(Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học Thực Nghiệm) Đánh Giá Khả Năng Ức Chế Enzyme Acetylcholinesterase Và Bảo Vệ Tế Bào Thần Kinh Của Nano Astaxanthin Trên Dòng Tế Bào Thần Kinh

Bà GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O

VIàN HÀN LÂM KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

HàC VIÞN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHÞ

LäI CÀM ¡N

Vãi să kính trãng và cÁ t¿m lòng, em xin gÿi låi cÁm ¢n sâu sÃc, chân thành nh¿t đÁn cô TS Hoàng Thá Minh HiÃn – Tr°çng phòng Công nghá TÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm Khoa hãc và Công nghê đã tÁn tình h°ãng d¿n từng chi tiÁt, chß d¿y tß mß và đßng hành cùng em trong suát quá trình hãc tÁp và thăc hián luÁn vn Nhå có cô, em đã tă tin và hoàn thành luÁn vn cąa bÁn thân thành công, nâng cao thêm hiÅu biÁt và kiÁn thćc trong lĩnh văc nghiên cću Em có thêm nhiÃu trÁi nghiám trong cÁ lĩnh văc chuyên môn và kiÁn thćc đåi sáng Em chân thành cÁm ¢n cô HiÃn r¿t nhiÃu Em luôn kính mÁn, kính trãng và biÁt ¢n cô

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn GS ĐÁng Dißm Hßng, TS Ngô Thá Hoài Thu, TS Lê Thá Th¢m, TS Nguyßn Cẩm Hà, KS Nguyßn M¿nh Đ¿t cùng các b¿n nghiên cću viên phòng Công nghá TÁo, Vián Công nghá sinh hãc đã tÁn tình giúp đÿ, chß bÁo em trong quá trình thăc hián luÁn vn

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn TS Hoàng Mai Hà, TS Hß Thá Oanh, phòng VÁt liáu tiên tiÁn, Vián Hoá hãc, Vián Hàn lâm đã cung c¿p cho em nguyên liáu nano astaxanthin

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn Ban Lãnh đ¿o, các thÁy, cô giáo Khoa Công nghá sinh hãc, Hãc vián Khoa hãc và Công nghá đã chß d¿y, cung c¿p các kiÁn thćc chuyên môn bá ích cho em đÅ em có hành trang tát nh¿t cho công viác cũng nh° t°¢ng lai sau này

LuÁn vn đ°āc thăc hián trong khuôn khá đà tài Quỹ Phát triÅn Khoa hãc và Công nghá Quác gia - Nafosted, Bá Khoa hãc và Công nghá:<Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chuyÅn hóa

lipit cąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên mô hình in vitro và in vivo=

mã sá 108.06-2019.314 do TS Hoàng Thá Minh HiÃn làm chą nhiám

Và em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn bá mẹ, gia đình đã là hÁu ph°¢ng vāng chÃc đÅ em tiÁp tăc hành trình cho nhāng dă đánh sau này

Em xin cÁm ¢n t¿t cÁ nhāng ng°åi b¿n, luôn là ngußn đáng viên, là nhāng låi khuyên, là nhāng kß niám trong suát 2 nm hãc nói chung và quá trình thăc hián luÁn vn nói riêng

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN NGHIÊN CĆU 3

1.1 TàNG QUAN VÂ BàNH ALZHEIMER 3

1.1.1 Alzheimer 3

1.1.2 Các ph°¢ng pháp điÃu trá phân tÿ đái vãi bánh AD 4

1.1.3 Các mô hình tÁ bào cho nghiên cću bánh AD 7

1.2 TàNG QUAN VÂ ASTAXANTHIN 7

1.2.1 Tác dăng cháng oxy hóa 8

1.2.2 Tác dăng cháng viêm 9

1.3 NANO ASTAXANTHIN VÀ TÁC DĂNG SINH HâC CĄA NÓ 11

CH¯¡NG 2 ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 15

2.1 ĐàI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU 15

2.1.1 Đái t°āng nghiên cću 15

2.1.2 Hóa ch¿t và thiÁt bá 15

2.2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 15

2.2.1 Xác đánh ho¿t tính ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE) 16

2.2.2 Ph°¢ng pháp nuôi c¿y tÁ bào 17

2.2.3 Ph°¢ng pháp đánh giá đác tính cąa nano astaxanthin 17

2.2.4 Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng h¿p thu tÁ bào 17

2.2.5 Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vá tÁ bào cąa nano astaxanthin cháng l¿i stress oxy hóa trong tÁ bào C6 đ°āc cÁm ćng H2O2 17

2.2.6 Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh C6 cąa nano astaxanthin cháng l¿i tác h¿i gây đác thÁn kinh gây ra bçi A³25-35 18

2.2.7 Phân tích biÅu hián gen liên quan đÁn khÁ nng bÁo vá thÁn kinh cąa nano astaxanthin bằng ph°¢ng pháp quantitative Real-Time PCR (qPCR) 18

2.2.8 Ph°¢ng pháp xÿ lý sá liáu 19

CH¯¡NG 3 KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN 20

3.1 NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ KHÀ NNG ĆC CHÀ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE (ACHE) CĄA NANO ASTAXANTHIN 20

3.2 NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ MàT Sà ĐÀC ĐIÄM SINH HâC LIÊN QUAN ĐÀN KHÀ NNG BÀO Và TÀ BÀO THÀN KINH CĄA NANO ASTAXANTHIN 21

3.2.1 Nghiên cću đánh giá khÁ nng gây đác tÁ bào C6 cąa

3.3.1 Nghiên cću Ánh h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián gen cąa các enzyme cháng oxy hóa trong tÁ bào C6 27

3.3.2 Nghiên cću Ánh h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián gen cąa các enzyme gây viêm trong tÁ bào C6 cąa nano astaxanthin 32

3.3.3 Nghiên cću Ánh h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh táng hāp acetylcholine trong tÁ bào C6 35

CH¯¡NG 4 KÀT LUÀN VÀ KIÀN NGHà 38

KÀT LUÀN 38

KIÀN NGHà 38

DANH MĂC CÔNG TRÌNH CĄA TÁC GIÀ 39

DANH MĂC TÀI LIàU THAM KHÀO 40

DANH MĀC CÁC KÝ HIÞU, CÁC CHĀ CÁI VI¾T TẮT

AICD Amyloid precursor protein intracellular domain

MiÃn nái bào cąa protein tiÃn ch¿t amyloid Akt Protein kinase B

ALS Amyotrophic lateral sclerosis Bánh x¢ cćng teo c¢ mát bên

APP Amyloid precursor protein Protein tiÃn ch¿t amyloid

CD4 Cluster of differentiation 4 Căm biát hóa 4 CNS Central nervous system Há tháng thÁn kinh

trung °¢ng COS Chitosan oligosaccharides

CTF Carboxy-terminal fragment DMEM Dulbecco’s modified eagle’s

medium DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

DSS Dextran sulfate sodium Dextran natri sulfat DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-

nitrobenzoic

Axit 5-nitrobenzoic EBI Early brain injury Ch¿n th°¢ng não sãm ERK Extracellular regulated protein

