate-buffered saline Dung dịch muối đệm

photphat 18 RPMI Roswell Park Memorial Institute

Working Group of National Co-ordinators of the TGs programme

Tổ công tác phối hợp các quốc gia thuộc chương trình TGs 20 XPRT Xanthine-guanine

phosphoribosyltransferase

MỞ ĐẦU

Những thay đổi di truyền có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Các biến đổi trên dòng tế bào soma có thể dẫn đến các bệnh nguy hiểm như bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn hệ miễn dịch, bệnh thần kinh, … [38] Các tế bào sinh dục bị biến đổi có thể gây hậu quả nghiêm trọng cho thế hệ sau dẫn đến các bệnh bẩm sinh … Vì vậy, đánh giá về khả năng gây độc tính gene hay còn gọi là độc tính di truyên (genotoxicity) của các hóa chất là một bước quan trọng trong đánh giá về tính an toàn, có vai trò trong việc bảo vệ sức khỏe con người Độc tính di truyền là đặc tính của các chất hóa học làm tổn hại đến thông tin di truyền Chất gây độc tính di truyền thường hay bị nhầm với chất gây đột biến Trong khi các chất gây đột biến là các chất gây độc tính gene, một số chất gây độc tính gene có thể không phải là chất gây đột biến Độc tính gene có thể được gây ra bởi các tác nhân gây ung thư, các tác nhân gây đột biến hoặc các tác nhân gây dị tật bẩm sinh, dẫn đến những tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến DNA Hiện nay, các thử nghiệm đánh giá khả năng gây độc tính gene của hóa chất đang được sử dụng rộng rãi với các điểm đánh giá khác nhau Dựa vào đặc tính của hóa chất cần kiểm tra như cơ chế hoạt động, các đích gây độc tiềm năng và điều kiện sẵn có của cơ sở thí nghiệm; các nhóm nghiên cứu sẽ lựa chọn phương pháp đánh giá độc tính di truyền phù hợp

Vi khuẩn lam là nhóm sinh vật đa dạng về hình thái và đặc tính sinh hóa, có khả năng sinh sống ở nhiều môi trường khác nhau Bên cạnh những ứng dụng gần gũi trong đời sống như nhiên liệu sinh học, phân bón sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường …, vi khuẩn lam ngày càng được quan tâm về tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc mới nhờ khả năng tổng hợp một phổ rộng các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Các hợp chất thứ sinh được tổng hợp từ vi khuẩn lam có thể là nguồn nguyên liệu dồi dào thay thế cho các hợp chất hóa học đang được sử dụng hiện nay [3]

Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới ẩm gió mùa với hệ thống sinh vật phong phú với đa dạng các chủng vi khuẩn lam Một số công trình nghiên cứu hiện nay đã

hướng tới ứng dụng các hợp chất thứ sinh được sản xuất từ vi khuẩn lam để tìm kiếm thuốc điều trị ung thư Để thực hiện mục tiêu này, thử nghiệm đánh giá tính an toàn các hợp chất đó trên các mô hình là một bước thiết yếu Hiện nay, các thí nghiệm đánh giá an toàn không còn chỉ giới hạn trong độc tính gây tử vong mà đã mở rộng sang cả độc tính gene

Trong nghiên cứu “Đánh giá độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn

lam trên dòng tế bào CHO”, các thử nghiệm được tiến hành nhằm hoàn thiện quy

trình đánh giá độc tính gene HPRT trên dòng tế bào CHO Sau đó, quy trình đánh giá

đột biến gene được ứng dụng để đánh giá khả năng gây đột biến gene của các dịch

chiết từ hai chủng vi khuẩn lam Scytonema bilaspurense NK13 và Neowestiellopsis

persica QT1321 Đây là hai chủng vi khuẩn lam được phân lập từ mẫu đất ruộng ở

Việt Nam và đã được chứng minh có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư HeLa Vì vậy, kết quả nghiên cứu từ đề tài luận văn này sẽ cung cấp dữ liệu về tính an toàn, cũng như tiềm năng ứng dụng của các dịch chiết này trong các nghiên cứu tiếp theo

1 Mục tiêu của đề tài

- Hoàn thiện quy trình đánh giá độc tính gây đột biến gene HPRT của hóa chất

trên dòng tế bào động vật có vú CHO theo hướng dẫn OECD 476 - Đánh giá khả năng gây độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn lam trên

dòng tế bào CHO

2 Nội dung đề tài

- Xác định môi trường nuôi cấy, thời gian nhân đôi, khả năng tạo cụm của dòng tế bào CHO, tác động của 6-TG và EMS lên sức sống của tế bào CHO

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào và xác định các chỉ số IC10 và IC20 sử dụng cho thử nghiệm đánh giá độc tính gene của 3 dịch chiết vi khuẩn lam NK13_TS QT1321_EtOAc và QT1321_MeOH lên dòng tế bào CHO

- Đánh giá khả năng gây độc tính gene của ba dịch chiết vi khuẩn lam NK13_TS, QT1321_EtOAc và QT1321_MeOH trên dòng tế bào CHO

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về độc tính gene

Thử nghiệm độc tính gene là một bước quan trọng trong tất cả các đánh giá rủi ro và mối nguy hiểm hóa học Các hóa chất gây tổn thương di truyền có thể gây ra những hậu quả bất lợi lâu dài cho sức khỏe bao gồm ung thư, rối loạn di truyền và các tình trạng thoái hóa khác Nhiều yếu tố vật lý, hóa học hoặc sinh học có thể gây chết tế bào Tuy nhiên, một số yếu tố chỉ làm hỏng vật liệu di truyền và được gọi là chất độc di truyền (geneotoxin) Những biến đổi về vật liệu di truyền không được phát hiện và kiểm soát có thể tiếp tục tồn tại và nhân lên trong quá trình nhân đôi tế bào và góp phần vào sự phát triển của các bệnh ung thư, tim mạch, thoái hóa thần kinh, Sự tổn thương vật liệu di truyền của tế bào soma có thể dẫn đến các bệnh ung thư; trong khi đó, tổn thương ở tế bào mầm sinh dục có thể dẫn đến đột biến di truyền gây dị tật bẩm sinh Đột biến có thể xảy ra dưới nhiều hình thức, có thể bao gồm sao chép, chèn hoặc xóa thông tin di truyền làm hỏng DNA hoặc nhiễm sắc thể của tế bào Vì vậy, đánh giá độc tính gene là cần thiết để đánh giá khả năng, mức độ gây tổn thương lên vật liệu di truyền của các hóa chất được quan tâm đối với con người và quần thể sinh vật Nghiên cứu về độc tính gene là các thử nghiệm đánh giá trên các

mô hình in vitro và in vivo để xác định chất được quan tâm có gây tổn thương vật liệu

di truyền một cách trực tiếp hay gián tiếp bằng các cơ chế khác nhau Độc tính di truyền thường là điểm cuối trong quá trình đánh giá tính an toàn của một chất mục tiêu [38]

