Xác Định tự kháng thể trong huyết tương dịch não tủy của các bệnh nhân mắc bệnh tủy sống do thoái hóa myelin

Xác Định tự kháng thể trong huyết tương dịch não tủy của các bệnh nhân mắc bệnh tủy sống do thoái hóa myelin Xác Định tự kháng thể trong huyết tương dịch não tủy của các bệnh nhân mắc bệnh tủy sống do thoái hóa myelin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Thanh Nhàn

XÁC ĐỊNH TỰ KHÁNG THỂ TRONG HUYẾT TƯƠNG/ DỊCH NÃO TỦY CỦA CÁC BỆNH NHÂN

BỊ BỆNH TỦY SỐNG DO THOÁI HÓA MYELIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Thanh Nhàn

XÁC ĐỊNH TỰ KHÁNG THỂ TRONG HUYẾT TƯƠNG/ DỊCH NÃO TỦY CỦA CÁC BỆNH NHÂN

BỊ BỆNH TỦY SỐNG DO THOÁI HÓA MYELIN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Bùi Phương Thảo

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu em đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trịnh Hồng Thái và TS Bùi Phương Thảo cũng như sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết quả của luận văn là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí khoa học Việc sử dụng các dữ liệu trong luận văn đã được sự chấp thuận của các đồng tác giả Luận văn chưa từng được tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Học viên cao học

Lê Thị Thanh Nhàn

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Hồng Thái và TS Bùi Phương Thảo, những người thầy, cô đã định hướng, chỉ bảo và hướng dẫn tận tình cho em những kiến thức chuyên môn, kỹ năng

nghiên cứu, luôn động viên và khích lệ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo ở Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người Các thầy, cô là vừa người thầy truyền đạt kiến thức chuyên môn, vừa là tấm gương để em học tập, tạo điều kiện giúp em hoàn thành được luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các bác sĩ, y tá Khoa Nội tổng hợp - Bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ lấy mẫu cũng như hỗ trợ thu thập thông tin về đặc

điểm mẫu của bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các PGS.TS Nguyễn Lai Thành đã chỉ dạy và hỗ trợ em suốt thời gian vừa qua Cảm ơn các bạn học viên cao học và sinh viên đang học tập, nghiên cứu tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc, những người luôn nhiệt tình giúp đỡ, đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập và

nghiên cứu tại phòng

Luận văn này được thực hiện dưới sự hỗ trợ kinh phí của đề tài QG.22.01 và sử dụng trang thiết bị, cơ sở vật chất của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Phòng thí nghiệm Sinh học người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người và Trung tâm Khoa học Sự sống thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn

Em xin trân trọng cảm ơn !

HVCH Lê Thị Thanh Nhàn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh lý tổn thương tủy sống do thoái hóa myelin 2

1.1.1 Viêm não tủy rải rác cấp tính 2

1.1.2 Viêm tủy thị thần kinh 5

1.2 Dấu ấn sinh học phân tử trong bệnh lý tổn thương tủy sống do thoái hóa myelin 12

1.3.1 Vai trò của tế bào T và tế bào B trong bệnh tự miễn 18

1.3.2 Mối liên quan giữa HLA-DRB1*15:01 với ADEM và NMO 19

1.3.3 Vai trò của epitope và nghiên cứu tin sinh học trong tìm hiểu cơ chế bệnh tự miễn 20

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Máy móc và trang thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Tách huyết tương từ mẫu máu toàn phần 24

2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 25

2.2.3 Xác định chuỗi nhẽ tự do kappa bằng phương pháp Western Blot 25

2.2.4 Xác định kháng thể kháng MOG và AQP4 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 26

2.2.5 Phân tích số liệu và xử lý thống kê 28

2.2.6 Lập danh sách các epitope tiềm năng của tự kháng nguyên MOG/AQP4 ở bệnh thoái hóa myelin do viêm bằng phương pháp in silico 28

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Xác định chuỗi nhẹ tự do kappa bằng phương pháp Western Blot 32

3.2 Xác định kháng thể kháng MOG và kháng thể kháng AQP4 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 36

3.2.1 Kết quả xác định sự có mặt của kháng thể kháng MOG và kháng thể kháng AQP4 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 36

3.2.2 Trường hợp bệnh nhân dương tính đồng thời với cả kháng thể kháng MOG và kháng thể kháng AQP4 39

3.3 Dự đoán các epitope của tự kháng nguyên MOG/AQP4 trong bệnh tủy sống do thoái hóa myelin 43

3.3.1 Sàng lọc các epitope tiềm năng 43

3.3.2 Mô hình cấu trúc 3D của các epitope, HLA-DRB1*15:01 và kháng thể IgG người 49

DANH MỤC VIẾT TẮT

ADEM Viêm não tủy rải rác cấp tính

(Acute Disseminated Encephalomyelitis)

AM Viêm tủy cấp tính (Acute myelitis)

APC Tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cells)

AQP4-IgG Kháng thể kháng AQP4 (Aquaporin 4 IgG)

BBB Hàng rào máu não (Blood brain barrier)

BCR Thụ thể tế bào B (B cell receptor)

CBA Xét nghiệm huyết thanh học dựa trên tế bào (Cell-Based Assays)

CIS Hội chứng lâm sàng đơn độc (Clinically isolated syndrome)

CNS Hệ thần kinh trung ương (Central nervous system)

CRION Viêm thần kinh thị giác tái phát mạn tính

(Chronic relapsing inflammatory optic neuropathy)

CSF Dịch não tủy (Cerebrospinal fluid)

FLC Chuỗi nhẹ tự do (Free light chains)

HLA Kháng nguyên bạch cầu ở người (Human leukocyte antigen)

IEF Điện di tập trung đẳng điện (Isoelectric focusing)

IIFT Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunofluorescence Test)

LETM Viêm tủy kéo dài trên 3 đoạn đốt sống trở lên

(Longitudinally extensive transverse myelitis)

MOG Myelin-oligodendrocyte glycoprotein

MOG-IgG Kháng thể kháng MOG (Myelin-oligodendrocyte glycoprotein IgG)

Tên viết tắt Tên đầy đủ

MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging)

MS Đa xơ cứng (Multiple Sclerosis)

NMO Viêm tủy thị thần kinh (Neuromyelitis Optica)

NMOSD Rối loạn phổ viêm tủy thị thần kinh

(Neuromyelitis optica spectrum disorder)

NMOSD ON Rối loạn phổ viêm tủy thị thần kinh liên quan đến viêm thị thần kinh NTSCI Không do chấn thương tủy sống (Non traumatic spinal cord injury)

OAP Orthogonal arrays of particles

OCT Chụp cắt lớp quang học (Optical Coherence Tomography)

ON Viêm dây thần kinh thị giác (Optic neuritis)

RRMS Đa xơ cứng tái phát thuyên giảm

(Relapsing remitting multiple sclerosis)

SCI Tổn thương tủy sống (Spinal cord injury)

TCR Thụ thể tế bào T (T cell receptor)

TM Viêm tủy cắt ngang (Transverse myelitis)

TSCI Chấn thương tủy sống (Traumatic spinal cord injury)

κ-FLC Chuỗi nhẹ tự do Kappa (Kappa free light chains)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Tiêu chuẩn chẩn đoán ADEM 4

Bảng 2: Các đặc điểm khác biệt giữa ADEM và NMO 11

Bảng 3: So sánh việc xác định κ-FLC và OCBs trong CSF 13

Bảng 4: Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 5: Máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 6: Độ nhạy và độ đặc hiệu của kit 26

Bảng 8: So sánh một vài đặc điểm giữa bệnh nhân bị bệnh tủy sống do thoái hóa bao myelin với sự có mặt của MOG-IgG và AQP4-IgG trong huyết tương 38

Bảng 9: Tần suất xuất hiện các tự kháng thể MOG-IgG và AQP4-IgG ở nghiên cứu này và trên thế giới 39

Bảng 10: Epitope tế bào T CD4+ 44

Bảng 11: Epitope tế bào B liên tục 46

Bảng 12: Các epitope chung ở tế bào T và tế bào B 47

Bảng 13: Epitope hình dạng tế bào B 48

Bảng 15: Điểm số mô hình 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Lịch sử các tiêu chuẩn chẩn đoán NMO và NMOSD [86] 10

Hình 2: Cơ chế gây bệnh của MOG-IgG trong CNS [37] 15

Hình 3: Cơ chế gây bệnh của AQP4-IgG trong CNS [37] 17

Hình 6: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 28

Hình 7: Western blot xác định sự có mặt của κ-FLC 34

Hình 8: Kết quả chụp MRI cột sống lưng và não 41

Hình 9: Kết quả chụp MRI cột sống cổ 42

Hình 10: Vị trí của các epitope không liên tục của tế bào B được chọn thể hiện dưới dạng hình cầu màu đỏ 49

Hình 11: Đánh giá mô hình HLA-DRB1*15:01 50

Hình 12: Vùng CDR trên kháng thể IgG người 51

Hình 13: Vị trí liên kết giữa MOG80-YRNGKD-85 và HLA-DRB1*15:01/Fab IgG 52

MỞ ĐẦU

Tổn thương tủy sống là tình trạng y tế nghiêm trọng dẫn đến tiên lượng bệnh xấu và có khả năng thương tật vĩnh viễn cao Một trong những nguyên nhân gây ra tổn tủy sống là do bệnh tự miễn hoặc viêm Nghiên cứu này tập trung vào hai bệnh chính bao gồm viêm não tủy rải rác cấp tính và viêm tủy thị thần kinh Do những hiểu biết còn hạn chế về cơ chế bệnh sinh của chúng nên việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học được cho là đặc trưng cho bệnh đặc trưng cho bệnh như các chuỗi nhẹ tự do hay các tự kháng thể và việc phân tích sự biểu hiện về các tự kháng nguyên, tự kháng thể trong huyết tương và/ hoặc dịch não tủy là việc làm cần thiết, mang lại cơ hội xác định chỉ thị đặc hiệu cho bệnh, mở ra khả năng xác định các tác nhân gây bệnh nếu các tác nhân đó được biểu hiện, cung cấp thông tin quan trọng để giải mã cơ chế bệnh sinh và điều trị