GABA Gamma-aminobutyric acid

GLUT-1 Glucose transporter-1 Ch¿t vÁn chuyÅn glucose-1 GST-α1 Glutathione- S-transferase-α1

H2O2 Hydrogen peroxide HO-1 Heme oxygenase-1 ICAM-1 Intercellular adhesion

molecule-1

Phân tÿ bám dính giāa các tÁ bào-1

IKK³ Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta

Ch¿t ćc chÁ beta tiÅu đ¢n vá kappa-B kinase cąa nhân tá

MCAO Middle cerebral artery

occlusion TÃc đáng m¿ch não giāa MCP1 Monocyte chemotactic

protein 1

Protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1

MPP + 1-methyl-4-phenylpyridinium

mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MSK1 Mitogen- and stress-activated

protein kinase-1 NADP(H) Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

ND Neurodegenerative disorders Các bánh thoái hóa

thÁn kinh

NF-KB Nuclear factor chain-enhancer of activated B

kappa-light-YÁu tá h¿t nhân tng c°ång chußi nhẹ kappa cąa các

tÁ bào B ho¿t đáng

NFT Neurofibrillary tangles Các đám rái sāi thÁn kinh NMDA N-methyl-D-aspartate

iNOS Inducible nitric oxide synthase Táng hāp oxit nitric cÁm ćng

NR1 NMDA receptor subunit 1 Nrf2 Nuclear erythroid 2-related

factor 2

PGE2 Prostaglandin E2 PI3K Phosphoinositide 3-kinase PLGA Poly lactic- co -glycolic acid

ROS Reactive oxygen species

RPE Retinal pigment epithelial TÁ bào biÅu mô sÃc tá võng m¿c

SAH Subarachnoid hemorrhage Xu¿t huyÁt d°ãi m¿ng nhán Sp1 Specificity protein 1 Protein đÁc hiáu 1

STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

Bá chuyÅn đái tín hiáu và bá kích ho¿t phiên mã 3 TLR4 Toll-like receptor 4 Thă thÅ giáng Toll 4 TNF Tumor Necrosis Factors YÁu tá ho¿i tÿ khái u VEGF Vascular endothelial growth

factor

YÁu tá tr°çng nái mô m¿ch máu tng

DANH MĀC BÀNG

BÁng 2.1: BÁng trình tă các mßi đ°āc sÿ dăng trong qPCR 19

DANH MĀC HÌNH ÀNH

Hình 1.1: Con đ°ång d¿n đÁn suy giÁm nhÁn thćc trong bánh Alzheimer 4

Hình 1.2: C¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t cháng oxy hóa trong thoái hóa

Hình 3.11: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen iNOS liên quan đÁn tình tr¿ng viêm ç tÁ bào C6 33 Hình 3.12: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen COX liên quan đÁn tình tr¿ng viêm ç tÁ bào C6 33 Hình 3.13: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen TNF-α liên quan đÁn tình tr¿ng viêm ç tÁ bào C6 34 Hình 3.14: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen IL-6 liên quan đÁn tình tr¿ng viêm ç tÁ bào C6 34 Hình 3.15: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen mã hóa cho ChAT tham gia vào quá trình giÁi phóng acetylcholine trong tÁ bào C6 .37Hình 3.16: Ành h°çng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen mã hóa cho VAChT tham gia vào quá trình giÁi phóng acetylcholine trong tÁ bào C6 37

MÞ ĐÀU

Thoái hóa thÁn kinh đã đ°āc xác đánh là să thay đái sinh lý bánh chą yÁu trong hÁu hÁt các rái lo¿n liên quan đÁn não Bánh Alzheimer (AD) là mát trong nhāng bánh thoái hóa thÁn kinh điÅn hình gây ra chćng m¿t trí nhã trong xã hái già hóa cąa chúng ta Stress oxy hóa, viêm, tÁ bào chÁt theo ch°¢ng trình (apoptosis) và tng ho¿t tính cąa enzyme acetylcholinesterase (AChE) d¿n đÁn să thiÁu hăt cholinergic đ°āc xem nh° là các con đ°ång gây bánh chính Kích ho¿t tÁ bào thÁn kinh đám và giÁi phóng cytokine/chemokine cąa các con đ°ång viêm, cũng nh° các gác tă do oxy hóa và tán th°¢ng ty thÅ trong con đ°ång stress oxy hóa d¿n đÁn quá trình thoái hóa thÁn kinh và cuái cùng là gây chÁt tÁ bào

MÁc dù có nhiÃu phát triÅn trong lĩnh văc chm sóc sćc khße lâm sàng, các liáu pháp bÁo vá thÁn kinh đái vãi chćng thoái hóa thÁn kinh và các rái lo¿n liên quan đÁn gây chÁt tÁ bào thÁn kinh v¿n là nhāng thách thćc lâm sàng mà không có giÁi pháp hāu hiáu Do đó, nhu cÁu phát triÅn ph°¢ng pháp điÃu trá đa măc tiêu liên quan đÁn các con đ°ång tín hiáu đang đ°āc các nhà khoa hãc đÁc biát quan tâm nghiên cću đÅ cÁi thián ch¿t l°āng cuác sáng cąa nhāng ng°åi mÃc bánh thoái hóa thÁn kinh

Astaxanthin là mát trong nhāng carotenoid quan trãng, có ćng dăng điÃu trá phong phú và đa d¿ng đái vãi các bánh và gan, tim m¿ch, điÃu trá ung th°, bÁo vá da và mÃt cháng l¿i bćc x¿ tia căc tím và tng c°ång sćc đà kháng há tháng mißn dách Bên c¿nh đó, các nhà nghiên cću cũng chß ra rằng astaxanthin có tác dăng bÁo vá há thÁn kinh và nh° là mát tác nhân bÁo vá thÁn kinh đa măc tiêu, astaxanthin tác đáng lên nhiÃu c¢ chÁ ho¿t đáng đÅ giÁi quyÁt các c¢ chÁ sinh lý bánh phćc t¿p cąa bánh thoái hóa thÁn kinh Tuy nhiên, nh°āc điÅm cąa astaxanthin là có đá tan trong n°ãc th¿p và dß bá oxi hóa d¿n d¿n đÁn sinh khÁ dăng bá h¿n chÁ GÁn đây, trong đà tài <Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chuyÅn hóa lipit cąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên mô hình in vitro và in vivo= do

quỹ Nafosted tài trā nm 2019 – 2023, phòng Công nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN kÁt hāp vãi Vián Hóa hãc đã chÁ t¿o thành công nano astaxanthin có tính sinh khÁ dăng (g¿p 5-6) và ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm lipit cao h¢n nhiÃu so vãi astaxanthin tă do

Do đó, vãi nhāng lāi ích và tÁm quan trãng nh° vÁy, đà tài <Đánh giá

khÁ nng ąc ch¿ enzyme acetylcholinesterase và bÁo vß t¿ bào thÁn kinh căa nano astaxanthin trên dòng t¿ bào thÁn kinh= đ°āc thăc hián