1.1.1 Lịch sử phát triển của các phương pháp đánh giá độc tính gene

Độc tính di truyền được nghiên cứu từ những năm 1900 và được tách thành một nhánh nghiên cứu độc lập về độc tính gene vào năm 1927 Năm 1983, số lượng các chất mới được phát triển tăng lên đáng kể Các yêu cầu về đăng ký, đánh giá, cấp phép của châu Âu yêu cầu phải đánh giá về độc tính và cả độc tính gene của số lượng lớn các chất được sử dụng trước đó đã tạo động lực cho các thử nghiệm về độc tính

di truyền trở nên hiệu quả và nhanh chóng hơn Hơn thế, các cơ quan quản lý ký cam kết tránh sử dụng động vật thí nghiệm khi không cần thiết trong quá trình thử độc Để phù hợp với các nguyên tắc cơ bản về tính nhân đạo khi sử dụng động vật thí

nghiệm, các thử nghiệm in vitro được phát triển mạnh mẽ thay thế cho các thử nghiệm

in vivo nhưng vẫn đảm bảo đầy đủ về mặt khoa học Các phương pháp đánh giá khả

năng gây đột biến của hóa chất theo hướng dẫn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (OECD) lần đầu tiên được công bố vào năm 1987 Tháng 3 năm 2010, tại cuộc họp lần thứ 22, nhóm điều phối quốc gia của OECD đã thành lập nhóm chuyên gia để xem xét và đưa ra các quyết định điều chỉnh các thử nghiệm đánh giá độc tính gene Sau đó, các bản cập nhật bổ sung, thay đổi hoặc xóa bỏ một số thử nghiệm đánh giá độc tính di truyền được công bố vào những năm 2013, 2014, 2015, 2016 [43]

1.1.2 Xu hướng ứng dụng các thử nghiệm đánh giá độc tính gene hiện nay

Các thử nghiệm đánh giá độc tính gene đang được phát triển mạnh từ những năm 2010 đến nay Hằng năm, khoảng 2000 nghiên cứu có từ khóa độc tính gene (geneotoxic) được công bố trên Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) Từ đó, chúng ta có thể nhận thấy việc đánh giá độc tính gene ngày càng được sử dụng rộng rãi và thường quy cũng như sự cần thiết của việc đánh giá độc tính trong các đề tài nghiên cứu Rất nhiều các thử nghiệm với các đối tượng thí nghiệm đa dạng trong các đánh giá về độc tính di truyền được công bố và hướng dẫn theo OECD Tùy vào từng nhóm chất và mục đích đánh giá độc tính di truyền, các nhóm nghiên cứu sẽ sử dụng các công cụ và đối tượng đánh giá phù hợp Sau khi sửa đổi qua các giai đoạn, các nhà khoa học đã đưa ra 21 hướng dẫn theo OECD sử dụng trong đánh giá độc tính gene Tuy nhiên, hiện nay một số phương pháp được sử dụng phổ biến hơn đó là thử nghiệm Ames (OECD 471), Comet assay (OECD 489), đánh

giá độc tính gene tế bào động vật có vú bằng gene HPRT/XPRT (OECD 476), thử

nghiệm vi nhân (Micronucleus) (OECD 474, OECD 487), thử nghiệm bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể (OECD 473) [17]

1.1.2.1 Thử nghiệm đột biến gene trên mô hình vi khuẩn - Thử nghiệm Ames

Thử nghiệm đánh giá độc tính gene trên mô hình vi khuẩn (Ames test) được thực hiện theo hướng dẫn của OECD 471 Thử nghiệm sử dụng trong đánh giá phát hiện các đột biến liên quan đến việc thay thế, thêm hoặc mất một hoặc một vài cặp

bazơ nitơ trong các gene cần thiết để tổng hợp histidine Các chủng Salmonella

typhimurium được sử dụng trong thử nghiệm là các chủng đã được biến đổi làm chúng

không thể tổng hợp axit amin thiết yếu – histidine Do đó, chúng không thể phát triển và hình thành khuẩn lạc trong môi trường thiếu histidine Khi các đột biến mới được hình thành trên các gene liên quan đến histidine trên đột biến trước đó hoặc trên các vị trí gần đó có thể giúp vi khuẩn sinh trưởng nhờ có thể tổng hợp histidine nội sinh Kết quả là các vi khuẩn đột biến tăng sinh và hình thành các khuẩn lạc [6], [40]

Để đánh giá khả năng bị đột biến của Salmonella typhimurium gây ra do hóa

chất thử nghiệm hay không, vi khuẩn được nuôi trên đĩa thạch có bổ sung hóa chất cần đánh giá độc tính gene và một lượng nhỏ histidine để chúng có thể phát triển trong thời gian đầu và có khả năng biến đổi Sau đó, khi môi trường đã cạn kiệt histidine, những vi khuẩn bị đột biến có thể sinh trưởng không phụ thuộc vào histidine ngoài môi trường mới có thể tiếp tục phát triển và tạo ra các khuẩn lạc Số lượng khuẩn lạc được tạo ra một cách tự phát trong đĩa đối chứng âm là tương đối cố định với từng chủng vi khuẩn (Hình 1.1-A) Trong các đĩa được bổ sung chất gây đột biến, số lượng khuẩn lạc được tăng lên (Hình 1.1-B)

Hình 1.1: Kết quả thử nghiệm Ames A: Đĩa đối chứng, B: Đĩa tế bào phơi nhiễm với chất gây đột biến [15].

Thử nghiệm có ưu điểm là nhanh chóng, chi phí thấp và dễ thực hiện Tuy

nhiên, Salmonella typhimurium là sinh vật nhân sơ nên không phải là mô hình phù

hợp cho các đánh giá, nhận định liên quan tới cơ thể người Do đó, thử nghiệm thường được sử dụng trong sàng lọc ban đầu về độc tính gene hoặc khả năng gây ra đột biến

1.1.2.2 Thử nghiệm bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tế bào động vật có vú

Thử nghiệm bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể được đưa vào hướng dẫn theo OECD 473 Thử nghiệm nhằm đánh giá khả năng gây tổn thương đến bộ nhiễm sắc thể của các hóa chất Các dòng tế bào thường được sử dụng trong mô hình đánh giá này là V-79, CHO, tế bào lympho máu ngoại vi của người Thử nghiệm dựa trên quần thể tế bào đang tăng sinh của các dòng tế bào đã được nuôi cấy trong kỳ giữa Các tế bào được phơi nhiễm với hóa chất sau đó sẽ được tiếp xúc với Colchicine (chất ức chế giai đoạn giữa và giai đoạn sau của quá trình phân bào) Sau đó, tế bào được ủ trong môi trường nhược trương để thu được bộ nhiễm sắc thể, cố định và nhuộm Giemsa [44] Những thay đổi trong bộ nhiễm sắc thế của tế bào so với bộ nhiễm sắc thể ban đầu như thay đổi hình thái nhiễm sắc thể hoặc số lượng nhiễm sắc thể cho thấy hóa chất thử nghiệm có khả năng gây ra đột biến gene (Hình 1.2)

Hình 1.2: Kết quả thử nghiệm bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể

Mũi tên màu đỏ chỉ các nhiễm sắc thể bị đứt gãy [34].