Theo hiểu biết của chúng tôi, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào báo cáo xác định các tự kháng thể của các bệnh nhân mắc bệnh tủy sống do thoái hóa myelin cũng như trên thế giới chưa có báo nào liên quan trên đối tượng người Việt Nam Từ những thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định tự kháng thể trong huyết tương/ dịch não tủy của các bệnh nhân mắc bệnh tủy sống do thoái hóa myelin” nhằm mục tiêu:

- Triển khai được phương pháp xác định sự có mặt của chuỗi nhẹ tự do

kappa bằng kỹ thuật Western Blot

- Xác định được sự có mặt của các kháng thể tự miễn MOG-IgG và

AQP4-IgG, và dự đoán epitope tiềm năng của chúng trong bệnh tủy sống do thoái hóa myelin

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, và Phòng thí nghiệm Sinh học người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học cùng với sự hỗ trợ về thiết bị từ Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa sinh học, Trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Bệnh lý tổn thương tủy sống do thoái hóa myelin

Tổn thương tủy sống (Spinal cord injury-SCI) là tình trạng y tế nghiêm trọng do tổn thương một phần hoặc toàn bộ tủy sống dẫn đến tiên lượng xấu bệnh và khả năng thương tật vĩnh viễn cao [102, 105] Có hai nguyên nhân chính dẫn đến SCI là do chấn thương tủy sống (Traumatic spinal cord injury-TSCI) và không do chấn thương tủy sống (Non traumatic spinal cord injury-NTSCI) [102] Mặc dù có tới 90% SCI có nguồn gốc từ TSCI, nhưng NTSCI lại chiếm 60% số ca SCI nhập viện phục hồi chức năng [48, 102] Các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến NTSCI bao gồm khối u cột sống, rối loạn thoái hóa, bệnh mạch máu và viêm/tự miễn [152] Nghiên cứu này tập trung vào nguyên nhân thoái hóa myelin do viêm, một nhóm các bệnh viêm đặc trưng bởi sự tổn thương thần kinh khởi phát cấp tính liên quan đến sự thoái hóa myelin của hệ thần kinh trung ương (Central nervous system-CNS) gây ảnh hưởng đến não và cột sống Trong phạm vi bệnh, xảy ra trong các biểu hiện lâm sàng tồn tại ở nhiều dạng rối loạn, khiến cho việc phân biệt bệnh ở các cá thể trở nên khó khăn [44] Hai rối loạn thoái hóa myelin chính của CNS bao gồm bệnh Viêm não tủy rải rác cấp tính (Acute Disseminated Encephalomyelitis-ADEM) và Viêm tủy thị thần kinh (Neuromyelitis Optica-NMO) được thực hiện trong nghiên cứu này

1.1.1 Viêm não tủy rải rác cấp tính

ADEM hay còn được gọi là viêm cơ não lan tỏa sau truyền nhiễm, là một quá trình tự miễn dịch cấp tính, tiến triển nhanh chóng, xảy ra trong CNS, được đặc trưng bởi sự thoái hóa myelin trong não và tủy sống Có nghiên cứu chỉ ra rằng, ADEM có thể xảy ra sau khi tiêm chủng hoặc bị nhiễm trùng, cơ thể người có thể sinh ra phản ứng để đối phó với tình trạng viêm, kết quả của quá trình có thể dẫn đến quá trình tự miễn cấp tính, lan tỏa trong não và tủy sống Mặc dù ADEM thường xảy ra đơn phát, nhưng các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng 18-25% trường hợp mắc phải có thể tái phát [2]

Cơ chế gây bệnh chính xác của ADEM hiện chưa được hiểu rõ hoàn toàn, tuy nhiên, có một số giả thuyết được công nhận rộng rãi về nguyên nhân của ADEM, bao gồm [2, 59]:

1) Tình trạng viêm gây ra bởi tác nhân kích thích từ môi trường như

tiêm chủng hoặc việc mắc các bệnh truyền nhiễm ở những người nhạy cảm về mặt di truyền Bệnh có thể xảy ra do sự tăng tính thấm thành mạch và tắc nghẽn

trong CNS, gây ra bởi tình trạng viêm và các phức hợp miễn dịch tuần hoàn xảy ra sau khi tiêm chủng hoặc bị nhiễm trùng Sự xâm nhiễm của tế bào bạch cầu đơn nhân vào hệ thống mạch máu của CNS sẽ dẫn đến hiện tượng phù mạch ở xung quanh các tế bào thần kinh và đôi khi xuất huyết gây tổn thương cho các tế bào thần kinh xung quanh (như mất myelin, hoại tử hoặc gliosis)

2) Rối loạn trong một số phản ứng tự miễn dịch gây thoái hóa myelin

trong CNS: Phản ứng qua trung gian tế bào hoặc kháng thể được tạo ra để đáp ứng

với tác nhân kích thích từ môi trường, tuy nhiên, chúng có thể phản ứng chéo với các tự kháng nguyên myelin như protein nền của myelin, protein của tế bào thần kinh đệm, proteolipid dẫn đến sự thoái hóa myelin

ADEM chủ yếu xảy ra ở nam giới với tỷ lệ nam: nữ là 1,3:1 Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên tần suất cao hơn thường gặp ở độ tuổi trung bình từ 5-8 tuổi do trẻ em tiếp xúc với kháng nguyên, tần suất tiêm chủng và khả năng nhiễm virus cao Ước tính có khoảng 1/125.000-250.000 ca mắc mới ADEM mỗi năm trên thế giới [2] Tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em được báo cáo là 0,07-0,51 trên 100.000 trẻ em ở Châu Âu và 0,2-0,6 ở Bắc Mỹ [36, 113, 123] Ở Nhật Bản, tỷ lệ mắc bệnh được báo cáo là 0,4/100.000, tỷ lệ mắc ADEM dao động từ 0,019-0,09/100.000/năm ở Trung Quốc, dữ liệu về tỷ lệ mắc bệnh này rất ít ở các nước châu Á, bao gồm cả Việt Nam [172, 173]

Hầu hết bệnh nhân mắc ADEM đều bị nhiễm trùng trước đó (lên đến 61%) hoặc tiêm vắc-xin (lên đến 4%) trong vòng 4 tuần trước khi bắt đầu có triệu chứng suy giảm thần kinh [28] Diễn biến bệnh điển hình bắt đầu bằng sự khởi phát đột

ngột của bệnh não và một số dấu hiệu thần kinh khu trú như yếu chi, liệt dây thần kinh sọ não, co giật, viêm tủy và viêm dây thần kinh thị giác (Optic neuritis-ON) cùng nhiều bệnh khác Đối tượng cũng xuất hiện các triệu chứng toàn thân như nhức đầu, sốt và nôn mửa [150] Các khiếm khuyết về thần kinh đã được mô tả ở bệnh nhi mắc ADEM, bao gồm: lơ mơ và suy giảm ý thức (69%); dấu hiệu đường dài một hoặc hai bên (unilateral or bilateral long tract signs, 60-95%); liệt nửa người cấp tính (76%); mất điều hòa vận động (18-59%); viêm màng não (26-31%); co giật (13-35%); bệnh liên quan đến tủy sống (24%); suy giảm thị lực (7-23%); và suy giảm khả năng nói hoặc mất ngôn ngữ (5-21%) [69, 153] Mặc dù bệnh nhân ADEM ban đầu có tổn thương thần kinh nghiêm trọng và biểu hiện tổn thương đa ổ/lan tỏa trên hình ảnh cộng hưởng từ (MRI) nhưng hầu hết các triệu chứng và tổn thương này đều có thể phục hồi hoàn toàn với tỷ lệ 57-89% [69, 137, 153]

Các tiêu chuẩn chẩn đoán hiện có chưa thể phân biệt được ADEM với các bệnh tự miễn, các bệnh viêm nhiễm khác và các rối loạn về mạch máu, chuyển hóa và di truyền một cách đáng tin cậy [29] Chưa có chỉ thị sinh học huyết thanh học cụ thể, hình ảnh não và các kháng thể cụ thể bổ trợ cho xét nghiệm chẩn đoán xác định ADEM nên chẩn đoán ADEM vẫn là một chẩn đoán lâm sàng (Bảng 1) [97]

Bảng 1: Tiêu chuẩn chẩn đoán ADEM

Đặc điểm lâm sàng (tất cả đều bắt buộc) Đặc điểm MRI tổn thương não

Biến cố lâm sàng, đa ổ ở CNS đầu tiên được cho là nguyên nhân gây thoái hóa myelin do viêm

Các tổn thương lan tỏa, ranh giới không rõ, lớn (>1–2 cm) chủ yếu liên quan đến chất trắng não

Bệnh não không thể giải thích bằng sốt, bệnh toàn thân hoặc các triệu chứng sau cơn

Có thể có các tổn thương chất xám sâu (ví dụ, liên quan đến hạch nền hoặc đồi thị) Không có phát hiện lâm sàng và MRI mới nào

xuất hiện 3 tháng sau khi khởi phát

Tổn thương giảm tín hiệu T1 ở chất trắng hiếm gặp

MRI não bất thường trong giai đoạn cấp tính (3 tháng)