1 Māc tiêu căa đÁ tài:

Đánh giá đ°āc khÁ nng ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE); KhÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cháng l¿i các tác nhân gây đác thÁn kinh và đánh giá biÅu hián mát sá gen liên quan đÁn ho¿t tính bÁo vá thÁn kinh cąa nano-astaxanthin trên dòng tÁ bào C6

2 Nái dung nghiên cąu:

- Nái dung 1: Xác đánh ho¿t tính ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE) - Nái dung 2: Nghiên cću mát sá đÁc điÅm sinh hãc liên quan đÁn khÁ nng

bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin

- Nái dung 3: Nghiên cću biÅu hián mát sá gen liên quan đÁn ho¿t tính bÁo

vá thÁn kinh cąa nano astaxanthin trên dòng tÁ bào C6 đ°āc cÁm ćng vãi các tác nhân gây đác thÁn kinh

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN NGHIÊN CĄU 1.1 TàNG QUAN VÀ BÞNH ALZHEIMER

1.1.1 Alzheimer

TÁ bào thÁn kinh là trung tâm cho ho¿t đáng bình th°ång cąa bá não con ng°åi vì chúng đóng vai trò quan trãng trong giao tiÁp HÁu hÁt các tÁ bào thÁn kinh bÃt ngußn từ não, tuy nhiên, tÁ bào thÁn kinh có mÁt ç mãi n¢i trong c¢ thÅ Các tÁ bào gác thÁn kinh t¿o ra phÁn lãn tÁ bào thÁn kinh ç trẻ em và sá l°āng này giÁm đáng kÅ khi tr°çng thành Khi các tÁ bào thÁn kinh bá chÁt hoÁc m¿t c¿u trúc hay chćc nng s¿ d¿n đÁn hián t°āng thoái hóa thÁn kinh, nguyên nhân chính gây ra sinh lý bánh cąa mát sá rái lo¿n não nh° bánh Alzheimer

Chćng m¿t trí nhã Alzheimer (AD) là mát cn bánh phá biÁn Ánh h°çng đÁn trí nhã và nhÁn thćc Sinh lý bánh cąa suy giÁm nhÁn thćc liên quan đÁn AD đ°āc cho là do m¿t tÁ bào thÁn kinh cholinergic Ćc chÁ acetylcholinesterase (AChE) d¿n đÁn giÁm phân hąy và tích tă acetylcholine sau đó L°āng acetylcholine d° thừa này d¿n đÁn tng kích thích các thă thÅ muscarinic và nicotinic, cung c¿p mát sá bián pháp điÃu trá giÁm trí nhã trong AD [1]

Các nghiên cću gÁn đây và sinh lý bánh AD đã chß ra rằng să tích tă amyloid-beta (A³) và protein Tau là trung tâm cąa să tiÁn triÅn cąa AD (Hình 1.1) [2] Să hình thành các mÁng chća A³ trong não, đ°āc liên kÁt vãi các đám rái sāi thÁn kinh (neurofibrillary tangles - NFT) bao gßm Tau tng phosphoryl hóa, đã đ°āc xác đánh là đÁc điÅm cá điÅn cąa AD Să hình thành mÁng bám làm gián đo¿n m¿ch hßi hÁi mã d¿n đÁn viác cąng cá trí nhã ngÃn h¿n kém thành các d¿u vÁt dài h¿n Trong AD, có să m¿t mát tÁ bào thÁn kinh trên dián ráng, các kÁt nái khãp thÁn kinh bá lßi và tán th°¢ng há tháng d¿n truyÃn thÁn kinh thiÁt yÁu cÁn thiÁt cho các chćc nng cąa não, bao gßm cÁ trí nhã Do đó, triáu chćng lâm sàng phá biÁn nh¿t ç giai đo¿n đÁu cąa AD là suy giÁm trí nhã có chãn lãc Ngoài ra, hßi hÁi mã và các chćc nng phă thuác vào thùy thái d°¢ng ç giāa, chẳng h¿n nh° trí nhã tình tiÁt khai báo, cũng th°ång bá Ánh h°çng Cuái cùng, suy giÁm chćc nng điÃu hành, phán đoán và giÁi quyÁt v¿n đà là nhāng biÅu hián lâm sàng bá sung và th°ång xu¿t hián sãm [3] Bên c¿nh đó, stress oxy hóa và să hình thành các lo¿i oxy phÁn ćng (ROS) cũng đ°āc coi là nguyên nhân chính gây ra bánh này

Hình 1.1: Con đ°ång d¿n đÁn suy giÁm nhÁn thćc trong bánh Alzheimer [4] Các monome amyloid-beta (A³) kÁt tă l¿i vãi nhau đÅ t¿o thành các oligome có c¿u trúc biÁn thÅ Sau đó, các oligome tÁp hāp l¿i t¿o thành các sāi A³, sÃp xÁp t¿o thành các mÁng A³ Să hình thành mÁng bám gây ra phÁn ćng viêm bao gßm să hình thành các tÁp hāp Tau d¿n đÁn viác chuyÅn đái các tÁ bào thÁn kinh khße m¿nh thành các tÁ bào thÁn kinh bá bánh Să hián dián cąa nhiÃu tÁ bào thÁn kinh bá bánh h¢n s¿ gây ra mát phÁn ćng viêm khác d¿n đÁn m¿t nhiÃu tÁ bào thÁn kinh h¢n và sau đó là m¿t chćc nng não cũng nh° suy giÁm nhÁn thćc

Vì AD là mát bánh đa yÁu tá, nhiÃu ph°¢ng pháp điÃu trá đã đ°āc đà xu¿t đÅ điÃu trá nó

1.1.2 Các ph°¢ng pháp điÁu trß phân tÿ đái vãi bßnh AD

Các ph°¢ng pháp điÃu trá AD đ°āc phân thành hai con đ°ång điÃu trá hiáu quÁ chính là cholinergic và không cholinergic æ nhāng bánh nhÁn bá AD, rái lo¿n d¿n truyÃn thÁn kinh cholinergic gây ra să suy giÁm ch¿t d¿n truyÃn thÁn kinh acetylcholine (ACh) [5]

AchE là mát enzyme cholinergic chą yÁu đ°āc tìm th¿y ç các điÅm nái thÁn kinh c¢ sau synap, đÁc biát là ç c¢ và dây thÁn kinh Enzyme này thąy phân acetylcholine (ACh), mát ch¿t d¿n truyÃn thÁn kinh tă nhiên, thành axit axetic và choline Vai trò chính cąa AChE là ch¿m dćt să truyÃn d¿n và truyÃn tín hiáu thÁn kinh giāa các khãp thÁn kinh đÅ ngn chÁn să phân tán ACh và kích ho¿t các thă thÅ gÁn đó Do đó, các ch¿t ćc chÁ AchE có thÅ tái

cân bằng mćc acetylcholine bằng ho¿t đáng cąa AChE Acetylcholine đ°āc tích tă trong khe sinap thÁn kinh Con đ°ång này đ°āc gãi là ph°¢ng pháp tiÁp cÁn choline và đ°āc coi là ph°¢ng pháp điÃu trá triáu chćng chính cho AD