1.1.2.3 Thử nghiệm sao chổi (Comet assay - CMT)

Thử nghiệm Comet assay được thực hiện theo hướng dẫn của OECD 489 Comet assay được áp dụng cho nhiều loại mô và bất kỳ loại tế bào đặc biệt nào Thử nghiệm giúp phát hiện các tổn thương DNA và phát hiện nhiều tổn thương DNA nguyên phát mà các xét nghiệm khác không thể đánh giá

Trong thử nghiệm, sau khi được phơi nhiễm với các hóa chất cần đánh giá, các tế bào được ủ trong agarose trên một lam kính và được ly giải để giải phóng các vùng nhân có chứa các vòng DNA siêu xoắn liên kết với ma trận hạt nhân (nuclear matrix) Điện di ở độ pH cao cho kết quả có cấu trúc giống sao chổi được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Các vòng có điểm đứt sẽ mất độ siêu xoắn và bị kéo dài về phía cực dương [54] Cường độ của đuôi sao chổi so với đầu phản ánh số lượng DNA bị đứt gãy Tín hiệu DNA di chuyển càng mạnh thì vật chất di truyền bị tổn thương càng nhiều Cấu trúc tổng thể có đầu tròn tương ứng với DNA không bị đứt gãy (Hình 1.3-A) Phần đuôi của sao chổi thể hiện DNA bị hỏng Đuôi càng sáng và dài thì mức độ

tổn thương DNA càng cao (Hình 1.3-B) [50]

1.1.2.4 Thử nghiệm vi hạt nhân (Micronucleus test - MN)

Thử nghiệm vi nhân được đưa vào hướng dẫn của OECD 474 và OECD 487 Thử nghiệm nhằm đánh giá khả năng gây đột biến của các hóa chất dựa trên sự hình thành nhân con trong quá trình phân bào Các dòng tế bào thường được sử dụng trong

Hình 1.3: Kết quả thử nghiệm Comet assay A: Tế bào bình thường, B: Tế bào bị đột biến [19].

thử nghiệm là TK6, CHO-WBL, CHO-K1, CHL, V-79, L5178Y, tế bào lympho máu ngoại vi của chuột, … Các vi nhân hình thành là kết quả của sự đứt gãy DNA dẫn đến hình thành các đoạn nhiễm sắc thể hoặc một nhiễm sắc thể không thể phân chia về hai phía của tế bào trong quá trình phân bào Những nhiễm sắc thể hoặc đoạn nhiễm sắc thể này được bao bọc bởi màng nhân và có cấu trúc tương tự như nhân thông thường, tuy nhiên chúng có kích thước nhỏ hơn Sự hình thành vi nhân chỉ được quan sát thấy ở tế bào đang trải qua quá trình phân chia nhân (Hình 1.4) Vì vậy, Cytochalasin B được sử dụng để ngăn chặn quá trình phân chia tế bào chất [8]

1.1.2.5 Thử nghiệm đột biến gene trên dòng tế bào động vật có vú

Thử nghiệm đánh giá độc tính gene trên dòng tế bào động vật có vú được thực hiện theo hướng dẫn của OECD 476 Thử nghiệm đánh giá đột biến dựa trên sự nhạy

cảm của gene HPRT/XPRT đối với môi trường chọn lọc có bổ sung 6-TG Các dòng

tế bào được sử dụng trong thử nghiệm là CHO, V-79, L5178Y, TK6, … Sự gia tăng

Hình 1.4: Kết quả thử nghiệm vi nhân Mũi tên chỉ nhân con được hình thành trong tế bào bị đột biến gene

Nguồn ảnh: https://we.vub.ac.be/~cege/volders/ENG/tests/MN.htm

số lượng khuẩn lạc trong môi trường có bổ sung 6-TG được xác định là có đột biến

xảy ra trên gene HPRT/XPRT (Hình 1.5)

Trong nghiên cứu này, phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính gene của một số dịch chiết vi khuẩn lam dựa theo hướng dẫn của OECD 476 Vì vậy, nguyên lý hoạt động của thử nghiệm sẽ được trình bày chi tiết ở phần tiếp theo

1.1.3 Thử nghiệm đánh giá đột biến gene tế bào động vật có vú dựa vào gene

HPRT/XPRT theo hướng dẫn của OECD 476 1.1.3.1 Nguyên lý của mô hình đánh giá độc tính gene trên tế bào động vật có

vú dựa vào gene HPRT/XPRT dựa theo OECD 476

Mục đích của thử nghiệm là nhằm phát hiện các đột biến gen do hóa chất gây ra Các dòng tế bào được sử dụng trong thử nghiệm dùng để xác định đột biến trên

gene báo cáo là gene HPRT hoặc XPRT Các tế bào đột biến thiếu hoạt động của

enzyme Hprt hoặc Xprt có khả năng chống lại tác động kìm hãm sự sinh trưởng tế

bào của chất 6-TG Ngược lại, các tế bào có gen HPRT hoặc GPT không bị đột biến

rất nhạy cảm với 6-TG 6-TG gây ức chế chuyển hóa tế bào và ngăn sự phân chia tế

bào Do đó, các tế bào bị đột biến gene HPRT/XPRT có thể phát triển trong môi trường

có bổ sung 6-TG, trong khi các tế bào bình thường không thể tăng sinh

Hình 1.5: Cụm tế bào được nhuộm Giemsa A: Đĩa tế bào đối chứng âm, B: Đĩa tế bào được phơi nhiễm với chất gây đột

biến gene HPRT.