1.1.2 Viêm tủy thị thần kinh

NMO (hay còn được gọi là bệnh Devic) là một bệnh tự miễn, gây thoái hóa myelin, chủ yếu tác động đến tủy sống và dây thần kinh thị giác [34]Đây là một dạng bệnh khó xác định do khi chụp MRI não thường không thấy hoặc thấy rất ít tổn thương viêm được bộc lộ Các tín hiệu bất thường theo chiều dọc có thể được phát hiện trên tủy sống trong các cơn cấp tính, thường kéo dài trên ba hoặc nhiều hơn ở các đốt sống [65] Hầu hết các bệnh nhân đều không thể hồi phục hoàn toàn và có các khuyết tật dai dẳng [73]

NMO là căn bệnh xảy ra trên toàn thế giới, nguyên nhân gây bệnh chưa rõ ràng, được chia thành hai dạng bao gồm 20% bệnh nhân thuyên giảm vĩnh viễn và 80% bệnh nhân bị tái phát [31] Trên thế giới, NMO có tỷ lệ phổ biến trên 100.000 dân dao động từ 0,053 đến 0,4 trong khi tỷ lệ mắc bệnh là 0,52-4,4/100.000 người Tuổi trung bình khi khởi phát bệnh là 32,6-45,7 tuổi và tỷ lệ giới tính nam:nữ ở NMO là nhỏ hơn 1:3 [93] Ở châu Á, các nhóm chủng tộc tuy có sự chênh lệch về tỷ lệ mắc nhưng nhìn chung là cao hơn so với người da trắng [85] Nghiên cứu khác từ Úc và New Zealand đã phát hiện thấy tỷ lệ mắc bệnh ở người châu Á cao gấp ba lần so với người không phải người châu Á [148] Khi khảo sát toàn quốc, Nhật Bản ước tính tỷ lệ hiện mắc là 3,42/100.000, tỷ lệ mắc bệnh ở người Hàn Quốc là 3,56/100.000 và tỷ lệ mắc bệnh ở người Nam Ấn Độ ở Mangalore là 0,72/100.000 và hiện chưa có dữ liệu nào về tỷ lệ lưu hành NMO tại Việt Nam [56, 77, 92]

NMO từng được coi là một biến thể của bệnh đa xơ cứng (Multiple Sclerosis-MS) MS là bệnh xảy ra khi một phần của CNS bị viêm, dẫn đến tổn thương myelin và sợi trục, ảnh hưởng đến não, tủy sống, các dây thần kinh thị giác [112] Khoảng 40% bệnh nhân mắc NMOSD bị chẩn đoán nhầm với MS hoặc các bệnh có biểu hiện tương tự khác [3] Với việc xác định Aquaporin 4 (AQP4), NMO được xác định là bệnh riêng biệt với MS cổ điển Tiêu chuẩn chẩn đoán NMO trước đây yêu cầu liên quan đến dây thần kinh thị giác và tủy sống mà không có biểu hiện hoặc bệnh về não [31, 73] Năm 2007, thuật ngữ các rối loạn phổ viêm tủy thị thần

kinh (Neuromyelitis optica spectrum disorder-NMOSD) được đặt ra và đề cập đến huyết thanh dương tính AQP4 như một tiêu chí chẩn đoán bệnh Thuật ngữ rộng hơn của NMOSD có thể bao gồm NMO cùng với các dạng khác bao gồm ON tái phát, viêm tủy ngang và một số biểu hiện viêm não, từ đó, có thể thấy ON và viêm tủy có mối liên hệ lớn đối với NMO [33]

1.1.2.1 Viêm thị thần kinh

ON hay viêm thị thần kinh là bệnh lý thần kinh thị giác do thoái hóa myelin, ảnh hưởng đến một hoặc cả hai dây thần kinh thị giác Tỷ lệ mắc ON nằm trong khoảng 1,04-6,4 ca/100.000 người Tần suất mắc ON cao ở những người dân sống ở vĩ độ cao như ở miền bắc Hoa Kỳ và Tây Âu, và thấp nhất ở những vùng gần xích đạo [26, 156]

Tại Hoa Kỳ, các nghiên cứu đã ước tính tỷ lệ mắc ON hàng năm lên tới 6,4 ca trên 100.000 người, xảy ra thường xuyên hơn ở người da trắng so với người Mỹ da đen [129] Ở châu Á, ON phổ biến hơn so với MS và tần suất của 2 bệnh này cao hơn so với Mỹ và Châu Âu [122] Độ tuổi trung bình khi khởi phát là 36, ON hiếm gặp ở những người dưới 18 tuổi hoặc trên 50 tuổi với hơn 70% bệnh nhân ON là phụ nữ [132, 143] Thông thường, bệnh biểu hiện bằng cơn đau khi cử động mắt, sau đó là thị lực kém dần đi Tuy nhiên, đau khi cử động mắt không có ở 8% bệnh nhân có ổ viêm nằm ở phần nội sọ của dây thần kinh thị giác và chỉ 0,4% bệnh nhân xuất hiện các triệu chứng đồng thời ở cả hai mắt [35, 143].ON được chia thành dạng điển hình và không điển hình trên lâm sàng ON điển hình được báo trước bằng cơn đau khi cử động mắt, 92% trường hợp gặp tình trạng này có thể tiến triển thành ON trong một tuần, có khả năng phục hồi thị lực gần như hoàn toàn Ngược lại, các tình trạng viêm CNS khác có liên quan đến các phân nhóm ON không điển hình có khả năng gây mù và dễ tái phát, trong những năm gần đây, việc phát hiện ra các dấu ấn sinh học huyết thanh học mới đã giúp xác định các trường hợp trước đây được phân loại là ON không rõ nguyên nhân hoặc bệnh lý viêm thần kinh thị giác tái phát mạn tính (Chronic relapsing inflammatory optic neuropathy-CRION) [132]

Ishikawa và cs (2019) chỉ ra rằng chỉ có 53% bệnh nhân rối loạn phổ viêm tủy thị thần kinh liên quan đến viêm thị thần kinh (NMOSD ON) cảm thấy đau khi đến khám [55] Trong NMO, thời gian trung bình từ khi bệnh nhân bắt đầu mắc ON đến khi bị mù cùng bên là 2 năm và đến khi ON hai bên là 3 năm, trong 5 năm, hơn một nửa số bệnh nhân NMO tái phát bị mù một hoặc cả hai mắt và suy giảm thị lực ở bệnh nhi có thể nhanh hơn ở bệnh nhân NMO trưởng thành [30, 58, 124] Theo tiêu chuẩn chẩn đoán NMOSD năm 2015 của Wingerchuk và cs, ON ở mức độ nghiêm trọng (thị lực kém hơn 20/200), có thể bắt đầu từ cả hai bên và có đặc điểm là khiếm khuyết về tầm nhìn nên nhanh chóng được chẩn đoán NMOSD [32] MRI của não và ổ mắt ở NMOSD ON thường sẽ cho thấy các tổn thương theo chiều dọc của các đoạn dây thần kinh thị giác nội sọ sau kéo dài về phía sau liên quan đến dây giao thoa và đôi khi cả các dải thị giác [32]

Các đặc điểm lâm sàng của NMOSD ON tương tự như ON liên quan đến MS (MS ON) nhưng nghiêm trọng hơn dẫn đến mất thị lực hoàn toàn ở 40% bệnh nhân [34] Mất thị giác sâu và dai dẳng là dấu hiệu đặc trưng của ON trong NMO, không phải ở MS [143] 80% mắt của bệnh nhân NMO bị mất thị lực nghiêm trọng trong cơn cấp tính, so với 36% ở bệnh MS 60% bệnh nhân NMO bị mù một bên hoặc hai bên trong khoảng thời gian trung bình là 7,7 năm sau khi phát bệnh, so với 4% bệnh nhân MS ON sau 15 năm theo dõi [34, 141] Có sự khác biệt rõ rệt về đặc điểm MRI giữa NMOSD ON và MS ON giúp phân biệt hai bệnh viêm thần kinh này Mealy và cs (2015) cho thấy các tổn thương NMO lan rộng theo chiều dọc (có chiều dài ít nhất là 17,6 mm) và sẽ liên quan đến ít nhất ba đoạn dây thần kinh thị giác Ngược lại, các tổn thương MS thường khu trú hơn ở một đoạn dây thần kinh thị giác khu trú ở phía trước Phát hiện này có độ đặc hiệu (76,9%) và độ nhạy (80,8%) đối với NMO [96]

Bên cạnh MRI, OCT cũng là một phương pháp hữu ích để phát hiện sự thoái hóa sợi trục trong các sợi thần kinh thị giác và có thể giúp phân biệt MS và NMO Các nghiên cứu gần đây cho thấy ON trong NMO thường ảnh hưởng đến lớp sợi thần kinh võng mạc (Retinal nerve fiber layer-RNFL) nghiêm trọng, lớp tế bào hạch

mỏng đi và phù hoàng điểm vi nang dẫn đến teo Tổn thương dây thần kinh thị giác thầm lặng và mỏng RNFL có thể xảy ra ở MS nhưng hiếm gặp ở NMO Trong một nghiên cứu của Bichuetti và cs (2013), độ dày RNFL trong bệnh đa xơ cứng tái phát thuyên giảm (Relapsing remitting multiple sclerosis-RRMS), NMO tái phát và CRION được so sánh, tần suất ON ở CRION là cao nhất (100%), trong khi 84% bệnh nhân NMO và 34% bệnh nhân RRMS có ON Đánh giá độ dày RNFL nhằm cung cấp thông tin có giá trị trong khi phân biệt MS, NMO và CRION được thực hiện, thị lực và độ dày RNFL ở mắt NMO và CRION kém hơn đáng kể so với RRMS, nhưng không có sự khác biệt giữa mắt NMO và CRION [25] Hiện nay, OCT được xem là một xét nghiệm có giá trị trong việc phân biệt NMO với MS và có thể được sử dụng làm thông số kết quả và theo dõi tiến triển của bệnh [25, 68]