Mát ph°¢ng pháp điÃu trá khác phă thuác vào viác ngn chÁn să tích tă cąa amyloid-beta (A) Do đó, b¿t kỳ hāp ch¿t nào, có thÅ làm giÁm hoÁc ngn chÁn să kÁt tă A giāa các n¢ron, đÃu có thÅ là mát ćng cÿ viên tiÃm nng cąa thuác cháng AD và có thÅ làm giÁm să tiÁn triÅn cąa bánh [6]

Bên c¿nh đó, các ph°¢ng pháp tiÁp cÁn khác bao gßm nhiÃu hāp ch¿t và đ°ång h°ãng nh° ch¿t cháng oxy hóa, kháng viêm, ćc chÁ Tau t¿o ra quá trình phosphoryl hóa và NFT nái bào tích lũy, sÿ dăng yÁu tá h°ãng thÁn kinh có ngußn gác từ não, liáu pháp tÁ bào gác và liáu pháp nái tiÁt tá [7]

Trong đó, các phân tÿ oxy hóa (ví dă, reactive oxygen species - ROS và reactive nitrogen species - RNS) đ°āc t¿o ra bçi quá trình hô h¿p tÁ bào hoÁc d¿n truyÃn thÁn kinh s¿ kích ho¿t con đ°ång cháng oxy hóa bằng cách phân ly phćc hāp Nrf2/Keap1 (Nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2/ Kelch-like ECH-associated protein 1) Khi đ°āc tách ra khßi Keap1, Nrf2 s¿ di chuyÅn vào nhân tÁ bào, kích ho¿t să biÅu hián cąa mát sá gen cân bằng nái môi vãi trình tă AREs (antioxidant responsive elements) trong các vùng khçi đáng cąa chúng, bao gßm glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), heme oxigenase 1 (HO-1), glutathione S-transferase (GST) và catalase (CAT) (Hình 1.2A)

Khi cân bằng nái môi bá thay đái thúc đẩy sÁn xu¿t ROS/RNS quá mćc có thÅ kích ho¿t các tÁ bào thÁn kinh đám (tÁ bào hình sao và microglia) giÁi phóng các ch¿t gây viêm, làm gián đo¿n d¿n truyÃn thÁn kinh và rái lo¿n ho¿t đáng thÁn kinh đám, từ đó gây nên các bánh và rái lo¿n thoái hóa thÁn kinh (Hình 1.2 B)

Hình 1.2: C¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t cháng oxy hóa trong

thoái hóa thÁn kinh [8]

Hình 1.3: C¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t gây viêm trong thoái hóa thÁn kinh [9]

Các kích thích khác nhau (ví dă: lipopolysaccharide - LPS, A³ ) có thÅ tác đáng vào microglia, đÁc biát, să t°¢ng tác cąa LPS vãi thă thÅ giáng Toll 4/ căm biát hóa 14 (TLR4/CD14) có thÅ ho¿t hóa các tín hiáu nái bào (ví

dă: NF-κB, MAPK và JAK/STAT), d¿n đÁn ho¿t hóa các tÁ bào thÁn kinh đám và giÁi phóng các ch¿t trung gian gây viêm nh° oxit nitric cÁm ćng (inducible nitric oxidase synthase, iNOS), cyclooxygenase 2 (COX-2), các cytokine (ví dă interleukin-1³ (IL-1³), IL-6 và yÁu tá ho¿i tÿ khái u-α (tumor necrosis factor α, TNF-α)), chemokine (ví dă: protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)),& có liên quan đÁn tình tr¿ng viêm thÁn kinh và d¿n đÁn tán th°¢ng tÁ bào thÁn kinh (Hình 1.3)

1.1.3 Các mô hình t¿ bào cho nghiên cąu bßnh AD

Các dòng tÁ bào có khÁ nng nuôi c¿y án đánh th°ång đ°āc sÿ dăng đÅ nghiên cću đÅ nghiên cću các bánh thoái hóa thÁn kinh bao gßm PC-12, Luhmes, SH-SY5Y và C6 [10] Trong đó, tÁ bào Luhmes là tÁ bào tiÃn thân tÁ bào thÁn kinh phôi, tÁ bào PC-12 giáng nh° các tÁ bào thÁn kinh h¿ch giao cÁm, tÁ bào SH-SY5Y là tÁ bào đ°āc nhân bÁn từ dòng tÁ bào u nguyên bào thÁn kinh và tÁ bào C6 là dòng tÁ bào thÁn kinh đám đ°āc phân lÁp từ não cąa mát con chuát bá u thÁn kinh đám

Sau khi biát hóa, các tác nhân gây đác thÁn kinh đ°āc thêm vào môi tr°ång nuôi c¿y tÁ bào đÅ gây ra đác tính và chÁt tÁ bào Viác bá sung A³ oligomers, ch¿t cÁm ćng stress oxy hóa vào các tÁ bào thÁn kinh s¿ t¿o nên các kiÅu hình cholinergic gây ra apoptosis Đây là mát mô hình nái tiÁng cąa AD r¿t hāu ích đÅ đánh giá các tác dăng bÁo vá thÁn kinh tiÃm nng cąa các lo¿i thuác mãi Trong nhóm, các dòng tÁ bào sÿ dăng đÅ nghiên cću vai trò bÁo vá thÁn kinh nói trên, C6 là mát trong nhāng dòng tÁ bào có phÁn ćng nhanh chóng vãi các kích thích bên ngoài, chẳng h¿n nh° H2O2, có thÅ t¿o ra stress oxy hóa

C6 là dòng tÁ bào thÁn kinh đám đ°āc phân lÁp từ não cąa mát con chuát mÃc bánh Glioma (u thÁn kinh đám) Khái u thÁn kinh đám đ°āc t¿o ra bçi N-nitrosomethylurea sau mát lo¿t quá trình nuôi c¿y và chuyÅn đáng vÁt thay thÁ

1.2 TàNG QUAN VÀ ASTAXANTHIN

Astaxanthin là mát carotenoid tă nhiên có màu đß, dß hòa tan trong lipid vãi công thćc phân tÿ C40H52O4 và khái l°āng mol 596,84 g/mol Astaxinthin có mÁt trong trong nhiÃu sinh vÁt biÅn nh° cá hßi, tôm, nhuyßn thÅ, tôm hùm, hay trong vi sinh vÁt và mát sá loài thăc vÁt