Thử nghiệm dựa trên hoạt động của gene HPRT (Hypoxanthine-guanine photphoribosyl transferase) hoặc XPRT (Xanthine-guanine photphoribosyl transferase) (gene GPT) Đối với thử nghiệm liên quan đến gene HPRT, một số dòng

tế bào được sử dụng là CHO, CHL, V79, L5178Y, TK6 Dòng tế bào sử dụng trong

thử nghiệm gene XPRT là tế bào CHO-AS52, chứa gene chuyển GPT và thiếu gene

HPRT Thử nghiệm có thể phát hiện đột biến ở gene HPRT hoặc gene GPT Xét

nghiệm trên gene GPT cho phép phát hiện các đột biến gene không thể phát hiện trên locus HPRT của nhiễm sắc thể X

Những tế bào được chọn có khả năng tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy

và ổn định tần suất đột biến tự phát Các tế bào có HPRT hoặc GPT rất nhạy cảm với

hoạt động của 6-Thioguanine (6-TG) Chúng không thể phát triển trong môi trường

có bổ sung 6-TG Tuy nhiên, các tế bào này khi bị đột biến gene HPRT hoặc GPT, chúng có khả năng kháng 6-TG và tiếp tục tăng sinh Xét nghiệm HPRT có thể phát

hiện các đột biến thay thế nucleotide, dịch khung, mất hoặc chèn đoạn nhỏ trên nhiễm

sắc thể X Đối với xét nghiệm XPRT, các đột biến phát hiện được là các mất đoạn lớn

hoặc có thể là các tái tổ hợp không phân bào không được phát hiện trong thử nghiệm

HPRT

Các tế bào được nuôi duy trì trong môi trường nuôi cấy tăng trưởng trong một khoảng thời gian đủ (7-9 ngày) đặc trưng cho từng locus và loại tế bào để cho phép biểu hiện kiểu hình của các đột biến cảm ứng

Tần số đột biến được xác định bằng cách cấy một lượng tế bào đã biết trong môi trường chọn lọc có bổ sung 6-TG để xác định sự hiện diện của các tế bào đột biến Bên cạnh đó, các tế bào trong các điều kiện thử nghiệm được nuôi duy trì trong môi trường nuôi cấy tăng sinh để xác định hiệu suất cấy tế bào Khả năng gây đột biến của một chất phụ thuộc vào tần số đột biến liên quan đến nồng độ thử nghiệm Nếu tần số đột biến không tăng, chất thử nghiệm không được coi là gây đột biến [45]

Gene HPRT được sử dụng như một gene báo cáo để đánh giá các đột biến soma và đột biến trong các nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm đánh giá các chất gây

ung thư tiềm ẩn và các liệu pháp điều trị ung thư HPRT tham gia vào quá trình tổng hợp DNA trong tế bào Enzyme HPRT chịu trách nhiệm trong việc hình thành IMP và GMP từ các tiền chất tế bào để tạo thành Inosine và Guanine HPRT chuyển Photphoribose từ PRPP sang bazơ Hypoxanthine và Guanine Sau khi tổng hợp IMP và GMP, chúng được chuyển hóa thành các nucleotide chức năng và dùng trong quá trình tổng hợp và sửa chữa DNA

1.1.3.2 Ứng dụng đánh giá độc tính gene trên động vật có vú dựa trên hoạt động

của gene HPRT/XPRT theo hướng dẫn OECD 476

Mô hình đánh giá độc tính gene trên tế bào động vật có vú đã được sử dụng từ thế kỷ thứ 19 Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (Organization for Economic Co-Operation and Development - OECD) đã chính thức phê duyệt phương pháp đánh giá và đưa vào hướng dẫn số 476 Năm 2010, tác giả Christian Strupp đã sử dụng phương pháp đánh giá độc tính gene trên tế bào động vật có vú V-79 để tiến hành đánh giá khả năng gây ra đột biến gene của kim loại Beryllium Trong điều kiện nuôi cấy không có S9, kết quả cho thấy đối chứng dương EMS với nồng độ 150 µg/mL phơi nhiễm trong 4 giờ gây đột biến gene cao gấp 5 lần so với đối chứng âm và EMS nồng độ 1,1 µg/mL phơi nhiễm trong 24 giờ gây đột biến gene cao gấp 25 lần so với đối chứng âm Trong khi đó, kim loại Beryllium tại các nồng độ thử nghiệm có tần số đột biến tương đương với đối chứng âm Từ đó, tác giả đưa ra kết luận kim loại Beryllium

không gây ra đột biến di truyền trên thử nghiệm in vitro [62] Trong nghiên cứu năm

2015, Anna Huk và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác động của nano bạc (Ag ENM)

đối với các tổn thương DNA khác nhau và đột biến gene HPRT Kết quả cho thấy Ag

ENM gây ra nhiều loại tổn thương DNA bao gồm đứt gãy sợi, oxy hóa DNA đồng thời gây đột biến gene [4] Để đánh giá đặc tính gây đột biến gene của các hạt nano Ni và NiO trên mô hình động vật có vú, nhóm tác giả Emma Åkerlund đã sử dụng dòng tế bào mES Kết quả cho thấy có sự gia tăng tần số đột biến ở các nồng độ thử

nghiệm với tần số đột biến gấp khoảng 1,5 đến 2 lần so với đối chứng của các ion và phức hợp Ni Trong đó, chỉ có liều 0,5 µg/mL NiO khác biệt có ý nghĩa thống kê [5] Các hạt nano oxit kẽm (ZnO NP) cũng đã được Abhishek Kumar Jain và cộng sự tiến

hành đánh giá độc tính gene dựa trên hoạt động của gene HPRT trên dòng tế bào

V-79 năm 2019 Các tổn thương DNA và khả năng gây đột biến đã được quan sát thấy sau 6 giờ phơi nhiễm với ZnO NP [27] Alenan Kazimirova và cộng sự đã sử dụng mô hình đánh giá độc tính gene trên tế bào động vật có vú để đánh giá ảnh hưởng của hạt nano Titanium Dioxide (TiO2 NP) đối với đột biến gene vào năm 2020 Kết quả cho thấy TiO2 NP không gây gia tăng tần số đột biến gene HPRT ở tế bào phơi nhiễm

và không có sự khác biệt về giá trị hiệu suất cấy chuyển (PE) giữa TiO2 NP và đối chứng [31] Kim loại Niken là một nguyên tố tự nhiên được sử dụng nhiều trong công nghiệp và tiêu dùng Năm 2020, Samuel Buxton và cộng sự đã tiến hành đánh giá đột

biến gene (HPRT) và đột biến nhiễm sắc thể (MN) của bột kim loại Niken trên dòng

tế bào V-79 Kết quả độc tính gene nằm trong ngưỡng an toàn và kết luận là Niken

không gây đột biến gene [14] Có thể thấy, mô hình đánh giá độc tính gene HPRT đã

được ứng dụng phổ biến, cung cấp thêm thông tin quan trọng về ảnh hưởng của chất thí nghiệm lên các đối tượng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu Từ đó, các nhà khoa học đã cung cấp thêm các khuyến cáo cần thiết khi sử dụng các hợp chất có nguy cơ gây ảnh hưởng đến vật chất di truyền

1.1.3.3 Tế bào CHO (Chinese hamster ovary) sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá độc tính gene theo hướng dẫn OECD 476