1.1.2.2 Viêm tủy

Viêm tủy là một biểu hiện phổ biến của một số rối loạn thoái hóa myelin do viêm của CNS và thường là nguyên nhân chính gây ra các khuyết tật thần kinh khác nhau [15] Bất kỳ bệnh nhân nào có dấu hiệu lâm sàng tủy sống tiến triển cũng thường được cân nhắc về việc mắc viêm tủy Tùy thuộc vào nguyên nhân cơ bản, các đợt viêm tủy có thể tái phát, thường dẫn đến tổn thương tủy sống không hồi phục và tàn tật nghiêm trọng lâu dài

Viêm tủy thường được gọi trong y văn là “viêm tủy cắt ngang” (Transverse myelitis-TM) hoặc “viêm tủy ngang cấp tính”, có thể xuất hiện ở mọi lứa tuổi và xu hướng phụ thuộc vào nguyên nhân cơ bản của tổn thương [167] Tỷ lệ mắc viêm tủy ước tính lên tới 3/100.000 bệnh nhân mỗi năm (0,003%) Các biểu hiện lâm sàng của viêm tủy là hậu quả của rối loạn chức năng vận động và cảm giác Mặc dù hiếm gặp, viêm tủy có thể gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến thần kinh với tới 2/3 bệnh nhân bị tàn phế ở mức độ trung bình đến nặng [20] Ở mức độ trầm trọng nhất, 50% bệnh nhân bị liệt hoàn toàn (không cử động chân theo ý muốn), hầu như tất cả đều có rối loạn chức năng bàng quang ở một mức độ nào đó và 80-94% bị tê, dị cảm hoặc rối loạn cảm giác giống như dây đeo [165] Phần lớn bằng chứng cho

thấy sự thâm nhiễm tế bào lympho xâm nhập vào tủy sống gây một đợt bệnh có thể dẫn đến mất khả năng dẫn truyền tín hiệu, thoái hóa myelin, tổn thương sợi trục và tổn thương tế bào thần kinh Trong khi các trường hợp TM ở người trưởng thành liên quan đến sự thay đổi chất trắng ở tủy sống, thì bệnh nhân nhi ngày càng được xác định là có tổn thương chất trắng hỗn hợp và tế bào sừng trước đó [15, 167]

Các bệnh rối loạn thoái hóa myelin chính của CNS có thể gây viêm tủy sống thông qua các cơ chế gây bệnh khác nhau, dẫn đến ít nhiều phá vỡ tính toàn vẹn của tủy sống Khi viêm tủy xảy ra đơn lẻ, nó được coi là TM nguyên phát hoặc vô căn Tuy nhiên, ở một số bệnh nhân, TM có thể là một phần của ADEM (khi cả não và tủy sống đều bị ảnh hưởng) Nói chung, TM nguyên phát và ADEM được coi là các biến cố đơn phát (nhưng 25-33% là vô căn), trong khi các tình trạng khác thường tái phát (chiếm 70%, có thể xảy ra do tái phát ở bệnh nhân mắc NMO) [11, 17]Khoảng 5-10% bệnh nhân mắc bệnh TM có nguy cơ mắc MS khi mắc viêm tủy ngang cấp tính đây rất có thể là RRMS biểu hiện dưới dạng TM là triệu chứng đầu tiên [62, 89] Đối với ADEM, TM xảy ra khoảng ở 24% bệnh nhân, thường có tiên lượng tốt [154, 169] Ngược lại, TM liên quan đến NMO thường nghiêm trọng, mở rộng theo chiều dọc kéo dài trên 3 tín hiệu dây trở lên [31, 148]

ON và TM thường là các triệu chứng lâm sàng của NMO/NMOSD, nghiên cứu của Orman và cs (2017) cho thấy tăng cường các tổn thương não trong ON cấp tính và/hoặc viêm tủy kéo dài trên 3 đoạn đốt sống trở lên (Longitudinally extensive transverse myelitis-LETM) có thể báo hiệu tỷ lệ tái phát cao hơn trong NMOSD [31] Ở NMO, ON thường xảy ra trước viêm tủy trong 80% trường hợp và thường kéo dài dưới 3 tháng [73] Sự xuất hiện của ON và viêm tủy được nhắc đến xuyên suốt trong lịch sử phát triển chẩn đoán NMO/NMOSD Kể từ khi phát hiện ra kháng thể kháng AQP4 (AQP4-IgG), khái niệm chẩn đoán lâm sàng đã phát triển và mở rộng từ NMO (1999 và 2006) sang NMOSD (2007 và 2015), từ ON và viêm tủy cấp tính (Acute myelitis-AM) không có bệnh liên quan đến CNS nào khác (1999) đến ON và AM 2006) đến NMO hoặc ON hoặc LETM (2007) và cuối cùng đến một đặc điểm lâm sàng cốt lõi (ON hoặc viêm tủy cấp tính hoặc Brain Syn) trong NMOSD

có huyết thanh dương tính với AQP4-IgG hoặc có hai hoặc nhiều đặc điểm lâm sàng cốt lõi (một trong số chúng phải là ON hoặc AM hoặc Hội chứng postrema vùng) trong NMOSD có huyết thanh âm tính với AQP4-IgG (2015) [86] (Hình 1)

Hình 1: Lịch sử các tiêu chuẩn chẩn đoán NMO và NMOSD [86]

Hiện nay, tiêu chí của Hội đồng quốc tế về chẩn đoán NMO (IPND) năm 2015 được đánh giá phản ánh tốt phổ lâm sàng rộng hơn của NMOSD và cải thiện rõ rệt hiệu quả chẩn đoán so với các tiêu chí trước đó, ngay cả ở những bệnh nhân không rõ tình trạng AQP4-IgG, tăng tỷ lệ chẩn đoán NMOSD lên 76% [84] (Phụ lục 1) Tuy nhiên, chẩn đoán sai hoặc NMOSD vẫn còn là một vấn đề trong thực hành lâm sàng và có ý nghĩa quan trọng đối với bệnh nhân Chẩn đoán không chính xác là do biểu hiện không điển hình hoặc giả bệnh, mặc khác, các biến số như giới tính, tuổi khởi phát và chẩn đoán cũng có thể có ảnh hưởng [4] Do đó, dữ liệu về bệnh cần được cập nhập thường xuyên song song với tìm kiếm các chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán bệnh chính xác là cần thiết

Tóm lại, việc điều trị bệnh tự miễn thoái hóa myelin ở CNS nói chung và các bệnh ADEM và NMO nói riêng còn chưa thực sự hiệu quả khi tỷ lệ tái phát bệnh còn rất cao (Bảng 2) Nguyên nhân là do những hiểu biết còn hạn chế về cơ chế sinh

bệnh của chúng và chưa tìm kiếm được chỉ thị sinh học thực sự đặc trưng cho bệnh Việc tìm và phân tích sự biểu hiện của các chỉ thị sinh học mang lại cơ hội xác định chỉ thị đặc hiệu cho bệnh và mở ra khả năng xác định các tác nhân gây bệnh nếu các tác nhân đó được biểu hiện, cung cấp thông tin quan trọng để giải mã cơ chế bệnh sinh của chúng

Bảng 2: Các đặc điểm khác biệt giữa ADEM và NMO

Khởi phát và diễn biến lâm sàng Đơn phát (75-82%)

 Tái phát (18-25%)

Đa pha

 Đơn phát (~20%)  Tái phát (~80%)

Tỷ lệ lưu hành (trên 100.000 người/ năm)

Chưa có thông tin 0,053-0,40

khi lớn theo chiều dọc

Mở rộng theo chiều dọc

1.2 Dấu ấn sinh học phân tử trong bệnh lý tổn thương tủy sống do thoái hóa myelin

Nghiên cứu về dấu ấn sinh học đã nổi lên như một lĩnh vực nghiên cứu đặc biệt do các ứng dụng tiềm năng của chúng trong thực hành lâm sàng liên quan đến chẩn đoán và đánh giá tiên lượng bệnh [78] Hiện nay cả ADEM và NMO đều chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh rõ ràng nên việc chẩn đoán phân biệt chính xác từng bệnh vô cùng khó khăn cho cả các bác sĩ cũng như các nhà nghiên cứu Một số xét nghiệm sinh học phân tử đã được đưa ra sử dụng tại các bệnh viện nhằm hỗ trợ chẩn đoán bệnh Nếu DNA với vai trò là chất đánh dấu phân tử, việc xử lý ít đòi hỏi cũng như việc phát hiện dễ dàng và ít tốn kém hơn thì RNA và protein là những vật chất di truyền có tính định lượng, phù hợp để theo dõi các quá trình cụ thể của bệnh Trong lĩnh vực các bệnh viêm đặc trưng bởi sự thiếu hụt thần kinh khởi phát cấp tính liên quan đến sự thoái hóa myelin của CNS gây tổn thương tủy sống, các dấu ấn sinh học phân tử được nhắc đến hiện nay đều là protein, hầu hết là kháng thể [75]