Các nghiên cću lâm sàng và trên đáng vÁt thăc nghiám đã chćng minh

rằng astaxanthin có nhiÃu ho¿t tính sinh hãc nh° tiêu diát hiáu quÁ các gác tă do, kháng viêm, cháng lão hóa, giÁm să hình thành khái u, phòng ngừa bánh tim m¿ch và tai biÁn m¿ch máu não, bÁo vá gan, cháng tiÅu đ°ång, bÁo vá c¢ thÅ khßi bćc x¿ tia căc tím v.v Bên c¿nh đó, các nhà nghiên cću cũng chß ra rằng astaxanthin có tác dăng bÁo vá há thÁn kinh và nh° là mát tác nhân bÁo vá thÁn kinh đa măc tiêu, astaxanthin tác đáng lên nhiÃu c¢ chÁ ho¿t đáng đÅ giÁi quyÁt các c¢ chÁ sinh lý bánh phćc t¿p cąa bánh thoái hóa thÁn kinh

1.2.1 Tác dāng cháng oxy hóa

Stress oxy hóa là mát ch¿t trung gian chính trong bánh lý cąa các bánh thÁn kinh Să xáo trán tr¿ng thái cân bằng cąa các phÁn ćng tiÃn oxy hóa/cháng oxy hóa trong tÁ bào có thÅ d¿n đÁn stress oxy hóa, gây ra să hình thành ROS (reactive oxygen species) và các gác tă do

Tác dăng cháng oxy hóa cąa astaxanthin cũng đã đ°āc nghiên cću trong các mô hình thí nghiám và tình tr¿ng thÁn kinh c¿p tính (hình 1.4) Lee và

cáng să đã báo cáo rằng astaxanthin cung c¿p tác dăng bÁo vá thÁn kinh

cháng l¿i stress oxy hóa gây ra bçi să thiÁu hăt oxy-glucose trong các tÁ bào u nguyên bào thÁn kinh ng°åi SH-SY5Y và thiÁu máu não căc bá trong 10 phút ç chuát [11] Trong mát mô hình chuát bá đát quỵ do thiÁu máu căc bá, viác điÃu trá tr°ãc bằng astaxanthin làm giÁm sÁn xu¿t ROS và giÁm peroxid hóa lipid ç não cùng bên cąa chuát bá tÃc đáng m¿ch não giāa (middle cerebral artery occlusion - MCAO) [12] Đßng thåi, astaxanthin làm giÁm nhßi máu

não và thúc đẩy phăc hßi chćc nng vÁn đáng sau MCAO [12] Zhang và cáng să đã phát hián ra rằng sÿ dăng astaxanthin có khÁ nng làm giÁm tán

th°¢ng não sãm (early brain injury - EBI) sau khi xu¿t huyÁt d°ãi nhán (subarachnoid hemorrhage - SAH) thông qua các đÁc tính cháng oxy hóa cąa nó [13] ĐiÃu trá bằng astaxanthin đ°āc cho là mang l¿i tác dăng bÁo vá bằng cách khôi phăc các enzym cháng oxy hóa nái sinh glutathione (GSH) và superoxide dismutase (SOD) sau SAH [13] Wu và cáng să đã báo cáo rằng

viác điÃu trá astaxanthin sau SAH đã t¿o điÃu kián thuÁn lāi cho con đ°ång Nrf2-ARE và cÁi thián EBI trong mát mô hình bÅ chća prechiasmatic cąa SAH [14] Astaxanthin kích ho¿t con đ°ång truyÃn tín hiáu Nrf2-ARE làm tng să biÅu hián cąa các enzyme do Nrf2 điÃu khiÅn nh° heme oxygenase-1

(HO-1), NAD(P)H quinine oxidoreductase-1 (NQO-1) và glutathione-

S-transferase-α1 (GST-α1) đÅ cháng l¿i stress oxy hóa [14] (Hình 1.4)

Hình 1.4: Tác dăng cháng oxy hóa cąa astaxanthin trong các bánh thÁn kinh [15]

Astaxanthin t¿o điÃu kián cho să phân ly và truyÃn tin nái bào cąa yÁu tá liên quan đÁn hßng cÁu h¿t nhân 2 (Nrf2), thông qua viác kích ho¿t các con đ°ång truyÃn tín hiáu PI3K/Akt và ERK, góp phÁn làm tng biÅu hián cąa các enzyme điÃu hòa Nrf2 nh° HO-1, NQO-1, và GST-α1 cháng l¿i stress oxy hóa Ngoài ra, astaxanthin điÃu hòa ng°āc âm tính đ°ång truyÃn tín hiáu Sp1/NR1, làm giÁm viác sÁn xu¿t ROS nái bào và stress oxy hóa

1.2.2 Tác dāng cháng viêm

Viêm đ°āc đánh nghĩa là mát lo¿t các phÁn ćng mißn dách phćc t¿p xÁy ra và mÁt sinh hãc nh° mát phÁn ćng đái vãi các vÁt th°¢ng cąa c¢ thÅ Trong há tháng thÁn kinh trung °¢ng (CNS), tình tr¿ng viêm đóng vai trò quan trãng trong cÁ tình tr¿ng c¿p tính (đát quỵ và ch¿n th°¢ng) và tình tr¿ng thoái hóa thÁn kinh mãn tính (ví dă: AD, PD) ĐÁc biát, astaxanthin thÅ hián tác dăng kháng viêm trong viêm màng bß đào do lipopolysacarit gây ra bằng cách trăc tiÁp ngn chÁn ho¿t đáng cąa enzym táng hāp oxit nitric (nitric oxide synthase - NOS) (Hình 1.5) Ngoài ra, astaxanthin ćc chÁ biÅu hián gen cąa các ch¿t trung gian gây viêm (TNF-α và IL-1³) và làm giÁm viêm màng bß đào do nái đác tá gây ra bằng cách ngn chÁn con đ°ång truyÃn tín hiáu phă thuác NF-κB [16] Trong điÃu kián bình th°ång, NF-κB, mát phân tÿ

dimer bao gßm các tiÅu đ¢n vá p50 và p65, t°¢ng tác vãi ch¿t ćc chÁ NF-κB (IκB) và duy trì chúng ç tr¿ng thái b¿t ho¿t trong bào t°¢ng [17] Khi đ°āc kích thích, IκB trÁi qua quá trình phosphoryl hóa bçi IκB kinase ³ (IKK³) và bá phân hąy thông qua con đ°ång proteasome ubiquitin [18, 19] Să phân ly cąa IκB từ phân tÿ dimer p50/p65 đã t¿o ra tín hiáu chuyÅn phân tÿ NF-κB tãi nhân, d¿n đÁn să chuyÅn vá trí cąa NF-κB (p65) vào nhân đÅ điÃu chßnh quá trình phiên mã cąa các gen gây viêm [20] ĐiÃu trá bằng astaxanthin làm giÁm hiáu quÁ tình tr¿ng viêm liên quan đÁn NF-κB ç gan cąa chuát đ°āc n chÁ đá nhiÃu đ°ång và ch¿t béo cao bằng cách ćc chÁ quá trình phosphoryl hóa IKK³ và truyÃn tin nái bào cąa tiÅu đ¢n vá NF-κB (p65) [21] Astaxanthin cũng ćc chÁ biÅu hián gen do ROS gây ra bçi NF-κB (p65) và giÁm sÁn xu¿t các cytokine tiÃn viêm (IL-1³, IL-6 và TNF-α) trong các tÁ bào đ¢n nhân U937 bằng cách khôi phăc mćc đá sinh lý cąa protein tyrosine phosphatase-1 (SHP-1) [22] Trong mát mô hình chuát thí nghiám và tng sinh m¿ch màng đám, Izumi-Nagai đã chćng minh rằng điÃu trá bằng astaxanthin d¿n đÁn să ćc chÁ đáng kÅ să xâm nhÁp cąa đ¿i thăc bào vào quá trình tng sinh m¿ch màng đám [23] H¢n nāa, astaxanthin ngn chÁn să phân hąy IκB-α và truyÃn tin nái bào NF-κB, d¿n đÁn giÁm các yÁu tá gây viêm (IL-6, yÁu tá tng tr°çng nái mô m¿ch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF), phân tÿ bám dính giāa các tÁ bào-1 (intercellular adhesion molecule-1 - ICAM-1), và protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1 (monocyte chemotactic protein 1 - MCP1) [23] Astaxanthin cũng làm giÁm viêm d¿ dày ç chuát bá