Hình 1.6: Hình thái tế bào CHO, độ phóng đại 5X

CHO là dòng tế bào biểu mô có nguồn gốc từ buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc (Hình 1.6) Chuột Hamster Trung Quốc được sử dụng trong nghiên cứu từ năm 1919 Năm 1948, Hoa Kỳ lần đầu tiên nhân giống chuột Hamster Trung Quốc trong phòng nghiên cứu Năm 1957, Theodore T Puck đã sử dụng một con chuột cái từ phòng thí nghiệm của tiến sĩ George Yerganian tại Quỹ Nghiên cứu Ung thư Boston và sử dụng chúng để tạo ra dòng tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc ban đầu [35] Dòng tế bào CHO có kích thước nhỏ, số lượng nhiễm sắc thể thấp (2n = 22) nên đã trở thành một mô hình tốt trong nghiên cứu nuôi cấy [55] Tế bào CHO là mô hình tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học, y học, dược phẩm Tế bào CHO có vai trò quan trọng trong nghiên cứu vì tính ổn định của chúng do tốc độ biến đổi tự phát thấp

Tế bào CHO là một trong những dòng tế bào được lựa chọn sử dụng trong thử nghiệm đánh giá độc tính gene Tia UV được sử dụng trong điều trị các bệnh ngoài da như vảy nến, chàm dị ứng, phát ban, … Tuy nhiên, tia UV cũng được biết đến là một tác nhân gây ra các bệnh nguy hiểm cho sức khỏe con người Vì vậy, việc đánh giá tính an toàn của các dải UV được sử dụng liên quan trực tiếp đến con người là một yêu cầu cần thiết Để đánh giá khả năng gây đột biến của UVB dải hẹp đối với tế bào động vật có vú, Dylan J Buglewicz cùng cộng sự đã đánh giá khả năng gây đột biến thông qua tần số đột biến HPRT trên tế bào CHO Tế bào CHO được chiếu xạ UVR và nuôi cấy để đánh giá tần số đột biến của các nồng độ chiếu xạ Kết quả cho thấy UVB dải hẹp có thể gây đột biến ngay cả ở liều lượng thấp không gây độc tế bào với tần số đột biến HPRT là 17,65 đối với liều 500 J/m2 [13] Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Masanobu Kawanishi đã đánh giá độc tính di truyền của hạt cao lanh dưới hai dạng là hạt thô và hạt nano trên dòng tế bào CHO AA8 Dạng hạt nano được chứng minh có độc tính di truyền cao hơn các hạt thô với tần số đột biến tăng lên khoảng 10 lần khi tế bào tiếp xúc với hạt ở liều lượng 200 µg/mL [30]

1.1.3.4 Ethyl methanesulfonate (EMS) - đối chứng dương trong thử nghiệm

đánh giá độc tính gene HPRT trên dòng tế bào CHO theo OECD 476

EMS là hợp chất hữu cơ có công thức hóa học C3H8SO3 (Error! Reference

source not found.) EMS tạo ra các đột biến trong vật liệu di truyền bằng cách thay

thế nucleotide đặc biệt thông qua quá trình chuyển đổi G:C sang A:T gây ra bởi quá trình kiềm hóa guanine EMS thường tạo đột biến điểm [51] EMS có thể gây đột biến với tần suất từ 5x10-4 đến 5x10-2 trên mỗi gene mà không gây chết tế bào [7]

Cơ chế gây đột biến của EMS: Nhóm ethyl của EMS liên kết với guanine trong DNA, tạo thành bazơ bất thường O6-ethylguanine Trong quá trình sao chép DNA, các DNA polymerase xúc tác quá trình bắt cặp thymine thay cytosine với O6-ethylguanine Sau các vòng sao chép tiếp theo, cặp cơ sở G:C ban đầu có thể trở thành A:T (đột biến chuyển vị) RNA polymerase cũng có thể xúc tác quá trình bắt cặp uridine với với O6-ethylguanine [23] Sự thay đổi này có thể gây hại cho tế bào và gây bệnh cho toàn cơ thể sống

Trong nghiên cứu đánh giá khả năng gây đột biến gene HPRT của ethyl

methanesufonate (EMS) và mitomycin C (MMC) trên dòng tế bào V-79 vào năm

1993, nhóm tác giả M.J Davies đã kết luận là EMS làm tăng đột biến gene HPRT

theo chiều tăng của nồng độ Nồng độ EMS được sử dụng trong thử nghiệm là 1000 µg/mL và MMC là 0,063-0,5 µg/mL Tần suất gây đột biến của EMS tăng từ 119 đến 916 tế bào đột biến trên 106 tế bào Trong khi đó, tần số đột biến của MMC tương đối thấp là 10-31 tế bào đột biến trên 106 tế bào [18] Do khả năng gây đột biến với tần số đột biến cao, EMS được sử dụng làm đối chứng dương trong thử nghiệm

100-đánh giá độc tính gene HPRT trên mô hình động vật có vú

1.1.3.5 6-thioguanine (6-TG) - yếu tố chọn lọc tế bào đột biến trong thử nghiệm

đánh giá độc tính gene HPRT trên dòng tế bào CHO theo OECD 476

Cơ chế hoạt động của 6-TG (6-thioguanine): 6-TG sử dụng enzyme

hypoxanthine guanine photphoribosyltransferase (HGPRTase) để chuyển đổi thành 6- thioguanosine monophosphate (TGMP) Nồng độ TGMP cao có thể tích tụ nội bào và cản trở quá trình tổng hợp guanine thông qua enzyme Inosine monophosphate

dehydrogenease (IMP dehydrogenease) [26] Vì vậy, khi nuôi tế bào trong môi trường có bổ sung 6-TG, các tế bào bình thường có khả năng tổng hợp HGPRTase chuyển

đổi 6-TG thành TGMP, gây độc tế bào Các tế bào bị đột biến gene HPRT không có

khả năng tổng hợp HGPRTase Do vậy, các tế bào này sẽ không sử dụng được 6-TG, quá trình tổng hợp guanine diễn ra bình thường, tế bào tăng sinh và phát triển

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lam 1.2.1 Nguồn gốc vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam là một ngành vi khuẩn Gram âm rất lớn và đa dạng, là sinh vật nhân sơ quang tự dưỡng Chúng là một trong những sinh vật lâu đời nhất trên Trái đất với các mẫu hóa thạch có niên đại 3,8 tỷ năm và đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái của Trái đất Vi khuẩn lam có thể được tìm thấy ở hầu hết các môi trường sống trên cạn, dưới nước (môi trường nước ngọt và nước mặn), đất ẩm, đá ẩm trong sa mạc, và các môi trường đặc biệt như suối nước nóng, nước siêu mặn, các vùng cực, [59]