1.2.1 Chuỗi nhẹ tự do Kappa

Oligoclonal bands (OCBs) là dải các kháng thể Ig được tạo ra bởi các tế bào B khác nhau được kích hoạt chủ yếu ở CNS, chứa nhiều đột biến soma, được cho là để đáp ứng với sự kích thích kháng nguyên kéo dài, sự có mặt của OCBs trong dịch não tủy (Cerebrospinal fluid-CSF) là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán MS [113].Việc phát hiện chuỗi nhẹ tự do Kappa (kappa free light chain-κ-FLC) được cho là có những lợi thế đáng kể về mặt phương pháp so với phát hiện OCBs và xét nghiệm κ-FLC có thể hỗ trợ hoặc thậm chí thay thế thử nghiệm OCBs trong CSF trong tương lai do tính khả thi của phương pháp [41] (Bảng 3)

Bảng 3: So sánh việc xác định κ-FLC và OCBs trong CSF

 Phát hiện sự tổng hợp IgG nội sọ

Phương pháp dễ dàng và nhanh chóng Phương pháp tốn thời gian và đòi hỏi kỹ

thuật Hiệu quả về lao động và chi phí Tốn nhiều công sức và chi phí Kết quả định lượng Kết quả định tính

Việc diễn giải kết quả không phụ thuộc vào người đánh giá

Việc giải thích kết quả phụ thuộc vào người đánh giá

Không phân biệt giữa IgG khác nhau và các kiểu tổng hợp IgG riêng biệt

Phát hiện IgG khác nhau trong CSF và huyết thanh (poly, oligo-, monoclonal), phân biệt 2 dạng IgG trong tủy sống

Tế bào B sản xuất Immunoglobulin (Ig) nguyên vẹn bằng cách kết hợp chuỗi nặng và chuỗi nhẹ thông qua liên kết disulfide và tương tác không cộng hóa trị, bên cạnh đó tạo ra chuỗi nhẹ với tỷ lệ khoảng 10-40% so với chuỗi nặng và tiết ra chúng dưới dạng tự do Các nghiên cứu về chức năng sinh học của chuỗi nhẹ tự do (Free light chains-FLC) đã chứng minh các hoạt động sinh học khác nhau của các protein này, bao gồm khả năng điều chỉnh hệ thống miễn dịch, hoạt động phân giải protein cũng như liên kết FLC với kháng nguyên [91, 116] FLC trong huyết thanh chủ yếu được đào thải qua thận, trừ những trường hợp gặp bất thường Do đó, việc phát hiện và định lượng FLC kết hợp với chức năng hàng rào máu não (Blood brain barrier-

BBB) có thể phản ánh sự tổng hợp Ig nội mô, và thông số này có thể được sử dụng trong chẩn đoán và tiên lượng các bệnh do viêm trong CSF [162] Năm 2020, nghiên cứu của Süße và cs chỉ ra rằng tổng lượng κ-FLC trong vỏ não có thể phân biệt viêm tủy liên quan đến MS với viêm tủy liên quan đến NMOSD với độ nhạy 88,5% và độ đặc hiệu 88,9% [117] Năm 2023, các phát hiện cho thấy chỉ số κ‑FLC có độ nhạy chẩn đoán nằm trong khoảng 52-100% (trung bình có trọng số: 88%), độ đặc hiệu chẩn đoán dao động trong khoảng 69-100% (trung bình có trọng số: 89%) trong MS và chỉ số κ-FLC có độ chính xác trong chẩn đoán ở MS tương tự như OCB [54, 95] Các nghiên cứu gần đây cho thấy κ-FLC tương quan chặt chẽ với sự hiện diện của OCBs và nhận diện chúng có thể sử dụng để chẩn đoán MS, tuy nhiên cho đến hiện nay chưa có nghiên nào sử dụng κ-FLC để phân biệt bệnh nhân MS và ADEM

1.2.2 Kháng thể kháng Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein

Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) là một loại protein xuyên màng có độ bảo thủ cao, khối lượng phân tử 28 kDa, chiếm khoảng 0,05% tổng lượng protein myelin [151] Trình tự axit amin của MOG được bảo thủ cao ở các loài động vật (>90%), cho thấy chúng có thể có chức năng sinh học quan trọng đối với cơ thể [160] Trong CNS, MOG được biểu hiện dưới dạng homodimer trên bề mặt của các tế bào thần kinh đệm ít gai (oligodendrocytes cells), các tế bào thần kinh đệm hình thành myelin (myelin-forming glial cells) và nằm ngoài cùng của vỏ myelin quấn quanh sợi trục, hình thành một lớp bảo vệ cần thiết cho sự dẫn truyền xung nhanh, ổn định vi ống, có chức năng thụ thể và là dấu hiệu của tế bào gai trưởng thành [118, 160] Sự biểu hiện muộn của MOG trong quá trình phát triển tương quan với các giai đoạn sau của quá trình tạo myelin, cho thấy MOG có vai trò trong việc hoàn thiện, nén và/hoặc duy trì myelin, ngoài ra, MOG cũng có thể có chức năng liên quan đến miễn dịch vì nó liên kết với C1q và do đó có thể điều hoà con đường bổ thể cơ bản [133, 160] Hiện nay, chức năng sinh học chính xác của MOG vẫn chưa được biết hoàn toàn nhưng người ta quan sát được rằng protein MOG hoạt

phản ứng do viêm [118, 160] Việc xuất hiện kháng thể kháng MOG có nguồn gốc từ phân nhóm immunoglobulin-G (MOG-IgG) có phải là chìa khóa kích hoạt quá trình này hay không vẫn đang còn tranh cãi

Trong vài năm qua, hội chứng thoái hóa myelin mắc phải của CNS liên quan đến MOG-IgG đã phát triển thành một thể bệnh viêm mới khác biệt với MS và NMOSD Hiểu biết về vai trò sinh học và các dạng đồng phân của MOG-IgG còn hạn chế, chúng được tổng hợp bên ngoài CNS, xâm nhập qua BBB gây thoái hóa myelin nhưng cơ chế còn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên, khả năng gây bệnh liên quan đến phản ứng miễn dịch thoái hóa myelin đã được chứng minh trong nhiều mô hình thử nghiệm trước đây (Hình 2) Vì lý do này, MOG-IgG đã được nghiên cứu suốt thời gian qua ở các hội chứng thoái hóa myelin mắc phải [37, 53]

Hình 2: Cơ chế gây bệnh của MOG-IgG trong CNS [37]

MOG-IgG được tìm thấy trong các bệnh MS, ADEM, NMOSD, ON và TM ở cả người lớn và trẻ em Phản ứng miễn dịch liên quan đến MOG-IgG hiếm khi được thấy ở MS [131] MOG-IgG đã được xác định ở khoảng 5% bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh MS không điển hình có các cơn viêm tủy nặng, ON và/hoặc hội chứng thân não nghiêm trọng, không sử dụng được một số loại thuốc điều trị bệnh [115] Đối với NMO, khoảng 21% bệnh nhân được chẩn đoán NMO có huyết

tương âm tính với AQP4-IgG và dương tính với MOG-IgG Kiểu hình của bệnh nhân NMO dương tính với MOG-IgG phù hợp với chẩn đoán NMO nhưng có một số khác biệt so với kiểu hình của bệnh nhân dương tính với AQP4-IgG như tuổi trẻ hơn, ít gặp hơn ở nữ và ít có khả năng bị tái phát hơn, vì vậy, MOG-IgG vẫn chưa được áp dụng trong tiêu chí chẩn đoán năm 2015 cho NMO như AQP4-IgG [80] Trên thực tế, ON là kiểu hình lâm sàng thường gặp nhất ở bệnh nhân lớn tuổi Trong hai thử nghiệm lâm sàng lớn nhất được thực hiện ở Pháp và Anh, khoảng 44-60% bệnh nhân ON có mang MOG-IgG Các trường hợp trẻ thường phát triển ON một bên, trong khi ở những bệnh nhân khởi phát bệnh muộn cả hai dây thần kinh thị giác đều bị viêm Hầu hết bệnh nhân bị ON liên quan đến MOG-IgG đều biểu hiện tình trạng mất thị lực nghiêm trọng kèm theo đau mắt ngay từ đầu Mặc khác, TM là biểu hiện ban đầu của bệnh liên quan với MOG-IgG ở khoảng 20% bệnh nhân, nhưng sự kết hợp giữa TM và ON xảy ra ở thêm 8 đến 15% ca mắc [80, 110]

1.2.3 Kháng thể kháng Aquaporin-4

Aquaporin-4 (AQP4) là protein vận chuyển nước xuyên màng chiếm tỷ trọng lớn nhất trong não, tủy sống và dây thần kinh thị giác, đồng thời kiểm soát cân bằng nội môi nước ở cơ quan này Ở dạng monomer AQP4 có khối lượng ~30 kDa, tồn tại dưới dạng tetramer trong màng sinh chất [64] AQP4 có nhiều nhất trong tế bào hình sao và biểu hiện cao nhất ở chân cuối của tế bào hình sao quanh mạch máu CNS Do biểu hiện đặc biệt cao ở BBB và hàng rào CSF, AQP4 kiểm soát trao đổi chất lỏng hai chiều [39]

AQP4-IgG thường được biết đến là tự kháng thể có nguồn gốc từ bên ngoài, xâm nhập vào CNS thông qua BBB, sau đó liên kết có chọn lọc với AQP4-một protein màng tạo thành kênh dẫn nước chính trong CNS Sự tương tác này dẫn đến việc khi AQP4 bề mặt giảm biểu hiện, nó sẽ làm xáo trộn tính ổn định đồng nhất của nước, gây tăng tính thấm BBB và sự xâm nhập của bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu ái toan và bạch cầu trung tính vào trong CSF khiến quá trình bệnh xấu đi Sự kết hợp giữa tổn thương qua trung gian bổ thể và dòng tế bào đi vào CSF, dẫn đến

cái chết của tế bào hình sao, tế bào thần kinh đệm và các tế bào thần kinh khác [37] (Hình 3) Tuy nhiên, Bennett và cs (2009) phát hiện ra rằng tương bào CD138+ có trong CSF trong các trường hợp NMO sớm có khả năng tổng hợp AQP4-IgG và đây có thể là nguồn chính để sản xuất AQP4-IgG trong vỏ não Do đó, AQP4-IgG có trong vỏ não khi bắt đầu bệnh và trực tiếp dẫn đến hình thành tổn thương trong CNS [67] Điều này cho thấy vai trò của AQP4-IgG trong sinh bệnh học NMO cần phải nghiên cứu thêm