nhißm Helicobacter pylori, cÁm nhißm tÁ bào lympho T từ Th1 sang Th1/Th2

[24] Ngoài ra, astaxanthin làm giÁm sÁn xu¿t oxit nitric (NO) và ho¿t đáng táng hāp oxit nitric cÁm ćng (inducible nitric oxide synthase - iNOS) trong đ¿i thăc bào, d¿n đÁn ćc chÁ cyclooxygenase và điÃu hòa giÁm prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α ç chuát [25] Sÿ dăng astaxanthin trong chÁ đá n kiêng đã ćc chÁ đáng kÅ să ho¿t hóa NF-κB b¿t th°ång ç niêm m¿c đ¿i tràng, làm giÁm biÅu hián gen cąa IL-1³, IL-6 và COX-2, góp phÁn làm suy giÁm viêm đ¿i tràng do dextran natri sulfat (dextran sulfate sodium - DSS) [26] Lee và các đßng nghiáp đã phát hián ra rằng astaxanthin ngn ngừa quá trình viêm bằng cách ngn chÁn să ho¿t hóa tín hiáu NF-κB và sÁn xu¿t các cytokine gây

viêm (ví dă: TNF-α và IL-1³) bằng cách sÿ dăng cÁ mô hình in vitro và in

vivo [27] Trong tÁ bào sừng cąa con ng°åi, Terazawa và cáng să đã chćng

minh rằng astaxanthin làm gián đo¿n quá trình tă phosphoryl hóa và tă ho¿t hóa protein kinase-1 (MSK1), d¿n đÁn giÁm quá trình phosphoryl hóa NF-κB (p65) và thiÁu ho¿t đáng liên kÁt DNA cąa NF-κB [28] KÁt quÁ là, să biÅu hián và bài tiÁt PGE2, IL-8 do UVB gây ra đ°āc điÃu chßnh giÁm trong các tÁ bào sừng này cąa con ng°åi [28]

Hình 1.5: Tác dăng cháng viêm cąa astaxanthin trong các bánh thÁn kinh [15]

Thông qua viác ngn chÁn să thoái hóa IκB-α và ćc chÁ truyÃn tin nái bào NF-κB, astaxanthin ćc chÁ các yÁu tá gây viêm IL-6, ICAM-1 và MCP1 Astaxanthin cũng ćc chÁ truyÃn tin nái bào NF-κB và làm giÁm viác sÁn xu¿t các cytokine gây viêm ç h¿ bì bằng cách khôi phăc mćc sinh lý cąa SHP-1

1.3 NANO ASTAXANTHIN VÀ TÁC DĀNG SINH HàC CĂA NÓ

MÁc dù có nhiÃu ho¿t tính sinh hãc quý nh°ng astaxanthin l¿i đ°āc xÁp vào nhóm ho¿t ch¿t có đá tan trong n°ãc r¿t th¿p Do đó, nhiÃu ph°¢ng pháp đã đ°āc áp dăng đÅ cÁi thián khÁ nng h¿p thă cũng nh° bÁo vá ho¿t tính đÁy tiÃm nng cąa astaxanthin nh° là công nghá nano, biÁn đái c¿u trúc, t¿o phćc ch¿t vùi& Trong đó, công nghá nano mang l¿i hiáu quÁ v°āt trái h¢n cÁ trong viác nâng cao đá phân tán và cÁi thián să h¿p thu vào trong tÁ bào Đ°āc thiÁt kÁ phù hāp vãi đ°ång đi cąa thuác bên trong c¢ thÅ, tiÅu phân nano có khÁ nng giúp vÁn chuyÅn thuác đÁn đúng vá trí cÁn giÁi phóng ho¿t ch¿t hoÁc

đích sinh hãc nh° tÁ bào bánh, mô bánh hoÁc bào quan bên trong tÁ bào bánh Trên đ°ång vÁn chuyÅn đÁn đích có nhiÃu tác nhân phân hąy nh°: nhiát đá, đá ẩm, oxy, không khí và ánh sáng, pH, dách sinh lý, enzyme Do đó, các ho¿t ch¿t kém bÃn nh° astaxanthin đ°āc bao bãc bên trong tiÅu phân nano s¿ tránh đ°āc các tác đáng trên và đ°a thuác đÁn đích an toàn Đßng thåi, viác đó s¿ tránh đ°āc să phân bá thuác đÁn các mô lành và tÁ bào lành

Nm 2011, Meor Mohd Affandi và nhóm nghiên cću đã chÁ t¿o thành công nano nhũ t°¢ng bằng ph°¢ng pháp ly tâm tác đá cao 9000 vòng/phút ç áp su¿t 800 bars Nhũ t°¢ng nano astaxanthin bao gßm các thành phÁn: 4% w/w ch¿t ho¿t đáng bà mÁt, 2% w/w astaxanthin, 14% w/w dÁu và 80% w/w n°ãc SÁn phẩm nano thu đ°āc có kích th°ãc là 150-160 nm, dß hòa tan trong n°ãc và có khÁ nng tng ho¿t tính sinh hãc mà không thay đái c¿u trúc hóa hãc cąa astaxanthin [29]

Trong thí nghiám nghiên cću tác dăng bÁo vá da do tia căc tím cąa nano astaxanthin, astaxanthin tan trong dÁu và lutein cąa Harada và cáng să đã cho th¿y, chuát đ°āc uáng nano astaxanthin có tác dăng giÁm viêm, giÁm sá l°āng tÁ bào niêm m¿c bá chÁt cùng vãi giÁm mćc đá biÅu hián cąa các gen COX-2, p-IkB-a, TNFa và CD45 cao nh¿t khi so sánh vãi các nhóm chuát đ°āc uáng astaxanthin pha trong dÁu và lutein [30] Nghiên cću chćng minh rằng nano astaxanthin có hiáu quÁ trong viác bÁo vá bà mÁt mÃt cháng l¿i các tác đáng có h¿i cąa viác tiÁp xúc vãi tia UVB c¿p tính, mà không có tác dăng phă b¿t lāi rõ ràng nào đ°āc quan sát th¿y Nano astaxanthin t¿o ra mát ch¿t hòa tan trong n°ãc có ngußn gác tă nhiên đÁy hća hẹn đÅ bÁo vá cháng l¿i tán th°¢ng bà mÁt mÃt trong điÃu kián cng thẳng oxy hóa cao khi sÿ dăng theo đ°ång uáng