Vi khuẩn lam đa dạng về loài với các hệ thống phân loài khác nhau Hiện nay, các nhà khoa học chưa thống nhất hệ thống phân loài chính xác nhất cho nhóm vi

khuẩn lam Dựa vào hình thái, vi khuẩn lam được chia thành 5 nhóm: Chroococcales,

Pleurocapsale Oscillatoriales, Nostocales và Stigonematales Chroococcales là vi

khuẩn lam đơn bào và thường sống thành cụm Pleurocapsale có các tế bào có khả năng hình thành bào tử bên trong (baeocytes cell) Oscillatoriales có các tế bào dạng

sợi, sắp xếp không đồng nhất và không hình thành các tế bào chuyên biệt Hai bộ

Nostocales và Stionematales có dạng hình sợi, là các nhóm quan trọng có khả năng

biệt hóa thành dị bào Dị bào (heterocysts) là các tế bào chuyên biệt cho phép chúng

tách nito cố định từ quá trình quang hợp Nostocales là nhóm vi khuẩn lam phân nhánh giả, Stionematales là nhóm vi khuẩn lam phân nhánh thật [26]

Vi khuẩn lam là vi khuẩn Gram âm với một số đặc điểm như có lớp Peptidoglycan dày hơn (10-700 nm) các vi khuẩn Gram âm khác (2-6 nm) [25] và

màng ngoài Lipopolysaccharide [20] Cấu trúc thành tế bào giúp vi khuẩn lam thích ứng với những biến đổi của môi trường, bảo vệ và vận chuyển các chất dinh dưỡng, chất chuyển hóa xuất nhập bào [25]

1.2.2 Sự đa dạng các chủng vi khuẩn lam ở Việt Nam

Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới ấm gió mùa với nền sinh vật rất đa dạng và phong phú Với điều kiện thuận lợi như vậy, Việt Nam là môi trường sống lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lam Vi khuẩn lam phát triển mạnh mẽ với số lượng chủng loài lớn và đa dạng trên khắp địa hình Việt Nam Các nghiên cứu về vi khuẩn lam ở Việt Nam hiện nay tập trung vào đa dạng và phân loại cũng như các ứng dụng về khả năng cố định nito và khả năng gây độc của chúng Năm 2012, Hồ Sỹ Hạnh đã báo cáo rằng có tổng cộng 120 loài và phân loại vi khuẩn lam được tìm thấy trong đất canh tác (lúa bông và cà phê) của tỉnh Đắk Lắk và Đắk Nông [24] Nguyễn Đức Diện và cộng sự đã xác định được 22 loài vi khuẩn lam dị bào có trong 60 mẫu đất canh tác ở tỉnh Nghệ An [19] Trong nghiên cứu về một số chủng vi khuẩn

lam Nostoc từ đất trồng tỉnh Nghệ An năm 2018, Nguyễn Đức Diện và cộng sự đã

phân lập thành công 5 chủng Nostoc đều có khả năng cố định nito, có thể làm nguồn nguyên liệu để nghiên cứu sản xuất phân bón sinh học [1] Nguyễn Phạm Thanh Bình

đã xác định được 47 loài vi khuẩn lam thuộc 14 chi, 9 họ và 4 bộ (Chroococcales,

Noctoscales, Oscillatoriales, Synechococcales) trong nghiên cứu về sự đa dạng vi

khuẩn lam ở một số thủy vực thuộc tỉnh Trà Vinh Vi khuẩn lam phân bố ở tất cả các thủy vực được khảo sát, các thủy vực nước đọng có thành phần và mật độ vi khuẩn lam cao, mùa mưa có số loài vi khuẩn lam phong phú hơn mùa nắng [2]

1.2.3 Ứng dụng của vi khuẩn lam trong sinh dược

Vi khuẩn lam quang hợp sản sinh chủ yếu oxy Quá trình quang hợp bên trong kết hợp với các chất trung gian hóa học tạo ra nguồn năng lượng tái tạo tiềm năng [15] Bên cạnh đó, chúng còn sản xuất các hợp chất thứ sinh có ứng dụng quan trọng như chất kháng sinh, độc tố, chất gây viêm và chống viêm, hormone, hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn, chống ung thư, Các hợp chất này tạo lợi thế cạnh tranh cao cho

vi khuẩn lam đối với các sinh vật khác trong cùng môi trường sống, đảm bảo sự phát triển, đa dạng của loài Hiện nay, các nhà khoa học đang rất quan tâm đến ứng dụng của các hợp chất thứ sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn lam trong y học và sinh dược học

1.2.3.1 Vi khuẩn lam sản xuất các hợp chất có tác dụng kháng khuẩn, kháng

viêm

Theo nghiên cứu năm 2008 của Mostafa M El-Sheekh và cộng sự, vi khuẩn

lam Anabaen wisconsinense và Oscillatoria curviceps có tác dụng kháng khuẩn,

chống lại mầm bệnh từ cá trong nuôi trồng thủy sản Các hợp chất được chiết trong

dung môi Ethanol của O curviceps có hoạt tính cao nhất trong việc chống lại

Lactobacillus sp và Aeromonas hydrophilia Trong khi đó, các hợp chất chiết được

trong Methanol của A wisconsinense và O curviceps có tác dụng kháng khuẩn chống lại B Firmus, A hydorphilia, P flourescens, P angulliseptica và nấm A niger, S

parastitica [21] Một số chất do vi khuẩn lam sản xuất có đặc tính diệt khuẩn như

thuốc diệt tảo, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu có thể được ứng dụng trong nông nghiệp với ưu thế dễ phân hủy trong thời gian ngắn, ít tác động bất lợi đến hệ sinh thái [9]

Cyanovirin được phân lập từ Nostoc ellipsosporum và Cyanothece sp được chứng

minh là có khả năng ức chế chống lại HIV-1, HIV-2, vi rút suy giảm miễn dịch ở linh trưởng (SIV), vi rút gây suy giảm miễn dịch ở mèo, HHV-6 và vi rút sởi, ức chế vi rút Ebola và cúm [12]

Bảy họ chất chuyển hóa được phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính chống viêm là Aeruginosins, Coibacins, Honaucins, Malyngamides, Phycocyanin,

Scytonemin và Tolypodiol Malyngamide 2 được chiết từ Lyngbya sordida thể hiện

hoạt tính chống viêm trong các tế bào đại thực bào (IC50 = 8,0 µM), Honaucin

(Leptolyngbya crossbyana) ức chế sự biểu hiện cytokine gây viêm và gây độc tế bào

mức độ thấp đối với dòng tế bào động vật có vú [37], [16] Phycocyanin là một Phycobiliprotein có tác dụng chống viêm, chống oxi hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ gan Phycocyanin làm giảm mức độ biểu hiện của TNF-α trong huyết thanh chuột

được điều trị bằng nội độc tố và bảo vệ tế bào thần kinh trong nuôi cấy tế bào hạt tiểu não chuột [48]