Hình 3: Cơ chế gây bệnh của AQP4-IgG trong CNS [37]

AQP4-IgG còn được gọi là NMO-IgG là một dấu ấn sinh học cụ thể của bệnh NMO, đặc trưng bởi độ nhạy 94% và độ đặc hiệu 96% đối với NMO khi quan sát trên 129 bệnh nhân mắc MS và NMO [10] Tuy nhiên, độ nhạy phụ thuộc vào phương pháp phân tích được sử dụng để phát hiện AQP4-IgG và cao nhất đối với các xét nghiệm huyết thanh học dựa trên tế bào (Cell-Based Assays-CBA) Đây được xem là xét nghiệm hữu ích nhất để chẩn đoán NMO do có khoảng 73-90% bệnh nhân NMO dương tính với AQP4-IgG, nhưng các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng khoảng 10-40% các trường hợp AQP4-IgG không được phát hiện gây ra sự không chắc chắn trong chẩn đoán bệnh NMO [66, 148] Bên cạnh NMO, AQP4-IgG còn được tìm thấy ở 4,3% ở bệnh nhân mắc MS, 30,8% ở bệnh nhân mắc ON và 51,7% ở bệnh nhân mắc LETM [171] Ở ON tái phát và LETM tái phát, tự kháng

thể này cũng có tần suất xuất hiện cao lần lượt là 25% và 52% nhưng hiếm khi gặp ở những bệnh nhân bị viêm tủy cắt ngang một phần cấp tính [159] Riêng ADEM có tỷ lệ AQP4-IgG dương tính rất thấp và gần như không có [171]

Như vậy, mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến ADEM và NMO cũng như các chỉ thị sinh học bệnh của chúng, nhưng do sự khác biệt về phương pháp, mục đích và đối tượng thực nghiệm, dẫn các nghiên cứu khác nhau thường không đưa ra kết quả thống nhất, do đó cần phải nghiên cứu thêm

1.3 Vai trò của tế bào T, tế bào B, HLA lớp II và epitope trong bệnh tủy sống do thoái hóa myelin

1.3.1 Vai trò của tế bào T và tế bào B trong bệnh tự miễn

Các bệnh tự miễn xảy ra khi cơ chế tự dung nạp của cơ thể bị phá vỡ do ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và môi trường [138] Các tế bào T và tế bào B tham gia vào phản ứng miễn dịch đặc hiệu vì chúng là những tế bào duy nhất trong cơ thể có khả năng nhận biết và phản ứng cụ thể với từng epitope kháng nguyên Tế bào B có khả năng biến đổi thành tương bào và chịu trách nhiệm sản xuất kháng thể Do đó, khả năng miễn dịch dịch thể phụ thuộc vào tế bào B trong khi khả năng miễn dịch tế bào phụ thuộc vào tế bào T Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với những kiến thức mới về đáp ứng miễn dịch, người ta nhận ra rằng tế bào T tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng miễn dịch tế bào B thích ứng và tế bào B đóng vai trò tương hỗ trong quá trình kích hoạt tế bào T CD4+ trong các bệnh tự miễn [8]

Kích hoạt phản ứng miễn dịch chống lại các tự kháng nguyên khi có sự tương đồng về mặt kháng nguyên giữa mầm bệnh ngoại lai và tự peptide được xem là cơ chế gây bệnh tự miễn [100] Phản ứng miễn dịch chống lại các tự kháng nguyên xảy ra khi gặp mầm bệnh có sự tương đồng về cấu trúc và trình tự với các tự kháng nguyên, cũng có thể do sự hình thành các epitope mới thông qua tổn thương mô Tổn thương mô có thể góp phần vào sự phát triển của các tế bào T tự phản ứng bằng cách trình diện các tự epitope [50, 83]

kích hoạt phản ứng tự miễn dịch [106] Các alen kháng nguyên bạch cầu người (Human leukocyte antigen-HLA) mã hóa các biến thể trong các rãnh liên kết peptide của phân tử HLA, xác định ái lực liên kết của chúng với các kháng nguyên cụ thể được trình diện cho các tế bào T trợ giúp (helper T cells-Th) Việc trình diện kháng nguyên thông qua các phân tử HLA lớp II trên các tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào APC) dẫn đến kích hoạt các tế bào Th tự phản ứng, từ đó kích hoạt tế bào B hình thành tự kháng thể và cảm ứng tự miễn dịch [76]

Tế bào B không chỉ tạo ra các tự kháng thể, trên thực tế, tế bào B có thể điều khiển khả năng tự miễn dịch dưới dạng APC vì chúng có thể liên kết các protein tự thân thông qua thụ thể tế bào B (B cell receptor-BCR), xử lý và trình diện chúng cho tế bào T [6] Khả năng này của tế bào B cho phép tế bào B hoạt động như các APC mạnh ở nồng độ protein rất thấp, thấp hơn 10-100 lần để kích thích tế bào T [40, 146, 164]

Bằng cách mở rộng epitope (epitope spreading), tế bào B khuếch đại phản ứng tự miễn dịch Tế bào B liên kết với một epitope cụ thể trong kháng nguyên thông qua BCR Sau lần nhận biết ban đầu, protein hay thậm chí cả phức hợp protein có thể được nội hóa và xử lý để trình diện kháng nguyên Tuy nhiên, protein này chứa một số epitope khác ngoài epitope được BCR liên kết ban đầu và khớp với các rãnh liên kết của phân tử HLA lớp II trên tế bào B Kết quả là các tế bào B có thể trình diện không chỉ epitope ban đầu mà còn cả các epitope khác của cùng một protein hoặc phức hợp protein với tế bào T, từ đó kích hoạt các đặc tính khác nhau của tế bào T [50] Hiện tượng này, được gọi là sự mở rộng epitope, cho phép các tự kháng nguyên vốn không phải là mục tiêu ban đầu của các tế bào lympho tự phản ứng khi bắt đầu quá trình tự miễn dịch trở thành kháng nguyên ở các giai đoạn sau Điều này được mô tả ở hầu hết các bệnh miễn dịch và thường liên quan đến sự tiến triển của bệnh [83]

1.3.2 Mối liên quan giữa HLA-DRB1*15:01 với ADEM và NMO

Di truyền có thể đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các

bệnh thần kinh tự miễn liên quan đến kháng thể HLA là yếu tố di truyền chính liên quan đến các bệnh tự miễn, chiếm một nửa khuynh hướng di truyền đã biết [101] Liên quan đến HLA-DRB1*15:01, alen này được chỉ ra là yếu tố nhạy cảm di truyền đối với bệnh ADEM và NMO

HLA-DRB1*15:01 làm tăng nguy cơ mắc bệnh ở ADEM Theo Hyun và cs (2004), tần suất HLA-DRB1*15:01 (40%) tăng đáng kể ở trẻ em Hàn Quốc mắc ADEM so với nhóm đối chứng [52] Tương tự, Soniza và cs (2009) nhận thấy tần suất xuất hiện HLA DRB1*15:01 ở bệnh nhân Brazil mắc ADEM đơn pha cao hơn

so với nhóm đối chứng (36,3% so với 13,0 %, P= 0,04) [155] Trái ngược với

ADEM, DRB1*15:01 đóng vai trò bảo vệ ở NMO Tần suất nhóm alen

HLA-DRB1*15 ở bệnh nhân NMO thấp đáng kể so với bệnh nhân MS (P= 0,0001), cho

thấy rằng dấu hiệu này có thể giúp NMO chống lại khuynh hướng phát triển thành MS [1] Năm 2010, Marcelo và cs một lần nữa chứng minh MS và NMO có mối liên hệ khác nhau với HLA-DRB1*15:01 và vai trò bảo vệ của HLA-DRB1*15:01 lại được khẳng định [109] Hiện nay, các nguyên cứu về HLA-DRB1*15:01 trên đối tượng mắc ADEM và NMO tuy chưa nhiều nhưng phần nào thể hiện được khả năng dự đoán nguy cơ mắc các bệnh của HLA-DRB1*15:01

1.3.3 Vai trò của epitope và nghiên cứu tin sinh học trong tìm hiểu cơ chế bệnh tự miễn

Tương tác phân tử đóng vai trò linh hoạt trong nhiều quá trình tế bào bằng cách điều chỉnh và điều phối các sự kiện sinh học Protein thường sử dụng các mạng tương tác phức tạp để thực hiện chức năng, do đó bắt buộc phải đánh giá các tương tác như vậy để làm sáng tỏ tầm quan trọng của chúng ở cả cấp độ tế bào và sinh vật Các cơ chế bệnh sinh phụ thuộc vào các quá trình nhận biết và tương tác sinh học, đặc biệt là những cơ chế liên quan đến phản ứng miễn dịch như trình diện kháng nguyên và liên kết kháng nguyên-kháng thể, trong đó, kháng thể là các protein có tính chuyên biệt cao, có khả năng nhận biết các kiểu cấu trúc hóa học của các yếu tố lạ-được gọi là kháng nguyên [61]