Liu và cáng să đã nghiên cću chÁ t¿o astaxanthin bao bãc trong các h¿t nano poly (axit lactic-co-glycolic) (PLGA) và chitosan oligosaccharide (COS) Să bao bãc tát cąa các h¿t nano PLGA và COS đã cho kÁt quÁ sÁn phẩm nano chća astaxanthin có d¿ng hình cÁu, kích th°ãc h¿t trung bình khoÁng 150 nm Hiáu su¿t bao bãc (> 85%) và khÁ nng tÁi (> 15%) cąa astaxanthin trong các h¿t nano là t°¢ng đái cao Phân tích tia X cho th¿y rằng astaxanthin đ°āc bao bãc ç d¿ng vô đánh hình Các h¿t nano có khÁ nng phân tán tát và án đánh trong dung dách n°ãc và có khÁ nng t°¢ng thích tÁ bào cao [31]

Bên c¿nh đó, Guan và cáng să cũng đã chÁ t¿o thành công sÁn phẩm nano chća astaxanthin bằng ph°¢ng pháp đông khô Bát nano cho khÁ nng phân tán r¿t tát trong n°ãc Tuy nhiên hàm l°āng astaxanthin có trong sÁn phẩm t°¢ng đái th¿p chß 2,9% KÁt quÁ thÿ nghiám trên chuát cho th¿y vãi liÃu uáng là 2,4 mg/kg, sau 28 ngày sÿ dăng liên tiÁp không có đác tính [32]

Trong nghiên cću cąa Sun và cáng să, nhũ t°¢ng nano astaxanthin không chća n°ãc (ASX-NANE) đ°āc chÁ t¿o bằng ph°¢ng pháp đßng nh¿t áp su¿t cao [33] SÁn phẩm kÁt hāp các °u điÅm cąa ch¿t mang nano và nhũ t°¢ng không chća n°ãc ASX-NANE thu đ°āc có d¿ng hình cÁu vãi să phân bá kích th°ãc đßng đÃu và hiáu su¿t bám cao (98,4 ± 0,3%) Phân tích FTIR chß ra rằng astaxanthin đã đ°āc bao bãc thành công vào lõi lipit cąa ASX-NANE Há nano nhũ t°¢ng này có tính án đánh trong khoÁng thåi gian 4 tuÁn ç 25°C và có thÅ bÁo vá astaxanthin cháng l¿i să oxy hóa Nghiên cću tÁ bào

in vitro cho th¿y ASX-NANE có đác tính th¿p và có thÅ bÁo vá tÁ bào cháng l¿i stress oxy hóa Nghiên cću thẩm th¿u trong áng nghiám và các phÁn mô hãc da cho th¿y să thẩm th¿u tng c°ång cąa astaxanthin và să biÁn đái cąa lãp sừng vãi să h¿p thă toàn thân th¿p và biÅu bì không thay đái Do đó, nhũ t°¢ng nano không chća n°ãc có thÅ là mát chiÁn l°āc thích hāp đÅ sÁn xu¿t chÁ phẩm astaxanthin bôi t¿i chß

Bằng ph°¢ng pháp nhũ hóa - bay h¢i, Oh và cáng să đã chÁ t¿o astaxanthin lecithin nano-liposol (ASTA @ Lec NS) có kích th°ãc 169-187 nm và chß sá đa phân tán <0.3 [34] ASTA @ Lec NS án đánh trong mát thåi gian đą dài và dß dàng đông khô thành bát khi thêm mát l°āng sucrose thích hāp Ngoài ra, khÁ nng hòa tan trong n°ãc tát cąa ASTA @ Lec NS đã cÁi thián đáng kÅ sinh khÁ dăng cąa astaxanthin SÁn phẩm ASTA @ Lec NS có thÅ lo¿i bß các gác tă do (ROS) và thúc đẩy quá trình chāa lành vÁt th°¢ng cąa các tÁ bào NIH 3T3 (nguyên bào sāi) hiáu quÁ h¢n mà không gây ra b¿t kỳ đác tính tÁ bào nào KÁt quÁ nghiên cću đã khẳng đánh khÁ nng cháng oxy hóa t¿i chß và in vitro cąa ASTA@Lec NS đÃu cao h¢n so vãi

astaxanthin tinh khiÁt và lecithin

æ n°ãc ta, các nghiên cću và bào chÁ d¿ng nano cąa các ho¿t ch¿t có ho¿t tính sinh hãc đang đ°āc quan tâm và phát triÅn trong nhāng nm gÁn đây Tuy nhiên, viác nghiên cću chÁ t¿o d¿ng nano astaxanthin nói riêng cho tãi thåi điÅm hián t¿i là r¿t ít Liên quan tãi ho¿t ch¿t này, t¿i Viát Nam mãi

chß triÅn khai nghiên cću chiÁt tách astaxanthin từ các ngußn nguyên liáu khác

nhau, trong đó các nghiên cću đÃu đ°a ra kÁt luÁn: Vi tÁo Haematococcus

pluvialis là ngußn nguyên liáu cho hàm l°āng tích lũy astaxanthin cao nh¿t và sÁn phẩm astaxanthin thu đ°āc có khÁ nng ćng dăng sÿ dăng đ°āc cho con ng°åi [35]

Trong đà tài <Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chuyÅn hóa lipit cąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên

mô hình in vitro và in vivo= do quỹ Nafosted tài trā nm 2019 – 2023, nhóm nghiên cću phòng Công nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc đã kÁt hāp vãi Vián Hóa hãc đã chÁ t¿o thành công nano astaxanthin có tính sinh khÁ dăng (g¿p 5-20 lÁn) và ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm lipit cao h¢n so vãi astaxanthin tă do Chính vì vÁy, <Đánh giá khÁ nng ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase và bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin trên

dòng tÁ bào thÁn kinh= đ°āc tiÁn hành đÅ làm rõ h¢n và vai trò cąa nano astaxanthin, đßng thåi góp phÁn đánh h°ãng cho các nghiên cću sau này

CH¯¡NG 2 ĐàI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 2.1 ĐàI T¯þNG NGHIÊN CĄU

2.1.1 Đái t°ÿng nghiên cąu

Nano astaxanthin có ngußn gác từ astaxanthin tách chiÁt từ vi tÁo lăc

Haematococcus pluvialis do TS Hoàng Mai Hà, phòng VÁt liáu tiên tiÁn, Vián Hoá hãc, Vián Hàn lâm cung c¿p vãi kích th°ãc h¿t là 98 ± 2 nm, hình cÁu, chß sá PDI là 0,184 ± 0,003 và giá trá tuyát đái cąa thÁ zeta là 36,8 mV Nano astaxanthin phân bá đßng đÃu và phân tán tát trong n°ãc