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lam trong phát triển thuốc và điều trị ung thư

Vi khuẩn lam sản sinh ra các chất chuyển hóa thứ sinh độc tố (cyanotoxin) có ứng dụng cao cũng như nhiều thách thức trong sinh học và dược học Trong bối cảnh kinh tế công nghiệp toàn cầu phát triển, sự thay đổi khí hậu cũng như ô nhiễm môi trường, hiệu ứng nhà kính làm cho hiện tượng nở hoa ở vi khuẩn lam tăng đáng kể Nhiều loài vi khuẩn lam nở hoa đã sản sinh ra độc tố gây hại cho các động vật đa bào và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng [46] Bên cạnh những tác động xấu của độc tính vi khuẩn lam đến con người, chúng cũng là nguồn nguyên liệu tiềm năng trong nghiên cứu phát triển thuốc trong nghiên cứu và điều trị ung thư Các nghiên cứu về độc tính của các chất chuyển hóa thứ sinh ngày càng được quan tâm và mở rộng Ngày nay, các quốc gia lớn trên thế giới hầu hết đều có các trung tâm nghiên cứu hoặc chương trình nghiên cứu của các trường đại học về độc tố vi khuẩn lam Các độc tố này gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tế bào ở nhiều cơ quan như gây độc thần kinh, độc gan, độc tố da Độc tố do vi khuẩn lam sản sinh ra thay đổi theo giai đoạn phát triển của chúng Mức độ sản xuất cao hơn trong giai đoạn tăng sinh muộn (qAS muộn), bức xạ mặt trời tăng, nhiệt độ nước tăng, pH lớn, nito và oxi, nồng độ sắt, … [28], [34]

Nhiều hợp chất có nguồn gốc từ vi khuẩn lam được chứng minh về tiềm năng sinh y, phát hiện thuốc mới và điều trị ung thư Scytonmin được chiết xuất từ

Scytonema liên quan trực tiếp trong việc kiểm soát chu kỳ tế bào, ức chế khả năng

tăng sinh tế bào nội mô và nguyên bào sợi [53] L majuscula sản sinh ra

Lyngbyabellin A có khả năng gây độc tính tế bào lên các dòng tế bào ung thư cổ tử cung KB và ung thư ruột kết LoVo ở người với IC50 lần lượt là 0,03 µg/mL và 0,5 µg/mL [36] Hợp chất dị vòng Oxadiazine nocuolin A (NoA) được chiết từ ba chủng

vi khuẩn lam độc lập thuộc các chi Nostoc, Nodularia và Anabaena gây chết tế bào

theo con đường apoptosis phụ thuộc vào caspase NoA hoạt động chống tăng sinh ở

một số dòng tế bào ung thư ở người và nhạy cảm hơn với các dòng tế bào ung thư đột

biến p53 với giá trị IC50 dao động từ 0,7 đến 4,5 µM Các dòng tế bào ung thư đột biến p53 có khả năng kháng thuốc chống ung thư thông thường nên NoA có thể mang

lại tiềm năng lớn cho quá trình phát triển thuốc hướng đích tế bào ung thư không phụ

thuộc vào p53 [58] Pitipeptolit là các depsipeptide tuần hoàn (cyclic depsipeptides) được phân lập từ L majuscila cho thấy khả năng gây độc tế bào đối với các tế bào

ung thư biểu mô tuyến đại tràng HT29 và các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với giá

trị IC50 từ 10 đến 100 µM [39] Năm 2015, Lyngbya được thống kê là có 144 hợp

chất mới có hoạt tính ức chế ung thư Các hợp chất như Dolastatin, Soblidotin, Synthadotin, Cryptophycin, … từ các chủng vi khuẩn lam đã được phát triển trong thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư Anabaenolysin được phân lập từ hai chủng

thuộc chi Anabaena cho thấy khả năng gây độc tế bào đối với tất cả 10 dòng tế bào

được thử nghiệm, với giá trị LC50 nằm trong khoảng từ 4 đến 20 µM tùy thuộc vào dòng tế bào và các biến thể anabaenolysin [29] Hierridin B là một polyketide được

sản xuất bởi Cyanobium sp có khả năng gây độc tế bào, chống lại dòng tế bào ung

thư ruột kết HT-29 với IC50 có giá trị 0,1 µM [33]

Một số hợp chất, thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ vi khuẩn lam đã và đang được tiến hành qua các giai đoạn lâm sàng và được thương mại hóa Brentuximab vedotin 63 (AdcetrisTM) có nguồn gốc từ Symploca hydnoides và Lyngbya majuscula là thuốc chống ung thư bạch cầu dạng hạch

Hodgkin (Hodgkin lymphoma (HL)) và u ung thư tế bào lớn dị sản (ALCL), và ung

thư máu tế bào lympho T Glembatumumab vedotin từ Lyngbya sp đang được thử

nghiệm lâm sàng ở giai đoạn II ứng dụng trong điều trị ung thư vú biểu hiện GPNMB

(glycoprotein xuyên màng mã hóa bởi gene GPNMB) DMMC (Lyngbya majuscule), Apratoxin A (Lyngbya bouloni), Coibamide A (Leptolyngbya sp.) là các chất có tiềm

năng chống ung thư mạnh mẽ đang trong giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng [8]

Tại Việt Nam, trong nghiên cứu năm 2017 của Phạm Thị Lương Hằng và cộng sự, 13 chủng Nostoc được phân lập từ đất trồng lúa ở Việt Nam Trong đó, 11 chủng

có hoạt tính kháng khuẩn, 3 chủng có khả năng gây độc tế bào ung thư MCF7 và HTC119 với các giá trị IC50 dao động từ 47,8 µg/mL đến 232,0 µg/mL Các chủng có trình tự gene 16S rRNA giống nhau nhưng khả năng kháng khuẩn và gây độc tế bào khác nhau [47] Ngô Thị Trang và cộng sự (2021) đã tiến hành khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi khuẩn lam phân lập từ các mẫu đất và nước thu thập tại Hà Nội Dựa trên thử nghiệm đánh giá sức sống tế bào MTT, kết quả thu được là bốn dịch chiết của hai chủng (HK7 và NK1111) thể hiện hoạt tính ức chế tế bào HeLa với giá trị IC50 từ 84,6 µg/mL đến 257,3 µg/mL [56] Các ứng dụng hợp chất thứ sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn lam chưa có nhiều nghiên cứu sâu và ứng dụng trong thực tế, gây lãng phí nguồn tài nguyên quý giá này