Epitope là một yếu tố quyết định kháng nguyên, hoặc một vị trí trên bề mặt của phân tử kháng nguyên, nơi một kháng thể đơn lẻ liên kết Năm 2014, Pisani và cs đã chứng minh đột biến của aspartate ở vị trí 69 (D69) làm suy yếu sự liên kết giữa AQP4 và AQP4-IgG khiến chức năng kênh nước không bị thay đổi cũng như sự hình thành các OAP (Orthogonal arrays of particles) Việc thay thế D69 bằng histidine là nguyên nhân làm tăng tính di động của vòng A, do đó làm gián đoạn hình dạng các epitope [46] Năm 2019, Ierich và cs chỉ ra rằng các epitope trên MOG liên quan đến sự thoái hóa myelin [63] Bên cạnh đó, sự thoái hóa myelin được cho là có liên quan đến sự hình thành phân tử phức hợp của thụ thể tế bào T (T cell receptor-TCR), tự kháng nguyên và kháng nguyên HLA trong khi những thay đổi về acid amin trong epitope chung đã được công nhận là để phân biệt các alen nhạy cảm với các alen bảo vệ [19, 106, 125] Điều này chứng tỏ epitope đóng vai trò mật thiết trong việc mô tả đặc tính của tự kháng nguyên và quá trình trình diện kháng nguyên

Mặc dù các epitope có khả năng phân biệt các alen HLA nhưng cho đến nay có rất ít có nghiên cứu nào báo cáo về khả năng của các epitope MOG/AQP4 liên kết với HLA-DRB1*15:01 và kích hoạt tế bào CD4+ được công bố Các nghiên cứu

in Silico được thực hiện để dự đoán các epitope có thể kích hoạt cả phản ứng tế bào

T và tế bào B [70] Tin học miễn dịch là một nhánh của tin sinh học trong đó mối quan hệ giữa phản ứng miễn dịch và các epitope dự đoán được nghiên cứu [88] Sự phát triển nhanh chóng của tin học miễn dịch được đặc trưng bởi việc tạo ra các công cụ dùng để dự đoán các epitope được tế bào T và tế bào B nhận biết cũng như

cho các phản ứng kháng nguyên [70] Ứng dụng nghiên cứu in Silico làm giảm

thiểu chi phí sử dụng tài nguyên, thời gian thực nghiệm và giải quyết vấn đề y đức vì việc sàng lọc ảo đã được diễn ra nhằm tăng hiệu quả tìm kiếm epitope tiềm năng

Các epitope tế bào T thường là các peptide có nguồn gốc từ protein kháng nguyên được trình diện bởi các phân tử phức hệ hòa hợp tổ chức chủ yếu (major histocompatibility complex-MHC) trên các APC và được các TCR nhận biết [140] Dự đoán epitope tế bào T nhằm mục đích xác định các peptide ngắn nhất trong một

kháng nguyên có khả năng kích thích tế bào T CD4 hoặc CD8 [90] Khả năng kích thích tế bào T này được gọi là khả năng sinh miễn dịch và được xác nhận trong các xét nghiệm yêu cầu peptide tổng hợp có nguồn gốc từ kháng nguyên [140] Có nhiều peptide riêng biệt trong các kháng nguyên và các phương pháp dự đoán tế bào T nhằm mục đích xác định những peptide có khả năng gây miễn dịch Khả năng miễn dịch của epitope tế bào T phụ thuộc vào ba bước cơ bản: (i) xử lý kháng nguyên, (ii) liên kết peptide với các phân tử MHC và (iii) nhận biết bởi TCR cùng nguồn gốc Trong 3 bước này, liên kết MHC-peptide là bước có tính chọn lọc nhất nên thường được nghiên cứu

Các epitope của tế bào B là các peptide hoặc acid amin bề mặt protein kháng nguyên liên kết với kháng thể [140] Dự đoán epitope tế bào B nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu chức năng cấu trúc Bất kỳ vùng tiếp xúc với dung môi nào trong kháng nguyên đều có thể được kháng thể nhận biết Tuy nhiên, các epitope tế bào B có thể được chia thành hai nhóm chính là các epitope tế bào B liên tục (Linear B-cell epitopes) bao gồm các gốc acid amin nối tiếp nhau-các peptide (chiếm rất ít) và các epitope tế bào B không liên tục (Discontinuous B-cell epitopes) bao gồm các mảng nguyên tử tiếp xúc với dung môi từ các gốc, không nhất thiết phải tuần tự (chiếm 90%) Các kháng thể nhận biết các epitope tế bào B liên tục có thể nhận ra các kháng nguyên bị biến tính, trong khi biến tính kháng nguyên dẫn đến mất khả năng nhận biết các epitope tế bào B không liên tục [103] Vì vậy, việc xác định các epitope của tế bào T và tế bào B và đánh giá khả năng tương tác giữa chúng với phân tử HLA-DRB1*15:01 là cần thiết nhằm tìm hiểu cơ chế hoạt động trong hệ thống miễn dịch ở bệnh nhân mắc bệnh tự miễn liên quan đến MOG và AQP4

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 195 mẫu huyết tương và/ hoặc CSF của bệnh nhân nghi ngờ mắc ADEM, NMO, ON và viêm tủy theo chẩn đoán của bác sĩ, được cung cấp Khoa nội tổng hợp, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội (Phụ lục 2)

Mẫu máu được đựng trong ống nghiệm chống đông bằng EDTA, mẫu CSF được đựng trong ống nghiệm chuyên dụng, được vận chuyển về ở điều kiện lạnh (2-8oC) Mẫu máu sau đó được để lắng tự nhiên và tách huyết tương, mẫu CSF không được xử lý thêm Tiếp đến, cả hai loại mẫu đều được bảo quản tủ lạnh -25oC cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 4 theo hãng cung cấp:

Bảng 4: Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Western Blot

- ProteoPrep®Immunoaffinity Albumin & IgG

- Clarity™ Western ECL Substrate - Bio-Rad, Mỹ - Ig κ light chain Antibody (2G5-14)

- Santa Cruz Biotechnology, Mỹ - m-IgGκ BP-HRP

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

- Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) IIFT

- EUROIMMUN, Đức - Anti-Aquaporin-4 IIFT

Ngoài ra, các hóa chất khác như, Tris-base, EDTA, ethanol, sodium acetate, được sử dụng đều đạt độ sạch phân tích dùng trong sinh học phân tử

2.1.3 Máy móc và trang thiết bị

Các máy móc và thiết bị phục vụ chính trong quá trình nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc được thống kê trong Bảng 5

Bảng 5: Máy móc và thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu

1 Tủ lạnh -25oC và -80oC

- Nuaire, Mỹ

2 Tủ an toàn sinh học

4 PowerPac™ Basic Power Supply

- Bio-Rad, Mỹ

5 Mini-Protean II Cell Gel System 6 ChemiDoc Imaging Systems 7 Kính hiển vi soi ngược huỳnh quang Axio Observer 7 kèm

Apotome 2

(Thuộc Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa sinh học, Trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)

- ZEISS, Đức

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách huyết tương từ mẫu máu toàn phần

Ngay sau khi lấy mẫu máu toàn phần, chúng được chuyển vào ống có chứa chất chống đông máu EDTA Đảo ngược các ống để trộn đều mẫu với chất chống đông máu và đưa về phòng thí nghiệm Tách huyết tương từ mẫu máu toàn phần trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy mẫu

Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm được để lắng tự nhiên, cột máu được chia thành 3 lớp dịch thể: Phần màu đỏ nằm ở đáy ống nghiệm, chiếm khoảng 40-45% thể tích máu toàn phần là hồng cầu; phần màu trắng ở giữa chiếm thành phần rất

nhỏ là bạch cầu và tiểu cầu; và phần màu vàng nhạt trên cùng chiếm 55-60% thể tích máu toàn phần là huyết tương

Thu huyết tương và chuyển sang ống Eppendorf 1.5mL (BioBasic, Canada), thao tác cẩn thận để không chuyển hồng cầu cùng với huyết tương Ly tâm mẫu huyết tương vừa thu được ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng và lặp lại bước thu huyết tương nhằm đảm bảo mẫu không chứa hồng cầu

Để đảm bảo mẫu huyết tương thu được đủ điều kiện để làm các thí nghiệm tiếp theo, chúng được dán nhãn rõ ràng với thông tin nhận dạng cụ thể để phân biệt Huyết tương được tách ra khỏi tế bào, các mẫu huyết tương phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC nếu chưa sử dụng ngay

2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Trong các phương pháp định lượng protein, phương pháp Bradford đã trở thành phương pháp chuẩn được sử dụng thường quy ở nhiều phòng thí nghiệm Sự liên kết giữa chất màu Coomassie blue G-250 với các gốc lysine và arginine của protein là cơ sở của phương pháp này Chất màu tự do có thể tồn tại dưới các dạng ion khác nhau, trong đó, chất màu chiếm ưu thế trong dung dịch phản ứng có tính acid thuộc dạng ion tích điện dương, màu đỏ và màu xanh lá cây với sự hấp thụ cực đại tương ứng ở bước sóng 470 nm và 650 nm Chất màu dạng ion tích điện âm, màu xanh nước biển là loại liên kết với protein có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 590 nm Vì vậy, việc định lượng protein có thể được thực hiện bằng cách đo lượng chất màu dạng màu xanh thông qua đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 595 nm