TÁ bào thÁn kinh đám C6 (ATCC, CCL-107™) do TS Nguyßn Vn Trā, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN cung c¿p

2.1.2 Hóa ch¿t và thi¿t bß

Hóa ch¿t: Môi tr°ång nuôi c¿y tÁ bào dulbecco's modified eagle medium (DMEM)/high glucose (Gibco™, Thermo Fisher, Singapore), fetal bovine serum (FBS; Sigma), penicillin, và streptomycin (Invitrogen, Mỹ), ascobic acid (Trung Quác), galantamine hydrobromide (Sopharma AD, Bulgaria), H2O2 (Trung Quác), A³25-35 (purity ≥ 97%, No A.4559; Sigma, USA), acetylcholinesterase inhibitor screening Kit (MAK 119; Sigma, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Invitrogen, USA), TRIzol™ (Invitrogen, Singapore), Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (New England BioLabs Inc., UK), Mßi (Công ty Phù Sa, Viát Nam)

ThiÁt bá: Dùng cho nghiên cću gßm Cân kỹ thuÁt Precisa XB 1200C (Switzerland), Cân phân tích Shimadzu AY 120 (NhÁt BÁn); Máy ly tâm Sorvall® LEGEND RT (Đćc), Máy khu¿y từ Kika Labortechnik (Đćc), Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W (Kendro, Germany), Nßi khÿ trùng (ALP, NhÁt BÁn), Tą l¿nh th°ång, Pipetteman các lo¿i (Gilson, France) và các dăng că thông th°ång cąa phòng thí nghiám

2.2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU

KhÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin đ°āc tiÁn hành t¿i Phòng Công nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN từ tháng 2-9/2023 nh° đ°āc trình bày trong hình 2.1

Hình 2.1: S¢ đß nghiên cću khÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa

nano astaxanthin

2.2.1 Xác đßnh ho¿t tính ąc ch¿ enzyme acetylcholinesterase (AchE)

Tác dăng ćc chÁ enzym AChE (Sigma Aldrich, Singapore) cąa m¿u thÿ đ°āc tiÁn hành bằng kit Acetylcholinesterase Inhibitor Screening Kit (MAK324, Sigma, Mỹ) theo h°ãng d¿n cąa nhà sÁn xu¿t Ph°¢ng pháp này dăa trên nguyên tÃc sau: C¢ ch¿t acetylthiocholin iodid (ACTI) bá thąy phân nhå xúc tác cąa AChE t¿o thiocholin Thiocholin sau đó phÁn ćng vãi axit 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic DTNB t¿o thành sÁn phẩm acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng và so màu ç b°ãc sóng 412 nm L°āng sÁn phẩm đ°āc t¿o thành tỷ lá thuÁn vãi ho¿t đá cąa AChE Galantamine (ç nßng đá 4, 20, 100 và 500 µg/mL) đ°āc sÿ dăng làm đái chćng d°¢ng tính Ho¿t tính AChE đ°āc đánh giá dăa trên đá h¿p thă cąa nano astaxanthin hoÁc galantamine đo đ°āc ç b°ãc sóng 412 nm bằng máy microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) Đánh giá kÁt quÁ thông qua phÁn trm ćc chÁ ho¿t đá enzym AChE (I%) theo công thćc:

I% = (1-∆ODtest/∆ODNo inhibitor) × 100%

Trong đó: I%: phÁn trm ho¿t tính AChE bá ćc chÁ; ΔODtest: Să thay đái giá trá OD412 cąa giÁng chća nano astaxanthin hoÁc ch¿t chuẩn ç thåi điÅm 0 phút và 10 phút ΔODNo inhibitor: Să thay đái giá trá OD412 cąa giÁng đái chćng không ćc chÁ

2.2.2 Ph°¢ng pháp nuôi c¿y t¿ bào

TÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y trên môi tr°ång DMEM có chća 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tą nuôi c¿y vô trùng ç 37 °C, 5% CO2

2.2.3 Ph°¢ng pháp đánh giá đác tính căa nano astaxanthin

Đác tính cąa nano astaxanthin ç các nßng đá khác nhau (10, 50, 100, 200 và 500 µg/mL) trên dòng tÁ bào C6 đ°āc phân tích theo ph°¢ng pháp so màu MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) theo công bá cąa Hien và cáng să (2023) [36] că thÅ là tÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y vào trong đĩa 96 giÁng vãi mÁt đá 2 x 104 tÁ bào/giÁng/100 μL môi tr°ång đÁy đą Ą qua 24 giå cho tÁ bào phát triÅn án đánh Sau đó, tÁ bào đ°āc ą vãi nano astaxanthin hoÁc n°ãc c¿t khÿ trùng (0,01%) trong 24 giå tiÁp theo Sau 24h, bá sung 5 µL cąa dung dách MTT (5 mg/mL) vào từng giÁng và tiÁp tăc ą trong 4 giå Môi tr°ång đ°āc lo¿i bß sau 4h và bá sung 100 µL DMSO hòa tan các tinh thÅ đ°āc t¿o thành vãi MTT Màu cąa dung dách đ°āc đãc ç b°ãc sóng 570nm bằng bằng máy microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) Tỷ lá sáng sót cąa tÁ bào đ°āc tính bằng cách so sánh đá h¿p thă cąa m¿u vãi m¿u đái chćng Trong đó phÁn trm sáng sót cąa tÁ bào đ°āc xác đánh nh° sau:

Tỷ lá tÁ bào sáng (%) = (Sá tÁ bào sáng/Táng sá tÁ bào) x 100% Thí nghiám đ°āc lÁp l¿i ít nh¿t ba lÁn

2.2.4 Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng h¿p thu t¿ bào

KhÁ nng h¿p thu cąa nano astaxanthin so vãi astaxanthin tă do trong tÁ bào C6 đ°āc tiÁn hành theo ph°¢ng pháp đ°āc mô tÁ bçi Hien và cáng să [36] Că thÅ là, các tÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y tr°ãc trong 24 giå vãi mÁt đá 1×106 tÁ bào trên mßi đĩa và sau đó đ°āc xÿ lý bằng 5 µg/mL astaxanthin tă do hoÁc 50 µg/mL nano astaxanthin (chća mát l°āng t°¢ng đ°¢ng 5 µg/mL astaxanthin) trong 4 giå Sau thåi gian ą, các tÁ bào đ°āc rÿa ba lÁn bằng dung dách muái đám phát phát (PBS), ly giÁi và ly tâm ç 2000 vòng/phút trong 3 phút Nßng đá cąa astaxanthin trong các tÁ bào đ°āc xác đánh bằng ph°¢ng pháp sÃc ký lßng hiáu nng cao (HPLC), theo báo cáo tr°ãc đây cąa Hien và cáng să [36]

2.2.5 Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vß t¿ bào căa nano astaxanthin cháng l¿i stress oxy hóa trong t¿ bào C6 đ°ÿc cÁm ąng H2O2