1.2.4 Khả năng gây độc tính gene của các hợp chất thứ sinh được tổng hợp từ vi khuẩn lam

Độc tính gene của vi khuẩn lam rất phức tạp do vi khuẩn lam tạo ra rất nhiều hoạt tính sinh học đa dạng Các độc tố có khả năng gây độc tính gene và có khả năng gây ung thư Độc tố được nghiên cứu phổ biến rộng rãi là cyclic heptapeptides microcystins (MCs) và alkaloid cylindrospermopsin (CYN) MCs gián tiếp gây độc gene thông qua các loại oxy phản ứng (reactive oxygene species) dẫn đến tổn thương DNA do oxy hóa [60] Mặt khác, CYN gây độc tính gene theo cơ chế ức chế quá trình tổng hợp protein [49] Tuy nhiên, nhiều mẫu vi khuẩn lam gây đột biến không thông qua các độc tố đã biết Sieroslawska và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng gây đột biến của các chiết xuất vi khuẩn lam và ba loại độc tố tinh khiết là microcystin-LR, cylindrospermopsin và anatoxin-a Bốn trong mười dịch chiết được nghiên cứu có hoạt tính gây đột biến trong thử nghiệm Ames Tuy nhiên, các độc tố được tinh chế cho kết quả không gây đột biến hoặc tác động gây đột biến gene yếu hơn so với các dịch chiết tổng [52] Trong nghiên cứu năm 2010 của nhóm tác giả Ludek Bláha,

dịch chiết vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa và Aphanizomenon Flos-Aquae được

chứng minh là gây độc tính và thúc đẩy con đường ung thư trên tế bào giống biểu mô gan chuột (WB-F344) Tuy nhiên, tác dụng đó không phụ thuộc vào hàm lượng

Microcystin-LR và cylindrospernopsin - độc tố được nghiên cứu gây độc tính và sự phát triển của khối u gan [11]

Một sản phẩm khác của vi khuẩn lam có khả năng gây độc tính gene là retinoid, trong đó retinoid acid (RA) là retinoid tự nhiên mạnh nhất Năm 2021, Michal Bittner và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng gây độc tế bào và độc tính gene của dịch chiết vi khuẩn lam, đánh giá hàm lượng microcystin và retinoid acid trong dịch chiết trên dòng tế bào HepG2 - tế bào ung thư gan Các vi khuẩn lam được nghiên cứu là

Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon gracile, Microcystis aeruginosa, M viridis, M ichyoblabe, Planktothrix agardhii, Limnothrix redekei) và tảo

(Desmodesmus quadricauda) Kết quả cho thấy có 6 trên 8 dịch chiết được nghiên

cứu gây độc tính tế bào (0,04-2 mg khối lượng khô/mL) và năm dịch chiết gây độc

tính gene (C raciborskii, A gracile, L redekei, M ichyoblabe, và D quadricauda)

Nồng độ thấp nhất gây tổn thương DNA vào khoảng 0,2-1 mg/mL Các chất gây độc tính gene có mối liên hệ tuyến tính với hàm lượng RA tuy nhiên lại không có mối liên hệ giữa độc tính tế bào và hàm lượng RA Độc tính gene không có mối liên hệ với hàm lượng microcystin [10]

Nghiên cứu sâu vào khả năng sinh tổng hợp các chất có ứng dụng trong y dược của vi khuẩn lam hứa hẹn mang lại nhiều giá trị cao trong bảo vệ sức khỏe con người Đánh giá về độc tính và dược tính là phần cốt yếu trong quá trình ứng dụng các dược liệu Tính an toàn của các hợp chất được tách chiết trên các mô hình thí nghiệm sẽ giúp đưa ra các khuyến cáo cũng như hướng sử dụng thuốc trong tương lai

Các đánh giá về ảnh hưởng của các hóa chất lên vật chất di truyền tại Việt Nam chưa được phổ biến rộng rãi Trong đánh giá ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe trẻ sơ sinh ở Hà Nam, Việt Nam, nhóm tác giả Panida Navasumrit đã sử dụng phương pháp comet assay và micronucleus test để đánh giá sự ảnh hưởng liên quan đến vật chất di truyền DNA Kết quả cho thấy mức độ tổn thương DNA và tần số MN tăng đáng kể khi mức độ tiếp xúc asen tăng từ người mẹ Từ đó, nhóm tác giả đưa ra những khuyến cáo về việc người mẹ tiếp xúc với asen trong quá trình mang thai có thể ảnh

hưởng đến sức khỏe thai nhi trước và sau sinh, có nguy cơ gây tổn thương di truyền ở trẻ sơ sinh [41] Đây là một đánh giá hiếm hoi về hợp chất tồn tại trong đời sống hàng ngày của người Việt Nam Tuy nhiên, thử nghiệm này lại không được tiến hành thường xuyên tại Việt Nam

Trong quá trình nghiên cứu tài liệu trong nước về đánh giá tính an toàn của các hợp chất, chúng tôi chưa tìm ra công bố nào từ Việt Nam sử dụng các phương pháp đánh giá độc tính gene Việc hoàn thiện quy trình đánh giá độc tính gene có thể góp phần xây dựng công cụ hữu ích cho các nghiên cứu phát triển dược phẩm, thực phẩm hỗ trợ sức khoẻ nhằm đưa các hợp chất mới với nhiều tiềm năng vào ứng dụng thực tế

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Các vật tư, dụng cụ tiêu hao; các loại hoá chất; các thiết bị sử dụng trong nghiên

cứu được liệt kê trong các Bảng 2.1, Bảng 2.2, Bảng 2.3

Bảng 2.1: Các vật tư sử dụng trong thí nghiệm

Đĩa nuôi cấy tế bào 35mm, 60mm,

Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng trong, 96

Chai nuôi cấy tế bào T25, T75 SPL Life Sciences

Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng

Tủ an toàn sinh học cấp II SafeFAST Elite 212 D Tủ nuôi cấy tế bào Eppendorf CellXpert® C170i Kính hiển vi soi ngược

Carl Zeiss Kính hiển vi quang học

Máy ly tâm ống 15 mL Hettich

Máy đọc đĩa đa chức năng

Berthold - Đức TriStar 2 LB 942 Multimode Microplate Reader

Bảng 2.3: Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm

Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose

PAN Biotech Ham´s F12 Medium

DMEM/F12 (1:1) Medium Dulbecco S Phosphate Buffered Saline (DPBS)

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)

Trypsin Powder Fetal Bovine Serum (FBS)

Gibco Penicillin Streptomycin Glutamine

Ethyl Methanesulfonate (EMS)

Sigma-Aldrich 6-Thioguanine (6-TG)

CellTiter-Glo® Luminescentkit Promega Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Bio Basic

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào CHO được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào động vật, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Nghiên cứu được tiến hành trên 3 dịch chiết từ 2 chủng vi khuẩn lam là chủng

Scytonema bilaspurense NK13 [42] và chủng Neowestiellopsis persica QT1321,

được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của TS Phạm Thị Lương Hằng, Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Sinh khối của mỗi chủng vi khuẩn lam được chiết xuất