2.2.3 Xác định chuỗi nhẽ tự do kappa bằng phương pháp Western Blot

Để xác định κ-FLC bằng phương pháp WB, mẫu huyết tương được pha loãng với NaCl 0,9% với tỷ lệ 1:80, mẫu CSF không pha loãng Ủ mẫu sau khi chuẩn bị với đệm SB5X có DTT (6M Urea; 2M Thiourea; 1mM DTT; 10% Glycerol; 2% CHAPS; 0,2% Biolyte Ampholytes; 0,4% Bromophenol blue) hoặc đệm SB5X không DTT (6M Urea; 2M Thiourea; 10% Glycerol; 2% CHAPS; 0,2% Biolyte Ampholytes; 0,4% Bromophenol blue) và SB5X không có DTT trong 30

phút ở nhiệt độ thường Điện di trên gel polyacrylamide 10% và chuyển protein lên màng nitrocellulose bằng hệ thống Turbo Trans Blot (Biorad, Mỹ) Sau đó, màng được ủ với Ig κ light chain Antibody (2G5-14) với tỷ lệ 1:200 ở 4oC qua đêm Rửa và tiếp tục ủ màng với m-IgGκ BP-HRP với tỷ lệ 1:10000 ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Rửa, tiếp theo, cơ chất Clarity™ Western ECL Substrate (Biorad, Mỹ) được

nhỏ đều lên màng Tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận bằng thiết bị ChemiDoc

(Biorad-Mỹ) Kết quả được phân tích bằng phần mềm FIJI ImageJ [82]

2.2.4 Xác định kháng thể kháng MOG và AQP4 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Sự có mặt của các kháng thể kháng MOG và AQP4 trong huyết tương của bệnh nhân nghi ngờ mắc MS, ADEM hoặc NMO được xác định bằng bộ kit Anti-Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) IIFT và Anti-Aquaporin-4 IIFT (EUROIMMUN, Đức) Cả hai bộ kit đều dựa trên tế bào kết hợp với nguyên lý miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunofluorescence Test-IIFT) giúp định tính hoặc bán định lượng các tự kháng thể có trong mẫu bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao (Bảng 6)

Bảng 6: Độ nhạy và độ đặc hiệu của kit

Tên bộ kit

(1) : Kit Anti-Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) IIFT (EUROIMMUN, Đức)

(2) : Kit Anti-Aquaporin-4 IIFT (EUROIMMUN, Đức)

Nguyên lý của phương pháp IIFT được thể hiện trong kit như sau: Bằng cách sử dụng hai kháng nguyên đã biết là MOG và AQP4 được biểu hiện trên các tế bào nằm trên các BIOCHIP cố định, nếu trong huyết tương của người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì phức hợp kháng nguyên và kháng thể sẽ hình

thành Sau đó kháng thể thứ cấp được đánh dấu huỳnh quang được đưa vào để liên kết với phức hợp kháng thể vừa được tạo ra Sự phát huỳnh quang được quan sát bằng Kính hiển vi soi ngược huỳnh quang Axio Observer 7 kèm Apotome 2 (Zeiss, Đức) ở vật kính 40X (Hình 4)

Hình 4: Nguyên lý phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể nhằm phát hiện

kháng thể kháng MOG/AQP4 bằng phương pháp IIFT

Các bước thực hiện quy trình xét nghiệm được tiến hành theo đúng hướng dẫn sử dụng của kit [13] Đối với thí nghiệm này, mẫu dương tính khi quan sát dưới kính hiển vi, chúng phát ra các mảng huỳnh quang màu xanh lá cây xung quanh màng tế bào và mẫu âm tính sẽ không lên màu huỳnh quang đặc trưng này (Hình 5)

Hình 5: Kết quả dương tính và âm tính khi được quan sát dưới kính hiển vi

((+): Kết quả dương tính; (-): Kết quả âm tính; Tế bào phát huỳnh quang màu xanh lá cây là tế bào biểu hiện MOG/AQP4, phát quang khi mẫu chứa MOG-IgG/AQP4-IgG)

2.2.5 Phân tích số liệu và xử lý thống kê

Sự khác biệt về tần suất xuất hiện của MOG-IgG và AQP4-IgG được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phần mềm Graphpad Prism phiên bản 8.4.2 dành cho Windows (GraphPad Software, San Diego, California, Mỹ) Các biến định lượng tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn và được so sánh bằng kiểm định T test Ngược lại, kiểm định Mann-Whitney U test được sử dụng nếu dữ liệu không tuân theo phân phối chuẩn Đối với các biến định tính, so sánh thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng Fisher’s Exact test đối với

tần suất của các mẫu quan sát nhỏ Giá trị P nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa

thống kê

2.2.6 Lập danh sách các epitope tiềm năng của tự kháng nguyên

MOG/AQP4 ở bệnh thoái hóa myelin do viêm bằng phương pháp in silico

Với mục tiêu dự đoán epitope tiềm năng của MOG/AQP4 trong bệnh tủy sống do thoái hóa myelin, chúng tôi tiến hành các bước thực hiện được thể hiện trong sơ đồ thí nghiệm ở Hình 6 Trong nghiên cứu này chúng tôi dự đoán cả epitope tế bào T và epitope tế bào B, thông tin các phần mềm chính đã sử dụng được trình bày trong Phụ lục 3

Hình 6: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm

2.2.6.1 Dự đoán epitope

Trình tự dưới dạng FASTA của MOG (AlphaFold DB ID: AF_AFQ16653F1) và AQP4 (PDB ID: 3GD8) lần lượt được lấy từ AlphaFold DB (https://alphafold.ebi.ac.uk/) và Ngân hàng Dữ liệu Protein (https://www.rcsb.org/) [57, 119]

2.2.6.1.1 Dự đoán epitope tế bào T CD4+

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp dự đoán peptide liên kết MHC cụ thể để xác định epitope tế bào T Để dự đoán các epitope tiềm năng MHC lớp II, chúng tôi đã sử dụng các công cụ dự đoán MHC II từ IEDB để tính toán các giá trị nồng độ ức chế tối đa 50% (IC 50) đối với các peptide liên kết với phân tử HLA cụ thể (http://tools.iedb.org/mhcii/) [111] Trong nghiên cứu này, HLA-DRB1*15:01 được lựa chọn cho phân tích tương tác với các peptide kháng nguyên Tất cả các peptide epitope tiềm năng được dự đoán liên kết với HLA-DRB1*15:01 với điểm IC 50 < 500 nM đều được lựa chọn cho bước nghiên cứu tiếp theo

2.2.6.1.2 Dự đoán epitope tế bào B

Dựa trên trình tự: Sáu phương pháp khác nhau bao gồm dụng Dự đoán

epitope liên tục Bepipred, Dự đoán β turn của Chou & Fasman, Dự đoán khả năng tiếp cận bề mặt Emini, Dự đoán tính linh hoạt của Karplus & Schulz, Tính kháng nguyên của Kolaskar & Tongaonkar và Dự đoán tính ưa nước của Parker có sẵn dưới dạng các công cụ phụ (Cụ thể xem Phụ lục 3) được sử dụng để sàng lọc các epitope tế bào B liên tục từ hai tự kháng nguyên MOG và AQP4 [9, 38, 72, 99, 127, 135] Các phương pháp này có sẵn tại Công cụ dự đoán epitope tế bào B của IEDB (http://tools.iedb.org/bcell/) [149]

Dựa trên cấu trúc: Phần mềm ElliPro (http://tools.iedb.org/ellipro/) và DiscoTope (http://tools.iedb.org/discotope/) đã được sử dụng để dự đoán các epitope tế bào B ElliPro có thể dự đoán cả các epitope liên tục và không liên tục dựa trên cấu trúc 3D của protein Discotope được sử dụng để dự đoán epitope không

liên tục dựa trên số liệu thống kê về acid amin, thông tin không gian và khả năng tiếp cận bề mặt dựa trên cơ sở dữ liệu epitope miễn dịch (The Immune Epitope Database-IEDB) [79, 130]

Đối với mỗi công cụ, mỗi epitope có 7 acid amin và ngưỡng được đặt theo giá trị mặc định do công cụ cung cấp Mỗi công cụ cung cấp một biểu đồ trong đó các vùng có điểm cao hơn ngưỡng có nhiều khả năng trở thành epitope tế bào B hơn Tất cả các biểu đồ do các công cụ cung cấp đều được so sánh Đối với epitope liên tục, các epitope được dự đoán có độ tin cậy cao được chọn để phân tích tiếp theo Đối với các epitope không liên tục, các epitope dự đoán chung của hai công cụ ElliPro và Discotope được coi là các epitope cuối cùng

2.2.6.2 Phân tích các acid amin gối nhau và xác định vị trí epitope trên bề

mặt tế bào

Để tìm ra các epitope được dự đoán cuối cùng, tất cả các epitope liên tục thu được đều được so sánh trình tự với nhau bằng công cụ Clustal Omega của Viện Tin sinh học Châu Âu (//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) [47] Các epitope sau khi được phân cụm đã được đưa vào danh sách để tiếp tục các đánh giá tiếp theo

Dựa trên cấu trúc trong cơ sở dữ liệu UniProt (http://www.uniprot.org/) và mô hình 3D trong Ngân hàng Dữ liệu Protein (https://www.rcsb.org/), vị trí epitope trên bề mặt tế bào được xác định [57, 166]

2.2.6.3 Chuẩn bị thụ thể

Xây dựng mô hình: : Mô hình 3D phân tử HLA-DRB1*15:01 không có sẵn

trong Ngân hàng Dữ liệu Protein (https://www.rcsb.org/), nên SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) đã được sử dụng để mô hình hóa cấu trúc của HLA-DRB1*15:01 dựa trên trình tự protein HLA-DRB1*15:01 (IMGTHLApro: HLA00865) được thu thập từ cơ sở dữ liệu IPD-IMGT/HLA (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/), trình tự chuỗi alpha của phức hệ HLA-DR (ID: P01903) được lấy từ cơ sở dữ liệu UniProt (http://www.uniprot.org/) [57, 81,